CN108553486A - 一种神经干细胞制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种神经干细胞制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种神经干细胞制剂，其包括脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞和间充质干细胞分泌的外泌体，所述的神经干细胞和所述的外泌体的配比为(6‑8)×106神经干细胞﹕100μg外泌体。本发明还公开了所述神经干细胞制剂的制备方法、含所述神经干细胞制剂的药物组合物、神经干细胞制剂在治疗肌萎缩侧索硬化症中的应用以及药物组合物在治疗肌萎缩侧索硬化症中的应用。间充质干细胞诱导的神经干细胞通过自我更新修复神经系统，外泌体可调节免疫和缓解神经毒性，二者联用可以进一步促进移植神经干细胞发挥有效作用，更好地治疗肌萎缩侧索硬化症。

Description

一种神经干细胞制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及一种神经干细胞制剂及其制备方法和应用。
背景技术
肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)是一种致命性神经系统变性疾病，由于上、下运动神经元变性导致延髓、四肢、躯干、胸部及腹部肌肉逐渐无力和萎缩，患者常在症状出现后3-5年内因呼吸肌麻痹而死亡。ALS作为最常见的运动神经元疾病，其年发病率为(2-3)/10万，其中家族性ALS约占5％-10％，散发性ALS占90％-95％。ALS以上运动神经元变性(主要特征为腱反射亢进、肌张力增高)和下运动神经元变性(肌萎缩、肌无力、束颤和腱反射失)为主要症状与体征。随着神经影像学、神经心理学等诊断技术的发展，发现认知功能受损亦是ALS的常见特征。根据发病部位可分为肢体发病(占65％)、延髓发病(30％)，极少数患者以呼吸系统症状、体质量减轻和孤立性情感不稳定为首发症状与体征。根据上下运动神经元受累的程度，可分为肌萎缩侧索硬化症、原发性侧索硬化(PLS)、进行性脊肌萎缩(PSMA)和进行性延髓麻痹(Progressive bulbar palsy)等类型。目前ALS的发病机制仍不明确，主要有神经兴奋性氨基酸毒性、氧化应激、线粒体异常、基因突变、神经营养因子不足和免疫炎症等。
应用利鲁唑(Riluzole)可使肌萎缩侧索硬化患者的生存期延长数月，是目前惟一被美国FDA批准的临床药物，但价格昂贵且无法治愈疾病。其他治疗措施包括抗氧化和自由基清除药、神经营养因子及基因治疗等，但尚无确切效果。近年来，神经干细胞的发现及其神经修复理论的完善为该病的治疗提供了新思路。目前实验及临床研究进展表明神经干细胞移植能够提高一定的治疗效果。但神经干细胞主要从胚胎干细胞诱导或是直接从发育中的中枢神经系统分离获得，存在伦理学、安全性问题及细胞来源和数量有限等问题。因此，寻找其他能获得神经干细胞的途径尤为重要。脐带/脐血来源的间充质干细胞在适当的诱导条件下可以多向分化为间质谱系内的各种细胞，跨系分化为外胚层的神经细胞及内胚层的肝细胞。但间充质干细胞增殖速度、分化方向的调控，移植后融入相应的组织器官并发挥特定功能、分化过程中细胞生长因子的具体作用机制、相互之间存在的影响等问题仍未知，且间充质干细胞存在致瘤性。因此目前施用间充质干细胞治疗肌萎缩侧索硬化效果不佳，可能是由于ALS患者脑内一定神经毒性，削弱间充质干细胞定向分化和神经系统修复能力。也有使用外泌体治疗ALS患者的少量报道，但其效果同样不佳，单纯使用外泌体或者神经营养因子不能有效逆转已受损神经元，且外泌体的提取纯化步骤复杂繁琐，现有商品化试剂盒价格昂贵，因此有碍科学研究和临床试验的开展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中单独施用间充质干细胞治疗肌萎缩侧索硬化效果不佳的缺陷，提供了一种含脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞和外泌体的神经干细胞制剂及其制备方法和应用。
