CN113876457A - 一种经济定量无创的矽尘致肺纤维化职业病小鼠模型建立方法及制备装置 - Google Patents

一种经济定量无创的矽尘致肺纤维化职业病小鼠模型建立方法及制备装置 Download PDF

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崔世华
胡东
齐浩然
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王紫萍
王亚洲
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Abstract

本发明涉及一种经济定量无创的矽尘致肺纤维化职业病小鼠模型建立方法及制备装置。分别涉及矽尘肺纤维化模型中插管针制作，小鼠固定装置制作和小鼠气管插管操作等过程。具体的，每只小鼠麻醉后固定在自制的小鼠固定板上，暴露声门并使用自制的气管插管针在小鼠气管内定量滴注SiO2悬液。每隔5‑7天插管一次，连续一月，矽尘肺纤维化职业病模型造模成功。取小鼠肺组织进行肺部形态和病理分析，结果证实此法操作简单，成本低，矽尘肺纤维化职业病小鼠模型成功率高，纤维化程度呈进行性发展。本发明为进一步研究矽尘致肺纤维化发病机制及药物筛选提供了良好的实验动物模型。

Description

一种经济定量无创的矽尘致肺纤维化职业病小鼠模型建立方 法及制备装置
技术领域
本发明属于医学及实验技术领域，具体涉及一种经济定量无创的矽尘致肺纤维化职业病小鼠模型建立方法及制备装置。
背景技术
肺纤维化是一种治愈难度大、死亡率高的慢性进行性肺疾病，主要由于组织的异常修复导致胶原过度沉积和肺泡结构紊乱，致肺功能进行性障碍的呼吸系统疾病。主要致病因素有吸烟、药物、粉尘、细菌或病毒感染(如COVID-19)等引起。尘肺病是由粉尘引起的一种广泛而又严重的肺部疾病。我国每年新诊断职业病中约90％为尘肺病，且尘肺病人数和粉尘暴露量居世界首位，其中煤工尘肺发病率高达51％。矽尘是煤矿作业区中的常见无机粉尘，在煤矿职业活动中，长期吸入在肺内潴留的致病粉尘易引起肺组织弥漫性纤维化，即矽尘致肺纤维化。这是一种常见的职业性因素所致的肺间质纤维化病，发病率和死亡均高，其中病情严重者可致呼吸困难，劳动能力丧失并最终发展为呼吸衰竭，极度危害患者生命安全与身心健康，且治疗难度大、成本高，增大了家庭与社会的负担。
煤矿矽尘的主要成分为二氧化硅(SiO2)，是一种不溶性的结晶颗粒可刺激肺部组织引发炎症继而诱发肺组织纤维化性并发症。最致病的是<5μm粒径的SiO2颗粒，因反复吸入在肺内潴留难以从肺部清除，易形成持续刺激而诱发肺部纤维化，其诱发的纤维化更符合职业破坏性的间质性肺部纤维化疾病特征，可作为矽尘致肺纤维化的动物模型。
为构建一个理想的肺间质纤维化模型，常采用气管插管法。一些无创的气管插管法，常因小鼠的气道直径较小，气管插管操作时很难精确观察到气道位置，很容易将插管插入食管导致造模失败或者损伤小鼠咽部。有创的方式如，经手术剪剪开小鼠皮肤，暴露气管进行插管，然后缝合伤口而获得肺纤维化模型。此种方法，虽然可以准确观察到气道，但是对小鼠的伤害较大，而且多次手术，小鼠很难耐受，容易感染死亡，不仅造成经济损失，还会影响后续实验的进行。此外，还有一种无创喷雾吸入致病物质进行肺纤维化模型构建，此法难以定量致病物质，易导致构建模型病理程度不均匀，难以保证后续实验的可信度。
