CN109331187A - 间充质干细胞制剂致敏性的评价方法和应用 - Google Patents

间充质干细胞制剂致敏性的评价方法和应用 Download PDF

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CN109331187A CN201811506318.1A CN201811506318A CN109331187A CN 109331187 A CN109331187 A CN 109331187A CN 201811506318 A CN201811506318 A CN 201811506318A CN 109331187 A CN109331187 A CN 109331187A
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徐永胜
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杨莹
李伟
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Abstract

本发明提供了一种间充质干细胞制剂致敏性的评价方法和应用，涉及生物技术领域。该间充质干细胞制剂致敏性的评价方法包括使用所述间充质干细胞制剂免疫动物，免疫动物分为低剂量组和高剂量组；然后按照免疫后的动物的症状将所述间充质干细胞制剂的致敏性划分为预设的等级；该方法还提供了低剂量和高剂量下的合理的药物用量，避免了由于给药量不合理导致的评价结果不准确的问题，缓解了现有技术中缺乏一种有效地对间充质干细胞制剂的致敏性的评价方法。

Description

间充质干细胞制剂致敏性的评价方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种间充质干细胞制剂致敏性的评价方法和应用。
背景技术
间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、神经、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
美国临床试验数据库ClinicalTrials数据显示，目前与间充质干细胞相关的临床试验已涉及300多种疾病，单是在美国开展的与间充质干细胞相关的临床试验就达到了650多件，主要的疾病包括骨损伤、神经退行性疾病、糖尿病、心肌缺血、重症肌无力和肝损伤等。
干细胞制剂制备所用的培养基成分除了要遵循《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》所制定的“应有足够的纯度并符合无菌、无致病微生物及内毒素的质量标准，残留的培养基对受者应无不良影响”的标准外，还要保证其“干性”、增殖及分化能力。但是干细胞作为特殊的药物，在临床前的安全性评价，特别是致敏性方面的评价缺乏评价指标和相应的技术手段。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种间充质干细胞制剂致敏性的评价方法，缓解了现有技术中缺乏一种有效地对间充质干细胞制剂的致敏性的评价方法。
本发明的第二目的在于提供间充质干细胞制剂致敏性的评价方法在制备包含间充质干细胞的药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
本发明提供了一种间充质干细胞制剂致敏性的评价方法，包括使用所述间充质干细胞制剂免疫动物，然后按照免疫后的动物的症状将所述间充质干细胞制剂的致敏性划分为预设的等级；
所述经间充质干细胞制剂免疫的动物包括低剂量组和高剂量组；所述间充质干细胞制剂免疫动物包括诱导阶段和激发阶段；
所述低剂量组在致敏阶段和激发阶段的给药剂量分别独立的为所述动物的等效临床给药剂量的0.2～0.3倍，给药浓度为所述动物的等效临床给药浓度的0.8～1.2倍；
所述高剂量组在致敏阶段的给药剂量为所述动物的等效临床给药剂量的0.8～1.2倍，给药浓度为所述动物的等效临床给药浓度的4～4.5倍；
所述高剂量组在激发阶段的给药剂量为所述动物的等效临床给药剂量的0.8～1.2倍，给药浓度为所述动物的等效临床给药浓度的3～3.5倍。