通过本发明发现，体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞，并进行鉴定，可保证间充质干细胞的定向分化。且研究表明干细胞免疫调节和神经修复的功能主要是通过分泌的细胞因子和外泌体。将脐带间充质干细胞分泌的外泌体进行分离、纯化与其诱导的神经干细胞共同制成细胞悬液，对ALS患者能起到促进神经元生成、分泌神经营养因子、降低谷氨酸神经毒性、促使血管重建等作用。通过本发明的实施例，可以看出在NSC移植治疗7周后患者的脑脊液中谷氨酸和磷酸化神经丝重链(pNfH)水平下降，胱蛋白酶抑制剂C(CyC)水平有所恢复，依据肌萎缩侧索硬化功能评分量表，NSC移植后患者肢体症状和活动得到明显改善。因此本发明可以直接阻止脑损伤进程或促进损伤神经的再生，有效解决上述背景技术中的问题。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：
一种神经干细胞制剂，其包括脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞和间充质干细胞分泌的外泌体，所述的神经干细胞和所述的外泌体的配比为(6-8)×106神经干细胞﹕100μg外泌体。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：
一种神经干细胞制剂的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将脐带间充质干细胞诱导培养分化成神经干细胞，分离制备成细胞悬液；
(2)从脐带间充质干细胞获得外泌体；
(3)将所述的神经干细胞和所述的外泌体按(6-8)×106﹕100μg的配比混合。
所述间充质干细胞细胞诱导培养2周后观察，发现细胞表面突起增多，且有聚集成一定细胞球，可见出现神经干细胞球样生长。现有移植间充质干细胞治疗肌萎缩侧索硬化症的技术中，未见将神经干细胞诱导成神经球的记载。
优选地，步骤(1)中取第3代脐带间充质干细胞在含250μg/L BDNF和10μg/L bFGF的DMEM/F12培养基中诱导培养2周。
更优选地，所述神经干细胞的活性>95％，内毒素<2EU/mL，CD133阳性率≥40％和nestin阳性率≥90％。
进一步更优选地，步骤(2)中将脐带间充质干细胞贴壁后静置培养7天，收集培养上清液，然后超速离心法分离纯化得到所述外泌体。
优选地，所述超速离心法包括以下步骤：
(1)低温2500～5000×g离心，除去细胞及其碎片；
(2)继续100,000～120,000×g离心，弃上清，加缓冲液重悬底部沉淀；
(3)再次100,000～120,000×g离心，弃上清。
上述的低温在本领域通常指10℃以下，较佳选择离心设备设置的温度即为4℃。
优选地，所述步骤(1)的离心速度为3000×g，离心时间10min；步骤(2)重复一次；所述缓冲液为PBS缓冲液；和/或所述步骤(2)或(3)的离心速度为110,000×g，离心时间70min。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：
含所述神经干细胞制剂的药物组合物。
优选地，其给药方式为注射给药。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：
所述药物组合物在制备治疗肌萎缩侧索硬化症的药物中的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：
