CN115252663A - 一种快速调节植物神经的组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速调节植物神经的组合物及其制备方法和应用，属于医药技术领域。该组合物包括体积比为(1:1)‑(4:1)的金缕梅提取物诱导获得的间充质干细胞细胞外囊泡和细胞培养基。所述组合物的制备方法为：将0.005‑0.01ppm的金缕梅提取物加入间充质干细胞中，培养并收集细胞培养上清，离心，制得间充质干细胞细胞外囊泡，再将新鲜获取的间充质干细胞细胞外囊泡与细胞培养基混合，制得快速调节植物神经紊乱的组合物。该组合物能够在解决局部无菌性炎症问题的同时，调节植物神经系统中神经递质水平，提供神经营养，快速高效精准地修复植物神经紊乱，该组合物适用于对植物神经紊乱引起的疾病、干燥综合征、术后外周神经受损等疾病的治疗。

Description

一种快速调节植物神经的组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种快速调节植物神经的组合物及其制备方法和应用。
背景技术
植物神经功能紊乱是由于长期的精神紧张，心理压力过大，或精神受到刺激后引发的神经递质分泌不平衡所引起的一组症候群，居各种神经官能症的首位。由于大脑高级神经中枢和植物神经的功能失调，患者往往伴有睡眠障碍、头痛、头昏、视力下降及记忆力减退等大脑功能紊乱以及循环、消化、内分泌代谢及生殖系统功能失调的症状。长期的神经功能紊乱会造成神经营养障碍及局部无菌性炎症，引发大量自由基聚集，进一步破坏植物神经功能，造成恶性循环。
目前临床上对于植物神经紊乱的治疗分中医疗法、西医疗法及心理治疗多个方面。在西医上通常给予患者口服B族维生素、谷维素和小量安定、抗焦虑、抗抑郁类药物如舒乐安定、多虑平等，对症治疗如丹参、倍他乐克、吗丁啉等，并配合有心理干预，效果微弱，且长期服用药物不但对患者身体造成损害，还会造成一定的耐药性，使得患者植物神经紊乱愈发严重。中医多采用黄芪、当归、知母类的中草药配伍后对症治疗，或配合针灸疗法也能缓解患者症状，但不能从根本上解决神经紊乱的问题。因此急需一种药物能调节神经递质分泌、补充神经营养，修复受损的神经，恢复神经传导功能。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种快速调节植物神经的组合物及其制备方法和应用，解决西药配合心理治疗效果微弱以及耐药性的问题，中药治疗仅能缓解患者症状的问题，中西医治疗不能解决神经紊乱的根本问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种快速调节植物神经紊乱的组合物，包括体积比为(1:1)-(4:1)的间充质干细胞细胞外囊泡和细胞培养基；
其中，所述间充质干细胞细胞外囊泡由金缕梅提取物诱导间充质干细胞后获得。
优选地，所述间充质干细胞细胞外囊泡由脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和牙髓间充质干细胞中的一种或两种分泌而来。
优选地，所述间充质干细胞为P3-P6代间充质干细胞。
优选地，所述金缕梅的添加剂量为0.005-0.01ppm。
优选地，所述细胞培养基为含有维生素及氨基酸的培养基。
进一步优选地，所述培养基为DMEM培养基、MEM培养基或α-MEM培养基。
本发明还公开了上述一种快速调节植物神经紊乱的组合物的制备方法，将金缕梅提取物诱导间充质干细胞后获得的间充质干细胞细胞外囊泡与细胞培养基以体积比为(1:1)-(4:1)混合，制得快速调节植物神经紊乱的组合物。
优选地，制备间充质干细胞细胞外囊泡的具体步骤为：将0.005-0.01ppm的金缕梅提取物加入间充质干细胞中，37℃，5％CO2培养箱中共培养，24h后弃掉上清，磷酸盐缓冲液清洗细胞，换无血清培养基继续在37℃，5％CO2培养箱培养48h，收集细胞培养上清，低速离心去掉细胞碎片，超滤离心制得间充质干细胞细胞外囊泡。
本发明还公开了上述一种快速调节植物神经紊乱的组合物在制备治疗植物神经紊乱引起的疾病、干燥综合征和术后外周神经受损的药物制剂中的应用。
优选地，在使用快速调节植物神经紊乱的组合物时，每侧星状神经节的注射量为1-2mL。
