CN114794015A - 一种肺部损伤动物模型的构建方法及其应用 - Google Patents

一种肺部损伤动物模型的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肺部损伤动物模型的构建方法及其应用，构建方法包括以下步骤：将小鼠麻醉后固定，暴露声门，将气管插管套件插入小鼠气管，气管插管套件包括中空软管，中空软管内穿设有插管导丝；取出气管插管套件中的插管导丝，使中空软管置于小鼠气管中；选取呼吸均匀的小鼠，将诱导液加入中空软管中，若中空软管中的诱导液随小鼠呼吸而上下波动，待小鼠吸入所需量的诱导液后取下中空软管，胸外按压，构建得到所述肺部损伤动物模型。本发明得到的动物模型在术中和术后的死亡率显著降低，通过自主呼吸替代推注和鼻滴方式，以确保造模药物更好地到达肺部并均匀分布于两侧肺部，从而降低动物实验中由于模型的组间差别带来的不良影响。

Description

一种肺部损伤动物模型的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及动物实验模型技术领域，尤其涉及一种肺部损伤动物模型的构建方法及其应用。
背景技术
肺损伤性疾病包括有肺炎性损伤、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化等，是临床上常见的疾病之一，其诱发因素包括有因外力、肺部感染、毒物等，早期多有咳嗽、胸痛等表现，严重时可出现不同程度呼吸衰竭及继发性肺部感染，危及患者生命安全。
病理生理学实验以动物实验为主，采取何种动物是决定实验成功与否的一种重要因素。一般针对实验目的，根据实验动物的生物学特征以及复制动物疾病模型的经验选择实验动物品种。目前根据我国实验动物的使用情况和国外文献报道的常使用实验动物，最常用的实验动物品种为：小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬等，其中，小鼠是最常用的实验动物品种。其品系多，可供选用的范围广，性周期短，生育能力强，价廉，加之对小鼠的生物学特性比较了解，遗传学研究深入且广泛，实验积累资料丰富，因此为科研工作者所乐用。在研究肺损伤发病机制及临床治疗肺损伤的药物开发过程中，伦理和研究经费等问题很大程度上限制了研究在患者或大型哺乳动物中进行，但目前科研人员构建或改良肺损伤模型时常使用大鼠作为实验动物。因此，成功构建小鼠肺损伤模型对肺损伤相关研究而言至关重要。
既往构建肺损伤动物模型主要分为有创与无创。有创即通过外科手术暴露气管的方法制备，如王婷等(三种大鼠急性肺损伤模型的比较[J].成都医学院学报,2016,11(1):5-9.DOI:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.01.002.)通过分离暴露气管，插管后经支气管滴注内毒素溶液构建急性肺损伤模型，具体地，将成年SD大鼠分为正常组、气管滴注LPS(LPS-IT)组及假手术组(SHAM)，每组十只。正常组不进行任何干预。LPS-IT组使用水合氯醛腹腔注射麻醉后(8％，1mL)，将大鼠固定，分离暴露气管，插管，经支气管缓慢滴注内毒素溶液5mg/kg(100μL)，缝合伤口；SHAM组同LPS-IT组插管后，气管滴注生理盐水100μL。在造模24h后，腹主动脉取血至死，取出完整的肺，结扎右肺，进行后续分析。但对于小鼠构建的动物模型来说，有创方式具有以下缺点：(1)具有侵入性，术中难以控制感染风险，并且需对小鼠进行深度麻醉，小鼠在术中及术后死亡率高；(2)当滴入颗粒性悬液时易于阻塞大气管引起动物窒息死亡；(3)滴入溶液容易使液体在两侧肺重分布不均匀。因此，采用小鼠进行造模的成功率与死亡率较难保障，从而影响实验可重复性。近来科研人员借助一些专用插管装置进行无创造模，如中国专利CN201711118504.3，其通过建立一种矽肺肺纤维化动物模型的专用插管装置构建大鼠矽肺模型。但此方法存在以下缺点：(1)其装置适用于大鼠模型，体积较大，无法用于小鼠造模；(2)其给药方式为使用注射器推注，不符合小鼠呼吸频率，给药速度过快，容易出现小鼠呼吸顺应性降低，引起小鼠呛咳或窒息，死亡率增高。此外，还有科研人员使用滴鼻的方法构建模型(如中国专利CN201910793141.6)，但此方法通过鼻腔给药，有文献报道大部分药物会滞留于鼻腔中，导致进入肺内的药物明显减少，从而影响药物对肺损伤的作用强度，且样本之间进入药物的量也不稳定，会影响实验稳定性。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种小鼠肺部损伤模型，通过本发明的构建方法得到的动物模型在术中和术后的死亡率显著降低，通过自主呼吸替代推注和鼻滴方式，以确保造模药物更好地到达肺部并均匀分布于两侧肺部，从而降低动物实验中由于模型的组间差别带来的不良影响。
