CN104271735A - 含有海藻糖的用于预防肺栓塞形成的哺乳动物细胞悬浮液 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题是提供能够预防在经由血管施予哺乳动物干细胞等哺乳动物细胞时的肺栓塞形成的哺乳动物细胞悬浮液、和预防在经由血管施予哺乳动物细胞时的肺栓塞形成的预防剂。本发明的特征在于将哺乳动物干细胞等哺乳动物细胞悬浮于含有海藻糖或其衍生物或它们的盐作为有效成分的生理性水溶液中，从而制作含有哺乳动物细胞及海藻糖或其衍生物或它们的盐作为有效成分的、用于预防在经由血管施予哺乳动物细胞时的肺栓塞形成的哺乳动物细胞悬浮液。作为所述哺乳动物细胞，除哺乳动物干细胞以外，还可以举出胰岛细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、α·βT细胞、γ·δT细胞、细胞毒性T细胞等，此外，作为上述哺乳动物干细胞，可以合适地举出哺乳动物间充质干细胞或哺乳动物亚全能干细胞。

Description

含有海藻糖的用于预防肺栓塞形成的哺乳动物细胞悬浮液
技术领域
本发明涉及含有哺乳动物细胞及海藻糖或其衍生物或它们的盐的、用于预防在经由血管施予哺乳动物细胞时的肺栓塞形成的哺乳动物细胞悬浮液，还涉及含有海藻糖或其衍生物或它们的盐作为有效成分的、预防在经由血管施予哺乳动物细胞时的肺栓塞形成的预防剂等。
背景技术
近年来，由于干细胞研究的迅速发展，向再生医疗中应用的形势高涨，其知识和理解不仅在研究者中、在普通人中也得到了广泛普及。使用干细胞的再生医疗是以利用干细胞所具有的自复制能力和多分化能力、干细胞分泌的因子来恢复因各种疾病而受到损伤的细胞和组织的功能为目的的医疗。若对白血病、再生不良性贫血等血液疑难病患者进行骨髓移植，则造血干细胞在患者体内成活，有可能在几乎一生内维持造血能力。此外，近来很多研究者以使用除造血干细胞以外的干细胞的临床应用为目标，对中枢神经、末梢神经、骨髓、小肠等中的干细胞进行鉴定，已开始实践针对外伤性疾病和组织变性疾病进行组织干细胞移植治疗(非专利文献1～3)。
认为为了将哺乳动物干细胞效率良好地移植至目标损伤部位(患部)，实现干细胞移植方法(移植途径)的优化是重要的。目前为止，作为干细胞的移植方法，已知主要有4种方法，即，定位性[直接]移植法、髓腔内[脑脊液内]移植法、经静脉移植法以及经动脉移植法。其中，定位性移植法是直接向患部移入干细胞的方法。使用定位性移植法时，虽然侵入性略高，但是由于直接施予至患部，所以成活的供体干细胞多，因此可减少施予的干细胞数。此外，髓腔内移植法是通过脑室穿刺将干细胞移入髓腔内的方法。髓腔内移植法是主要为了用于治疗脑梗塞、脑挫伤、脊髓损伤等脑疾病而正被研究的方法，但在临床应用上仍留有诸多问题，如脑室穿刺潜在导致新的脑损伤的风险等。
经静脉移植法及经动脉移植法是将干细胞等细胞分别移入静脉及动脉内的方法(经由血管施予法)。使用经由血管施予法时，虽然成活的供体干细胞数比使用定位性移植法时要少，但侵入性较低，并且可以使干细胞等细胞、干细胞等细胞分泌的因子在全身循环。目前，作为在临床中进行的经由血管施予法，已知有下述方法：针对脑梗塞疾病以经静脉的方式移植间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells；MSC)的方法；针对脑梗塞疾病以经静脉的方式移植单核细胞的方法；和向I型糖尿病患者以经静脉的方式移植胰岛细胞的方法等。
作为采用经血管施予法移植干细胞等细胞时的风险，已指出经动脉或经静脉施予的细胞在通过肺时成为在肺动脉的毛细血管中堵塞的状态(肺栓塞)，结果导致肺功能、心功能降低(肺栓塞症)，根据情况存在致死的危险性。为了将肺栓塞形成、肺栓塞症防患于未然，在临床的现场中，在用脉搏氧饱和度仪(Pulse oxymeters)监测干细胞施予中的末梢血氧分压的同时进行干细胞的移植。
另一方面，海藻糖(trehalose)为葡萄糖以1,1-糖苷键键合而成的二糖之一。海藻糖呈甜味、且具有高的保水力，因此被用于各种食品、化妆品中。此外，海藻糖具有使细胞膜稳定、抑制细胞损伤的性质，因此被用作移植器官时的器官保护液的有效成分。已研制了ET-Kyoto液和New ET-Kyoto液等含有海藻糖的优异的器官保存液(专利文献1及2，非专利文献4)。但是，将干细胞等细胞悬浮于含有海藻糖的溶液中、经由血管施予细胞悬浮液时，由细胞引起的肺栓塞形成的风险是否降低、肺栓塞症是否能被预防尚不明确。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利第3253131号公报
专利文献2:国际公开第2007/043698号小册子
非专利文献
非专利文献1:Gage,F.H.Science 287:1433-1438(2000)
