CN106214280A - 一种微创制作肺纤维化动物模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种微创制作肺纤维化动物模型的方法。具体步骤包括：动物麻醉，气管插管，药物灌注。动物麻醉后以斜侧卧位保定，用气管插管装置从口腔经声门插入动物单侧肺并灌注药物。根据动物肺、气管和支气管的解剖结构以及气管给药时气管插管装置停留在一侧肺的深度和位置，药物可大多均匀分布在一侧肺中，也可集中在一侧肺的某个肺叶中。该方法制作过程简便，成功率高，结果稳定可靠，无或极低死亡率，避免了气管切开等其它方法的复杂操作及其对动物造成的外源性损伤或机械阻塞性窒息，在肺纤维化疾病的病因学、病理学、药物筛选、临床诊断和治疗等研究中具有重要的实际应用价值，可广泛推广。

Description

一种微创制作肺纤维化动物模型的方法

技术领域

本发明专利涉及一种微创制作肺纤维化动物模型的方法，属于医学动物实验领域。

背景技术

肺纤维化是一种早期以肺组织炎症，后期以大量成纤维细胞异常增殖转型和细胞外基质大量沉积为主要表现特点的肺间质疾病。多种病因可引起肺纤维化，如特发性肺纤维化（IPF）、结节病、尘肺、过敏性肺炎等。肺纤维化发病率高，其中大部分疾病呈进行性加重，不可逆且致死率高。以IPF为例，据一项美国医疗保险受益人收集到的数据显示：2001到2011年，美国65岁以上老人，每年IPF的发病率平均为93.7例/10万人，患病率在2001年为202.2例/10万人、2011年为494.5例/10万人，发病率保持稳定，但患病率却出现了明显的增长。以尘肺为例，据2015年中国国家卫生部公布数据显示：2014年中国新发尘肺病例26873例，约为2005年新发病例的3倍，占新发职业病的89.66%。截止至2014年底，中国尘肺病累计病例逾77万例。

目前，肺纤维化的防治应以预防为主，尚无有效的治疗方法，现有的治疗仅限于非特异性抗炎、免疫抑制剂等，但疗效均不理想。因此构建一种成功率高，结果稳定可靠，无或低死亡率，可广泛推广的肺纤维化动物模型，对该类疾病的病因学、病理学、药物筛选、临床诊断和治疗等研究中具有重要的实际应用价值，可广泛推广。

目前利用药物诱导肺纤维化动物模型的给药途径有多种，如气管内给药法、经鼻给药法以及腹腔或静脉注射药物法等。这些方法均存在一些缺点：如经鼻给药法即经鼻腔将药液滴入，此方法操作简单快速、动物死亡率低，但药液不能完全进入肺部，造成药物损失和个体差异，导致模型不稳定且成功率低；腹腔或静脉注射药物法需要多次注射，剂量大，费用高，模型成型时间晚。气管内给药是目前国内外公认的制作肺纤维化模型的成熟方法，其主要方式有三种：雾化给药法、气管切开给药法以及气管插管给药法。雾化给药法需要特殊的给药仪器，实际操作较困难，成功率低；雾化后药物可能会存留在动物的皮肤、粘膜等处，造成定量不准确。气管切开给药法对实验动物造成外源性损伤，增加了实验动物失血过多和感染的风险，操作过于复杂，术后动物死亡率较高。气管插管给药法目前采用的是将动物平放仰卧保定，气管插管经口腔插入声门后给药，药物通过气管进入到双侧肺支气管和肺泡，直接损伤肺泡上皮细胞，肺组织纤维化病变主要分布在支气管、细支气管周围，可以一次或多次给药。但该方法死亡率较高，特别是给药时气管插管的位置较高、给药速度过快时，药物会阻塞气管，导致实验动物因缺氧而窒息。另外，注入气管内的药物会引起实验动物的咳嗽反射，造成药物损失和个体差异。

为了克服上述方法的缺点，本发明专利在气管插管给药法的基础上提出了一种微创制作肺纤维化动物模型的方法，其特点是微创，操作简便快速，成功率高，结果稳定可靠，无或低死亡率，成本低，可广泛推广。

发明内容

为克服现有的气管内给药法制作的肺纤维化动物模型损伤大、死亡率高的缺点，本发明专利提供了一种微创制作肺纤维化动物模型的方法，开发一种相对现有技术操作简捷、成功率高、损伤小且成本低廉、易广泛推广的动物气管内给药方法，此方法可建立与人类肺纤维化疾病高度相似的稳定疾病模型，在肺纤维化疾病的病因学、病理学、药物筛选、临床诊断和治疗等研究中具有重要的实际应用价值。

