CN101485656A - 表没食子儿茶素没食子酸酯在制备防治肺纤维化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表没食子儿茶素没食子酸酯在制备防治肺纤维化药物中的应用，通过博莱霉素复制小鼠肺纤维化动物模型，首次选用表没食子儿茶素没食子酸酯作为治疗药物，研究肺纤维化动物肺组织的病理学改变，观察表没食子儿茶素没食子酸酯对肺纤维化动物模型的治疗作用，从而为表没食子儿茶素没食子酸酯治疗肺纤维化提供依据。

Description

表没食子儿茶素没食子酸酯在制备防治肺纤维化药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种表没食子儿茶素没食子酸酯在制备防治肺纤维化药物中的应用。

背景技术

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是慢性间质性肺病原因不明类中的一种，也是以普通型间质性肺炎为特征性病理改变的慢性炎症性肺疾病，其临床表现为进行性呼吸困难伴有刺激性干咳，并最终因呼吸衰竭而死亡。虽然关于IPF的确切发病机制仍尚未阐明，但根据现有的资料，仍然可以将IPF的发病机制归纳为肺泡炎、肺实质损伤、过度的修复和纤维化几个阶段。目前，针对特发性肺纤维化机制的研究大多集中在对效应细胞、细胞因子及其相关基因调控的研究，其前提是学术界对肺纤维化的形成过程是涉及到细胞、细胞因子、细胞外基质(ECM)等因素的复杂过程已经具有共识。西医目前的治疗以糖皮质激素作为首选药物，但是只适用于20％的IPF患者，免疫抑制剂和细胞毒性药物也被用于IPF的治疗。近年来，随着关于中医药治疗和预防肺纤维化的作用的实验研究和临床研究工作的开展，它的作用已被广泛重视。

表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是绿茶提取物茶多酚中含量最多的一种生物活性成分，诸多研究表明EGCG具有多种生物学功能，包括抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗紫外辐射等。

发明内容

本发明目的是：提供一种表没食子儿茶素没食子酸酯在制备防治肺纤维化药物中的应用。

本发明的技术方案是：通过博莱霉素(Bleomycin，BLM)复制小鼠和大鼠肺纤维化动物模型，首次选用EGCG作为治疗药物，研究肺纤维化动物肺组织的病理学改变，观察EGCG对肺纤维化动物模型的治疗作用，从而为EGCG治疗肺纤维化提供实验依据。

本发明所说的EGCG，其提取方法可参见现有技术，也可商业购得。

本发明的优点是：

1.EGCG可以明显降低肺纤维化小鼠肺组织中羟脯氨酸含量，降低肺组织丙二醛含量，明显升高机体总抗氧化能力；给药14、28天时，EGCG均可显著降低小鼠肺纤维化模型的肺系数；光镜结果显示，EGCG在早期可减轻肺纤维化小鼠肺部的炎症反应，晚期可抑制胶原沉积和纤维化形成。

2.EGCG可以明显降低肺纤维化大鼠肺组织中羟脯氨酸含量；提高过氧化物歧化酶(SOD)活力、总抗氧化能力(T-AOC)水平，降低髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)含量，起到抗氧化能力；给药7、14、28天时，EGCG均可显著降低大鼠肺纤维化模型的肺系数；光镜结果显示，EGCG可以减轻肺纤维化大鼠肺部炎症，减少胶原沉积，有抗纤维化作用。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述：