非专利文献2:Morrison,S.J.et al.,Cell 96:737-749(1999)
非专利文献3:Batle,E.et al.,Cell 111:251-263(2002)
非专利文献4:Chem,F.et al.,Yonsei Med.J.45:1107-1114(2004)
发明内容
本发明的课题在于提供能够预防在经由血管施予哺乳动物干细胞等哺乳动物细胞时的肺栓塞形成的哺乳动物细胞悬浮液、和预防在经由血管施予哺乳动物细胞时的肺栓塞形成预防剂。
本申请的发明人发现，如果将哺乳动物干细胞悬浮于含有海藻糖的溶液中，则哺乳动物干细胞的凝集将被抑制、存活率的降低将被抑制(日本专利申请2010-251273)。作为由干细胞移植引起的肺栓塞形成的原因，认为是干细胞凝集产生的细胞块堵塞了肺动脉的毛细血管，但是，干细胞、例如间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells；MSC)的大小为10～50μm，而与之相对，肺动脉的毛细血管的内径为10μm，MSC比肺动脉的毛细血管内径更大，因此，还可充分地认为单纯地仅通过阻碍细胞凝集无法阻碍由干细胞引起的肺栓塞形成。本申请的发明人发现：将MSC悬浮于含有海藻糖的乳酸林格溶液(Lactated Ringer Solution)中、将含有海藻糖的悬浮有MSC的乳酸林格溶液静脉施予大鼠的情况下，在施予期间或施予后未发现血氧分压降低，此外，MSC群在肺中的集聚与对照组(使用不含海藻糖的乳酸林格溶液或生理盐水作为悬浮液)相比有所减少，本申请的发明人从而完成了本发明。
即，本发明涉及下述哺乳动物细胞悬浮液：(1)含有哺乳动物细胞及海藻糖或其衍生物或它们的盐的、用于预防在经由血管施予哺乳动物细胞时的肺栓塞形成的哺乳动物细胞悬浮液；(2)如上述(1)所述的哺乳动物细胞悬浮液，其中，哺乳动物细胞为哺乳动物干细胞；(3)如上述(2)所述的哺乳动物细胞悬浮液，其中，哺乳动物干细胞为哺乳动物间充质干细胞或哺乳动物亚全能干细胞；(4)如上述(1)～(3)中任一项所述的哺乳动物细胞悬浮液，其中，哺乳动物细胞包括处于单一细胞状态的哺乳动物细胞；(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的哺乳动物细胞悬浮液，其中，海藻糖或其衍生物或它们的盐的浓度在0.1～20％的范围内。
此外，本发明涉及下述预防剂：(6)含有海藻糖或其衍生物或它们的盐作为有效成分，预防在经由血管施予哺乳动物细胞时的肺栓塞形成的预防剂；(7)如上述(6)所述的预防剂，其中，哺乳动物细胞为哺乳动物干细胞；(8)上述(7)所述的预防剂，其中，哺乳动物干细胞为哺乳动物间充质干细胞或哺乳动物亚全能干细胞。
进一步地，本发明涉及下述应用：(9)海藻糖或其衍生物或它们的盐用于制备预防在经由血管施予哺乳动物细胞时的肺栓塞形成的预防剂的应用；(10)如上述(9)所述的应用，其中，哺乳动物细胞为哺乳动物干细胞。
根据本发明，能够减少在经由血管施予哺乳动物干细胞等哺乳动物细胞时的肺栓塞形成的风险，能够降低肺栓塞症的发病风险。
附图说明
[图1]为表示对分别施予了3种MSC悬浮液(悬浮有MSC的生理盐水[…▲…]、悬浮有MSC的乳酸林格溶液[…●…]以及含有海藻糖的悬浮有MSC的乳酸林格溶液[—■—])的大鼠的血氧分压(pO2)进行测定所得的结果的图。纵轴表示血氧分压。需要说明的是，血氧分压以将MSC悬浮液施予前(0分钟)的血氧分压设为1时的相对值的方式表示。此外，横轴表示MSC悬浮液施予开始后的时间。
[图2]为表示对分别施予了3种MSC悬浮液(悬浮有MSC的生理盐水、悬浮有MSC的乳酸林格溶液以及含有海藻糖的悬浮有MSC的乳酸林格溶液)的大鼠(分别为图中的左侧、中间及右侧)的MSC体内分布进行成像(imaging)分析所得的结果的图。
具体实施方式
作为本发明的用于预防在经由血管施予哺乳动物干细胞等哺乳动物细胞时的肺栓塞形成的哺乳动物细胞悬浮液，只要为含有哺乳动物干细胞等哺乳动物细胞及海藻糖或其衍生物或它们的盐(以下，称作海藻糖类)的悬浮液即可，没有特别限定，此外，作为本发明的预防在经由血管施予哺乳动物干细胞等哺乳动物细胞时的肺栓塞形成的预防剂，只要为含有海藻糖类作为有效成分的组合物即可，没有特别限定，作为上述哺乳动物，可以举出小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类，兔等兔形目，猪、牛、山羊、马、绵羊等有蹄目，狗、猫等食肉目，人、猴、猕猴、食蟹猴、狨猴、猩猩(orangutanan)、黑猩猩等灵长类等，其中，可以合适地举出小鼠、猪、人，此外，作为上述哺乳动物细胞，除了在再生医疗等中经由血管施予的哺乳动物干细胞以外，可以举出经静脉施予至I型糖尿病患者的哺乳动物胰岛细胞、经静脉施予至癌症患者的哺乳动物树突状细胞、自然杀伤细胞、α·β(αβ)T细胞、γ·δ(γδ)T细胞、细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte；CTL)等。