本发明专利提出了一种微创制作肺纤维化动物模型的方法，包括以下步骤：（1）动物麻醉；（2）气管插管；（3） 药物灌注。

在本发明专利一个较佳实施例中，所述气管插管装置为12号灌胃针，长度为10cm，灌胃针头端约弯曲15°。

在本发明专利一个较佳实施例中，步骤（3）所述灌注药物为博莱霉素，且博莱霉素剂量为3.0 mg/kg、5.0 mg/kg、7.0 mg/kg。

在本发明专利一个较佳实施例中，所述动物为各种种系和性别的实验大鼠，大鼠体重为200~250 g。

本发明专利的优势是：本发明专利采用微创气管内灌注药物（如博莱霉素）构建肺纤维化动物模型，该方法制作过程简便快速，减少气管切开等对动物造成的外源性损伤，成功率高，无/低死亡率，可广泛推广，在肺纤维化疾病的病因学、病理学、药物筛选、临床诊断和治疗等研究中具有重要的实际应用价值。

附图说明

图1为本发明专利中动物气管插管及实验操作示意图（以大鼠为例）。如图所示药物灌注时大鼠体位为斜侧卧位，使大鼠一侧肺位于斜上方，另一侧肺位于斜下方。本发明专利中气管插管装置从口腔经声门插入气管内并到达右肺下叶次级支气管分叉处。图中1所示为所用气管插管装置（以12号灌胃针为例），2所示为气管插管装置顶端到达右肺下叶次级支气管分叉处。

图2为无菌生理盐水和不同剂量的博莱霉素分别灌注大鼠肺后第七日全肺的肺系数对比图（肺系数=肺质量（mg）/体质量（g））。其中NS为无菌生理盐水灌注大鼠肺后第七日大鼠全肺的肺系数，3、5、7为分别使用3 mg/kg、5 mg/kg、7 mg/kg博莱霉素通过多点给药方式诱导大鼠肺纤维化后第七日全肺的肺系数。*表示差异具有统计学意义（P<0.05），**表示差异具有显著统计学意义（P<0.01）。

图3为无菌生理盐水和不同剂量的博莱霉素分别灌注大鼠肺后第七日肺的苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining，简称HE染色法）对比图（100倍）。其中A是用无菌生理盐水灌注大鼠肺后第七日右肺的HE染色图，B、C、D为分别使用3 mg/kg、5 mg/kg、7mg/kg博莱霉素通过多点给药方式诱导大鼠肺纤维化后第七日右肺的HE染色图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明专利的技术方案作进一步详细地说明，所描述的实施例仅是本发明专利的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 建立动物模型的方法

以无特定病原体动物级（Specific Pathogen Free，SPF）Sprague-Dawley雄性大鼠为例，提供一种微创制作肺纤维化动物模型的方法，包括以下步骤：

大鼠全身麻醉，如：用舒泰50麻醉剂肌肉注射麻醉动物。

（1）首先对大鼠进行体重称量，肌肉注射65 mg/kg舒泰50麻醉剂麻醉大鼠，15~20分钟后，大鼠达到Ⅲ期麻醉，此时会厌的保护性关闭反射消失，肌肉出现松弛。

（2）将麻醉后的大鼠以仰卧位保定于呈30~60°倾斜角的操作台上，大鼠上门牙钩挂固定于一半环状金属丝上，在颈下放置一直径约为1.5 cm的圆筒状垫枕，使胸部、颈部与下颌成一条直线。用双手保定住大鼠身体，操作者右手持镊子，轻微夹着大鼠舌头向外上方拉开，使大鼠口腔小幅度张开，左手持12号灌胃针，弯曲端朝上，向上轻压舌尖，沿着舌根部方向，灌胃针顶端紧贴上颚一直向前，插管时要将灌胃针尽量向上腭部方向轻挑，以防插入食道。灌胃针通过声门进入气管时会有轻微的阻力突破感，并在经过大鼠气管环状软骨时有间歇停顿的轻微阻塞感；当灌胃针到达气管和支气管分叉处时，由于大鼠气管、右肺主支气管与右肺下叶次级支气管成一条直线，将灌胃针稍微靠向右肺主支气管继续插入遇阻力时停止，灌胃针即可顺利进入大鼠右肺下叶次级支气管分叉处。

