CN105232641B - 赤芍总苷在制备预防或治疗微波辐射致神经细胞损伤药物中的用途及药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了赤芍总苷在制备预防或治疗微波辐射致神经细胞损伤药物中的用途、药物组合物及食品，其中赤芍总苷在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗微波辐射致神经细胞损伤。由此，可以利用赤芍总苷制备防治微波辐射致神经细胞损伤的药物，进而可以利用制备得到的药物对可能会遭受微波辐射的人或动物进行给药预防，或者对已遭受微波辐射致神经细胞损伤的人或动物进行给药治疗，实现减少神经细胞损伤、修复受损的神经细胞的目的。

Description

赤芍总苷在制备预防或治疗微波辐射致神经细胞损伤药物中 的用途及药物组合物

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及赤芍总苷在制备预防或治疗微波辐射致神经细胞损伤药物中的用途及药物组合物。

背景技术

微波辐射的生物危害越来越受到国内外学者的广泛关注。脑是微波辐射的敏感靶器官。研究表明，微波辐射可导致神经细胞结构和功能损伤。研究发现，ROS过度生成和累积所导致的氧化应激是微波辐射引起神经细胞结构破坏和功能障碍的重要机制之一。ROS是化学性质活跃的含氧原子或原子团，它的大量产生和积聚可使类脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化反应，破坏细胞膜的结构，干扰细胞代谢，并能启动和诱导细胞程序性死亡的发生。生物体内，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为丙二醛(MDA)，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性。

近年来，对微波辐射致神经细胞损伤及其机制的研究在国内外受到普遍重视，但有效的防护药物尚缺乏。因而，目前可用于防治微波辐射致神经细胞损伤的药物的研发仍待加强。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效用于防治微波辐射致神经细胞损伤的药物。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

赤芍是毛莨科植物芍药的干燥根，具有清热凉血，散瘀止痛等药理作用，可抗血栓形成、降血脂和抗动脉硬化，对心血管系统有良好的保护作用。赤芍主要活性成分为芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷等组成单萜苷类化合物，总称赤芍总苷。发明人经多次实验研究惊喜地发现：赤芍总苷可通过降低大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系(pheochromocytoma cells，PC12)(大鼠PC12细胞系是从神经嵴衍生出来的具有分化潜能的瘤细胞，经神经生长因子(nerve growth factor，NGF)诱导后作为较成熟的神经细胞培养模型，已被广泛应用于神经细胞分化、离子通道、受体、递质释放、神经毒性等的研究)的活性氧(reactive oxygen species，ROS)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量，有效地保护微波辐射所致的神经细胞损伤。

进而，根据本发明的一个方面，本发明提供了赤芍总苷在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于预防或治疗微波辐射致神经细胞损伤。由此，基于赤芍总苷能够有效降低神经细胞活性氧和MDA的含量，减少神经细胞损伤，修复受损的神经细胞，可以利用赤芍总苷制备防治微波辐射致神经细胞损伤的药物，进而可以利用制备得到的药物对可能会遭受微波辐射的人或动物进行给药预防，或者对已遭受微波辐射致神经细胞损伤的人或动物进行给药治疗，实现减少神经细胞损伤、修复受损的神经细胞的目的。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于预防或治疗微波辐射致神经细胞损伤的药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物包含：赤芍总苷。

发明人惊奇地发现，利用本发明的药物组合物，可以有效地对可能会遭受微波辐射的人或动物进行给药预防，或者对已遭受微波辐射致神经细胞损伤的人或动物进行给药治疗，通过有效降低神经细胞活性氧和MDA的含量，减少神经细胞损伤，修复受损的神经细胞。

根据本发明的实施例，本发明的用于预防或治疗微波辐射致神经细胞损伤的药物组合物，进一步包含药学上可接受的赋形剂。由此，本发明的药物组合物能够被制备成任何便于给药的药物剂型。