此外，上述“干细胞”是指具有自复制能力及分化·增殖能力的未成熟的细胞。干细胞根据分化能力包括亚全能干细胞(pluripotentstem cell)、多能干细胞(multipotent stem cell)、单能干细胞(unipotentstem cell)等亚群。所谓亚全能干细胞，是指虽然其自身不能形成为个体、但具有能分化成构成生物体的所有组织和细胞的能力的细胞。所谓多能干细胞，是指虽不能分化成所有种类的组织和细胞，但具有能分化成多种组织和细胞的能力的细胞。所谓单能干细胞，是指具有能分化成特定的组织和细胞的能力的细胞。
作为亚全能干细胞，可以举出胚胎干细胞(ES细胞)、EG细胞、iPS细胞等。ES细胞可以通过将内部细胞块于饲养细胞(feeder cell)上或含有LIF的培养基中进行培养来制造。ES细胞的制造方法已记载在例如WO96/22362、WO02/101057、US5、843、780、US6、200、806、US6、280、718等中。EG细胞可以通过将原始生殖细胞于含有mSCF、LIF及bFGF的培养基中进行培养来制造(Cell,70:841-847,1992)。iPS细胞可以通过向体细胞(例如成纤维细胞、皮肤细胞等)中导入Oct3/4、Sox2及Klf4(根据需要还可导入c-Myc或n-Myc)等重编程因子(Reprogramming factor)来制造(Cell,126:p.663-676,2006；Nature,448:p.313-317,2007；Nat Biotechno1,26；p,101-106,2008；Cel1 131:p.861‐872,2007；Science,318:p.1917-1920,2007；Cell Stem Cells 1:p.55-70,2007；Nat Biotechnol,25:p.1177-1181,2007；Nature,448:p.318-324,2007；Cell Stem Cells 2:p.10-12,2008；Nature 451:p.141-146,2008；Science,318:p.1917-1920,2007)。此外，通过对移植体细胞的细胞核而制作获得的早期胚进行培养而建立的干细胞也优选用作为亚全能干细胞(Nature,385,810(1997)；Science,280,1256(1998)；Nature Biotechnology,17,456(1999)；Nature,394,369(1998)；Nature Genetics,22,127(1999)；Proc.Nat 1.Acad.Sci.USA,96,14984(1999))，Rideout III等人(Nature Genetics,24,109(2000))。
作为多能干细胞，可以举出能分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等细胞的间充质干细胞，能分化成白细胞、红细胞、血小板等血细胞系细胞的造血干细胞，能分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等细胞的神经干细胞，骨髓干细胞、生殖干细胞等成体干细胞等。多能干细胞优选为间充质干细胞。所谓间充质干细胞，是指能分化成成骨细胞、成软骨细胞及成脂肪细胞中的全部或几种的干细胞。功能性干细胞可以通过本身已知的方法从生物体分离得到。例如，间充质干细胞可以采用已知的一般性方法从哺乳动物的骨髓、脂肪组织、末梢血、脐带血等中采集。例如，可以通过骨髓穿刺后的造血干细胞等的培养、传代来分离人间充质干细胞(Journal ofAutoimmunity,30(2008)163-171)。多能干细胞也可以通过将上述亚全能干细胞于合适的诱导条件下进行培养来获得。
作为本发明的哺乳动物细胞悬浮液中含有的干细胞等细胞，可以举出贴附性的细胞。虽然贴附性的细胞容易在悬浮液中发生凝集，但由于本发明的悬浮液中含有海藻糖类，所以可以有效地抑制该凝集。本说明书中，所谓“贴附性”细胞，是指可通过粘附于支持物上来进行生存、增殖、物质生产的支持物依赖性细胞。作为贴附性干细胞，可以举出亚全能干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、骨髓干细胞、生殖干细胞等。贴附性干细胞优选为间充质干细胞或亚全能干细胞。
哺乳动物细胞可以是从生物体内分离而获得的，也可以是在体外进行传代培养而获得的。此外，本发明的哺乳动物细胞悬浮液中含有的哺乳动物细胞(群)优选是经分离或纯化而获得的。本说明书中，所谓“分离或纯化”，是指施行将除目标成分以外的成分除去的操作。经分离或纯化获得的哺乳动物细胞的纯度(相对于总细胞数而言的、哺乳动物干细胞数等目标细胞的比例)通常为30％以上、优选为50％以上、更优选为70％以上、进一步优选为90％以上(例如100％)。