其中：

图1为EGCG治疗28天后对小鼠病理形态的影响(均数±标准差，n＝8)(×100)；

A：正常对照组；B：模型组；C-E：分别为EGCG100、50和25mg/kg治疗组；F：泼尼松组。

图2为7天正常对照组(HE，×100)；

图3为7天模型组(HE，×100)；

图4为7天泼尼松组(HE，×100)；

图5为7天EGCG大剂量组(HE，×100)；

图6为7天EGCG中剂量组(HE，×100)；

图7为7天EGCG小剂量组(HE，×100)；

图8为14天正常对照组(HE，×100)；

图9为14天模型组(HE，×100)；

图10为14天泼尼松组(HE，×100)；

图11为14天EGCG大剂量组(HE，×100)；

图12为14天EGCG中剂量组(HE，×100)；

图13为14天EGCG小剂量组(HE，×100)；

图14为28天正常对照组(HE，×100)；

图15为28天模型组(HE，×100)；

图16为28天泼尼松组(HE，×100)；

图17为28天EGCG大剂量组(HE，×100)；

图18为28天EGCG中剂量组(HE，×100)；

图19为28天EGCG小剂量组(HE，×100)。

具体实施方式

实施例1：博莱霉素致肺纤维化小鼠模型病理观察及EGCG的干预作用

一、材料

1、实验动物

昆明种小鼠96只，雌雄各半，体重18～22g，清洁级，由苏州大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证：XCYK(苏)2002-0008，实验动物使用许可证：SYXK(苏)2002-0037。

2、药物与试剂

2.1药物 博莱霉素A5(BLM)由日本化药株式会社生产；EGCG购自浙江东方茶业科技有限公司，纯度为70％；醋酸泼尼松由江苏徐州平光制药有限责任公司生产。

2.2试剂 羟脯氨酸(HYP)、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽(G SH)和丙二醛(MDA)试剂盒由南京建成生物技术研究所提供。

3、仪器 离心机，80-2型，上海手术器械厂；光学显微镜OLYMPUSCX31；分光光度计722型，上海精密科学仪器有限公司。

二、方法

1、造模及给药

昆明种小鼠96只，称重，编号，随机分为6组，即正常组、模型组、、EGCG大剂量(100mg/kg)组、中剂量(50mg/kg)组及小剂量(25mg/kg)组和醋酸泼尼松组(6.67mg/kg)，每组16只。模型组与各治疗组小鼠采用BLM复制动物肺纤维化模型，具体操作如下：实验小鼠用4％水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰卧于手术台上，固定头部及四肢，无菌条件下切开颈部皮肤，暴露气管，经气管缓慢注入BLM(5mg/kg体重)，缝合后立即将小鼠直立旋转3-5min，尽量使药液在肺内均匀分布。正常组在相同条件下经气管注入等体积生理盐水。术后第二天，醋酸泼尼松组和EGCG各剂量组开始灌胃给药，正常组及模型组给予等体积蒸馏水，每天一次。

2、标本采集

各组小鼠分别于给药后第14和28天经颈椎脱臼法处死，无菌条件下分离出气管和双肺，称重，一侧完整肺叶置于4％多聚甲醛中固定，常规切片，HE染色，另一侧肺部分冷冻保留以测定生化指标。

3、肺系数

肺系数＝肺重(mg)/体重(g)，模型组早期炎症细胞大量渗出，晚期成纤维细胞大量增生，胶原过度沉积都可导致肺系数增加，因此肺系数这一指标可间接反应肺纤维化小鼠炎症和纤维化的程度。

4、组织病理学观察

HE切片，参照Szaopiel等方法将肺泡炎和肺纤维化的程度分为四级：0级无明显改变；1级轻度改变，病变范围小于全肺的20％；2级中度改变，病变范围占全肺的20％-50％；3级重度改变，病变范围占全肺的50％以上。

5、肺组织生化指标测定

将冷冻保存的小块肺组织放入试管内，准确加水解液0.1ml，混匀，加盖后沸水浴水解20min，之后将各试管液体PH值调至6.5左右，加适量活性炭，混匀，3500r/min离心10min，取上清0.6ml，依次加入三种试剂后，混匀，60℃水浴15min，3500r/min离心10min，取上清在550nm，1cm光径下测定各管的吸光度，之后按照说明书公式计算肺组织中HYP含量。