根据本发明的一些具体示例，所述赋形剂为选自粘合剂、填料、涂膜聚合物、增塑剂、助流剂、崩解剂和润滑剂的至少一种。由此，能够将本发明的药物组合物制成便于给药的药物剂型。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明一个实施例，经过30mW/cm²微波辐射后神经细胞的超微结构变化检测结果，其中：

图1A为假辐射组神经细胞超微结构(标尺为500纳米)，

图1B为30mW/cm²辐射后神经细胞超微结构(标尺为500纳米)；

图2是根据本发明一个实施例，经过30mW/cm²微波辐射后神经细胞的细胞周期变化检测结果，其中：

图2A为假辐射组神经细胞细胞周期，

图2B为30mW/cm²辐射后神经细胞细胞周期；以及

图3是根据本发明一个实施例，经过30mW/cm²微波辐射后蒸馏水对照组和和赤芍总苷组的大鼠海马组织结构观察结果，其中：

图3A为蒸馏水对照组大鼠脑组织结构(标尺为50微米)，

图3B为赤芍总苷组给药后第14天大鼠脑组织结构(标尺为50微米)。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

用途

如前所述，发明人发现，赤芍总苷能够有效降低神经细胞活性氧和MDA的含量，从而减少神经细胞损伤，修复受损的神经细胞。进一步，发明人发现，利用包含赤芍总苷的药物可以对可能会遭受微波辐射的人或动物进行给药预防，或者对已遭受微波辐射致神经细胞损伤的人或动物进行给药治疗，实现有效减少神经细胞损伤、修复受损的神经细胞的目的。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了赤芍总苷在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于预防或治疗微波辐射致神经细胞损伤。

其中，需要说明的是，如本发明所使用的术语“治疗”任何疾病或病症，在其中一些实施例中指改善疾病或病症(即减缓或阻止或减轻疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一些实施例中，“治疗”指缓和或改善至少一种身体参数，包括可能不为患者所察觉的身体参数。在另一些实施例中，“治疗”指从身体上(例如稳定可察觉的症状)或生理学上(例如稳定身体的参数)或上述两方面调节疾病或病症。

术语“预防”指获病或障碍的风险的减少(即：使疾病的至少一种临床症状在主体内停止发展，该主体可能面对或预先倾向面对这种疾病，但还没有经历或表现出疾病的症状)。

药物组合物

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于预防或治疗微波辐射致神经细胞损伤的药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物包含：赤芍总苷。

发明人惊奇地发现，利用本发明的药物组合物，可以有效地对可能会遭受微波辐射的人或动物进行给药预防，或者对已遭受微波辐射致神经细胞损伤的人或动物进行给药治疗，通过有效降低神经细胞活性氧和MDA的含量，减少神经细胞损伤，修复受损的神经细胞。

当将本发明的药物组合物用于治疗微波辐射致神经细胞损伤时，治疗有效量的赤芍总苷作为药物组合物的活性成分提供。

此外，根据本发明的实施例，本发明的用于预防或治疗微波辐射致神经细胞损伤的药物组合物，可以进一步包含药学上可接受的赋形剂。由此，本发明的药物组合物能够被制备成任何便于给药的药物剂型。其中，根据本发明的一些具体示例，所述赋形剂为选自粘合剂、填料、涂膜聚合物、增塑剂、助流剂、崩解剂和润滑剂的至少一种。由此，能够将本发明的药物组合物制成便于给药的药物剂型。

根据本发明的另一些实施例，所述药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载体、辅剂或赋形剂，以及任选地，其它的治疗和/或预防成分。

合适的载体、辅剂和赋形剂对于本领域技术人员是熟知的并且详细描述于例如Ansel H.C.et al.,Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems(2004)Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia；Gennaro A.R.et al.,Remington：The Science and Practice of Pharmacy(2000)Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia；和Rowe R.C.,Handbook of Pharmaceutical Excipients(2005)Pharmaceutical Press,Chicago中。