本发明的悬浮液中含有的哺乳动物细胞(群)优选含有单一细胞(单个细胞，single cell)状态的哺乳动物细胞。本说明书中，所谓“单一细胞状态”，是指未与其他细胞聚集成块(即，未凝集的状态)。单一细胞状态的哺乳动物细胞可以通过用胰蛋白酶/EDTA等对经体外培养的哺乳动物细胞进行酶处理来制备。哺乳动物细胞中含有的单一细胞状态的哺乳动物细胞的比例通常为70％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为99％以上(例如100％)。单一细胞状态的细胞的比例可如下进行确定：将哺乳动物细胞分散于PBS中，于显微镜下对其进行观察，调查随机选择的多个(例如1000个)细胞是否凝集。
本发明的悬浮液中，哺乳动物细胞优选处于游离状态。本说明书中，所谓“游离”，是指细胞以不与容纳悬浮液的容器内壁接触的方式被保持在悬浮液中。
作为本发明中使用的海藻糖类中的海藻糖，除了作为两分子α-葡萄糖以1,1-糖苷键键合而成的二糖类的α,α-海藻糖以外，还可以举出作为α-葡萄糖和β-葡萄糖以1,1-糖苷键键合而成的二糖类的α,β-海藻糖、作为两分子β-葡萄糖以1,1-糖苷键键合而成的二糖类的β,β-海藻糖，其中，优选α,α-海藻糖。上述海藻糖可以通过化学合成、利用微生物的生产、利用酶的生产等任意已知的方法来制造，也可以使用市售品。例如，可以举出α,α-海藻糖(林原商事销售公司制)、α,α-海藻糖(和光纯药公司制)等市售品。
作为本发明中使用的海藻糖类中的海藻糖衍生物，只要为在二糖类的海藻糖上键合有1个或更多个糖单元的糖基海藻糖类即可，没有特别限定，糖基海藻糖类包括葡糖基海藻糖、麦芽糖基海藻糖、麦芽三糖基海藻糖(Maltotriosyltrehalose)等。
作为本发明中使用的海藻糖类中的海藻糖或其衍生物的盐，可以举出例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐、乙酸盐、丙酸盐、甲苯磺酸盐、琥珀酸盐、草酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、乙醇酸盐、甲磺酸盐、丁酸盐、戊酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苹果酸盐等酸加成盐，钠盐、钾盐、钙盐等金属盐，铵盐、烷基铵盐等。需要说明的是，上述盐在使用时制成溶液来使用，其作用优选与使用海藻糖的情况效果相同。上述盐类也可以形成水合物或溶剂合物，此外，可以单独使用任一种或适当地组合使用2种以上。
作为适用于本发明的哺乳动物细胞悬浮液和肺栓塞形成预防剂中的海藻糖类浓度，只要为能够预防由干细胞等细胞引起的肺栓塞形成的浓度即可，可以根据悬浮的细胞数、细胞浓度进行适当选择，优选为足以抑制哺乳动物细胞凝集和存活率降低的浓度。海藻糖类的浓度越高，在除了能预防肺栓塞形成的效果之外、对凝集和存活率降低的抑制效果也越高，但是如果海藻糖类浓度过高，则可能对细胞的存活率产生不利影响。例如，应用于本发明的哺乳动物细胞悬浮液和肺栓塞形成预防剂的海藻糖类浓度通常为0.1％以上、优选为0.5％以上、更优选为1.0％以上，此外，从避免对干细胞的存活率产生不利影响的观点考虑，通常为20％以下、优选为15％以下、更优选为5.0％以下。因此，悬浮液中的海藻糖类的浓度为0.1～20％、优选为0.5～15％、更优选为1.0～5.0％。
本发明中，所谓经由血管施予时的“肺栓塞形成”，是指经动脉或经静脉移植(施予)的哺乳动物细胞形成堵塞肺的末梢动脉系统(例如1条或2条以上的肺动脉的毛细血管)的状态。所谓上述移植的哺乳动物细胞将肺的末梢动脉系统“堵塞的状态”，不一定要细胞停止在肺的末梢动脉系统中，只要妨碍了该处的血流即可。此外，此时的血流不需要完全停止，从广义上来讲只要产生了使肺功能降低的程度的血流降低即可。上述“肺功能”在根本上是指向血中摄入来自空气中的氧，但也包括二氧化碳或其他气体的排出。如果发生由细胞引起的肺栓塞形成，则肺动脉的毛细血管中的血流降低，产生呼吸急促(呼吸数增加)或心动过速(心跳数增加)，肺动脉压等血压上升，或者血氧分压降低。因此，通过预防由细胞移植引起的肺栓塞的形成，可以减小由肺栓塞引起的呼吸急促、心动过速、血压上升、血氧分压降低等的风险。此外，如果由细胞移植而引起肺栓塞形成，则根据情况有可能会导致肺功能降低、心功能(使血液移动至动脉内部的功能和心脏使血液移动至静脉外部的功能等)降低等肺栓塞症发病。进一步地，本发明中的肺栓塞形成也包括形成哺乳动物细胞堵塞肺的外周动脉系统并且堵塞除此以外的血管的状态的情况。
