CN101716171A - 黄芩素提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黄芩素提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用，通过气管内滴注博莱霉素(Bleomycin，BLM)复制小鼠肺纤维化动物模型，首次选用黄芩素提取物作为治疗药物，研究黄芩素提取物对肺纤维化动物肺组织及血清相关生化指标及病理学改变的影响，观察黄芩素提取物对肺纤维化动物模型的治疗作用，从而为黄芩素提取物治疗肺纤维化提供实验依据。所述的药物为含有治疗有效量的黄芩素提取物可与药学上可接受的载体结合制备药物。

Description

黄芩素提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种传统中药中的有效成分提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用，具体为中药黄芩中的黄芩素提取物在制备预防和/或治疗肺纤维化药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

中药黄芩别名山茶根、黄芩茶、黄金条根，为唇形科(Labiatae)黄芩属(Scutellaria)多年生草本植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根，始载于东汉《神农本草经》，列为中品，药用历史悠久，历代本草均有记载，是我国大宗中药材之一。其性寒味苦，归肺、胆、胃、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒、止血，安胎等功效。黄芩同科植物有滇黄芩、粘毛黄芩、丽江黄芩，同属植物有甘肃黄芩及川黄芩。黄酮类化合物是黄芩的主要化学成分，目前已分离出四十多种，包括黄芩素(baicalein)、黄芩苷(baicalin)、汉黄芩素(wogonin)、汉黄芩苷(wogonoside)、千层纸素A(oroxylin-A)、白杨黄素(chrysin)、千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷(oroxylin-A-7-glucuronide)、黄芩新素I、II(skullcapflavone)、二氢黄芩苷(dihydrobaicalin)等，前四种为其最主要的活性成分。还有14种氨基酸、挥发油、豆甾醇和黄芩酶等。黄酮类成分是其发挥药理活性的基础，现代药理研究表明：黄芩及其黄酮类成份(黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素等)具有抗微生物、抗炎和抗变态反应，低剂量增强免疫功能、高剂量抑制免疫功能，降血压，降血脂，利尿，抗血小板聚集和抗凝，抗氧化及中枢镇静解热等作用。

黄芩素(Baicalein)，异名：黄芩苷元，黄芩黄素，是从黄芩的干燥根中提取出来的有效成分之一，在生药中占(ratio in of raw material)5.41％。黄芩素的醇提物为黄色针状晶体，分子量(MW)270.3，分子式为C₁₅H₁₀O₅，分子结构为5，6，7-三羟基黄酮，其化学结构属于黄酮类。研究表明黄芩素具有抗炎抗变态反应、抗氧化清除氧自由基、抗菌抗病毒、抗肿瘤、抗凝抗血栓形成、保护心脑血管和神经、抗焦虑等多种药理作用，最近研究表明其对糖尿病晚期肾脏发生纤维化样病变具有一定的防治作用。目前，临床上主要用黄芩素的抗炎和抗菌作用。

肺(间质)纤维化(Pulmonary fibrosis，PF)又称肺间质疾病(interstitiallung disease，ILD)，或弥漫性肺实质疾病(diggese parenchymal lungdisease，DPLD)，是以弥漫性的肺泡炎、肺间质炎症和间质纤维化为组织学特点的一组疾病群，涵盖的疾病有180多种，多数疾病缺乏有效的治疗手段，预后极差。因此，该组疾病目前引起世界呼吸病学届的重视。目前，对肺纤维化的临床研究主要集中在特发性间质肺纤维化(idiopathic pulmonaryfibrosis，IPF)方面，因其进展快、死亡率高而被世界卫生组织(WHO)列为肺系疑难疾病，也是遍及全世界的疾病。IPF确诊后平均存活期为2-4年，5年生存率50-70％。

肺纤维化的病理特点主要是长期肺部炎症导致肺泡持续性损伤，肺内间质细胞增生及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的大量沉积和广泛的肺实质重建。各种因素损伤肺泡上皮细胞和血管内皮细胞后，均可引起肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润，炎症细胞及其释放的细胞因子介导了早期的肺损伤，损伤的存在和反复而改变肺组织微环境，特别是肺泡腔，从而导致修复程序的失调，最终形成肺纤维化。