本文所使用的术语“治疗有效量”是指足以显示出有意义的患者益处的各活性组分的总量。当使用单独的活性成分单独给药时，该术语仅指该成分。当组合应用时，该术语则是指不论组合、依次或同时给药时，都引起治疗效果的活性成分的组合量。从与制剂其他成分相容以及对其接受者无害的意义上来讲，载体、稀释剂或赋形剂必须是可接受的。

根据本发明的另一方面，还提供了用于制备药物制剂的方法，该方法包括将赤芍总苷与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混匀。本发明所使用的术语“药学上可接受的”是指这样的化合物、原料、组合物和/或剂型，它们在合理医学判断的范围内，适用于与患者组织接触而无过度毒性、刺激性、变态反应或与合理的利益/风险比相对称的其他问题和并发症，并有效用于既定用途。

通常，赤芍总苷通过用于发挥类似效用的物质的任何常规施用方式以治疗有效量被施用。适宜的剂量范围取决于多种因素，例如所治疗疾病的严重性、施用对象的年龄和相对健康状况、所用赤芍总苷的效力、施用的途径和形式、施用所针对的适应症以及相关医学执业者的偏好和经验。治疗所述疾病领域的普通技术人员无需过多实验依靠个人知识和本申请的公开内容即能确定用于给定疾病的赤芍总苷的治疗有效量。

通常，本发明的药物组合物以药物制剂形式施用，所述的药物制剂包括那些适于口服(包括口腔和舌下)、直肠、鼻、局部、肺、阴道或胃肠外(包括肌内、动脉内、鞘内、皮下和静脉内)施用的药物制剂或适于吸入或吹入施用形式的药物制剂。优选的施用方式通常为口服，使用合适的日剂量方案，可根据疾痛程度对其进行调整。

可将赤芍总苷与一种或多种常规辅剂、载体或稀释剂一起置于药物组合物和单位剂量形式中。药物组合物和单位剂量形式可包含常规比例的常规成分，含或不含另外的活性化合物或成分，单位剂量形式可以含有与所应用的计划日剂量范围相称的任何适宜的有效量的活性成分。药物组合物的应用形式可以是固体例如片剂或填充胶囊剂、半固体、粉末、缓释制剂或液体例如溶液剂、混悬剂、乳剂、酏剂或口服使用的填充胶囊剂；或是用于直肠或阴道施用的栓剂形式；或是用于胃肠外使用的无菌注射用溶液形式。因此，每片中含有约1mg活性成分或更宽地，含有约0.01至约100mg活性成分的制剂是适宜的代表性的单位剂量形式。

具体地，本发明的可以配制成各种口服施用的剂量形式。药物组合物和剂量形式可以包含赤芍总苷作为活性成分。可药用的载体可以是固体或液体。固体形式的制剂包括：散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和可分散的颗粒剂。固体载体可以是一种或多种物质，其也可以用作稀释剂、矫味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包囊材料。在散剂中，载体通常为研细的固体，其与研细的活性成分形成混合物。在片剂中，活性成分通常与具有必需粘合能力的载体以适宜的比例相混合并压制成所需的形状和大小。适宜的载体包括但不限于碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。术语“制剂”旨在包括含有包囊材料作为载体以提供胶囊的活性化合物的制剂，在所述胶囊中带有或不带有载体的活性成分被与之结合的该载体所包围。类似地，还包括扁囊剂和锭剂。片剂、散剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂均是适于口服施用的固体形式。

其它适于口服施用的形式包括液体形式的制剂(包括乳剂、糖浆、酏剂、水性溶液剂、水性混悬剂)或者在使用前即刻转变为液体形式制剂的固体形式的制剂。乳剂可以在溶液例如丙二醇水溶液中制备或可以含有乳化剂例如卵磷脂、脱水山梨醇单油酸酯或阿拉伯胶。水性溶液剂可通过将活性成分溶解在水中并加入适宜的着色剂、矫味剂、稳定剂和增稠剂来制备。水性混悬剂可通过用粘性物质例如天然或合成的胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其它公知的悬浮剂将研细的活性成分分散在水中来制备。液体形式的制剂包括溶液剂、混悬剂和乳剂，除了活性成分外其还可以含有着色剂、矫味剂、稳定剂、缓冲剂、人造的和天然的甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。