本发明的第一个目的是提供一种肺部损伤动物模型的构建方法，包括以下步骤：
将小鼠麻醉后固定，暴露声门，将气管插管套件插入小鼠气管，所述气管插管套件包括中空软管，所述中空软管内穿设有插管导丝；取出气管插管套件中的插管导丝，使中空软管置于小鼠气管中，此时若小鼠表现为呼吸均匀，则表示中空软管插在气管内，否则小鼠表现为呼吸困难；随后将诱导液加入该中空软管中，此时中空软管中的诱导液随小鼠呼吸而上下波动，诱导液通过小鼠主动呼吸缓慢进入肺内，当小鼠吸入所需量的诱导液后，取下中空软管，将小鼠头部朝上，轻轻按摩胸部，促进诱导液进入肺内，构建得到肺部损伤动物模型。
进一步地，上述麻醉包括按5-15mL/kg体重的剂量向小鼠腹腔注射2％-5％戊巴比妥钠。
进一步地，上述诱导液通过将诱导物和生理盐水混合配制成能够诱导相应肺部损伤疾病的浓度，再经超声和灭菌后得到。
进一步地，小鼠为6-8周龄成年C57BL/6J小鼠，体重为20-25g。
进一步地，上述气管插管套件包括中空软管及穿设于中空软管内的插管导丝，插入小鼠气管时，插管导丝起支撑作用，使气管插管套件顺利进入气管中，随后取出其中的插管导丝，便于诱导物通过中空软管进入气管。优选地，中空软管直径为1mm。
进一步地，诱导物选自结晶二氧化硅、细菌脂多糖和博来霉素中的一种或几种。
本发明创新性地将内设插管导丝的中空软管组成的气管插管套件应用于肺部损伤模型的构建，更重要的，与现有技术不同，本发明通过小鼠自主呼吸将诱导药物直接吸入气管，避免药物误入食道或大部分滞留于鼻腔中，以及小鼠肺内药物沉积量不足影响实验结果的问题，主动吸入还避免小鼠发生呛咳甚至窒息而造成的死亡，提高模型的可重复利用率，有利于肺部疾病相关研究的进行。
本发明的第二个目的是提供上述构建方法构建得到的肺部损伤动物模型。
进一步地，肺部损伤动物模型为肺部炎症动物模型或肺纤维化动物模型。
本发明的第三个目的是提供一种肺部损伤评价模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)将小鼠随机分为模型组和对照组；
(2)将模型组小鼠麻醉后固定，暴露声门，将气管插管套件插入小鼠气管，所述气管插管套件包括中空软管，所述中空软管内穿设有插管导丝；取出气管插管套件中的插管导丝，使中空软管置于小鼠气管中，选取呼吸均匀的小鼠，将诱导液加入中空软管中，若中空软管中的诱导液随小鼠呼吸而上下波动，待小鼠吸入所需量的诱导液后取下中空软管；
阴性对照组小鼠：将诱导液替换为等量的生理盐水，其余操作同模型组小鼠；
(3)对模型组小鼠和阴性对照组小鼠进行胸外按摩后送回饲养室，将小鼠麻醉处死，取肺组织进行鉴定；
其中，模型组为多组，通过组间对比得到不同诱导液对肺部损伤程度的结果。
进一步地，上述诱导液可根据待评价的物质进行选择，如常见的可吸入颗粒物制备的悬液，二硫化钼、二氧化钛、PM2.5等。
进一步地，步骤(2)的具体方法为：按5-15mL/kg剂量腹腔注射2％-5％戊巴比妥钠对模型组小鼠进行麻醉，若小鼠昏迷但掐尾有反应证明小鼠麻醉成功，将小鼠固定于固定板上，将固定板置于45-60°倾斜；采用激光使其聚光点聚焦于小鼠声门处，暴露小鼠声门，在气管口张开的瞬间将气管插管套件插入气管；
松开用于暴露声门的组织镊，将气管插管套件中的插管导丝取出，剩下中空软管于小鼠气管中，将待测液体缓慢加入中空软管中，若中空软管中的待测液体随小鼠呼吸而上下波动，证明已插入到气管中，且中空软管中的待测液体随着小鼠继续呼吸缓慢下落至小鼠肺组织中；
阴性对照组小鼠：将待测液体替换为等量的生理盐水，其余操作同模型组小鼠；
进一步地，模型组可根据需要设置多组，通过组间对比得到不同待测液体对肺部损伤程度的结果；或将不同药物施用于本发明构建的动物模型，根据肺部损伤恢复情况筛选肺部损伤治疗药物。