优选地，所述预设的等级包括过敏反应阴性、过敏反应弱阳性、过敏反应阳性、过敏反应强阳性和过敏反应极强阳性；
其中，所述过敏反应阴性为所述动物无不良症状；
所述过敏反应弱阳性包括如下症状：不安宁、竖毛、发抖和搔鼻中的一种或多种；
所述过敏反应阳性包括如下症状：喷嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、排粪、流泪中的一种或多种；
所述过敏反应强阳性包括如下症状：呼吸困难、哮鸣音、紫癜、步态不稳、跳跃、喘息、痉挛、旋转和潮式呼吸中的一种或多种；
所述过敏反应极强阳性包括如下症状：死亡。
优选地，所述评价方法还包括设置阴性对照组和阳性对照组。
优选地，所述动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、小型猪、猴、雪貂、土拨鼠和裸鼹鼠中的一种或者多种；
优选地，所述动物包括小鼠、大鼠和豚鼠中的一种或者多种。
优选地，所述人间充质干细胞制剂免疫的动物为豚鼠。
优选地，所述低剂量组在致敏阶段和激发阶段的给药剂量分别独立的为1×106～2×106cells/kg；给药浓度分别独立的为6×105～7×105cells/mL；
优选地，所述低剂量组在致敏阶段和激发阶段的给药剂量分别独立的为1.3×106cells/kg，给药浓度分别独立的为6.5×105cells/mL。
优选地，所述高剂量组在致敏阶段和激发阶段的给药剂量分别独立的为4.5×106～5.5×106cells/kg；给药浓度分别独立的为1.5×106～3×106cells/mL；
优选地，所述高剂量组在致敏阶段的给药剂量为5.2×106，给药浓度为2.6×106；
优选地，所述高剂量组在激发阶段的给药剂量为5.2×106，给药浓度为2×106。
优选地，设置阴性对照组和阳性对照组；所述阴性对照组包括经生理盐水免疫的豚鼠；所述阳性对照组包括经卵清白蛋白溶液免疫的豚鼠；
优选地，致敏阶段腹腔给药，激发阶段静脉给药；
优选地，自腹腔给药致敏3次，隔日一次；末次致敏后第14天和21天，分别于豚鼠静脉给药，对每组半数数量的动物进行激发。
本发明还提供了上述间充质干细胞制剂致敏性的评价方法在制备包含间充质干细胞的药物中的应用；
优选地，所述药物包括人脐带间充质干细胞。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
发明提供了一种间充质干细胞制剂致敏性的评价方法，一方面该方法使用两种免疫剂量的间充质干细胞制剂分别免疫动物，以降低单一剂量免疫动物造成的由于剂量不合适而结果不准确的风险，同时还可以得出间充质干细胞制剂的致敏性与剂量的关系；另一方面，本发明提供了低剂量和高剂量下的合理的药物用量，避免了由于给药量不合理导致的评价结果不准确的问题。该评价方法能够提供间充质干细胞制剂的安全性资料，为临床安全用药提供参考。基于上述发明构思，本发明还提供了间充质干细胞制剂致敏性的评价方法在制备包含间充质干细胞的药物中的应用，以协助间充质干细胞作为活性成分或者辅助成分的药物的开发。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份指的是相对于组合物的重量百分数或重量份。
本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“6～22”表示本文中已经全部列出了“6～22”之间的全部实数，“6～22”只是这些数值组合的缩略表示。
本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。
本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。
本发明提供了一种间充质干细胞制剂致敏性的评价方法，该方法包括使用所述间充质干细胞制剂免疫动物，然后按照免疫后的动物的症状将所述间充质干细胞制剂的致敏性划分为预设的等级；所述经间充质干细胞制剂免疫的动物包括低剂量组和高剂量组；所述间充质干细胞制剂免疫动物包括诱导阶段和激发阶段。
其中，所述低剂量组在致敏阶段和激发阶段的给药剂量分别独立的为临床给药剂量的0.2～0.3倍，例如可以为但不限于为0.21倍、0.22倍、0.25倍、0.27倍、0.28倍或0.3倍；给药浓度为临床给药浓度的0.8～1.2倍；例如可以为但不限于为0.8倍、0.9倍、1倍、1.1倍或1.2倍。