基于现状，本发明目的在于提供一种经济定量无创的矽尘致肺纤维化职业病小鼠模型建立方法及制备装置，为进一步研究肺纤维化发病机制及治疗矽尘致肺纤维化药物的筛选提供技术保障。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，具体的本发明提供了一种经济定量无创的矽尘致肺纤维化职业病小鼠模型建立方法及制备装置，其包括步骤：
步骤一实验前准备：(1)小鼠的购买与饲养：购买的雄性小鼠(SPF级)，在特定的无菌环境中，饲养一周。(2)自制小鼠固定板：将购买的50ml塑料可拆卸两用离心管架去除四角的连接塑料棒，其中线绳可从50ml离心管直径孔中穿过，用于固定小鼠四肢部分。接着，在较短的一侧相邻两角的连接棒去除后的孔洞中插入去除针头的1ml注射器，并在两个注射器的上端用一根细线连接，此处可作为小鼠牙齿固定部位。(3)自制平头气管插管针：将1ml注射器的针头摘下并磨平，无损地把24G留置针针头上的软胶管拆卸掉，接着，留置针针头上的软胶管小心地套在磨平的针头上，最后将装套好的针头套在1ml平口注射器上，可得自制得到小鼠插管针。此法中软胶管不仅延长了注射器自带的针头长度，还可以对小鼠气管起到保护作用。
步骤二麻醉后的小鼠固定于固定板，用自制的平头气管插管针气管内定量滴注含有SiO2的生理盐水，插管后将小鼠直立旋转5-10分钟，使药物均匀分布于小鼠肺部，之后松绑使其自由进水进食。
进一步地，步骤二每隔5-7天一次，连续一个月。
进一步地，步骤二中所述麻醉用的麻醉药的剂量为每只小鼠10％水合氯醛2.0-2.5ml/kg。
进一步地，步骤二中所述的自制平头插管针在气管插管操作前经紫外灭菌处理。
进一步地，步骤二中所述用于气管内滴注的SiO2用0.9％生理盐水配置成相应的浓度，并灭菌处理。
进一步地，步骤二中所述每只小鼠气管内滴注的剂量为30-60mg/ml粒径<5μm的SiO2悬液1.5-2.5ml/kg。
本发明的有益效果在于：
设计精巧，自制的小鼠固定板使得小鼠以伏卧式的方式放置，小鼠的脖颈与躯干呈现近于90°，可以方便清晰地观察到小鼠的声门裂，为气管插管的精准度提供保障。自制的平头气管插管针，为注射器和留置针的组合。留置针的软管一方面可以延长注射器自带针头的长度，适应小鼠气管长度，便于操作；另一方面可以对小鼠气管起到保护作用，减轻插管操作对小鼠气管的损伤，大大减少了小鼠因创伤性感染而造成死亡，降低了实验耗材。
本发明通过定量多次气管内滴注SiO2混悬液，成功地建立了一种矽尘肺纤维化小鼠模型，在一个月内其肺部纤维化程度随着造模时间的延长而逐渐加剧，表现为一种进行性肺纤维化。本发明提供的肺纤维化模型成功率高，病理程度均匀，实验周期短，且成本低廉，操作简便，为进一步的实验研究提供了良好条件，将有助于矽尘致肺纤维化职业病发病机制和药物筛选的研究。
附图说明
图1为本发明所述的一种经济定量无创的矽尘致肺纤维化职业病小鼠模型建立方法及制备装置的实验流程图；
图2为本发明构建的矽尘致肺纤维化小鼠模型所用的自制平头气管插管针的装置图；
图3为本发明构建的矽尘致肺纤维化小鼠模型及插管装置中小鼠的伏卧式固定插管法图；
图4为本发明具体实施例1构建的矽尘致肺纤维化模型组和正常组小鼠体重变化图；
图5为本发明具体实施例1构建的矽尘致肺纤维化模型组和正常组小鼠肺组织形态；
图6为本发明具体实施例1构建的矽尘致肺纤维化模型组和正常组小鼠肺组织切片的H&E染色病理图；
具体实施方式
下面将结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
步骤一实验前准备