称取适量肺组织，加入冰冷生理盐水，体积为所取肺组织重量的9倍，内切式组织匀浆器制成10％肺组织匀浆，然后按照试剂盒方法进行GSH、T-AOC和MDA的测定。

6、统计学处理

采用SPSS11.0软件处理系统，实验数据以x±s表示，计量资料采用t检验；等级计数资料转化为计量资料，方法如下：0级计0分，1级计1分，依此类推，然后进行t检验，比较组间差异性。

三、结果

1、EGCG对小鼠肺系数的影响

造模后，各时间点模型组小鼠肺系数均明显高于正常对照组(P<0.01)；与模型组相比，醋酸泼尼松组及EGCG各剂量组均可明显降低肺系数(P<0.05，P<0.01)，结果见表1。

表1 EGCG对小鼠肺系数的影响(均数±标准差，n＝8)

注：##P<0.01与正常组比较；^*P<0.05，^**P<0.01与模型组比较

四、EGCG对小鼠肺组织病理形态学的影响

1、肉眼观察：给药14和28天时，正常组肺表面光滑，呈粉红色，弹性良好；模型组双肺颜色暗淡，体积增大，弹性较差，表面凹凸不平；醋酸泼尼松组及EGCG各剂量组双肺弹性较好，体积无明显改变。

2、光镜观察：正常组肺组织结构清晰，肺泡上皮细胞结构完整。造模14天肺泡炎症逐渐减轻，肺内纤维组织增生，肺泡壁增厚。28天肺泡结构破坏，肺纤维化程度加重，弥漫性肺纤维化形成。醋酸泼尼松组及EGCG各剂量组在14天炎症明显减轻，成纤维细胞增殖减少；28天肺泡间隔增宽较模型组显著减轻，肺泡结构基本正常，未见明显纤维化改变，结果见表2、表3和图1。

表2 EGCG对小鼠肺组织肺泡炎的影响(均数±标准差，n＝8)

注：##P<0.01与正常组比较；^*P<0.05，^**P<0.01与模型组比较

表3 EGCG对小鼠肺组织纤维化的影响(均数±标准差，n＝8)

注：##P<0.01与正常组比较；^*P<0.05，^**P<0.01与模型组比较

五、EGCG对小鼠肺组织HYP含量的影响

14天模型组HYP含量显著增高(P<0.01)，28天时达高峰(P<0.01)。与模型组相比，EGCG各剂量组在给药14和28天时均能显著降低肺组织中HYP含量(P<0.01)，结果见表4。

表4 EGCG对小鼠肺组织羟脯氨酸含量的影响(μg/mg，均数±标准差，n＝8)

注：##P<0.01与正常组比较；^*P<0.05，^**P<0.01与模型组比较

六、EGCG对小鼠肺组织T-AOC的影响

14天和28天模型组总抗氧化能力显著降低(P<0.01)。与模型组相比，EGCG各剂量组在给药14和28天时均能不同程度显著升高小鼠肺组织中的总抗氧化能力(P<0.05或P<0.01)，结果见表5。

表5 EGCG对小鼠肺组织T-AOC的影响(U/mgprot，均数±标准差，n＝8)

注：##P<0.01，#P<0.05与正常组比较；^*P<0.05，^**P<0.01与模型组比较

七、EGCG对小鼠肺组织MDA含量的影响

14天模型组肺组织MDA含量显著增高(P<0.01)，28天时达高峰(P<0.01)。与模型组相比，EGCG各剂量组在给药14和28天时能不同程度降低小鼠肺组织中的MDA含量，但仅有EGCG小剂量在28天时有显著意义(P<0.05)，结果见表6。

表6 EGCG对小鼠肺组织MDA含量的影响(nmol/mgprot，均数±标准差，n＝8)

注：##P<0.01与正常组比较；^*P<0.05，^**P<0.01与模型组比较

实施例2：表没食子儿茶素没食子酸酯干预对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化的影响

一、材料与方法

1、实验动物

Spragne-Dauley雄性大鼠144只，体重180～220g，清洁剂，由苏州大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证：SCXK(苏)2007—0007，实验动物使用许可证：SYXK(苏)2007—0035。