成纤维细胞参与人体各种组织和器官的损伤、修复和再生等过程，生理情况下肺成纤维细胞的生长存在精确的调控，肺内胶原的合成与降解处于平衡状态。肺成纤维细胞在各种因素所致的慢性肺间质纤维化形成过程中发挥着重要的作用。肺成纤维细胞的异常增殖及向肺肌成纤维细胞的表型转化被认为是IPF的主要特征。

胶原纤维是ECM的重要组成部分，其生化成份是胶原蛋白(collagen，简称胶原)。羟脯氨酸(hydroxproline，HYP)是机体胶原蛋白的主要成分之一，约占其氨基酸总量的13.4％，组织中HYP含量可作为其胶原组织代谢、衡量胶原含量及反映间质胶原纤维沉积的重要指标。

近年来，自由基损伤、脂质过氧化成为肺纤维化的热点之一。正常情况下，肺的抗氧化能力与机体不断产生自由基的氧化能力之间处于动态平衡。研究证实，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，SOD活性高低直接反映了机体清除自由基的能力。机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，氧自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并形成脂质过氧化物，如醛基(丙二醛malondialdehyde，MDA)、酮基、羟基(·OH)、新的自由基等。因此，体内MDA的含量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度。机体氧化应激存在时，通过一氧化氮合酶(NOS)形成一氧化氮(NO)，可与超氧阴离子结合，形成过氧亚硝酸盐阴离子(ONOO-)，从而产生肺毒性。

众多研究结果证实，与其他器官纤维化一样，肺纤维化是ECM过度沉积的过程，涉及到细胞、细胞因子、ECM等因素的相互作用，信号分子途径之间可能相互影响，存在多条旁路途径。因此，肺纤维化是多种因素、多个环节参与的缓慢的错综复杂的过程，目前尚缺乏特异有效的防治肺纤维化的药物。

中药具有多成分、多靶点、多途径的作用特点，在慢性肺纤维化疾病的治疗中显示了一定的优势。目前发现，对肺纤维化有一定治疗效果的中药研究主要集中于：(1).抗自由基损伤；(2).抑制炎症因子的释放，发挥抗炎性损伤作用；(3).影响胶原代谢过程，从而减少纤维蛋白形成；(4).影响机体免疫系统功能，降低应激效应程度(杨珺，潘强，王世岭，等。中国药业，2004，13(8)：21-24)。鉴于黄芩素提取物具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗菌抗病毒等多方面的药理作用，且至今尚未见有应用黄芩素提取物防治肺纤维化疾病的报道，因此本发明人研究了黄芩素提取物对BLM诱导肺纤维化小鼠动物模型是否具有防治作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是研究传统中药黄芩的黄芩素提取物在制备抗肺纤维化药物中的应用，尤其是从中药中提取分离防治肺纤维化的有效成份，以便制备疗效好、毒副作用小、价格低廉、服用方便，可长期使用的抗肺纤维化药物。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

黄芩素提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用

本发明的技术方案是：通过气管内注入博莱霉素(Bleomycin，BLM)制备小鼠肺纤维化动物模型，该模型的病理过程与人类特发性肺间质纤维化(IPF)相似，作为肺纤维化的经典动物模型而被广泛应用。本发明首次选用黄芩素提取物作为治疗药物，研究黄芩素提取物对BLM诱导肺纤维化动物肺组织、血清相关生化指标及病理形态学的影响，观察黄芩素提取物对肺纤维化动物模型的防治作用，从而为黄芩素提取物防治肺纤维化提供实验依据。

本发明所用黄芩素提取物中黄芩素含量≥50％(批号：090429)，由本所植化室参考现有技术从黄芩根中提取而得，所用中药材黄芩购自河北安国市新东方药业有限责任公司，黄芩素提取物也可由商业购得。