本发明的第四个目的是提供一种上述构建方法构建得到的肺部损伤评价模型。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
(1)本发明提供了一种小鼠肺损伤模型的建立方法，通过非创伤式造模避免了感染隐患，减低死亡率，利用小鼠呼吸将药物直接吸入气管，避免了药物误入食道或鼻腔滞留。操作时实验器械简单易得，大大降低了研究成本，且操作简单，造模方法简单易于学习和推广，对操作者技术水平要求较低，保证实验结果稳定性与成功率，自主吸入对实验动物刺激性低，成功率高，适用于短期、长期模型。
(2)本发明通过对比不同组别之间的肺部损伤情况，对待测液体的肺部毒性进行评价，该评价方法中，本发明制备的动物模型在使用等量同一诱导物的情况下表征更明显，在构建不同损伤程度的动物模型时诱导物的用量也更少，降低了成本；死亡率显著降低，诱导物稳定进入肺部，大大减少了诱导物的浪费，且诱导物均匀分布在肺两侧，进行肺的诱导物的量也相对稳定，对不同待测液体进行肺部毒性的评价时，降低了诱导物吸入差异及取肺组织进行鉴定时的差异，准确性更高。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为阴性对照组、滴鼻组和实验组构建的CS诱导肺组织急性炎症模型的H&E染色结果；
图2为阴性对照组、滴鼻组和实验组构建的CS肺组织急性炎症模型的瑞氏-吉姆萨染色结果；
图3为阴性对照组、滴鼻组和实验组构建的LPS急性肺部炎症模型的H&E染色结果；
图4为阴性对照组、滴鼻组和实验组构建的LPS急性肺部炎症模型的瑞氏-吉姆萨染色结果；
图5为阴性对照组和实验组构建的肺纤维化模型的H&E染色结果；
图6为阴性对照组和实验组构建的肺纤维化模型的天狼星红染色结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实验材料：
(1)实验动物及分组
健康SP级C57BL/6小鼠雌雄各10只，由广州赛业生物科技公司提供，体重18-25g。适应性喂养5天后，将小鼠随机分为2组，即阴性对照组和处理组，雌雄各半。阴性对照组采用非暴露式气管灌注50μL生理盐水。
(2)主要仪器与试剂
普通激光笔；组织镊；气管插管套件(Exel International公司)；结晶二氧化硅(crystalline silica,CS)购买于德国Doerentrup Quarz GmbH公司；细菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)购买自上海碧云天生物技术有限公司；移液器(上海泰坦科技股份公司)。
实施例1非暴露式气管灌注CS诱导肺部急性炎症模型
1、实验前准备：
制备CS悬液：称取CS颗粒，加入适量生理盐水配制成终浓度为60mg/mL的CS悬液，经过超声、高压灭菌后待用(给药前需要充分摇匀，使悬液中CS均匀分布)。
2、气管插管(实验组)
2-1、在小鼠麻醉前进行称重，按10mL/kg剂量腹腔注射3％戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉。
2-2、尾部钳夹确认小鼠麻醉成功后，使用普通胶布将小鼠四肢固定于泡沫板上，再用橡皮筋将小鼠上切牙固定于泡沫板，使其头颈部与操作者视线保持在同一直线上，将泡沫板置于60°倾斜，在灌注过程中利于CS进入气管。
2-3、固定激光笔，使其高度与小鼠声门相近，打开激光笔，使其聚光点聚焦于小鼠声门处，左手使用组织镊将小鼠舌头向前外侧拉出口腔，从而暴露小鼠声门。
2-4、在激光笔照射下，可在小鼠喉部看到有一透光区，即小鼠气管位置，随着小鼠呼吸可见气管口一张一合，此时右手持插管套件置于气管上方，趁气管口张开的瞬间将套件插入气管。
2-5、此时可松开组织镊，将套件中的针管取出，剩下中空软管于小鼠气管中，然后使用移液器吸取50μL CS悬液缓慢加入软管中，此时可见软管中的悬液随小鼠呼吸而上下波动，证明已插入到气管中，且软管中的悬液随着小鼠继续呼吸缓慢下落至小鼠气管以及肺组织中。阴性对照组为吸取50μL生理盐水。
2-6、胸外按压2-3分钟后，将小鼠送回SPF级常温动物饲养室中，记录小鼠体重指标及死亡率。第7天将小鼠麻醉处死，取肺组织进行病理实验。
为对比模型制备效果，将本发明构建的模型与注射法、气管切开插管法和滴鼻法制备的肺部急性炎症模型进行对比，具体构建步骤如下：