2、药物与试剂

2.1 药物 博莱霉素A5由日本化药株式会社生产；EGCG购自杭州Gosun生物科技有限公司，纯度为95％；醋酸泼尼松由江苏徐州平光制药有限责任公司生产。

2.2 试剂 羟脯氨酸(HYP)、总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和髓过氧化物酶(MPO)试剂盒由南京建成生物技术研究所提供。

3、仪器

离心机，80-2型，上海手术器械厂；光学显微镜OLYMPUS CX31；

分光光度计722型，为上海精密科学仪器有限公司生产，出厂编号：7070309047。

4、方法

4.1 造模及给药

Spragne-Dauley大鼠144只，称重，编号，随机分为6组，即正常组、模型组、EGCG大剂量(100mg/kg)组、中剂量(50mg/kg)组及小剂量(25mg/kg)组和醋酸泼尼松(3.36mg/kg)组，每组24只。模型组与各治疗组大鼠采用博莱霉素(BLM)复制动物肺纤维化模型，具体操作如下：实验大鼠用4％水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰卧于手术台上，固定头部及四肢，无菌条件下切开颈部皮肤，暴露气管，经气管缓慢注入BLM(5mg/kg体重)，缝合后立即将大鼠直立旋转3～5min，尽量使药液在肺内均匀分布。对照组在相同条件下经气管注入等体积无菌生理盐水。术后第2d，醋酸泼尼松组和EGCG各治疗组开始灌胃给药，对照组及模型组给予等体积蒸馏水，每天一次。分别于气管注射后第7，14，28天每组各处死8只动物。

4.2 标本采集

各组大鼠分别于给药后第7、14、28天用4％水合氯醛腹腔注射麻醉，钝性分离腹主动脉，取血后无菌条件下分离出气管和双肺，称重，一侧完整肺叶置于4％多聚甲醛中固定，常规切片，HE染色，另一侧肺部分保留以测定生化指标。

4.3 观察指标

(1)肺系数＝肺重(mg)/体重(g)

(2)组织病理学观察HE切片，参照Szaopiel等方法将肺泡炎和肺纤维化的程度分为四级：0级无明显改变；1级轻度改变，病变范围小于全肺的20％；2级中度改变，病变范围占全肺的20％-50％；3级重度改变，病变范围占全肺的50％以上。

(3)生化指标测定：各种生化指标按照试剂盒进行测定。

5、统计学处理

采用SPSS11.0软件处理系统，实验数据以均数±标准差表示，计量资料采用t检验；等级计数资料转化为计量资料，方法如下：0级计0分，1级计1分，依此类推，然后进行t检验，比较组间差异性。

二、结果

1、EGCG对大鼠肺系数的影响

造模后，各时间点模型组大鼠肺系数均明显高于正常对照组(P<0.O1)；醋酸泼尼松组及EGCG各治疗组可降低肺系数，提示EGCG可以降低博莱霉素所致大鼠肺纤维化模型的肺系数，结果见表7。

表7 EGCG对大鼠肺系数的影响(均数±标准差，n＝8)

注：与正常对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与模型组相比，^#P<0.05，^##P<0.01

2、EGCG对大鼠肺组织病理形态学的影响

2.1 肉眼观察：给药7、14、28天时，正常肺表面光滑，粉红色，弹性良好；模型组7天双肺颜色暗淡，有点状出血，弹性差；14天时表面凹凸不平，硬度增加；28天双肺硬度增加，体积增大，可见条索样凹沟。醋酸泼尼松组及EGCG各剂量组双肺弹性较好，体积无明显改变。