赤芍总苷可被配制用于胃肠外施用(例如，通过注射如快速浓注或连续输注施用)并且可以以单位剂量形式存在于安瓿、预先灌装的注射器、小容量输液中或存在于添加了防腐剂的多剂量容器中。药物组合物可采用的形式有例如在油性或水性赋形剂中的混悬剂、溶液剂或乳剂，例如在聚乙二醇水溶液中的溶液剂。油性或非水性载体、稀释剂、溶剂或赋形剂的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和注射用有机酯(例如油酸乙酯)，并且可含有制剂物质如防腐剂、湿润剂、乳化剂或悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以为粉末形式，其获得方法是将无菌固体进行无菌分装或通过将溶液冻干以便在使用前用适宜的赋形剂例如无菌、无热原的水进行构建。

赤芍总苷可被配制用于以软膏剂、乳膏剂或洗剂形式或以透皮贴剂形式局部施用于表皮。软膏剂和乳膏剂可以例如用添加了适宜的增稠剂和/或胶凝剂的水性或油性基质进行配制。洗剂可以用水性或油性基质配制并且通常还含有一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。适用于在口中局部施用的制剂包括：在经矫味的基质中包含活性剂的锭剂，所述经矫味的基质通常是蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶；在惰性基质中含有活性成分的软锭剂，所述惰性基质例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶；以及在合适的液体载体中包含活性成分的漱口剂。

赤芍总苷可被配制用于以栓剂形式施用。可首先将低熔点蜡如脂肪酸甘油酯混合物或可可脂熔化，并将活性成分例如通过搅拌均匀分散。然后将熔融的均匀混合物倒入合适大小的模具中，使其冷却并固化。

赤芍总苷可被配制用于阴道施用。除活性成分外还含有本领域公知载体的阴道栓、卫生栓、乳青剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂是适宜的。

赤芍总苷可被配制用于经鼻施用。可将溶液剂或混悬剂通过常规方法、例如用滴管、吸管或喷雾器直接应用于鼻腔。制剂可以是单剂量或多剂量形式。对于滴管或吸管的多剂量形式，这可以通过由患者施用适宜的、预定体积的溶液剂或混悬剂来实现。对于喷雾器，这可以例如通过计量雾化喷雾泵来实现。

赤芍总苷可被配制用于气雾剂施用，特别是施用于呼吸道并且包括鼻内施用。这里采用的赤芍总苷通常具有小的粒度，例如5微米或更小数量级的粒度。所述的粒度可通过本领域公知的方法、例如通过微粉化获得。活性成分以含有适宜抛射剂如含氯氟烃(CFC)例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷或者二氧化碳或其它适宜气体的加压包装提供。气雾剂还可合适地含有表面活性剂如卵磷脂。药物剂量可通过计量阀控制。或者，活性成分可以以干燥粉末形式、例如在适宜粉末基质如乳糖、淀粉、淀粉衍生物如羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮中的化合物的粉末混合物形式提供。粉末载体将在鼻腔中形成凝胶。粉末组合物可以以单位剂量形式例如以明胶胶囊剂或药筒或泡罩包装形式存在可通过吸入器由其中施用粉末。

需要时，制剂可以用适于缓释或控释施用活性成分的肠溶包衣进行制备。例如，赤芍总苷可被配制成透皮或皮下药物递送装置。当必须缓释化合物(赤芍总苷)时和当患者对治疗方案的依从性至关重要时，这些递送系统是有利的。透皮递送系统中的化合物经常附着在皮肤粘着性固体载体上。所关注的化合物也可以与渗透促进剂、例如月桂氮革酮(1-十二烷基氮杂环庚-2-酮)组合使用。可通过手术或注射将缓释递送系统皮下插入到皮下层。皮下植入物将化合物包囊在液体可溶性膜、例如硅橡胶或生物可降解的聚合物例如聚乳酸中。