所述高剂量组在致敏阶段的给药剂量为临床给药剂量的0.8～1.2倍，例如可以为但不限于为0.8倍、0.9倍、1倍、1.1倍或1.2倍；给药浓度为临床给药浓度的4～4.5倍，例如可以为但不限于为4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍或4.5倍。
所述高剂量组在激发阶段的给药剂量为临床给药剂量的0.8～1.2倍，例如可以为但不限于为0.8倍、0.9倍、1倍、1.1倍或1.2倍；给药浓度为临床给药浓度的3～3.5倍，例如可以为但不限于为3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍。
间充质干细胞是一种多能干细胞，具有自我更新和多向分化能力，促进骨、软骨、韧带、肌肉和脂肪组织等间质组织再生。因间充质干细胞来源丰富、制备简单、多能性和低致瘤性具有很大的临床利用价值。本发明提供了一种间充质干细胞制剂致敏性的评价方法，一方面该方法使用两种免疫剂量的间充质干细胞制剂分别免疫动物，以降低单一剂量免疫动物造成的由于剂量不合适而结果不准确的风险，同时还可以得出间充质干细胞制剂的致敏性与剂量的关系；另一方面，本发明提供了低剂量和高剂量下的合理的药物用量，避免了由于给药量不合理导致的评价结果不准确的问题。该评价方法能够提供间充质干细胞制剂的安全性资料，为临床安全用药提供参考。
其中，所述动物的等效临床给药剂量是指待评价的间充质干细胞制剂在人的临床治疗时的给药剂量折算成所述动物的给药剂量后的剂量；同理，所述动物的等效临床给药浓度指的是待评价的间充质干细胞制剂在人的临床治疗时的给药浓度折算成所述动物的给药浓度。以豚鼠为例，预设间充质干细胞制剂用于人时的临床给药剂量为1×106cells/kg，以人60kg(1.6246m2)、豚鼠350g(0.0487m2)计，豚鼠等效剂量为5.14×106cells/kg，则低剂量组在致敏阶段和激发阶段的给药剂量分别独立的为5.14×106cells/kg的0.2～0.3倍；高剂量组在致敏阶段的给药剂量为5.14×106cells/kg的0.8～1.2倍；所述动物的等效临床给药浓度同理。
需要说明的是，本发明所述的间充质干细胞制剂指的是包含人间充质干细胞的试剂、药物或者间充质干细胞本身；发明所述的给药剂量，是以间充质干细胞制剂中起到活性成分的间充质干细胞的数量计算的。所述间充质干细胞分离自例如可以为但不限于为骨髓、骨膜、血管、脂肪、肌肉、外周循环、脐带血、皮肤或牙体组织等；所述间充质干细胞例如可以为但不限于为实验室分离得到的细胞或者市售细胞系；所述间充质干细胞的来源例如可以为但不限于为人或者其他可分离到间充质干细胞的动物；所述间充质干细胞例如可以为但不限于为通过本领域可接受的手段得到的经诱变、突变或者经基因工程的改造得到的间充质干细胞。可以理解的是，本发明的目的是评价间充质干细胞制剂的致敏性，因此对间充质干细胞的来源不做限制；可以理解的是，本发明所述的间充质干细胞制剂除去作为活性成分的间充质干细胞还可以包含任意的辅料，例如可以为但不限于为溶剂、保护剂或其他活性成分。在一些优选的实施方式中，所述预设的等级包括过敏反应阴性、过敏反应弱阳性、过敏反应阳性、过敏反应强阳性或过敏反应极强阳性；其中，所述过敏反应阴性为所述动物无不良症状；所述过敏反应弱阳性包括如下症状：不安宁、竖毛、发抖和搔鼻中的一种或多种；所述过敏反应阳性包括如下症状：喷嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、排粪、流泪中的一种或多种；所述过敏反应强阳性包括如下症状：呼吸困难、哮鸣音、紫癜、步态不稳、跳跃、喘息、痉挛、旋转和潮式呼吸中的一种或多种；所述过敏反应极强阳性包括如下症状：死亡。该实施方式中根据经间充质干细胞制剂免疫的动物出现的症状将免疫程度划分为不同的等级，以评价间充质干细胞制剂的致敏性，该方法只需按照不同的过敏反应等级中分别对应的症状划分间充质干细胞制剂的致敏性即可。在一些优选的实施方式中，所述评价方法还包括设置阴性对照组和阳性对照组进行方法学验证，从而进一步减小评价误差。