(1)注射法：无损伤气管插管方法同实验组，区别在于确认插入小鼠气管后，使用注射器吸取50μL CS悬液推注进入导管。
(2)气管切开插管法：使用10％戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉，至深度麻醉程度后，固定小鼠四肢，将其置于仰卧位。对颈部进行酒精消毒后，减去颈部毛发，暴露颈部皮肤；找到小鼠气管位置后，使用手术刀切开颈部皮肤，分离气管与肌肉组织，游离气管，固定气管后，切开气管，将导管插入气管并固定，确定导管稳定后，加入50μLCS悬液，悬液全部进入气管后，拔出导管，缝合气管与皮肤。
(3)滴鼻法：小鼠麻醉后，将小鼠头朝上握住，手指抵住小鼠下颌，使用移液器吸取50μL CS悬液，枪头对准小鼠一侧鼻翼，轻轻打出一滴，小鼠吸入后再打入下一滴，待完全滴完后胸外按摩，确保生命体征恢复后送回SPF级常温动物饲养室，记录小鼠体重指标及死亡率。第7天将小鼠麻醉处死，取肺组织进行病理实验，对比鉴定模型制备效果。
3、实验结果
3-1、记录步骤2中所制备模型的小鼠死亡率，数据如表1所示：
表1
Figure BDA0003610978320000081
在实验过程中发现，使用注射器推注悬液时，小鼠出现较剧烈呛咳反应，由于悬液进入气道过快，小鼠出现呼吸困难现象；滴鼻组观察到大量的鼻腔残留，且伴有呛咳反应。在实验结束前后，本发明中小鼠的死亡数量为2只，死亡率仅为10％，而气管切开插管组和注射组的死亡率分别高达40％和20％，显著高于本发明。
3-2、苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin，H&E)染色结果
将小鼠肺组织石蜡白片脱蜡水化：先用二甲苯溶液浸泡10分钟，取出换新的二甲苯再次浸泡10分钟；紧接着用无水乙醇浸泡4分钟，更换新的无水乙醇后再次浸泡4分钟；而后用95％乙醇浸泡4分钟，80％乙醇再次浸泡4分钟；最后用流水冲洗5分钟，阴干，待染色。将脱水后已入蒸馏水的切片放入苏木精水溶液中染色5分钟后用自来水冲洗，将切片上残余的水吸干；把切片在盐酸乙醇中分化数秒；流水冲洗2小时后放入蒸馏水中片刻；而后放入70％和90％乙醇中脱水各10分钟；放入酒精伊红染色液染色2-3分钟。在95％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、无水乙醇分别浸泡5分钟，层级梯度脱水。二甲苯浸泡5分钟，最后中性树胶封片。
结论：H&E染色结果见图1，与阴性对照组相比，滴鼻组炎性细胞浸润不明显，未见肺泡间隔增厚现象，而实验组小鼠肺组织中出现炎性细胞结节，炎性细胞浸润增加，肺泡间隔增厚现象。以上结果表明，与现有方法相比，使用本方法可以有效构建CS诱导的小鼠肺部急性炎症模型。
3-3、瑞氏-吉姆萨染色结果
收集小鼠肺泡灌洗液(BALF)，制备细胞涂片，待涂片自然晾干后，取出Wright-Giemsa Stain与磷酸盐缓冲液等量混合，即为瑞氏-吉姆萨染色工作液；然后滴加适量工作也覆盖涂片，避光孵育10分钟后，流水冲洗1分钟。干燥封片后置于显微镜下计数巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞。
细胞总数与分数结果见图2。与阴性对照组相比，滴鼻组小鼠BALF中细胞总数稍有增加，其中以巨噬细胞增加为主，中性粒细胞与淋巴细胞稍有增加，而实验组小鼠BALF中细胞总数显著增加，其中，巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞均显著高于滴鼻组，表明与滴鼻组相比，实验组小鼠诱导急性炎症反应显著。
实施例2 LPS诱导小鼠肺部急性炎症模型构建
1、实验前准备：
制备LPS溶液：在LPS粉末中加入生理盐水，使其终浓度为0.4mg/mL。高压灭菌后待用。
2、各组操作方法参照实施例1，不同之处在于所给药物为LPS溶液，小鼠经灌注24小时后麻醉处死，记录死亡率，收集肺组织。
3、实验结果
3-1、小鼠死亡率数据如表2所示：
表2
Figure BDA0003610978320000101
结论：在实验结束时，本发明中小鼠的死亡数量仅为1只，死亡率仅为5％，而气管切开组的死亡率高达30％，注射组死亡率也高达20％左右，死亡率均显著高于本发明。