本发明的哺乳动物细胞悬浮液中，哺乳动物细胞通常被悬浮于含有海藻糖类作为有效成分的生理性水溶液中。另一方面，本发明的肺栓塞形成预防剂可大致分为液体型和非液体型。液体型预防剂通常作为其中含有海藻糖类作为有效成分的生理性水溶液的形式构成，如果将哺乳动物细胞悬浮于所述液体型预防剂中，则可以制备本发明的哺乳动物细胞悬浮液。此外，非液体型预防剂通常作为将被添加进悬浮有哺乳动物细胞的生理性水溶液中的粉状等的含有海藻糖类的物质的形式构成，如果将所述非液体型预防剂加入悬浮有哺乳动物细胞的生理性水溶液中，则可以制备本发明的哺乳动物细胞悬浮液。
进而，作为不同于本发明的哺乳动物细胞悬浮液的方案，可以举出在经由血管施予含有哺乳动物细胞及海藻糖类的哺乳动物细胞悬浮液的干细胞等细胞移植中预防肺栓塞形成的方法，此外，作为不同于本发明的肺栓塞形成预防剂的方案，可以举出海藻糖类用于制备预防在经由血管施予哺乳动物细胞时的肺栓塞形成的预防剂的应用。
作为上述生理性水溶液，可以举出例如生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、Tris缓冲生理盐水、HEPES缓冲生理盐水、林格液(乳酸林格液、乙酸林格液、碳酸氢盐林格液等)、5％葡萄糖水溶液、用于哺乳动物培养的液体培养基、等渗剂(葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、乳糖、氯化钠等)的水溶液等等渗水溶液，其中，优选林格液，更优选乳酸林格液、乙酸林格液或碳酸氢盐林格液，进一步优选乳酸林格液。本说明书中“等渗”是指浸透压在250～380mOsm/l的范围内。生理性水溶液可以进一步含有稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、螯合剂(例如，EDTA、EGTA、柠檬酸、水杨酸盐)、助溶剂、保存剂、抗氧化剂等。
可以将葡聚糖类与海藻糖类并用，对于所述葡聚糖类，本申请的发明人已确认了其与海藻糖类同样地具有预防肺栓塞形成的作用。此外，也可以替代海藻糖类或者与海藻糖类联合使用可预期与海藻糖类同样地具有预防肺栓塞形成的作用的麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、阿洛糖、半乳糖、山梨糖醇、木糖醇、糊精、环糊精等。
本发明的细胞悬浮液中含有的干细胞等细胞以游离状态存在，虽然游离状态的细胞通常容易发生凝集，但是通过本发明的由海藻糖类产生的效果，细胞凝集被抑制，可以长时间地维持单一细胞的状态。
哺乳动物细胞向含有海藻糖类的生理性水溶液中的悬浮可以通过吹吸(pipetting)或轻拍(tapping)等该技术领域中的公知方法来实施。本发明的哺乳动物细胞悬浮液的温度通常在0～37℃的范围内、优选在0～25℃的范围内。关于本发明的悬浮液中的哺乳动物细胞的密度，只要为能够预防由干细胞等细胞引起的肺栓塞形成的密度即可，较优选为能够实现抑制由海藻糖类引起的哺乳动物细胞的凝集和存活率降低的效果的密度，通常在103～1010个/ml的范围内。
本发明的哺乳动物细胞悬浮液中，通过海藻糖类抑制了哺乳动物细胞的凝集，因此，通过使用本发明的悬浮液来实施细胞移植，可以减少细胞的凝集物在插管(cannula)中堵塞的风险。此外，就本发明的哺乳动物细胞悬浮液而言，通过海藻糖类，能够抑制悬浮液中的哺乳动物细胞的存活率降低，因此，若使用本发明的悬浮液，则可以利用状态更好的细胞来实施细胞移植，可以预期治疗效果的提高。
关于本发明的哺乳动物细胞悬浮液和肺栓塞形成预防剂，可以通过容纳至合适的灭菌容器内，制成哺乳动物细胞悬浮液制剂和肺栓塞形成的预防制剂。作为上述容器，可以举出瓶、小瓶(vial)、注射器、输液袋等可塑性袋、试管等。上述容器可由玻璃或塑料这样的各种材料形成。此外，在用于哺乳动物细胞悬浮液制剂的容器上，可以以能将容器内的本发明的哺乳动物细胞悬浮液点滴注入至患者的方式连接插管和/或注射针。
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明的技术范围并不限定于这些示例。
实施例1
1.对本发明的干细胞悬浮用溶液能够用于预防由干细胞引起的肺栓塞形成的确认
1-1方法
1-1-1用于静脉施予至大鼠的MSC悬浮液的制备
〔1〕通过胰蛋白酶消化处理来剥离来自Lew/SsN Slc系雌性大鼠脂肪的MSC，然后以200×g离心3分钟，回收细胞。
〔2〕将MSC用Dulbecco磷酸缓冲盐水(D-PBS)(Invitrogen公司制)制备成2×106细胞/ml，然后将1×107细胞(5ml)分别注入3个试管中，分别向其中添加13μl的8.3mg/ml XenoLight DiR荧光试剂(Caliper公司制，产品编号125964)，于37℃下对MSC标记30分钟。