在一些可选的实施方式中，所述动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、小型猪、猴、雪貂、土拨鼠和裸鼹鼠中的一种或者多种；优选使用小鼠、大鼠和豚鼠中的一种或者多种，更优选使用豚鼠。
在一些优选的实施方式中，人间充质干细胞制剂免疫的动物为豚鼠，按照如下剂量给药，间充质干细胞制剂致敏性的评价效果更优：
低剂量组在致敏阶段和激发阶段的给药剂量分别独立的为1×106～2×106cells/kg，例如可以为但不限于为1×106cells/kg、1.2×106cells/kg、1.3×106cells/kg、1.5×106cells/kg、1.8×106cells/kg或2×106cells/kg；给药浓度分别独立的为6×105～7×105cells/mL，例如可以为但不限于为6×105cells/mL、6.2×105cells/mL、6.5×105cells/mL、6.7×105cells/mL或7×105cells/mL；通过优化和调整给药剂量，可以进一步优化间充质干细胞制剂致敏性的评价效果；更优选地，所述低剂量组在致敏阶段和激发阶段的给药剂量分别独立的为1.3×106cells/kg，给药浓度分别独立的为6.5×105cells/mL。
高剂量组在致敏阶段和激发阶段的给药剂量分别独立的为4.5×106～5.5×106cells/kg，例如可以为但不限于为4.5×106cells/kg、4.8×106cells/kg、5×106cells/kg、5.2×106cells/kg或5.5×106cells/kg；给药浓度分别独立的为1.5×106～3×106cells/mL，例如可以为但不限于为1.5×106cells/mL、1.8×106cells/mL、2×106cells/mL、2.2×106cells/mL、2.5×106cells/mL、2.8×106cells/mL或3×106cells/mL；通过优化和调整给药剂量，可以进一步优化间充质干细胞制剂致敏性的评价效果；更优选地，所述高剂量组在致敏阶段的给药剂量为5.2×106，给药浓度为2.6×106；更优选地，所述高剂量组在激发阶段的给药剂量为5.2×106，给药浓度为2×106。
在一些优选的实施方式中，设置阴性对照组和阳性对照组；所述阴性对照组包括经生理盐水免疫的豚鼠，优选使用0.9％的氯化钠注射液免疫豚鼠；所述阳性对照组包括经卵清白蛋白溶液免疫的豚鼠，优选使用1％卵清白蛋白溶液免疫豚鼠。
在一些可选的实施方式中，给药方式包括灌胃给药、腹腔给药、皮下给药、肌肉给药或静脉给药。在一些优选的实施方式中，按照致敏阶段腹腔给药，激发阶段静脉给药的方式使间充质干细胞制剂致敏性的评价效果更优。在一些优选的实施方式中，按照如下给药周期给药效果更佳：自腹腔给药致敏3次，隔日一次；末次致敏后第14天和21天，分别于豚鼠静脉给药，对每组半数数量的动物进行激发。
本发明还提供了上述间充质干细胞制剂致敏性的评价方法在制备包含间充质干细胞的药物中的应用，以协助以间充质干细胞作为活性成分或者辅助成分的药物的开发。在一些优选的实施方式中，所述药物包括人脐带间充质干细胞，人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells，hUC-MSCs)可分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经元和内皮细胞。人脐带间充质干细胞来源广泛、取材方便、成本低廉，具有高的可塑性和分化潜能，因此人脐带间充质干细胞在制备药物的应用中越加广泛，使用上述间充质干细胞制剂致敏性的评价方法可为人脐带间充质干细胞在制备药物的研究中提供安全性资料，为临床安全用药提供参考。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果：
实施例
本实施例提供了一种间充质干细胞制剂致敏性的评价方法，评价如下两种试剂的致敏性：
人脐带间充质干细胞制剂，主要由如下组分组成：人脐带间充质干细胞、人血清白蛋白和生理盐水；
无人源蛋白脐带间充质干细胞制剂，主要由如下组分组成：人脐带间充质干细胞和生理盐水。
实验设计：
(1)组别设置：