所述神经干细胞制剂在制备治疗肌萎缩侧索硬化症的药物中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：1)充分利用脐带间充质干细胞易获得、易分离、易分化和免疫调节等特性，应用脐带源神经干细胞移植来阻止或延缓ALS的进展；2)对比脐血源神经干细胞，脐带源神经干细胞分离和分化方法更简洁，细胞性质更稳定；3)间充质干细胞分泌的外泌体有免疫调节和修复神经细胞的功能，因此脐带源神经干细胞移植后通过分析病人脑脊液中分子水平就可对诊断和效果做出便捷的评估；4)颈部和上肢肌群肌力评分，流涎、吞咽、穿衣和卫生及行走评分，神经干细胞球+外泌体联合施用的方案效果明显优于神经干细胞、外泌体单独施用的方案，所以本发明可以有效阻止肌萎缩侧索硬化症疾病进程或促进损伤神经的再生。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞的制备
可以采用现有技术[(1)Matrix cells from Wharton’s jelly from neuronsand glia.Stem cell,2003,21(1):50-60；(2)人脐带间充质干细胞定向诱导分化成类神经元的实验研究,2015,31(2):229-233]制备可用于本发明的脐带间充质干细胞。
经医院伦理委员会批准、在新生儿产妇知情同意情况后，留取脐带组织。取足月健康新生儿剖宫产脐带10-15cm，无菌条件下放入PBS溶液中反复冲洗脐带，去除脐带动静脉及外膜，在培养基中将组织剪碎至约1mm3大小的小块。将组织块平铺于培养皿中，加入少量培养基浸润组织块，置于37℃，5％CO2的培养箱中贴壁4小时。贴壁后于37℃，5％CO2的培养箱静置培养，期间每3天进行半换液培养，7天后可见组织块周围有细胞爬出，待细胞长满并传代。
取第3代(P3)脐带间充质干细胞调整细胞密度，种2×105个细胞至25cm2细胞培养瓶，待细胞贴壁后使用诱导培养基。诱导培养基为含250μg/L BDNF(脑源性神经营养因子)和10μg/L bFGF的DMEM/F12。细胞诱导培养2周后观察细胞表面突起增多，且有聚集成一定细胞球，可见出现神经干细胞球样生长。现有移植间充质干细胞治疗肌萎缩侧索硬化症的技术中，未见将神经干细胞诱导成神经球的记载。将神经球分离制备成细胞悬液，并通过台盼蓝染色，用Beckman Vi-Cell计数仪进行细胞活性检测和计数进行神经干细胞活性鉴定,得细胞活性>95％，内毒素<2EU/mL。通过流式细胞仪，检测细胞表面分子CD133阳性率≥40％，nestin阳性率≥90％。每份神经干细胞悬液均需确认肝炎抗体、梅毒及其他传染病相关的检验无异常。
实施例2外泌体制备
可采用上述现有技术培养脐带间充质干细胞，然后运用超速离心法分离纯化外泌体：将实施例1中收集的脐带间充质干细胞诱导培养前的培养上清200mL分装于4个50mL离心管，4℃3000g离心15分钟除去细胞和细胞碎片；第1次110000×g离心70分钟，弃上清，保留沉淀，加入PBS至管底液体总量为5mL，重悬并轻轻吹打管底液体；第2次110000×g离心70分钟，离心后可见管底淡黄色沉淀，去上清，用PBS重悬并补足至5mL；第3次110000×g离心70分钟，小心弃上清，保留沉淀，加入110μL PBS将收集到的外泌体转移至管中备用或-80℃冰箱保存，剩下10μL用BCA法进行浓度测定。
实施例3神经干细胞制剂的制备
将实施例1制得的体外诱导并经过流式细胞仪鉴定的神经干细胞密度调整为3～4×106个细胞/mL，取2mL细胞悬液(总量6～8×106个细胞)，300g离心5分钟，弃去上清，用1.5mL生理盐水重悬，加入实施例2制得的100μg纯化好的外泌体，并将细胞悬液补充至2mL备用。
应用实施例1
一、选择患者和术前准备
A.选择患者
(一)适应证
1.符合2000年世界神经病学联盟修订的EI Escorial诊断标准，且有上或下运动神经元病损特征、病情逐步进展的肌萎缩侧索硬化症患者；
2.辅助支持肌萎缩侧索硬化症诊断的临床依据：1)1处或多处肌束震颤；2)肌电图提示前角神经细胞损害；3)运动和感觉神经传导速度正常，但远端运动传导潜伏期可以延长，波幅低；4)无传导阻滞；
3.利鲁唑治疗不能减缓病情进展或利鲁唑有禁忌证的患者；
4.康复治疗半年以上不能减缓病情进展或康复治疗有禁忌证的患者；
5.未进行气管切开和胃造瘘手术的患者
(二)禁忌证
1.严重肺部疾患、呼吸衰竭；
2.全身合并其他急、慢性感染；
3.术前已出现呼吸障碍
4.合并其他良性或恶性肿瘤
B.术前准备：
(一)患者准备