优选地，所述制剂为注射剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的一种快速调节植物神经紊乱的组合物，由细胞培养基和金缕梅提取物诱导的间充质干细胞细胞外囊泡组合而成，将皮肤活性原料金缕梅提取物运用于植物神经修复，其诱导后的间充质干细胞细胞外囊泡，一方面其含有的修复信号快速与星状神经节神经传导相结合，调节植物神经系统中神经递质水平，提供神经营养，促进神经修复，另一方面还具有金缕梅提取物强大的抗氧化、清除自由基功效，最终解决局部无菌性炎症的问题；组合物中的细胞培养基中含有的丰富的维生素及氨基酸，能外源性提供植物神经所需营养素，加持间充质干细胞细胞外囊泡植物神经修复功效，加快植物神经功能恢复，极大缩短神经修复时间。组合物中的细胞培养基和金缕梅提取物诱导的间充质干细胞细胞外囊泡，均为人体生理活动所必需的活性物质，在进入人体被吸收后营养、修复神经，不会产生药物的耐药作用。通过人体功效验证实验，与西药谷维素治疗，中药双参刺五加口服液治疗相比，经该快速调节植物神经紊乱的组合物治疗的患者状况明显好于西药和中药治疗组，说明该组合物适用于植物神经紊乱引起的疾病、干燥综合征、术后外周神经受损等疾病的治疗。此外，该组合物在使用时借助超声引导，精准注射至颈部星状神经节，通过星状神经节神经传导，能够实现精准治疗和快速修复。
本发明提供的一种快速调节植物神经紊乱的组合物的制备方法，所需原材料均为市售材料，培养条件易实现，制备工艺及制备要求简单，制备周期短，整个制备周期不超过7天，使用效果好，一次注射即可达到恢复植物神经功能效果。
附图说明
图1为本发明的皮内注射点部位图；其中，A为以体积比1:1注射完全弗氏佐剂与生理盐水的混合液的部位，B为以体积比1:1注射实施例1制备的组合物与完全弗氏佐剂的混合液的部位(阴性对照组则注射生理盐水，阳性对照组注射巯基苯并噻唑)，C为以体积比1:1注射A部位与B部位注射液(即前2种注射液)的部位。
其中：1-头部；2-L皮内注射点；3-去毛的肩肿骨内侧部位；4-尾部。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
本发明中所用部分试剂和药品说明如下：
金缕梅提取物，货号5632，购于西安普瑞斯生物工程有限公司；DMEM培养基，货号12100061，购于GIBCO；α-MEM培养基，货号12000063，购于GIBCO；MEM培养基，货号41500034，购于GIBCO；谷维素，购于北京中新制药厂；双参刺五加口服液，购于牡丹江灵泰药业股份有限公司。
本发明提供的一种快速调节植物神经紊乱的组合物，该组合物包括体积比为(1:1)-(4:1)的间充质干细胞细胞外囊泡和细胞培养基；
其中，所述间充质干细胞细胞外囊泡由脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和牙髓间充质干细胞中的一种或两种分泌而来；所述间充质干细胞细胞外囊泡由金缕梅提取物诱导间充质干细胞后获得；所述金缕梅提取物为市售的粉末，添加剂量为0.005-0.01ppm；所述细胞培养基是指含有丰富维生素及氨基酸来源的市售培养基，可以由市售的DMEM、MEM、α-MEM中的一种组合而成；所述间充质干细胞细胞外囊泡浓度≥1×109/mL；所述组合物的使用方法为在超声引导下，精准注射至颈部双侧星状神经节，注射量为每侧1-2mL。
本发明提供的一种快速调节植物神经紊乱的组合物的制备方法，将新鲜获取的间充质干细胞细胞外囊泡与细胞培养基混合，制得快速调节植物神经紊乱的组合物；
其中，间充质干细胞细胞外囊泡的制备方法为：将0.005-0.01ppm的金缕梅提取物加入P3-P6代间充质干细胞中，37℃，5％CO2培养箱中共培养，24h后弃掉上清，磷酸盐缓冲液清洗细胞，换无血清培养基继续在37℃，5％CO2培养箱培养48h，收集细胞培养上清，低速离心去掉细胞碎片，超滤离心制得间充质干细胞细胞外囊泡，经纳米颗粒分析仪测定后，间充质干细胞细胞外囊泡浓度≥1×109/mL。
实施例1
一种快速调节植物神经紊乱的组合物，包括4mL脐带间充质干细胞细胞外囊泡和1mLα-MEM培养基。