本实施例使用的间充质干细胞制剂包括人脐带间充质干细胞制剂和无人源蛋白脐带间充质干细胞制剂，实验设置5个组，包括：低剂量组：使用低剂量人脐带间充质干细胞制剂免疫动物；高剂量组：使用高剂量人脐带间充质干细胞制剂免疫动物；无蛋白对照组：使用无人源蛋白脐带间充质干细胞制剂免疫动物；阴性对照组：使用0.9％氯化钠注射液免疫动物；阳性对照组：使用1％卵清白蛋白溶液免疫动物；具体剂量如表1和表2所示，每组豚鼠8只，雌雄各半。
(2)计量设计及依据：脐带间充质干细胞(MSCs)具有多向分化功能，可分化为多种细胞，临床输注剂量为1×106cells/kg，以人60kg(1.6246m2)、豚鼠350g(0.0487m2)计，豚鼠的等效临床给药剂量为5.14×106cells/kg，等效临床给药浓度为6×105cells/mL，
致敏剂量如下，汇总如表1所示：
低剂量组：给药剂量1.3×106cells/kg，给药体积2mL/kg，药物浓度6.5×105cells/mL。
高剂量组：给药剂量5.2×106cells/kg，给药体积2mL/kg，药物浓度2.6×106cells/mL。
无蛋白对照组：给药剂量5.2×106cells/kg，给药体积2mL/kg，药物浓度2.6×106cells/mL。采用无人源蛋白脐带间充质干细胞制剂，与高剂量组等剂量、等体积、等浓度给药。
阴性对照组：给予等体积的0.9％氯化钠注射液。
阳性对照组：给予等体积的1％卵清白蛋白溶液。
表1间充质干细胞制剂致敏阶段免疫豚鼠的给药情况汇总
备注：*阳性对照组给药剂量单位为mg/kg，药物浓度单位为mg/mL。
激发剂量如下，汇总如表2所示：
高剂量组：给药剂量5.2×106cells/kg，给药体积2.6mL/kg，药物浓度2×106cells/mL。
无蛋白对照组：给药剂量5.2×106cells/kg，给药体积2.6mL/kg，药物浓度2×106cells/mL，采用无人源蛋白脐带间充质干细胞制剂，与高剂量组等剂量、等体积、等浓度给药。
阴性对照组、阳性对照组和低剂量组与致敏给药采用相同的给药剂量、给药体积和药物浓度进行激发给药。
表2间充质干细胞制剂激发阶段免疫豚鼠的给药情况汇总
备注：*阳性对照组给药剂量单位为mg/kg，药物浓度单位为mg/mL。
本实施例以阴性对照组和阳性对照组进行方法学验证。
低剂量组在致敏阶段和激发阶段的给药剂量分别独立的为豚鼠等效临床给药剂量的0.25倍，给药浓度为豚鼠等效临床给药浓度的1.01倍；所述高剂量组在致敏阶段的给药剂量为豚鼠等效临床给药剂量的1.08倍，给药浓度为豚鼠等效临床给药浓度的4.33倍；所述高剂量组在激发阶段的给药剂量为豚鼠等效临床给药剂量的1.08倍，给药浓度为豚鼠等效临床给药浓度的3.33倍。上述剂量能够满足对临床用药剂量和用药浓度的安全性检测要求。
无蛋白对照组采用与高剂量组等给药剂量、等药物浓度，但无人源蛋白的人脐带间充质干细胞制剂给药，检测人源蛋白(对豚鼠为异源蛋白质)对实验结果的影响。综合以上情况，本试验设计能够满足检测供试品对豚鼠的主动致敏作用的要求。
(3)给药途径：致敏阶段腹腔注射给药，激发阶段静脉注射给药。
(4)给药周期：自腹腔给药致敏3次，隔日一次；末次致敏后第14天和21天，分别于豚鼠静脉给药，对每组半数数量的动物进行激发。
试验方法：
(1)实验动物：
动物接收与检验：实验动物由实验人员、动物保障部门人员和兽医共同接收。接收时查看动物供应单位提供的动物合格证明，并确认合格证内容与申请购买的动物种属、级别、数量和性别一致。经动物接收室将动物传入检疫室内，在检疫室打开动物外包装，核对动物各性别数量与动物合格证所载事项一致。然后逐一对动物进行检查，包括检查性别、体重、头部、躯干、尾部、四肢、皮毛、精神和活动等，并用标记笔在豚鼠耳朵标记检疫号。将检疫后动物放入动物饲养笼中，每笼3～4只，雌雄分养，在笼具上悬挂标签，放在检疫间中进行适应期饲养。
动物适应期观察：动物共适应性饲养6天，适应期第1、6天分别对动物进行全面检查并称重，其它时间每天观察1次，适应期间动物未见异常。
动物分组与标示：适应期结束后，挑选状态良好、体重接近的豚鼠40只(雌雄各半)进入正式实验。将40只动物按区组随机法分为5组，每组8只，雌雄各半。按性别分笼饲养，每笼4只。用苦味酸染色对动物进行编号标记，并在饲养笼悬挂标签标记，搬入饲养观察室进行饲养。