（3）根据气管给药时气管插管停留在右肺的深度，药物灌注有三种方式。

多点给药方式一：如上所述，当灌胃针通过气管和支气管分叉处后继续插入直至遇阻力后停止，助手将大鼠水平翻转一定角度，使右肺位于斜下方，左肺位于斜上方，此时操作者通过灌胃针缓慢注入药液，与此同时，缓慢退回灌胃针，然后助手解除动物保定，保持斜侧卧位姿势轻微抖动动物，使大部分药液均匀分布在右肺各个肺叶中（利用体位及重力作用，使药物充分能够达到右肺各细支气管内），最后将动物以原侧卧位姿势放回笼内待其自然苏醒后正常饲养。

多点给药方式二：如上所述，当灌胃针通过气管和支气管分叉处后即停止继续插入，助手将大鼠水平翻转一定角度，使右肺位于斜下方，左肺位于斜上方，此时操作者通过灌胃针缓慢注入药液，然后助手解除动物保定，保持斜侧卧位姿势轻微抖动动物，使大部分药液均匀分布在右肺各个肺叶中，最后将动物以原侧卧位姿势放回笼内待其自然苏醒后正常饲养。

定点给药方式：助手将大鼠水平翻转一定角度，使右肺位于斜下方，左肺位于斜上方，此时操作者通过气管缓慢注入药液，然后助手解除动物保定，保持斜侧卧位姿势轻微抖动动物，使大部分药液均匀分布在右肺下叶中，最后将动物以原侧卧位姿势放回笼内待其自然苏醒后正常饲养。

实施例2 建立动物模型的结果评定

（1）肺系数测定

上述处理过的大鼠在标准条件下饲养七日后，称取体重后过量麻醉处死大鼠，取下大鼠两侧肺组织，然后仔细去除肺组织周围结缔组织，经生理盐水洗涤后用滤纸吸干，电子天平称取全肺湿重。根据公式计算肺系数，肺系数=肺质量（mg）/体质量（g），结果显示：博莱霉素灌注后第七日的肺系数均高于生理盐水灌注后第七日的肺系数，差异具有统计学意义（P<0.05）；且随着博莱霉素剂量的增大，大鼠肺系数逐渐升高，提示肺实变逐渐加重，如图2。

（2）病理切片鉴定

如上所述，取出大鼠两侧肺组织，并去除周围的结缔组织后用4%的多聚甲醛固定右肺组织用于制作病理切片，用HE染色，结果显示：生理盐水灌注后第七日的右肺肺泡形态正常，肺泡壁纤细，间质中有极少量的炎症细胞浸润，如图3A；博莱霉素灌注后第七日的右肺都有不同程度的实变，实变区肺泡壁增厚，间隔断裂，融合形成肺大泡，间质有较多的炎症细胞浸润和纤维样组织形成，实变的程度出现随灌注博莱霉素剂量的增大而加重的趋势，其中7 mg/kg博莱霉素灌注后第七日的右肺可见大片的实变，实变区有大量的炎症细胞浸润，大量肺泡结构消失，如图3B-D，提示动物肺组织有不同程度的炎症发生和纤维形成。

以上所述仅为本发明专利的实施例，并非因此限制本发明专利的专利范围，凡是利用本发明专利说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明专利的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种微创制作肺纤维化动物模型的方法，其特征为：动物麻醉，气管插管，药物灌注。

2.根据权利要求1所述的微创制作肺纤维化动物模型的方法，其特征在于：气管插管的操作和步骤。

3.根据权利要求1所述的微创制作肺纤维化动物模型的方法，其特征在于：药物灌注的操作和步骤。

4.根据权利要求1-2所述的微创制作肺纤维化动物模型的方法，其特征在于：气管插管装置具有合适的长度、直径和弯度，能够经口腔插入声门达到各种动物一侧支气管；且用于气管插管的装置不仅限于大小合适的灌胃针，也适用于其它长度、直径和弯度合适的气管导管等其它装置。

5.根据权利要求1-3所述的用于微创制作肺纤维化动物模型的方法，其特征在于：引起动物肺纤维化的药物，包括但不仅限于博莱霉素（Bleomycin），也适用于其它能够引起动物肺纤维化的药物。

6.根据权利要求1-5任一所述的微创制作肺纤维化动物模型的方法，其特征在于：所述动物不仅限于各种种系和性别的实验大鼠、也适用于各种种系和性别的实验小鼠等其它动物。