〔3〕以200×g离心3分钟，除去标记溶液，然后加入5ml的D-PBS，再次以200×g离心3分钟，除去上清。将沉淀的细胞分别悬浮于生理盐水(Otsuka Pharmaceutial Factory,Inc.制“大塚生食注”)、乳酸林格溶液(Otsuka Pharmaceutial Factory,Inc.制“Lactec Injection”)以及含有3％(30mg/ml)海藻糖(和光纯药公司制)的乳酸林格溶液中，使MSC浓度为2×106细胞/ml，制作了MSC悬浮生理盐水、MSC悬浮乳酸林格溶液及含有海藻糖的MSC悬浮乳酸林格溶液。
1-1-2MSC悬浮液向大鼠的静脉施予
〔1〕大鼠使用Lew/SsN Slc系、雌性10周龄的大鼠。需要说明的是，在施予MSC悬浮液的24小时前施行了禁食。
〔2〕为了确保向大鼠施予的途径，用固定器固定大鼠，将24G的Surflo留置针插入尾静脉内。
〔3〕将50mg/kg戊巴比妥(共立制药株式会社制)迅速施予至尾静脉内，进行麻醉处理。为了维持麻醉状态，在1小时后补充施予25mg/kg戊巴比妥(共立制药株式会社制)。
〔4〕为了防止血液凝固，经由尾静脉施予途径施予100IU/kg肝素(持田制药株式会社制)。
〔5〕通过切开颈部暴露左颈动脉，插入·固定聚氯乙烯管。
〔6〕使用体温维持装置(将株式会社Neuroscience制直肠温探针插入3.5cm)，将体温保持在37℃。
〔7〕在气管内插管16G的塑料制留置针，留置针的另一端与呼吸机(respirator)连接，设置于人工呼吸管理下(利用空气进行换气，换气量：10ml/kg/次，换气次数：约70程(stroke)/分钟)。
〔8〕为了避免出现自发呼吸，经由尾静脉施予途径施予肌肉松弛药(2或4mg/kg Mioblock静注；MSD株式会社制)。
〔9〕为了对MSC悬浮液施予前的血液气体分压(氧分压[pO2]及二氧化碳分压)(mmHg)进行测定，从颈动脉线(line)采血300μl。
〔10〕将通过上述“1-1-1用于大鼠静脉施予的MSC悬浮液的制备”中所述的方法制作的3种MSC悬浮液(悬浮有MSC的生理盐水、悬浮有MSC的乳酸林格溶液及含有海藻糖的悬浮有MSC的乳酸林格溶液)通过尾静脉分别施予至大鼠，施予进行40分钟。需要说明的是，以将悬浮有MSC的生理盐水、悬浮有MSC的乳酸林格溶液及含有海藻糖的悬浮有MSC的乳酸林格溶液分别静脉施予至大鼠的组，分别作为悬浮有MSC的生理盐水施予组(n＝4)、悬浮有MSC的乳酸林格溶液施予组(n＝4)以及含有海藻糖的悬浮有MSC的乳酸林格溶液施予组(n＝4)。
1-1-3施予了MSC悬浮液的大鼠的血氧分压及MSC成像分析
〔1〕从MSC悬浮液施予起到60分钟后为止，每10分钟从颈动脉系统采血300μl，通过Chiron 348(Siemens公司制)对血液气体分压(氧分压[pO2]及二氧化碳分压)(mmHg)进行测定。
需要说明的是，作为对照，使用在上述“1-1-2MSC悬浮液向大鼠的静脉施予”的工序〔8〕中于施予所制备的MSC悬浮液前采集的血液。
〔2〕从MSC悬浮液施予起经过60钟后，由颈动脉放血，使其安乐死。
〔3〕摘出肺，通过使用IVIS Spectrum(Caliper Lifesciences公司制)的成像分析对荧光及发光强度进行测定(激发波长710nm，吸收波长780nm)。
1-2结果
1-2-1对施予了MSC悬浮液的大鼠的血氧分压分析
作为MSC悬浮液使用生理盐水及乳酸林格溶液的情况下，确认到血氧分压从MSC悬浮液施予开始后降低，明确了至少到施予结束后经过20分钟的时刻(施予后60分钟)为止血氧分压有所降低(图1，表1)。另一方面，作为MSC悬浮液使用含有海藻糖的乳酸林格溶液的情况下，在施予期间(施予开始0～40分钟后)和施予后(施予开始40～60分钟后)的至少20分钟内未观察到血氧分压的降低(图1，表1)。根据上述结果可知，认为在施予(移植)在不含海藻糖的溶液(生理盐水或乳酸林格溶液)中悬浮了MSC而得的制品时发生了肺栓塞形成，而与此相对，认为在施予(移植)在含有海藻糖的乳酸林格溶液中悬浮了MSC而得的制品时，肺栓塞形成得以预防。
表1
表中的血氧分压(pO2)以将于MSC悬浮液施予前采集的血液的血氧分压(0分钟)设为1时的相对值的方式表示。此外，数值表示进行了4次独立实验所得的结果的平均值。
1-2-2对施予了MSC悬浮液的大鼠的MSC成像分析
通过成像分析对大鼠机体中的施予后的MSC体内分布进行了调查，结果明确发现，作为MSC悬浮液使用生理盐水的情况下，来源于肺中的MSC的荧光量最高(图2，表2)。另一方面，作为MSC悬浮液使用含有海藻糖的乳酸林格溶液的情况下，来源于MSC的荧光量最低，并且与使用生理盐水的情况相比，确认到统计学上的显著性差异(Tukey’s test中p<0.05)(图2，表2)。上述结果显示：在施予(移植)在不含海藻糖的溶液(生理盐水或乳酸林格溶液)中悬浮了MSC而得的制品时，MSC在肺、特别是肺的毛细血管中集聚，而与此相对，在施予(移植)在含有海藻糖的溶液(乳酸林格溶液)中悬浮了MSC而得的制品时，所述MSC在肺、特别是肺的毛细血管中的集聚减少。