(2)供试品
供试品准备：阴性对照组直接取用市购0.9％氯化钠注射液，无需配制；1％卵清白蛋白溶液的配制：称取1g卵清白蛋白，研磨后用0.9％氯化钠注射液稀释为100mL的溶液。配制过程在超净工作台内完成，2～8℃保存，有效期10天；低、高剂量组和无蛋白对照组所需的脐带间充质干细胞和无人源蛋白脐带间充质干细胞制剂即送达即给药。
给药：供试品人脐带间充质干细胞制剂和无人源蛋白脐带间充质干细胞制剂在运输、接收、给药过程中需使用冰袋进行低温保存。给药前需充分混匀药液，使细胞分布均匀，以免造成细胞聚集和血管堵塞。由于本供试品为细胞悬液，因此给药时需适当控制速度，以避免给药过快导致动物死亡而影响实验结果的判定。
供试品废气处理：本供试品为具有生物活性的生物制品，给药后剩余药液高压灭活后作为医疗废弃物统一处理。
(4)检查指标
(ⅰ)致敏期间，每日观察并记录每只动物的反应。
(ⅱ)激发后观察每只豚鼠在药后30min内出现的症状，记录症状出现及消失时间，最常观察3小时，根据表3和表4判断反应程度确定供试品的过敏反应强弱。因给药组激发后发现过敏反应症状，取阴性对照组豚鼠2只，自静脉注射激发剂量供试品，观察是否有类似过敏反应症状，以供结果判断时参考。
(ⅲ)于首、末次致敏和激发当日分别测定每只豚鼠的体重，计算各组动物体重的平均值和标准差(雌雄合并统计)，采用t-test进行组间检验，以P<0.05为统计有显著性差异，观察药物对动物体重的影响。
表3豚鼠过敏反应症状
0正常 7呼吸急促 14步态不稳
1不安宁 8排尿 15跳跃
2竖毛 9排粪 16喘息
3发抖 10流泪 17痉挛
4搔鼻 11呼吸困难 18旋转
5喷嚏 12哮鸣音 19潮式呼吸
6咳嗽 13紫癜 20死亡
表4豚鼠全身致敏性评价标准
症状 级别 结果判定
0 - 过敏反应阴性
1～4症状 + 过敏反应弱阳性
5～10症状 ++ 过敏反应阳性
11～19症状 +++ 过敏反应强阳性
20 ++++ 过敏反应极强阳性
(5)试验结果：
(ⅰ)致敏期间，各组动物未见明显异常。
(ⅱ)本实施例豚鼠经致敏给药3次后，于末次致敏后14天和21天分别对1/2动物(4只)进行激发，激发结果如下：
末次致敏后14天第一次激发：阳性对照组4只豚鼠激发给药后立即出现不安宁、搔鼻、呼吸急促、排尿、紫癜、步态不稳、跳跃、喘息、痉挛、潮式呼吸症状，药后4分钟内所有动物均死亡，呈极强阳性过敏反应。高剂量组4只豚鼠激发给药后见搔鼻、紫癜、咳嗽、呼吸急促、俯卧，30～44分钟恢复正常，呈强阳性过敏反应。低剂量组3只豚鼠出现搔鼻、紫癜、俯卧，19～25分钟恢复正常，呈强阳性过敏反应；1只豚鼠未见明显异常。阴性对照组和无蛋白对照组激发给药后未见明显过敏反应。具体发生情况见下表5。
表5：末次致敏后14天第一次激发豚鼠主动过敏反应情况
末次致敏后21天第二次激发：阳性对照组4只豚鼠激发给药后立即出现不安宁、搔鼻、呼吸急促、排尿、呼吸困难、紫癜、步态不稳、跳跃、痉挛、旋转、潮式呼吸症状，药后5分钟内所有动物均死亡，呈极强阳性过敏反应。高剂量组1只豚鼠于激发给药后见搔鼻、紫癜、呼吸困难、痉挛、潮式呼吸，4分钟内死亡，呈极强阳性过敏反应；其余3只豚鼠未见明显异常。低剂量组1只豚鼠激发给药后出现喷嚏、搔鼻、紫癜、步态不稳、跳跃、痉挛、潮式呼吸，5分钟内死亡，呈极强阳性过敏反应；1只豚鼠激发给药后出现喷嚏、搔鼻、咳嗽、哮鸣音、排尿、紫癜、俯卧，30分钟后恢复正常，呈强阳性过敏反应；其余2只豚鼠未见明显异常。阴性对照、无蛋白对照组激发给药后未见明显过敏反应，具体发生情况见下表6。
表6：末次致敏后21天第二次激发豚鼠主动过敏反应情况
致敏作用分析：由以上结果可知，本供试品脐带间充质干细胞完整制剂对豚鼠有明显主动致敏作用，但其不含人源蛋白样的脐带间充质干细胞制剂则对豚鼠无致敏作用发生，因此可以确认本供试品的致敏源为人源蛋白质，脐带间充质干细胞本身对豚鼠无主动致敏作用。因人源蛋白质对豚鼠为异源蛋白质，其对豚鼠的主动致敏作用为种属差异所致。
(ⅲ)各组动物体重增长稳定，各组与阴性对照组间无显著差异(P>0.05)，具体结果见如表7所示。
表7脐带间充质干细胞对豚鼠体重的影响(g)
注：采用组间t检验与阴性对照组比较，各组间无统计学差异。
(6)实验结论：