1.小鼠的购买、饲养和自由分组
30只SFP级雄性小鼠，体重在23±2g，购买于安徽医科大学动物实验中心。之后将其直接饲养在安徽理工大学实验动物中心SPF级实验室中心。所有的实验小鼠都生活在特定的无菌环境中，温度控制在25±2℃，湿度在60±10％范围内，明暗周期为12h/12h，条件允许小鼠自由进食和饮水。饲养一周后，随机分为模型组和正常组。此外，本实验的所有程序均经过安徽理工大学生物研究伦理委员会同意。
2.自制小鼠固定板
将购买的50ml塑料可拆卸两用离心管架去除四角的连接塑料棒，其中线绳可从50ml离心管直径孔中穿过，用于固定小鼠四肢部分。接着，在较短的一侧相邻两角的连接棒去除后的孔洞中插入去除针头的1ml注射器，并在两个注射器的上端用一根细线连接，此处可作为小鼠牙齿固定部位。
3.自制平头气管插管针
将1ml注射器的针头摘下并磨平，无损地把24G留置针针头上的软胶管拆卸掉，接着，把留置针针头上的软胶管小心地套在磨平的针头上，最后将装套好的针头套在1ml直口注射器上，可得自制的小鼠插管针。此法中软胶管不仅延长了注射器自带的针头长度，还可以对小鼠气管起到保护作用。
步骤二计算用药量并记录
用0.9％的生理盐水把<5μm粒径的SiO2配置成40mg/ml的混悬液。用电子分析天平对每只小鼠称重，并记录。根据体重每只小鼠10％水合氯醛2.0ml/kg计算麻醉药的用量，根据体重模型组每只小鼠40mg/ml的SiO2悬液2.0ml/kg计算小鼠气管内滴注SiO2混悬液的用量，根据体重正常组每只小鼠0.9％的生理盐水2.0ml/kg计算小鼠气管内滴注生理盐水的用量，并记录。
步骤三实验小鼠的麻醉
右手持已抽取10％水合氯醛的注射器，左手拇指、食指和中指握住大鼠颈部皮肤，另外两只手指抓住小鼠尾巴，手轻微向下倾斜使小鼠的头部朝下。在小鼠的腹中线两侧进针，针头与小鼠腹部呈45°，进针后先回抽一下发现无液体后进行注射，注射完麻醉剂后缓缓拔出针头。
步骤四麻醉后的小鼠固定于固定板，气管内定量滴注SiO2混悬液，其详细步骤如下：
1.小鼠的固定
两名实验人员相互配合，一人抓取麻醉后小鼠，一人将细线打成活结，系于小鼠四肢，系细线后，将小鼠置于小鼠固定板上，细线的剩余部分缠绕于固定板的四个角，并用小夹子夹住细线，使其牢固。将小鼠的门牙悬挂于小鼠固定板连接注射器的细线上，细线的多余部分缠绕在对侧的固定板离心管孔上，可用小夹子夹住细线，以便固定。注意小鼠固定时要尽量保证小鼠躯干和头部呈近90°，即伏卧式插管法，便于观察小鼠声门。
2.气管内定量滴注SiO2混悬液
将两把平头镊子的头部分别用医用胶带缠绕一圈，一名实验人员在距离小鼠颈部2cm处，用聚光灯照射小鼠颈部，另一名实验人员右手持镊子迅速将小鼠的舌头向左侧牵拉，左手持另一把镊子夹取小鼠舌头的根部并向左下方牵拉，从小鼠口腔中往里看可以看到，小鼠的会厌一张一合，有一个透亮的小点，则为气管入口。右手放下镊子，取用紫外灭菌后的自制插管针，进行气管内定量滴注已经高压灭菌处理的SiO2混悬液，正常组小鼠以同样方式和剂量滴注浓度为0.9％的生理盐水。
步骤五插管后将小鼠直立旋转7分钟，之后松绑使其自由摄食进水。
上述步骤二、三、四、五每隔6天插管一次，连续一个月。此外，在这造模期间，每隔七天对小鼠称一次体重并记录。
步骤六取小鼠肺组织制作病理切片并染色后观察
实验第一周、第二周、第四周，取模型组和正常组分别不少于3只小鼠，腹腔注射10％水合氯醛，麻醉后直接采用颈椎脱臼法处死小鼠，开胸取出肺组织并拍照。然后，小鼠肺组织经4％多聚甲醛固定，乙醇脱水，58-62℃浸蜡，切片机5μm切片，二甲苯脱蜡，H&E染色等过程，显微镜下观察肺组织结构变化，最后进行病理情况分析。