本发明人在研究中药抗肺阻塞性疾病的过程中，发现传统中药黄芩中的黄芩素提取物(黄芩素含量≥50％)给药28天后可使博莱霉素(BLM)诱导肺纤维化小鼠的体重明显增加(P＜0.01)，并可明显降低小鼠肺系数(P＜0.05，P＜0.01)(实施例1)；其血清和肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性增强或明显增强(P＜0.05，P＜0.01)，脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)含量减少或明显减少(P＜0.05，P＜0.01)(实施例2、3)；血清抑制羟自由基能力(·OH)明显增强(P＜0.01)(实施例2)，肺组织总抗氧化能力(T-AOC)增强或明显增强(P＜0.05，P＜0.01)(实施例3)。肺组织抑制羟自由基(·OH)能力增强(P＜0.05)(实施例4)，而总一氧化氮合酶(T-NOS)活性降低(P＜0.05)(实施例4)。肺组织中可间接反映胶原含量的羟脯氨酸(HYP)含量明显减少(P＜0.01)(实施例5)。进一步发现，黄芩素提取物可减轻或明显减轻肺纤维化小鼠的肺泡炎程度(P＜0.05，P＜0.01)及减轻或明显减轻肺纤维化程度(P＜0.05，P＜0.01)(实施例6)。这些实验结果证明：黄芩素提取物具有防治肺纤维化作用，具体体现为增加肺纤维化小鼠体重，降低肺系数，减轻肺泡炎程度和肺间质纤维化程度。其作用机制涉及抗炎症反应、增强机体抗脂质过氧化能力、抑制羟自由基产生、增强氧自由基清除、抑制细胞间质胶原生成、沉积及成纤维细胞增殖等方面。由鉴于此，按本发明所制备的黄芩素提取物有可能作为潜在的侯选药物，被用于肺阻塞性疾病，特别是肺纤维化的预防和治疗。因此，本发明的目的是提供一种传统中药黄芩中的黄芩素提取物用于防治肺阻塞性疾病，特别是在肺纤维化疾病药物中的应用。

本发明的再一个目的是提供含有本发明制备的黄芩素提取物，及一种或多种原药上可接受的载体和/或赋形剂的药物。本发明的药物除含有本发明制备的黄芩素提取物外，还可含有一种或多种具有相同或相似作用的其他天然或化学合成的活性成分。

可以按照工作中已知的方法将本发明的药物制成片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、栓剂、膏剂及溶液剂和悬浮剂。其中优选的是适用于胃肠道给药的胶囊剂和片剂。在制备适用于口服给药的胶囊剂、片剂、丸剂和粉末剂时，可以使用蔗糖、乳糖、玉米淀粉、微晶纤维素、羧甲基纤维素作为载体或赋形剂。

此外，也可以使用制药工业中已知的方法和辅助成分将本发明的药物制成适于口服给药的溶液剂和悬浮剂。为了制备适于胃肠道外途径给药的溶液剂或悬浮剂，可以使用蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠溶液或葡萄糖溶液，或者低浓度(例如1-100mM)磷酸盐缓冲液(PBS)作为载体或稀释剂。可以在这些胃肠道外给药的制剂中加入一种或多种其他辅助成分或添加剂，例如可使用抗坏血酸作为抗氧化剂，使用苯甲酸钠等作为防腐剂。在这些剂型中还可以含有其他适当的增溶剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、分散剂或表面活性剂。

一般说来，本发明药物组合物的临床口服给药剂量为0.1-100mg/Kg体重/天，较好为0.1-50mg/Kg体重/天，最好为1-10mg/Kg体重/天。然而，更确切的用药剂量应根据待治疗的疾病或病例状况性质、严重程度、患者的年龄、体重、待治疗患者对所用药的敏感性及给药方式等因素由临床医生决定。