2.2 光镜观察：正常组肺组织结构清晰，肺泡壁未见增厚。造模7天时，模型组肺间质及肺泡腔内有大量炎性细胞渗出，伴有轻度出血；14天时仍可见部分炎性细胞，肺间隔增宽；28天时肺组织结构破坏，肺间质可见大量胶原纤维增生，形成弥漫性肺纤维化。醋酸泼尼松组和EGCG各剂量组较同期模型组均明显减轻(P<0.05，P<0.01)。具体见表8、表9和附图2。

表8 EGCG对大鼠肺泡炎的影响(均数±标准差，n＝8)

注：与正常对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与模型组相比，^#P<0.05，^##P<0.01

表9 EGCG对大鼠肺纤维化的影响(均数±标准差，n＝8)

注：与正常对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与模型组相比，^#P<0.05，^##P<0.01

3、EGCG对大鼠肺组织HYP的影响

造模后，各时间点模型组大鼠HYP均明显高于正常对照组(P<0.01)；醋酸泼尼松组及EGCG大、中、小治疗组可不同程度降低大鼠HYP的含量(P<0.01或P<0.05)，但小剂量组与模型组间无统计学意义(表10)。

表10 EGCG对大鼠肺组织HYP的影响(μg/mg湿重，均数±标准差，n＝8)

注：与正常对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与模型组相比，^#P<0.05，^##P<0.01

4、EGCG对大鼠肺组织T-AOC的影响

造模后，各时间点模型组大鼠T-AOC均明显低于正常对照组(P<0.01或P<0.05)；醋酸泼尼松组及EGCG大、中、小治疗组可不同程度提高大鼠T-AOC的含量(P<0.01或P<0.05)，但小剂量组与模型组间无统计学意义(表11)。

表11 EGCG对大鼠肺组织T-AOC的影响(单位/毫克蛋白，均数±标准差，n＝8)

注：与正常对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与模型组相比，^#P<0.05，^##P<0.01

5、EGCG对大鼠肺组织SOD的影响

造模后，14天和28天模型组大鼠SOD活力均明显低于正常对照组(P<0.01)；醋酸泼尼松组及EGCG大、中、小治疗组可不同程度降低大鼠HYP的含量(P<0.01或P<0.05)(表12)。

表12 EGCG对大鼠肺组织SOD的影响(U/mgprot，均数±标准差，n＝8)

注：与正常对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与模型组相比，^#P<0.05，^##P<0.01

6、EGCG对28天大鼠肺组织MDA和MPO的影响

造模后，28天模型组大鼠MDA含量和MPO含量明显高于正常对照组(P<0.05或P<0.01)。醋酸泼尼松组及EGCG大剂量治疗组可不同程度降低大鼠MDA的含量(P<0.05)，而醋酸泼尼松组及EGCG大、中剂量治疗组可不同程度降低MPO的含量(P<0.01或P<0.05)(表13)。

表13 EGCG对28天大鼠肺组织MDA和MPO的影响(均数±标准差，n＝8)

注：与正常对照组比较，^＊P<0.05，^＊＊P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01

小结

1、给药14、28天时，EGCG均可显著降低小鼠肺纤维化模型的肺系数。

2、光镜结果显示，EGCG在早期可减轻肺纤维化小鼠肺部的炎症反应，晚期可抑制胶原沉积和纤维化形成。

3、EGCG可以明显降低肺纤维化小鼠肺组织中羟脯氨酸含量，降低肺组织MDA含量，明显升高机体总抗氧化能力。

4、给药7、14、28天时，EGCG均可显著降低大鼠肺纤维化模型的肺系数。

5、光镜结果显示，EGCG可以减轻肺纤维化大鼠肺部炎症，减少胶原沉积，有抗纤维化作用。

6、EGCG可以明显降低肺纤维化大鼠肺组织中羟脯氨酸含量；提高SOD、T-AOC水平，降低MPO、MDA含量，起到抗氧化能力。

Claims (1)

1.一种表没食子儿茶素没食子酸酯在制备防治肺纤维化药物中的应用。

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