实验结果分析：
如图4所示，经连续气管内滴注SiO2混悬液14天后，与正常组相比，模型组小鼠体重增加量明显下降(P<0.05)；经连续气管内滴注SiO2混悬液21天和28天后，与正常组相比，模型组小鼠体重增加量显著下降(P<0.01)。
如图5所示，经连续气管内滴注SiO2混悬液一月后，模型组小鼠肺组织颜色发白，质地变硬，有白色结节凸起于肺表面，正常组的肺组织红润，质地柔软。
如图6所示，经连续气管内滴注SiO2混悬液7天后，与正常组相比，模型组的小鼠肺组织的H&E染色中，可见有部分肺泡结构被破坏，肺泡壁有一定程度增厚；经连续气管内滴注SiO2混悬液14天后，与正常组相比，见有大量肺泡结构紊乱，肺泡壁明显增厚；经连续气管内滴注SiO2混悬液28天后，与正常组相比，肺组织病变明显，肺泡结构严重破坏，肺泡壁显著增厚。生理盐水组即正常组的肺组织H&E染色，无病变发生，一直可见肺泡结构完整，肺泡间隔清晰。
上述情况表明，本发明中所构建的矽尘肺纤维化小鼠模型，肺纤维化程度随造模时间推移而不断加深，纤维化情况呈现进行性变化。同时，在造模过程中无小鼠死亡，造模结果显示，模型成功率高，病理程度均匀，故可作为矽尘致肺纤维化职业病研究的动物模型。
实施例2
步骤一实验前准备
1.小鼠的购买、饲养和自由分组
30只SFP级雄性小鼠，体重在23±2g，购买于安徽医科大学动物实验中心。之后将其直接饲养在安徽理工大学实验动物中心SPF级实验室中心。所有的实验小鼠都生活在特定的无菌环境中，温度控制在25±2℃，湿度在60±10％范围内，明暗周期为12h/12h，条件允许小鼠自由进食和饮水。饲养一周后，随机分为模型组和正常组。此外，本实验的所有程序均经过安徽理工大学生物研究伦理委员会同意。
2.自制小鼠固定板
将购买的50ml塑料可拆卸两用离心管架去除四角的连接塑料棒，其中线绳可从50ml离心管直径孔中穿过，用于固定小鼠四肢部分。接着，在较短的一侧相邻两角的连接棒去除后的孔洞中插入去除针头的1ml注射器，并在两个注射器的上端用一根细线连接，此处可作为小鼠牙齿固定部位。
3.自制平头气管插管针
将1ml注射器的针头摘下并磨平，无损地把24G留置针针头上的软胶管拆卸掉，接着，把留置针针头上的软胶管小心地套在磨平的针头上，最后将装套好的针头套在1ml直口注射器上，可得自制的小鼠插管针。此法中软胶管不仅延长了注射器自带的针头长度，还可以对小鼠气管起到保护作用。
步骤二计算用药量并记录
用0.9％的生理盐水把<5μm粒径的SiO2配置成50mg/ml的混悬液。用电子分析天平对每只小鼠称重，并记录。根据体重每只小鼠10％水合氯醛2.5ml/kg计算麻醉药的用量，根据体重模型组每只小鼠50mg/ml的SiO2悬液2.0ml/kg计算小鼠气管内滴注SiO2混悬液的用量，根据体重正常组每只小鼠0.9％的生理盐水2.0ml/kg计算小鼠气管内滴注生理盐水的用量，并记录。
步骤三实验小鼠的麻醉
右手持已抽取10％水合氯醛的注射器，左手拇指、食指和中指握住大鼠颈部皮肤，另外两只手指抓住小鼠尾巴，手轻微向下倾斜使小鼠的头部朝下。在小鼠的腹中线两侧进针，针头与小鼠腹部呈45°，进针后先回抽一下发现无液体后进行注射，注射完麻醉剂后缓缓拔出针头。
步骤四麻醉后的小鼠固定于固定板，气管内定量滴注SiO2混悬液，其详细步骤如下：
1.小鼠的固定