表2
Tukey’s test：p<0.05(悬浮有MSC的生理盐水施予组vs含有海藻糖的悬浮有MSC的乳酸林格溶液施予组)；P＝0.1477(悬浮有MSC的乳酸林格溶液施予组vs含有海藻糖的悬浮有MSC的乳酸林格溶液施予组)
表中的数值表示进行了4次独立实验所得的结果的平均值。
根据上述两项结果，认为使用不含海藻糖的溶液来移植MSC时，由于MSC在肺、特别是肺的毛细血管中集聚而形成肺栓塞，该处的摄氧能力降低，血氧分压降低。另一方面，认为使用含有海藻糖的溶液来移植MSC时，MSC在肺中的集聚(肺栓塞的形成)被抑制，肺的摄氧能力不降低，血氧分压不降低。
产业上的可利用性
根据本发明，能够在移植MSC等干细胞等细胞时预防肺栓塞形成、减少肺栓塞症的发病风险，因此在再生医疗等中的移植医疗领域和癌症治疗领域是有用的。

Claims (10)

1.哺乳动物细胞悬浮液，所述哺乳动物细胞悬浮液含有哺乳动物细胞及海藻糖或其衍生物或它们的盐，用于预防在经由血管施予哺乳动物细胞时的肺栓塞形成。
2.如权利要求1所述的哺乳动物细胞悬浮液，其中，哺乳动物细胞为哺乳动物干细胞。
3.如权利要求2所述的哺乳动物细胞悬浮液，其中，哺乳动物干细胞为哺乳动物间充质干细胞或哺乳动物亚全能干细胞。
4.如权利要求1～3中任一项所述的哺乳动物细胞悬浮液，其中，哺乳动物细胞包括处于单一细胞状态的哺乳动物细胞。
5.如权利要求1～4中任一项所述的哺乳动物细胞悬浮液，其中，海藻糖或其衍生物或它们的盐的浓度在0.1～20％的范围内。
6.预防在经由血管施予哺乳动物细胞时的肺栓塞形成的预防剂，所述预防剂含有海藻糖或其衍生物或它们的盐作为有效成分。
7.如权利要求6所述的预防剂，其中，哺乳动物细胞为哺乳动物干细胞。
8.如权利要求7所述的预防剂，其中，哺乳动物干细胞为哺乳动物间充质干细胞或哺乳动物亚全能干细胞。
9.海藻糖或其衍生物或它们的盐用于制备预防在经由血管施予哺乳动物细胞时的肺栓塞形成的预防剂中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其中，哺乳动物细胞为哺乳动物干细胞。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10493023B2 (en) 2013-05-07 2019-12-03 Seelos Therapeutics, Inc. Treatment of protein aggregation myopathic and neurodegenerative diseases by parenteral administration of trehalose
US9084720B2 (en) 2013-05-07 2015-07-21 BioBlast Pharma Ltd. Compositions and methods for treating oculopharyngeal muscular dystrophy
BR112017006533A2 (pt) * 2014-09-29 2017-12-19 Cook General Biotechnology Llc usos de trealose em suspensões celulares
WO2018123628A1 (ja) * 2016-12-28 2018-07-05 ロート製薬株式会社 細胞医薬組成物、疾患治療用キット及び細胞懸濁用溶液
CZ307851B6 (cs) 2017-02-14 2019-06-26 Ústav experimentální medicíny AV ČR, v. v. i. Léčebný přípravek k prevenci a léčení zánětlivých a degenerativních onemocnění
JPWO2023038037A1 (zh) 2021-09-08 2023-03-16

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995033488A1 (en) * 1994-06-02 1995-12-14 Quadrant Holdings Cambridge Limited Method of preventing aggregation of various substances upon rehydration or thawing and compositions obtained thereby
JP2002532567A (ja) * 1998-12-21 2002-10-02 ニューロテック ソシエテ アノニム 不死化内皮細胞を含有する医薬組成物