上述用于快速调节植物神经紊乱的组合物的制备方法，具体步骤为：将0.005ppm金缕梅提取物加入P3代脐带间充质干细胞中，置于37℃，5％CO2培养箱共培养，24h后弃掉上清，用磷酸盐缓冲液清洗细胞两次，换无血清培养基37℃，5％CO2培养箱中继续培养48h，收集细胞培养上清。收集到的细胞上清先经过1000rpm离心5min，收集上清，再次经过100KD的超滤管离心，2000rpm离心20min，超滤管上层即为脐带间充质干细胞细胞外囊泡；再将1mLα-MEM细胞培养基与4mL制得的脐带间充质干细胞细胞外囊泡混合，制得快速调节植物神经紊乱的组合物。
对上述制得的调节植物神经紊乱的组合物进行性能评价，具体步骤如下：
1.脐带间充质干细胞细胞外囊泡纳米颗粒分析检测
将实施例1获得的组合物经过50倍稀释后，进行纳米颗粒分析仪检测，检测机型为ZETAVIEW PARTICLE METRIX，检测结果如表1所示。
结果显示，实施例1得到的脐带间充质干细胞细胞外囊泡浓度为5.7×109/mL，间充质干细胞细胞外囊泡浓度≥1×109/mL，说明该方法得到的细胞外囊泡浓度较高。
表1纳米流式检测结果
Figure BDA0003830660640000061
2.急性全身毒性试验
选取30只昆明小白鼠，体重为18±2g，雌雄兼半，适应性饲养7d后，随机分为3组，设为高剂量组、中剂量组及低剂量组，每组雌雄鼠各5只。每组小鼠腹腔注射上述制得的组合物，低剂量组注射10.3μL(按照动物与人体体表面积剂量折算系数表进行折算，小鼠正常用量约为11μL)，中剂量组注射22μL，高剂量组注射44μL，注射结束后7d观察小鼠的一般症状、中毒情况和死亡数量，实验结果见表2：
表2急性毒性实验结果
Figure BDA0003830660640000062
Figure BDA0003830660640000071
结果显示，无论是高剂量组，还是中剂量组和低剂量组，注射结束后小鼠精神状态良好，饮食正常，无蜷缩、俯卧等中毒症状，死亡数量都为0，说明本发明制备的组合物对小鼠无急性毒性。
3.热原检测
选用1.7-3.0kg的新西兰大白兔作为实验动物，挑选3只热原合格的动物，适应性饲养7d后，按照10mL/kg的剂量耳缘静脉注射上述制得的组合物，注射前测量动物正常体温，注射之后每隔30min按照前法测定体温1次，每次测定2次，共测6个时间段。以6次体温中最高值减去正常体温，即为该兔体温的升高温度(℃)。若3只家兔中有一只体温升高0.6℃或0.6℃以上，或3只家兔体温升高总和达1.4℃或超过1.4℃以上，判定为热原检测不合格，实验结果见表3：
表3热原检测结果
Figure BDA0003830660640000072
实验结果显示，受试的3只动物体温升高均不超过0.6℃，并且家兔体温升高总值低于1.4℃，热原检测结果合格。
4.致敏检查
选择30只，2-3月龄雌雄兼半的白色豚鼠，适应性培养7天后，分为3组，分为阳性组、阴性组和实验组，每组10只。
(1)皮内诱导阶段
在胸廓的背前区备皮(4cm×6cm)，消毒后于肩胛骨内侧按照图1从头向尾成对地注射6个点，每点注射0.1mL(按照动物与人体体表面积剂量折算系数表进行折算，每只豚鼠用量为127μL)。其中，图1中的部位A：注射完全弗氏佐剂与生理盐水以1:1(体积比)的混合液；图1中的部位B：注射实施例1制备的组合物与完全弗氏佐剂的1:1等体积混合物，阴性对照组则注射生理盐水，阳性对照组注射巯基苯并噻唑；图1中的部位C：注射A部位与B部位即前2种注射液的等体积混合物。
(2)局部诱导阶段
皮内诱导阶段后7d(±1d)，三组动物同区域剪毛，100g/L十二烷基硫酸钠预处理各注射点，按摩导入皮肤，24h±2h后用吸收性纱布块充分浸湿在上述步骤(1)中A、B、C注射点的液体中，纱布块对应局部贴敷于每只动物的肩胛骨内侧部门，覆盖诱导注射点。再用封闭式包扎带固定敷贴片，并于48h±2h后去除包扎带和敷贴片。
(3)激发阶段
局部诱导阶段后14d(±1d)，用实施例1制备的组合物激发全部试验动物和对照动物。在豚鼠腹部剪毛(约2cm×4cm)，消毒后于各点皮内注射组合物0.1mL。
(4)动物观察
于激发阶段后24h和48h观察试验组和对照组动物激发部位皮肤情况，在自然光或全光谱光线下观察皮肤反应。按照表4给出的Magnusson和Kligman分级标准对每一激发部位和每一观察时间皮肤红斑和水肿反应进行描述和分级。
表4 Magnusson和Kligman分级
反应情况 等级
无明显改变 0
散发性或斑点状红斑 1