两名实验人员相互配合，一人抓取麻醉后小鼠，一人将细线打成活结，系于小鼠四肢，系细线后，将小鼠置于小鼠固定板上，细线的剩余部分缠绕于固定板的四个角，并用小夹子夹住细线，使其牢固。将小鼠的门牙悬挂于小鼠固定板连接注射器的细线上，细线的多余部分缠绕在对侧的固定板离心管孔上，可用小夹子夹住细线，以便固定。注意小鼠固定时要尽量保证小鼠躯干和头部呈近90°，即伏卧式插管法，便于观察小鼠声门。
2.气管内定量滴注SiO2混悬液
将两把平头镊子的头部分别用医用胶带缠绕一圈，一名实验人员在距离小鼠颈部2cm处，用聚光灯照射小鼠颈部，另一名实验人员右手持镊子迅速将小鼠的舌头向左侧牵拉，左手持另一个镊子夹取小鼠舌头的根部并向左下方牵拉，从小鼠口腔中往里看可以看到，小鼠的会厌一张一合，有一个透亮的小点，则为气管入口。右手放下镊子，取用紫外灭菌后的自制插管针，进行气管内定量滴注已经高压灭菌处理的SiO2混悬液，正常组小鼠以同样方式和剂量滴注浓度为0.9％的生理盐水。
步骤五插管后将小鼠直立旋转8分钟，之后松绑使其自由摄食进水。
上述步骤二、三、四、五每隔7天一次，连续一个月，,即可得到矽尘致肺纤维化小鼠模型。
按照实施例1提供的方法对本实施实例的造模情况进行处理，所得模型组和正常组小鼠的体重变化、肺组织形态以及肺组织切片的H&E染色病理图与实施例1类似。
实施例3
步骤一实验前准备
1.小鼠的购买、饲养和自由分组
30只SFP级雄性小鼠，体重在23±2g，购买于安徽医科大学动物实验中心。之后将其直接饲养在安徽理工大学实验动物中心SPF级实验室中心。所有的实验小鼠都生活在特定的无菌环境中，温度控制在25±2℃，湿度在60±10％范围内，明暗周期为12h/12h，条件允许小鼠自由进食和饮水。饲养一周后，随机分为模型组和正常组。此外，本实验的所有程序均经过安徽理工大学生物研究伦理委员会同意。
2.自制小鼠固定板
将购买的50ml塑料可拆卸两用离心管架去除四角的连接塑料棒，其中线绳可从50ml离心管直径孔中穿过，用于固定小鼠四肢部分。接着，在较短的一侧相邻两角的连接棒去除后的孔洞中插入去除针头的1ml注射器，并在两个注射器的上端用一根细线连接，此处可作为小鼠牙齿固定部位。
3.自制平头气管插管针
将1ml注射器的针头摘下并磨平，无损地把24G留置针针头上的软胶管拆卸掉，接着，把留置针针头上的软胶管小心地套在磨平的针头上，最后将装套好的针头套在1ml直口注射器上，可得自制的小鼠插管针。此法中软胶管不仅延长了注射器自带的针头长度，还可以对小鼠气管起到保护作用。
步骤二计算用药量并记录
用0.9％的生理盐水把<5μm粒径的SiO2配置成60mg/ml的混悬液。用电子分析天平对每只小鼠称重，并记录。根据体重每只小鼠10％水合氯醛2.0ml/kg计算麻醉药的用量，根据体重模型组每只小鼠60mg/ml的SiO2悬液1.5ml/kg计算小鼠气管内滴注SiO2混悬液的用量，根据体重正常组每只小鼠0.9％的生理盐水1.5ml/kg计算小鼠气管内滴注生理盐水的用量，并记录。
步骤三实验小鼠的麻醉
右手持已抽取10％水合氯醛的注射器，左手拇指、食指和中指握住大鼠颈部皮肤，另外两只手指抓住小鼠尾巴，手轻微向下倾斜使小鼠的头部朝下。在小鼠的腹中线两侧进针，针头与小鼠腹部呈45°，进针后先回抽一下发现无液体后进行注射，注射完麻醉剂后缓缓拔出针头。
步骤四麻醉后的小鼠固定于固定板，气管内定量滴注SiO2混悬液，其详细步骤如下：
1.小鼠的固定