1.术前检查
(1)血液、尿液检查：血常规、凝血功能、心肺功能、肝肾功能、免疫四项(HBV、HCV、HIV，梅毒标志物)；根据患者工作和环境，或需做重金属检测；
(2)电生理检查：运动传导速度(MCV)、感觉传导速度(SCV)、重复神经刺激(RNS)和针电极肌电图(EMG)检查；
(3)磁共振成像；
(4)肌萎缩侧索硬化功能评分量表(ALS FRS-R)。
2.知情同意
患者及其家属自愿接受细胞移植治疗，并已充分了解神经干细胞移植的风险及可能出现的并发症。
二、神经干细胞的移植
(一)腰椎穿刺蛛网膜下腔注射移植
患者侧卧，在无菌条件下于第三与第四腰椎或第四与第五腰椎间隙穿刺，穿刺成功后测脑脊液压力，并留取2-4mL脑脊液，缓慢注入足量实施例3制备的神经干细胞悬液，冲洗2次，冲洗后缓慢拔出穿刺针，按压穿刺点2分钟，无菌敷贴保护伤口。穿刺过程注意患者生命体征变化，如有呼吸、脉搏、面色异常立即停止操作，并做相应处理。
时间：第1、2、4、6周；注射移植4次，第1周密切观察患者注射后的反应，特别是体温和头痛；路径：蛛网膜下腔；剂量：6×106个细胞/次。
(二)麻醉及术中观察
吉尔碘消毒后，采用2％利多卡因局部麻醉，并于穿刺和移植过程中监测生命体征，如有异常做相应处理。
三、术后处理
(一)腰椎穿刺神经干细胞移植后，患者去枕平卧4-6小时。
(二)术后监测：患者是否有头痛且体温升高，严密观察有无脑膜炎发生；患者有恶心、呕吐和头痛，可让其平卧休息，必要时按医嘱给予镇静、止吐和止痛剂。
(三)康复训练：术后3天接受康复训练，每天1次，每次时间1小时。
四、细胞移植术后评价
(一)安全性评价
1.感染的评估：术后1周内每天监测发热，如果出现发热，先排除常见呼吸道、肠道感染，予对症治疗；不明原因发热超过3天，伴有精神反应差，或出现中枢神经系统感染症状，进行头颅MRI检查，必要时行腰椎穿刺，排除中枢神经系统感染；
2.出血的评估：术后6小时内注意神志、瞳孔、生命体征的观察，出现异常，要警惕急性术后出血，立刻头颅MRI检查，必要时立即行手术治疗；术后1周观察患者精神反应、食欲，观察有无新的中枢神经系统症状出现，怀疑有小出血者，行头颅MRI检查，发现有少量出血者，一般不用手术处理，予以对症治疗。
(二)有效性评价
1.临床症状的评估：术后1个月由家属、医师共同观察认可的临床症状、体征改善，并做详细记录，共同签字；术后6、12个月使用父母随访问卷、电话咨询或返院复诊进行临床症状的观察记录；
2.肌肉收缩功能的评估(表1)：移植患者术前6个月、入组时及术后6个月进行肌力MRC 6级测定法进行评估(满分为12分，评分越高说明肌力越好)，包括：a.颈部肌群功能(语言、吞咽、口水、伸舌)；b.上肢肌群功能(写字、用餐具和穿衣)；c.下肢肌群功能(走路和爬楼梯)。通过治疗前后自身对照，比较移植前后6个月时间内总分提高幅度，反映患者肌肉收缩综合功能情况。
3.ALSFRS-R评估量表分析(表2)：由医师及康复师共同参与患者术前6个月、入组时及术后6个月的量表评估及分析。ALSFRS-R是对ALS患者日常活动整体功能的评估量表，包括言语、唾液分泌、吞咽、书写、切割食物和使用餐具、穿衣及卫生自理、床上翻身和整理被服、行走、爬楼梯、呼吸困难、端坐呼吸、呼吸功能不全等共12个项目，每个项目评分从0分到4分，评分总和从0分(严重受损)到48分(正常)。
表1 30例ALS患者NSC-外泌体移植治疗前后MRC肌力评估结果
与术前6个月比较，*P<0.05；与入组时比较#P<0.05。
以下神经干细胞p值简称为P神，外泌体p值简称为P外，联合组p值简称为P联。
移植治疗术后6个月，颈部肌群肌力评分仅联合组高于入住时(P联＝0.032)，上肢肌群肌力评分神经干细胞组、外泌体及联合组均高于入住时(P神＝0.043；P外＝0.042；P联＝0.03)，下肢肌群肌力评分高于术前6个月和入住时，但无统计学差异(P均＞0.05)。
术后6个月，联合组与神经干细胞组、外泌体组比较评估分析发现，颈部肌群肌力评分联合组显著高于神经干细胞组和外泌体组(P神＝0.041；P外＝0.037)；上肢肌群肌力评分联合组显著高于外泌体组(P神＝0.039)，下肢肌群肌力评分有增加趋势但无统计学差异(P＞0.05)。