本发明基于中药黄芩中的黄芩素提取物组成的药物，有效成分单一，疗效确切，使用方便，可广泛应用于制备防治肺纤维化及相关疾病的药物中。

本发明的优点是：

1.本发明首次将传统中药黄芩的有效成分——黄芩素提取物应用于经典而被广泛应用的肺纤维化动物模型，进行防治肺纤维化的实验研究。

2.本发明发现黄芩素提取物可明显增加模型小鼠的体重，同时明显降低模型小鼠的肺系数，并可有效地减轻肺组织的肺泡炎和肺纤维化程度，提示黄芩素提取物具有一定的防治肺纤维化作用。

3.本发明发现黄芩素提取物的抗纤维化作用机制与其抗炎症反应、增强机体抗氧化作用、减少羟自由基产生、增强氧自由基清除、抑制胶原生成及成纤维细胞增殖有关。

4.黄芩药材来源丰富、价格低廉，黄芩素提取工艺成熟、药理作用广、疗效确切、服用方便，可长期服用。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

附图为黄芩素提取物对博莱霉素致小鼠肺纤维化影响的病理观察结果(HE×100)

图1为正常对照组：肺组织结构清晰，肺泡腔透亮，肺泡壁完整，肺泡间隔未见增厚及炎细胞浸润。

图2为模型组；肺组织结构紊乱，肺泡腔变窄或消失，肺泡间隔显著增厚，肺间质大量成纤维细胞增生和胶原纤维沉积，大量炎细胞浸润，肺间质纤维化形成。

图3为黄芩素提取物小剂量组：肺泡结构清晰，有较少纤维化病灶，病灶周围炎细胞浸润，肺泡壁轻度增厚，肺泡间隔成纤维细胞较多，较多炎细胞浸润，肺纤维化程度轻。

图4为黄芩素提取物中剂量组：肺组织结构轻度破坏，肺泡壁轻度增厚，肺泡间隔成纤维细胞轻度增多，少量炎细胞浸润，肺间质纤维化程度较轻。

图5为黄芩素提取物大剂量组：组肺泡结构较完整清晰，肺泡壁轻度增厚，肺泡间隔成纤维细胞较少，少量炎性细胞浸润，肺间隔纤维化程度不明显。

图6为阳性对照药醋酸泼尼松组：肺泡结构较清晰，可见较少纤维化病灶，少量炎细胞浸润，肺泡间隔增厚，纤维化程度较模型组轻。

具体实施方式

以下实施例旨在进一步举例证明，而不是限制本发明。在不违背本发明的精神和原则前提下，对本发明的技术步骤进行的任何改动和改变都将落入本发明待批权利要求范围内。

实施例1

1.1实验目的：观察黄芩素提取物对BLM诱导的肺纤维化小鼠体重及肺系数的影响

1.2实验材料

实验动物：昆明种小鼠，90只，雌雄兼有，体重18-22克，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物生产许可证号SCXK(苏)2007-0007，实验动物使用许可证SYXK(苏)2007-0035。试验期间饲养室温度20±3.2℃，相对湿度为55±10％。

试验药物：黄芩素提取物，黄芩素含量为≥50％，棕黄色结晶，批号：090429，由本所植化室从黄芩根中提取而得，4℃冰箱保存。临用加5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)制成混悬液，现用现配；博莱霉素A5(BLM A5)，白色冻干粉末，15mg/支，日本化药株式会社生产，批号：880990，进口药品注册证号：H20040205；注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司生产，国药准字：H13020657；4％水合氯醛；醋酸泼尼松片，5mg/片，江苏徐州平光制药有限责任公司，批号：32022681。

仪器：电子天平，PL203型，美国梅特勒-托利多公司生产；

1.3实验方法

动物分组：昆明种小鼠，90只，雌雄兼有，体重18-22克，按性别体重随机分为6组，即正常对照组、模型组、黄芩素提取物大(200mg/kg/d)、中(100mg/kg/d)及小剂量组(50mg/kg/d)和阳性对照药醋酸泼尼松组(6.67mg/kg/d)，每组小鼠15只。