中度融合性红斑 2
重度红斑和水肿 3
(5)结果评价
按照Magnusson和Kligman分级标准，对照组动物等级小于1，而试验组中等级大于或等于1时一般提示致敏。如对照组动物等级大于或等于1时，试验组动物反应超过对照组中最严重的反应则认为致敏。如为疑似反应，推荐进行再激发以确认首次激发结果。试验结果显示为试验和对照动物中的阳性激发结果的发生率。
(6)检测结果
如表5所示，在本实验条件下组合物对豚鼠皮肤致敏率为0，按照Magnusson和Kligman分级标准为0级，表明本发明制备的用于快速调节植物神经紊乱的组合物不会引起致敏反应。
表5组合物对豚鼠皮肤致敏反应试验结果
Figure BDA0003830660640000091
Figure BDA0003830660640000101
5.人体功效验证
自2021年9月-2022年7月期间，收集年龄大于18周岁，且具有睡眠障碍、头晕、乏力症状的志愿者共81名，男女不限，随机分为试验组、西药组和中药组三组进行人体功效验证，每组27人。试验组颈部两侧星状神经节注射实施例1制备而来的组合物，2次/周；西药组口服谷维素，每日3次，10mg/次，饭后服用；中药组服用双参刺五加口服液，每日2次，10mL/次，饭后服用。一周为一个疗程。一周结束后，测定深吸气和深呼气状态下心电图，测定深吸气和深呼气的心率差，同时收集志愿者主观感受。判定标准如下，
判定标准如下：
显效：心率差≥15次/min，患者睡眠障碍、乏力、头晕症状明显改善，甚至消失；
有效：心率差＞11次/min，患者睡眠障碍、乏力、头晕症状轻微改善；
无效：心率差≤11次/min，患者睡眠障碍、乏力、头晕症状无任何改变，甚至加重；
总有效率＝(显效+有效)/治疗总例数×100％。
治疗效果如表6和表7所示：
表6各组药物使用一周后志愿者心率差结果
组别 心率差(次/min)
试验组 14.09±1.22
西药组 11.97±1.03
中药组 11.39±1.63
表7各组药物使用一周后有效率结果
组别 例数 显效 有效 无效 有效率
试验组 27 13 9 5 81.5％
西药组 27 6 10 9 59.3％
中药组 27 5 7 15 44.4％
治疗结果显示，服用西药谷维素一周后志愿者心率差为11.97次/min，有效率为59.3％，服用中药双参刺五加口服液一周后心率差为11.39次/min，有效率为44.4％，使用本发明中的组合物颈部双侧星状神经节注射2次后心率差为14.09次/min，接近植物神经正常人群心率差(正常人群心率差≥15次/min，植物神经紊乱患者心率差≤11次/min)，有效率为81.5％，说明本实施例获得的组合物具有快速调节植物神经紊乱的功效，效果优于谷维素和双参刺五加口服液。
实施例2
一种快速调节植物神经紊乱的组合物，包括2mL脐带间充质干细胞细胞外囊泡和1mL市售DMEM培养基。
一种快速调节植物神经紊乱的组合物的制备方法，具体步骤为：将0.01ppm金缕梅提取物加入P3代脐带间充质干细胞中，置于37℃，5％CO2培养箱共培养，24h后弃掉上清，用磷酸盐缓冲液清洗细胞两次，换无血清培养基37℃，5％CO2培养箱中继续培养48h，收集脐带间充质干细胞细胞培养上清。收集到的细胞上清先经过1000rpm离心5min，收集上清，再次经过100KD的超滤离心，2000rpm离心20min，超滤管上层即为脐带间充质干细胞细胞外囊泡；再将1mL市售DMEM细胞培养基与1mL制得的脐带间充质干细胞细胞外囊泡混合，制得快速调节植物神经紊乱的组合物。
对上述制得的快速调节植物神经紊乱的组合物进行人体功效验证，具体步骤如下：
患者，女，55岁，自述平时工作压力大，每晚12点之前迟迟不能入睡，严重时需要口服安定药物维持睡眠，即使处于睡眠状态仍然有多梦现象，大部分情况下于凌晨4点醒来，至天亮再无睡意，白天困乏无精神，注意力不集中，并伴有间歇性消化不良症状，此种情况已持续1-2年，临床判定为植物神经紊乱，先后尝试过心理疏导、口服药物，均无良好效果。在超声阴道下，经双侧颈部星状神经节注射本发明实施例2中制备的组合物，每周2次，注射1次后，患者自述注射当晚11点前自主入睡，夜里无醒来，多梦现象改善。注射2次后，患者自述睡眠情况明显好转，晚上10点困意来袭，一觉可睡到早上7点，中途几乎不做梦，胃口变好，便秘情况改善。