药物制剂优选为单位剂量形式。在该形式中，制剂被细分为含有适宜量活性成分的单位剂量。单位剂量形式可以是成套包装的制剂，包装中含有离散量的制剂，例如成套包装的片剂、胶囊剂和在小瓶中的粉末或安瓶剂。另外，单位剂量形式可以是胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者其可以是成套包装形式中适宜数量的这些形式中的任何一种。

其它适宜的药用载体和它们的制剂在Remington：The Science and Practice ofPharmacy 1995Martin，E.W编辑，Mack Publishing Company，第19版，Easton，Pennsylvania中有描述。

本发明的药物组合物可用于制备预防或治疗微波辐射致神经细胞损伤的药物。

本发明的药物组合物包含赤芍总苷，以及药学上可接受的载体，辅剂或赋形剂。本发明的药物组合物中赤芍总苷的量可以有效地可探测地降低神经细胞活性氧和MDA的含量以便预防或治疗微波辐射致神经细胞损伤。

本发明的药物组合物的“有效量”或“有效剂量”是指处理或减轻微波辐射致神经细胞损伤的严重度的有效量。根据本发明的实施例，赤芍总苷和包含赤芍总苷的药物组合物可以是任何给药量和任何给药途径来有效地用于处理或减轻疾病的严重程度。必需的准确的量将根据患者的情况而改变，这取决于种族，年龄，患者的一般条件，感染的严重程度，特殊的因素，给药方式，等等。赤芍总苷或包含赤芍总苷的药物组合物可以和一个或多个其他治疗剂联合给药。

本发明的药物组合物除了对人类治疗有益以外，还可应用于兽医治疗宠物、引进品种的动物和农场的动物中的哺乳动物。另外一些动物的实例包括马、狗和猫。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1、培养诱导PC12细胞

从液氮中取出具有神经元及神经分泌细胞特性的PC12细胞系，放入37摄氏度水中，融化后吸入离心管，再加入1.5毫升含10％胎牛血清、5％马血清、青霉素100单位/毫升和链霉素100微克/毫升的DMEM培养基(dubecco’s minimal essential medium，DMEM)培养，1000转/分钟离心10分钟，弃去上清，加入4毫升上述培养基吹打均匀后吸至培养瓶中，隔日换液，37摄氏度，5％CO₂条件下培养及传代；上述培养的细胞系传3代后，采用5纳克/毫升NGF、1％胎牛血清的DMEM培养基诱导其分化为类神经元细胞。

通过细胞倒置显微镜对培养中的细胞进行观察，发明人发现，NGF诱导前PC12细胞呈圆形，折光性强，半贴壁生长，经过5纳克/毫升NGF诱导后，可见细胞逐渐有小突起长出，诱导5天～10天后PC12细胞胞体呈圆形或锥形，突起丰富、细长并交织成网状，似成熟神经元细胞。

2、对PC12细胞进行微波辐射

将上述NGF诱导获得的PC12细胞接种于培养板中，随机平分为两组：假辐射组和微波辐射组。针对微波辐射组，采用军事医学科学院微波辐射源对神经细胞进行均匀辐射，微波辐射源的平均功率密度为30mW/cm²，辐射6分钟；针对假辐射组，将神经细胞置于辐射台上，不予辐射。

3、微波辐射后PC12细胞结构观察

针对各组，于辐射后6小时离心收集PC12细胞(1×10⁶个/毫升)，利用2.5％戊二醛固定2小时，1％锇酸后固定2小时，梯度乙醇和丙酮脱水，Epon 812树脂包埋，制作超薄切片(厚70纳米)，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，然后进行透射电镜观察并摄像。结果见图1。

由图1的结果可知，假辐射组的PC12细胞呈正常细胞结构(图1A)。微波辐射组，在30mW/cm²微波辐射后6h，PC12细胞的线粒体肿胀、嵴紊乱断裂，可见线粒体空化，内质网肿胀(图1B)。