CN102186338A (zh) * 2008-08-20 2011-09-14 人类起源公司 改进的细胞组合物及制备所述组合物的方法
JP2012115253A (ja) * 2010-11-09 2012-06-21 Otsuka Pharmaceut Factory Inc 幹細胞懸濁液

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3253131B2 (ja) 1992-07-24 2002-02-04 洋巳 和田 移植臓器用溶液
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
JPH114682A (ja) * 1997-06-16 1999-01-12 Asahi Medical Co Ltd 有核細胞保存方法、有核細胞保存用組成物及び有核細胞分離方法
US6280718B1 (en) 1999-11-08 2001-08-28 Wisconsin Alumni Reasearch Foundation Hematopoietic differentiation of human pluripotent embryonic stem cells
EP1403374A4 (en) 2001-06-08 2004-07-21 Dnavec Research Inc GENE TRANSFER IN EMBRYONIC PRIMATE STEM CELLS WITH THE VSV-G PSEUDOTYPE MONKEY IMMUNITY WEAK VIRUS VECTOR
CA2625628C (en) 2005-10-13 2012-04-24 Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. Solution for preserving liver
US9598669B2 (en) * 2005-12-29 2017-03-21 Anthrogenesis Corporation Composition for collecting placental stem cells and methods of using the composition
JP2009296889A (ja) * 2008-06-10 2009-12-24 Foundation For Biomedical Research & Innovation 造血幹細胞の培養方法
WO2010048628A1 (en) * 2008-10-24 2010-04-29 Indiana University Research And Technology Corporation Methods for preventing aggregation of adipose stromal cells
JP6027300B2 (ja) * 2009-03-19 2016-11-16 国立大学法人岩手大学 細胞または臓器の保存液および保存方法
JP2010251273A (ja) 2009-04-16 2010-11-04 Norio Sudo 多重管構造蛍光管

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995033488A1 (en) * 1994-06-02 1995-12-14 Quadrant Holdings Cambridge Limited Method of preventing aggregation of various substances upon rehydration or thawing and compositions obtained thereby
JP2002532567A (ja) * 1998-12-21 2002-10-02 ニューロテック ソシエテ アノニム 不死化内皮細胞を含有する医薬組成物
CN102186338A (zh) * 2008-08-20 2011-09-14 人类起源公司 改进的细胞组合物及制备所述组合物的方法
JP2012500021A (ja) * 2008-08-20 2012-01-05 アンスロジェネシス コーポレーション 改良型細胞組成物およびその作製方法
JP2012115253A (ja) * 2010-11-09 2012-06-21 Otsuka Pharmaceut Factory Inc 幹細胞懸濁液

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CA2872460A1 (en) 2013-11-14

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