实施例3
一种快速调节植物神经紊乱的组合物，包括6mL脂肪间充质干细胞细胞外囊泡和2mL市售MEM培养基。
上述用于快速调节植物神经紊乱的组合物的制备方法，具体步骤为：将0.008ppm金缕梅提取物加入P6代脂肪间充质干细胞中，置于37℃，5％CO2培养箱共培养，24h后弃掉上清，用磷酸盐缓冲液清洗细胞两次，换无血清培养基37℃，5％CO2培养箱中继续培养48h，收集脂肪间充质干细胞细胞培养上清。收集到的细胞上清先经过1000rpm离心5min，收集上清，再次经过100KD的超滤离心，2000rpm离心20min，超滤管上层即为脂肪间充质干细胞细胞外囊泡；再将2mL市售MEM培养基与6mL制得的脂肪间充质干细胞细胞外囊泡混合，制得快速调节植物神经紊乱的组合物。
实施例4
一种快速调节植物神经紊乱的组合物，包括1mL骨髓间充质干细胞细胞外囊泡和1mL市售MEM培养基。
上述用于快速调节植物神经紊乱的组合物的制备方法，具体步骤为：将0.008ppm金缕梅提取物加入P4代骨髓间充质干细胞中，置于37℃，5％CO2培养箱共培养，24h后弃掉上清，用磷酸盐缓冲液清洗细胞两次，换无血清培养基37℃，5％CO2培养箱中继续培养48h，收集骨髓间充质干细胞细胞培养上清。收集到的细胞上清先经过1000rpm离心5min，收集上清，再次经过100KD的超滤离心，2000rpm离心20min，超滤管上层即为骨髓间充质干细胞细胞外囊泡；再将1mL市售MEM培养基与1mL制得的骨髓间充质干细胞细胞外囊泡混合，制得快速调节植物神经紊乱的组合物。
实施例5
一种快速调节植物神经紊乱的组合物，包括总量为3mL的牙髓间充质干细胞细胞外囊和脂肪间充质干细胞细胞外囊泡，以及2mL的市售α-MEM培养基。
上述用于快速调节植物神经紊乱的组合物的制备方法，具体步骤为：将0.006ppm金缕梅提取物加入P3代牙髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞中，置于37℃，5％CO2培养箱共培养，24h后弃掉上清，用磷酸盐缓冲液清洗细胞两次，换无血清培养基37℃，5％CO2培养箱中继续培养48h，收集牙髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞细胞培养上清。收集到的细胞上清先经过1000rpm离心5min，收集上清，再次经过100KD的超滤离心，2000rpm离心20min，超滤管上层即为牙髓间充质干细胞细胞外囊泡和脂肪间充质干细胞细胞外囊泡；再将2mL市售α-MEM培养基与3mL制得的牙髓间充质干细胞细胞外囊泡和脂肪间充质干细胞细胞外囊泡混合，制得快速调节植物神经紊乱的组合物。
实施例6
一种快速调节植物神经紊乱的组合物，包括总量为1mL的脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞细胞外囊泡，以及1mL的市售DMEM培养基。
上述用于快速调节植物神经紊乱的组合物的制备方法，具体步骤为：将0.005ppm金缕梅提取物加入P6代脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞中，置于37℃，5％CO2培养箱共培养，24h后弃掉上清，用磷酸盐缓冲液清洗细胞两次，换无血清培养基37℃，5％CO2培养箱中继续培养48h，收集脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞细胞培养上清。收集到的细胞上清先经过1000rpm离心5min，收集上清，再次经过100KD的超滤离心，2000rpm离心20min，超滤管上层即为脐带间充质干细胞外囊泡和脂肪间充质干细胞外囊泡；再将1mL市售DMEM培养基与1mL制得的脐带间充质干细胞外囊泡和脂肪间充质干细胞外囊泡混合，制得快速调节植物神经紊乱的组合物。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种快速调节植物神经紊乱的组合物，其特征在于，包括体积比为(1:1)-(4:1)的间充质干细胞细胞外囊泡和细胞培养基；
其中，所述间充质干细胞细胞外囊泡由金缕梅提取物诱导间充质干细胞后获得。