两名实验人员相互配合，一人抓取麻醉后小鼠，一人将细线打成活结，系于小鼠四肢，系细线后，将小鼠置于小鼠固定板上，细线的剩余部分缠绕于固定板的四个角，并用小夹子夹住细线，使其牢固。将小鼠的门牙悬挂于小鼠固定板连接注射器的细线上，细线的多余部分缠绕在对侧的固定板离心管孔上，可用小夹子夹住细线，以便固定。注意小鼠固定时要尽量保证小鼠躯干和头部呈近90°，即伏卧式插管法，便于观察小鼠声门。
2.气管内定量滴注SiO2混悬液
将两把平头镊子的头部分别用医用胶带缠绕一圈，一名实验人员在距离小鼠颈部2cm处，用聚光灯照射小鼠颈部，另一名实验人员右手持镊子迅速将小鼠的舌头向左侧牵拉，左手持另一个镊子夹取小鼠舌头的根部并向左下方牵拉，从小鼠口腔中往里看可以看到，小鼠的会厌一张一合，有一个透亮的小点，则为气管入口。右手放下镊子，取用紫外灭菌后的自制插管针，进行气管内定量滴注已经高压灭菌处理的SiO2混悬液，正常组小鼠以同样方式和剂量滴注浓度为0.9％的生理盐水。
步骤五插管后将小鼠直立旋转7分钟，之后松绑使其自由摄食进水。
上述步骤二、三、四、五每隔6天一次，连续一个月，即可得到矽尘致肺纤维化小鼠模型。
按照实施例1提供的方法对本实施实例的造模情况进行处理，所得模型组和正常组小鼠的体重变化、肺组织形态以及肺组织切片的H&E染色病理图与实施例1类似。
以上所述是结合具体实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和补充，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种经济定量无创的矽尘致肺纤维化职业病小鼠模型建立方法及制备装置，其步骤包括：将购买来的小鼠饲养一段时间适应环境后，麻醉，并将其固定在自制的小鼠固定板上，用自制的平头气管插管针在小鼠气管内定量滴注含SiO2的生理盐水，一月内连续气管内滴注4-6次，即可获得矽尘致肺纤维化小鼠模型。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，自制的小鼠固定板为，去除四角的连接塑料棒的50ml塑料可拆两用离心管架，在较短的一侧相邻两角的连接棒去除后的孔洞中插入去除针头的1ml注射器，并在两个注射器的上端用一根细线连接。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，自制的插管针为，1ml直口注射器的针头摘下并磨平后，小心地拆除24G留置针针头上的胶管装套在磨平后的针头上，最后将装套好的针头套在1ml直口注射器上。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，小鼠的麻醉剂量为10％水合氯醛2.0-2.5ml/kg。
5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，用于小鼠气管内定量滴注的SiO2用0.9％的生理盐水配置为相应的浓度，并进行灭菌处理。
6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，每只小鼠气管内定量滴注的剂量为30-60mg/ml粒径<5μm的SiO2悬液1.5-2.5ml/kg。
7.按权利要求1所述的方法，其特征在于，小鼠每次气管内定量滴注SiO2的时间间隔为5-7天，且插管所用的插管针需在插管操作前经过紫外灭菌处理。
8.按权利要求1所述的矽尘致肺纤维化小鼠模型，其特征在于，所述模型肺纤维化呈现进行性病变。
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