3-2、H&E染色结果见图3，与阴性对照组相比，滴鼻组小鼠肺组织中出现少量炎性细胞浸润，实验组小鼠肺组织肺泡壁完整性被破坏，炎性细胞浸润显著增加，肺泡间隔增厚。表明与现有方法相比，使用本发明方法，可以有效构建LPS诱导小鼠肺部急性炎症模型。
3-3、瑞氏-吉姆萨染色结果见图4，与阴性对照组相比，滴鼻组与实验组小鼠肺泡灌洗液中细胞总数均显著增加，其中以中性粒细胞增加为主，巨噬细胞、淋巴细胞稍有增加，但实验组小鼠炎性细胞数目高于滴鼻组，炎症反应更明显。
实施例3 CS诱导小鼠肺纤维化模型构建
1、实验前准备参照实施例1
2、各组操作方法参照实施例1，不同之处在于小鼠经气管灌注送回SPF级动物饲养室后，在第48天麻醉处死小鼠，记录死亡率，收集肺组织进行病理实验。
3、实验结果
3-1、小鼠死亡率对比数据如表3所示
表3
Figure BDA0003610978320000111
结论：在实验结束时，本发明中小鼠的死亡数量仅为3只，死亡率仅为15％，而气管切开组和注射组的死亡率分别高达45％和25％，显著高于本发明。
3-2、H&E染色结果见图5。与阴性对照组相比，使用本发明方法气管灌注CS悬液48天后，小鼠肺组织中炎性细胞结节、炎性细胞浸润增加，肺泡间隔显著增厚。
3-3、天狼星红染色：石蜡切片常规脱蜡水化后，滴加适量天青石蓝染液5～10分钟后，将切片放入1XPBS中，洗3次，每次5分钟，再向切片中滴加天狼星红饱和酸液15～30分钟，染色结束后使用无水乙醇分化，最后使用梯度乙醇脱水，中性树脂封片，显微镜下观察结果。
天狼星红染色结果见图6，结果表明使用本发明方法气管灌注CS悬液48天后，肺组织中胶原纤维形成。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种肺部损伤动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将小鼠麻醉后固定，暴露声门，将气管插管套件插入小鼠气管，所述气管插管套件包括中空软管，所述中空软管内穿设有插管导丝；
取出气管插管套件中的插管导丝，使中空软管置于小鼠气管中；
选取呼吸均匀的小鼠，将诱导液加入中空软管中，若中空软管中的诱导液随小鼠呼吸而上下波动，待小鼠吸入所需量的诱导液后取下中空软管，胸外按压，构建得到所述肺部损伤动物模型。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述的麻醉为按5-15mL/kg体重的剂量向小鼠腹腔注射2％-5％戊巴比妥钠。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述的诱导液通过将诱导物和生理盐水配制成所需浓度，再经超声和灭菌后得到。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述诱导物选自结晶二氧化硅、细菌脂多糖和博来霉素中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述的小鼠为6-8周龄成年C57BL/6J小鼠，体重为20-25g。
6.权利要求1-5任一项所述的构建方法构建得到的肺部损伤动物模型。
7.根据权利要求6所述的肺部损伤动物模型，其特征在于：所述肺部损伤动物模型为肺部炎症动物模型或肺纤维化动物模型。
8.一种肺部损伤评价模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将小鼠随机分为模型组和对照组；
(2)将模型组小鼠麻醉后固定，暴露声门，将气管插管套件插入小鼠气管，所述气管插管套件包括中空软管，所述中空软管内穿设有插管导丝；取出气管插管套件中的插管导丝，使中空软管置于小鼠气管中，选取呼吸均匀的小鼠，将诱导液加入中空软管中，若中空软管中的诱导液随小鼠呼吸而上下波动，待小鼠吸入所需量的诱导液后取下中空软管；
阴性对照组小鼠：将诱导液替换为等量的生理盐水，其余操作同模型组小鼠；
(3)对模型组小鼠和阴性对照组小鼠进行胸外按摩后送回饲养室，将小鼠麻醉处死，取肺组织进行鉴定；
其中，模型组为多组，通过组间对比得到不同诱导液对肺部损伤程度的结果。
9.权利要求8所述的构建方法构建得到的肺部损伤评价模型。
10.权利要求6所述的肺部损伤动物模型或权利要求9所述的肺部损伤程度评价模型在肺部疾病治疗药物筛选中的应用。
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