表2 30例ALS患者NSC-外泌体移植治疗前后ALSFRS-R量表评估结果
与术前6个月比较，*P<0.05；与入组时比较#P<0.05。
移植治疗术后6个月，流涎评分神经干细胞组、外泌体组及联合组均高于入住时(P神＝0.044；P外＝0.049；P联＝0.021)，吞咽评分联合组高于入组时(P＝0.041)；穿衣和卫生评分神经干细胞组、外泌体及联合组均高于术前6个月(P神＝0.031；P外＝0.043；P联＝0.026)和入住时(P神＝0.031；P外＝0.042；P联＝0.022)，行走评分联合组高于6个月(P联＝0.038)和入住时(P神＝0.04)；神经干细胞组、外泌体组总分及其余功能区评分与术前6个月及入住时比较均无统计学差异(P均＞0.05)；联合组总分与术前6个月(P联＝0.019)及入住时(P联＝0.011)比较差异显著。
术后6个月，联合组与神经干细胞组、外泌体组比较评估分析发现，流涎评分联合组高于神经干细胞组和外泌体组(P神＝0.043；P外＝0.032)，穿衣和卫生评分联合组高于神经干细胞组和外泌体组(P神＝0.041；P外＝0.035)，行走评分联合组高于神经干细胞组和外泌体组(P神＝0.042；P外＝0.039)，其余功能区评分均无统计学差异(P均＞0.05)，联合组总分与神经干细胞组总分(P神＝0.038)、外泌体组总分(P外＝0.033)比较差异显著。

Claims (10)

1.一种神经干细胞制剂，其特征在于，其包括由脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞和间充质干细胞分泌的外泌体，所述的神经干细胞和所述的外泌体的配比为(6-8)×106神经干细胞﹕100μg外泌体。
2.一种神经干细胞制剂的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将脐带间充质干细胞诱导培养分化成神经干细胞，分离制备成细胞悬液；
(2)从脐带间充质干细胞获得外泌体；
(3)将所述的神经干细胞和所述的外泌体按权利要求1所述的配比混合。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中取第3代脐带间充质干细胞在含250μg/L BDNF和10μg/L bFGF的DMEM/F12培养基中诱导培养2周。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述神经干细胞的活性>95％，内毒素<2EU/mL，CD133阳性率≥40％和nestin阳性率≥90％。
5.如权利要求2～4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中将脐带间充质干细胞贴壁后静置培养7天，收集培养上清液，然后超速离心法分离纯化得到所述外泌体。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述超速离心法包括以下步骤：
(1)4℃2500～5000×g离心，除去细胞及其碎片；
(2)继续100,000～120,000×g离心，弃上清，加缓冲液重悬底部沉淀；
(3)再次100,000～120,000×g离心，弃上清；
优选地，所述步骤(1)的离心速度为3000×g，离心时间10min；步骤(2)重复一次；所述缓冲液为PBS缓冲液；和/或所述步骤(2)或(3)的离心速度为110,000×g，离心时间70min。
7.含如权利要求1所述的神经干细胞制剂的药物组合物。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，其给药方式为注射给药。
9.如权利7或8所述的药物组合物在制备治疗肌萎缩侧索硬化症的药物中的应用。
10.如权利要求1所述的神经干细胞制剂在制备治疗肌萎缩侧索硬化症的药物中的应用。
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