4、微波辐射后PC12细胞周期检测

于辐射后6小时离心收集PC12细胞(1×10⁶个/毫升)，用磷酸缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)洗涤细胞2次，1000转/分钟离心10分钟，弃上清，沉淀加300微升5％小牛血清PBS吹打均匀，加700微升无水乙醇混匀，-20摄氏度放置24小时以上。测定前，细胞3000转/分钟离心1分钟，去除乙醇，沉淀加1毫升PBS清洗1次，3000转/分钟离心1分钟，弃上清，沉淀加1毫克/毫升RNA酶A 100微升，37摄氏度水浴30分钟，加入100微克/毫升碘化丙啶300微升，暗处放置20分钟，然后利用流式细胞仪检测，分析系统自动输出荧光强度对细胞数目直方图及G₀-G₁、S和G₂-M期的细胞数。结果见图2和表1。

表1 30mW/cm²微波辐射后PC12细胞周期的改变(％)

组别	G<sub>0</sub>-G<sub>1</sub>	G<sub>2</sub>-M	S
				假辐射组	69.40±3.57	12.15±1.35	18.44±1.65
微波辐射组	79.17±3.28<sup>*</sup>	8.78±2.44<sup>**</sup>	12.05±1.03<sup>**</sup>

*表示与假辐射组相比，P<0.05，

**表示与假辐射组相比，P<0.01。

由表1可见，微波辐射组较假辐射组G₀-G₁期细胞数增加(P<0.05)，微波辐射组G₂-M期细胞数较假辐射组显著降低(P<0.01)，微波辐射组S期细胞数较假辐射组显著降低(P<0.01)。表明30mW/cm²微波辐射后PC12细胞的G₀-G₁期细胞数增加，细胞生长抑制。

5、微波辐射后PC12细胞凋亡的检测

于辐射后6小时收集PC12细胞(6×10⁵个/毫升)，PBS洗2次，1000转/分钟4摄氏度离心5分钟，弃上清；沉淀用PBS洗2次，将细胞重悬于200微升结合缓冲液，加入10微升Annexin V-FITC和5微升碘化丙啶，混匀反应15分钟，加入300微升结合缓冲液，然后利用流式细胞仪检测PC12细胞凋亡与坏死率。结果见表2。

表2 30mW/cm²微波辐射后PC12细胞凋亡和坏死率的改变(％)

组别	凋亡率	坏死率
			假辐射组	11.80±0.96	20.05±3.95
微波辐射组	15.17±0.86<sup>**</sup>	19.51±1.42

**表示与假辐射组相比，P<0.01。

由表2可见，30mW/cm²微波辐射后6小时，PC12细胞凋亡率增加(P<0.01)，坏死率无明显改变。

实施例2赤芍总苷对微波辐射致PC12细胞内ROS含量变化的影响

1、培养、诱导PC12细胞

从液氮中取出具有神经元及神经分泌细胞特性的PC12细胞系，放入37摄氏度水中，融化后吸入离心管，再加入1.5毫升含10％胎牛血清、5％马血清、青霉素100单位/毫升和链霉素100微克/毫升的DMEM培养基(dubecco’s minimal essential medium，DMEM)培养，1000转/分钟离心10分钟，弃去上清，加入4毫升上述培养基吹打均匀后吸至培养瓶中，隔日换液，37摄氏度，5％CO₂条件下培养及传代；上述培养的细胞系传3代后，采用5纳克/毫升NGF、1％胎牛血清的DMEM培养基诱导其分化为类神经元细胞。

通过细胞倒置显微镜对培养中的细胞进行观察，发明人发现，NGF诱导前PC12细胞呈圆形，折光性强，半贴壁生长，经过5纳克/毫升NGF诱导后，可见细胞逐渐有小突起长出，诱导5天～10天后PC12细胞胞体呈圆形或锥形，突起丰富、细长并交织成网状，似成熟神经元细胞，可备用。