脐带间充质干细胞制剂在不低于临床给药浓度和给药剂量下对豚鼠有明显致敏作用，但无人源蛋白脐带间充质干细胞制剂对豚鼠无致敏作用发生，因此脐带间充质干细胞对豚鼠的主动过敏作用为人源蛋白所致，干细胞本身对豚鼠无致敏作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞制剂致敏性的评价方法，其特征在于，包括使用所述间充质干细胞制剂免疫动物，然后按照免疫后的动物的症状将所述间充质干细胞制剂的致敏性划分为预设的等级；
所述经间充质干细胞制剂免疫的动物包括低剂量组和高剂量组；所述间充质干细胞制剂免疫动物包括诱导阶段和激发阶段；
其中，所述低剂量组在致敏阶段和激发阶段的给药剂量分别独立的为所述动物的等效临床给药剂量的0.2～0.3倍，给药浓度为所述动物的等效临床给药浓度的0.8～1.2倍；
所述高剂量组在致敏阶段的给药剂量为所述动物的等效临床给药剂量的0.8～1.2倍，给药浓度为所述动物的等效临床给药浓度的4～4.5倍；
所述高剂量组在激发阶段的给药剂量为所述动物的等效临床给药剂量的0.8～1.2倍，给药浓度为所述动物的等效临床给药浓度的3～3.5倍。
2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述预设的等级包括过敏反应阴性、过敏反应弱阳性、过敏反应阳性、过敏反应强阳性和过敏反应极强阳性；
其中，所述过敏反应阴性为所述动物无不良症状；
所述过敏反应弱阳性包括如下症状：不安宁、竖毛、发抖和搔鼻中的一种或多种；
所述过敏反应阳性包括如下症状：喷嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、排粪、流泪中的一种或多种；
所述过敏反应强阳性包括如下症状：呼吸困难、哮鸣音、紫癜、步态不稳、跳跃、喘息、痉挛、旋转和潮式呼吸中的一种或多种；
所述过敏反应极强阳性包括如下症状：死亡。
3.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述评价方法还包括设置阴性对照组和阳性对照组。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的评价方法，其特征在于，所述动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、小型猪、猴、雪貂、土拨鼠和裸鼹鼠中的一种或者多种；
优选地，所述动物包括小鼠、大鼠和豚鼠中的一种或者多种。
5.根据权利要求4所述的评价方法，其特征在于，所述人间充质干细胞制剂免疫的动物为豚鼠。
6.根据权利要求5所述的评价方法，其特征在于，所述低剂量组在致敏阶段和激发阶段的给药剂量分别独立的为1×106～2×106cells/kg；给药浓度分别独立的为6×105～7×105cells/mL；
优选地，所述低剂量组在致敏阶段和激发阶段的给药剂量分别独立的为1.3×106cells/kg，给药浓度分别独立的为6.5×105cells/mL。
7.根据权利要求5所述的评价方法，其特征在于，所述高剂量组在致敏阶段和激发阶段的给药剂量分别独立的为4.5×106～5.5×106cells/kg；给药浓度分别独立的为1.5×106～3×106cells/mL；
优选地，所述高剂量组在致敏阶段的给药剂量为5.2×106，给药浓度为2.6×106；
优选地，所述高剂量组在激发阶段的给药剂量为5.2×106，给药浓度为2×106。
8.根据权利要求5所述的评价方法，其特征在于，设置阴性对照组和阳性对照组；所述阴性对照组包括经生理盐水免疫的豚鼠；所述阳性对照组包括经卵清白蛋白溶液免疫的豚鼠。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的评价方法，其特征在于，致敏阶段腹腔给药，激发阶段静脉给药；
优选地，自腹腔给药致敏3次，隔日一次；末次致敏后第14天和21天，分别于豚鼠静脉给药，对每组半数数量的动物进行激发。
10.权利要求1-9中任一项所述的间充质干细胞制剂致敏性的评价方法在制备包含间充质干细胞的药物中的应用；
优选地，所述药物包括人脐带间充质干细胞。
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