2.根据权利要求1所述的一种快速调节植物神经紊乱的组合物，其特征在于，所述间充质干细胞细胞外囊泡由脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和牙髓间充质干细胞中的一种或两种分泌而来。
3.根据权利要求1所述的一种快速调节植物神经紊乱的组合物，其特征在于，所述间充质干细胞为P3-P6代间充质干细胞。
4.根据权利要求1所述的一种快速调节植物神经紊乱的组合物，其特征在于，所述金缕梅的添加剂量为0.005-0.01ppm。
5.根据权利要求1所述的一种快速调节植物神经紊乱的组合物，其特征在于，所述细胞培养基为含有维生素及氨基酸的培养基。
6.根据权利要求5所述的一种快速调节植物神经紊乱的组合物，其特征在于，所述培养基为DMEM培养基、MEM培养基或α-MEM培养基。
7.权利要求1-6任意一项所述的一种快速调节植物神经紊乱的组合物的制备方法，其特征在于，将金缕梅提取物诱导间充质干细胞后获得的间充质干细胞细胞外囊泡与细胞培养基以体积比为(1:1)-(4:1)混合，制得快速调节植物神经紊乱的组合物。
8.根据权利要求7所述的一种快速调节植物神经紊乱的组合物的制备方法，其特征在于，制备间充质干细胞细胞外囊泡的具体步骤为：将0.005-0.01ppm的金缕梅提取物加入间充质干细胞中，37℃，5％CO2培养箱中共培养，24h后弃掉上清，磷酸盐缓冲液清洗细胞，换无血清培养基继续在37℃，5％CO2培养箱培养48h，收集细胞培养上清，低速离心去掉细胞碎片，超滤离心制得间充质干细胞细胞外囊泡。
9.权利要求1-6任意一项所述的一种快速调节植物神经紊乱的组合物在制备治疗植物神经紊乱引起的疾病、干燥综合征和术后外周神经受损的药物制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在使用快速调节植物神经紊乱的组合物时，每侧星状神经节的注射量为1-2mL。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0576936A1 (de) * 1992-07-01 1994-01-05 Dr. Willmar Schwabe GmbH & Co. Hamamelis-Trockenextrakt, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Arzneimittel
CN104726406A (zh) * 2015-02-13 2015-06-24 中国医科大学 一种诱导牙髓间充质干细胞分化为神经细胞的方法
CN108553486A (zh) * 2017-12-13 2018-09-21 上海市浦东医院 一种神经干细胞制剂及其制备方法和应用
CN113952281A (zh) * 2021-11-08 2022-01-21 云南贺尔思细胞生物技术有限公司 一种含有干细胞提取物的抗过敏组合物及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0576936A1 (de) * 1992-07-01 1994-01-05 Dr. Willmar Schwabe GmbH & Co. Hamamelis-Trockenextrakt, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Arzneimittel
CN104726406A (zh) * 2015-02-13 2015-06-24 中国医科大学 一种诱导牙髓间充质干细胞分化为神经细胞的方法
CN108553486A (zh) * 2017-12-13 2018-09-21 上海市浦东医院 一种神经干细胞制剂及其制备方法和应用
CN113952281A (zh) * 2021-11-08 2022-01-21 云南贺尔思细胞生物技术有限公司 一种含有干细胞提取物的抗过敏组合物及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
肖伟洪,杨春华,徐秋林,吴玉萍: "3种金缕梅科植物提取物对动物皮肤防护研究", 日用化学工业, no. 01, pages 27 - 29 *

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