2、对PC12细胞进行微波辐射

将上述获得的PC12细胞随机分为三组：假辐射组、微波辐射组、赤芍总苷给药辐射组。针对赤芍总苷给药辐射组，预先将赤芍总苷(西安斯诺特生物技术有限公司，产品批号：SNT20140920)以二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide；dimethyl sulphoxide，DMSO)溶解，制成浓度为3微克/毫升的赤芍总苷溶液，并于辐射前48小时加入PC12细胞培养基中，然后采用军事医学科学院微波辐射源对PC12细胞进行均匀辐射，微波辐射源的平均功率密度为30mW/cm²，辐射6分钟；针对微波辐射组，于辐射前48小时，向PC12细胞培养基中给予与赤芍总苷给药辐射组的赤芍总苷溶液等体积的DMSO，然后采用军事医学科学院微波辐射源对PC12细胞进行均匀辐射，微波辐射源的平均功率密度为30mW/cm²，辐射6分钟；针对假辐射组，于辐射前48小时，向PC12细胞培养基中给予与赤芍总苷给药辐射组的赤芍总苷溶液等体积的DMSO，然后将PC12细胞置于辐射台上，不予辐射。

3、检测PC12细胞内ROS含量

按照1:1000用无血清培养液稀释荧光探针DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升，备用。

针对各组，均在辐射后即刻去除细胞培养液，并加入上述获得的10微摩尔/升的DCFH-DA(其中加入DCFH-DA的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于6孔板的1个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1ml)，然后于37摄氏度的细胞培养箱内孵育20分钟。接着，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。并且，检测时，各组均设设阳性对照孔，仅在阳性对照孔中加入Rosup(活性氧激动剂，生产厂家：北京普利莱基因公司；产品货号：C1300)作为阳性对照(通常活性氧阳性对照在刺激细胞20～30分钟后可以显著提高活性氧水平)，其余孔不必加入Rosup。然后，收集各组的细胞并分别用荧光分光光度计(生产厂家：Perkin Elmer，产品型号：Victor X3)(488纳米激发波长，525纳米发射波长)检测，每组至少重复检测3次。结果见表1。

表3赤芍总苷对微波辐射致PC12细胞内ROS含量的影响(×10⁴)

组别	ROS含量
		假辐射组	2.86±1.11
辐射组	44.11±12.56<sup>**</sup>
		赤芍总苷给药组+辐射组	16.09±8.29<sup>##</sup>

^**与假辐射组相比，P<0.01；

^##与辐射组相比，P<0.01。

由表3可知，与假辐射组相比，辐射组经30mW/cm²微波辐射后PC12细胞内的ROS明显增加(P<0.01)。与辐射组相比，赤芍总苷给药辐射组的ROS含量明显下降(P<0.01)。表明赤芍总苷可抑制微波辐射引起的PC12细胞ROS的升高，改善微波辐射所致的神经细胞氧化应激损伤。

实施例3赤芍总苷对微波辐射致PC12细胞内MDA含量变化的影响

1、培养、诱导PC12细胞

从液氮中取出具有神经元及神经分泌细胞特性的PC12细胞系，放入37摄氏度水中，融化后吸入离心管，再加入1.5毫升含10％胎牛血清、5％马血清、青霉素100单位/毫升和链霉素100微克/毫升的DMEM培养基(dubecco’s minimal essential medium，DMEM)培养，1000转/分钟离心10分钟，弃去上清，加入4毫升上述培养基吹打均匀后吸至培养瓶中，隔日换液，37摄氏度，5％CO₂条件下培养及传代；上述培养的细胞系传3代后，采用5纳克/毫升NGF、1％胎牛血清的DMEM培养基诱导其分化为类神经元细胞。

通过细胞倒置显微镜对培养中的细胞进行观察，发明人发现，NGF诱导前PC12细胞呈圆形，折光性强，半贴壁生长，经过5纳克/毫升NGF诱导后，可见细胞逐渐有小突起长出，诱导5天～10天后PC12细胞胞体呈圆形或锥形，突起丰富、细长并交织成网状，似成熟神经元细胞，可备用。

2、对PC12细胞进行微波辐射

将上述获得的PC12细胞随机分为三组：假辐射组、微波辐射组、赤芍总苷给药辐射组。针对赤芍总苷给药辐射组，预先将赤芍总苷(西安斯诺特生物技术有限公司，产品批号：SNT20140920)以二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide；dimethyl sulphoxide，DMSO)溶解，制成浓度为3微克/毫升的赤芍总苷溶液，并于辐射前48小时加入PC12细胞培养基中，然后采用军事医学科学院微波辐射源对PC12细胞进行均匀辐射，微波辐射源的平均功率密度为30mW/cm²，辐射6分钟；针对微波辐射组，于辐射前48小时，向PC12细胞培养基中给予与赤芍总苷给药辐射组的赤芍总苷溶液等体积的DMSO，然后采用军事医学科学院微波辐射源对PC12细胞进行均匀辐射，微波辐射源的平均功率密度为30mW/cm²，辐射6分钟；针对假辐射组，于辐射前48小时，向PC12细胞培养基中给予与赤芍总苷给药辐射组的赤芍总苷溶液等体积的DMSO，然后将PC12细胞置于辐射台上，不予辐射。

3、检测PC12细胞内MDA含量

针对各组，于辐射后48小时收集PC12细胞，并利用MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)分别检测各组PC12细胞内的MDA含量，具体地：

根据该MDA试剂盒的说明书，向收集获得的PC12细胞加入裂解液0.5毫升，混匀2分钟，再加入MDA试剂盒工作液，95摄氏度水浴40分钟，冷却后4000转/分钟离心10分钟，然后利用荧光分光光度计(生产厂家：Perkin Elmer，产品型号：Victor X3)于532纳米处测定吸光度值。

接着，根据下列计算公式计算出MDA含量：

结果见表4。

表4赤芍总苷对微波辐射致PC12细胞内MDA含量的影响(纳摩尔/毫升)

组别	MDA含量
		假辐射组	10.94±1.97
辐射组	12.81±0.87<sup>*</sup>
		赤芍总苷给药组+辐射组	10.20±0.66<sup>#</sup>

^*与假辐射组相比，P<0.05；

^##与辐射组相比，P<0.05。

由表4可知，与假辐射组相比，辐射组经30mW/cm²微波辐射后PC12细胞内MDA明显增加(P<0.05)。与辐射组相比，赤芍总苷给药辐射组PC12细胞内的MDA含量明显下降(P<0.05)。表明赤芍总苷可抑制微波辐射引起的PC12细胞内MDA的升高，改善微波辐射所致的神经细胞损伤。

实施例4赤芍总苷对微波辐射致大鼠神经细胞损伤的影响

取10只二级雄性Wistar大鼠，随机分成2组，蒸馏水对照组5只，赤芍总苷组5只。用军事医学科学院微波辐射源对其进行全身均匀辐射，微波辐射源的平均功率密度为30mW/cm²，辐射15分钟。各组大鼠于辐射后当天开始灌胃给药，每天1次，连续14d，赤芍总苷给药剂量为40mg/kg/d，注射剂的溶剂为蒸馏水，其中蒸馏水对照组大鼠的赤芍总苷注射量为0，即仅注射该蒸馏水。

分别于辐射后第14天即停药后第1天，脱臼处死大鼠，取大鼠的脑组织，10％缓冲福尔马林固定后，进行石蜡切片，然后对切片进行HE染色，观察脑组织的修复情况。结果见图3。

图3是经过30mW/cm²微波辐射后蒸馏水对照组和和赤芍总苷组的大鼠海马组织结构观察结果，其中图3A为蒸馏水对照组大鼠脑组织结构(标尺为50微米)，图3B为赤芍总苷组给药后第14天大鼠脑组织结构(标尺为50微米)。结果显示相较蒸馏水对照组，注射赤芍总苷能改善辐射致神经细胞的损伤。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (1)

1.赤芍总苷作为唯一活性成分在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗微波辐射致神经细胞损伤。