模型制备：模型组与各治疗组小鼠采用BLM复制肺纤维化动物模型。具体操作步骤如下：实验时，小鼠用4％的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰卧手术台，固定头部及四肢，常规消毒，无菌条件下行颈正中切口，钝性分离暴露气管，1ml注射器刺入模型组、黄芩素提取物各治疗组及醋酸泼尼松组小鼠气管软骨环间隙缓慢注入BLM A5(5mg/kg体重)，正常对照组在相同条件下注入等体积生理盐水。注药后立即将小鼠直立，沿身体纵轴左右旋转3-5min，使药液均匀分布于两侧肺内，然后缝合皮肤、消毒，待小鼠清醒后送清洁级观察室常规饲养。整个手术过程严格遵循无菌操作原则。术前1天及术后3天所有实验小鼠均连续肌肉注80万单位青霉素钠(0.1ml/只/天)。

给药方案：各组动物经博莱霉素造模后，第二天开始按照相应的体重灌服给药，正常对照组及模型组给予相应体积5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，各治疗组分别给予不同剂量的黄芩素提取物及阳性对照药泼尼松。每隔一天小鼠称重一次，连续给药28天。

小鼠称重及肺系数测定：各组小鼠处理前12小时禁食不禁水，处理当日小鼠称体重，计算各实验组动物的平均体重作为观察指标。无菌条件下开胸分离出气管和两侧肺脏，冰生理盐水清洗去除肺脏表面污渍后准确称取肺重。按以下公式计算肺系数，肺系数＝肺重(ng)/体重(g)。鉴于肺纤维化病程早期主要是肺间质及肺泡腔炎性细胞浸润及大量炎性细胞渗出，晚期肺间质成纤维细胞大量增生，胶原过度沉积等均可导致肺系数增加，因此肺系数这一指标可间接反应肺纤维化小鼠的肺泡炎症和肺纤维化的程度。

1.4统计方法

采用SPSS 12.0统计软件处理系统，实验数据以

表示，计量资料用t检验比较组间差异性，P＜0.05有统计学意义。

1.5实验结果

模型组小鼠体重较正常对照组明显降低(P＜0.01)，与模型组相比，黄芩素提取物各剂量组小鼠体重明显增加(P＜0.01)，中、小剂量组小鼠的肺系数降低(P＜0.05)，大剂量组小鼠的肺系数明显降低(P＜0.01)；醋酸泼尼松组小鼠体重呈增加趋势，但无统计学显著性差异(P＞0.05)，肺系数亦降低，(P＜0.05)，见表1。

表1黄芩素提取物对BLM诱导肺纤维化小鼠体重、肺系数的影响

##P＜0.01vs control；*P＜0.05，**P＜0.01vs model.

1.6结论

模型组小鼠体重明显降低，肺系数明显增加；黄芩素提取物可明显增加肺纤维化小鼠的体重，并不同程度地降低肺系数。阳性药醋酸泼尼松可降低小鼠肺系数，体重增加不明显。上述结果提示：黄芩素提取物可增加肺纤维化小鼠体重，且可降低肺系数，具有一定的防治肺纤维化作用。

实施例2

2.1实验目的：观察黄芩素提取物对BLM诱导肺纤维化小鼠血清SOD活性、MDA含量及抑制·OH能力的影响

2.2实验材料

实验动物：昆明种小鼠，90只，雌雄兼有，体重18-22克，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物生产许可证号SCXK(苏)2007-0007，实验动物使用许可证号SYXK(苏)2007-0035。试验期间饲养室温度20±3.2℃，相对湿度为55±10％。

试验药物：黄芩素提取物，黄芩素含量为≥50％，棕黄色结晶，批号：090429，由本所植化室从黄芩根中提取而得，4℃冰箱保存。临用加5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)制成混悬液，现用现配；博莱霉素A5(BLM A5)，白色冻干粉末，15mg/支，日本化药株式会社生产，批号：880990，进口药品注册证号：H20040205；注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司生产，国药准字：H13020657；4％水合氯醛；醋酸泼尼松片，5mg/片，江苏徐州平光制药有限责任公司，批号：32022681。

试剂与仪器：超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)及羟自由基(·OH)，检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号：20090529；紫外可见分光光度计，T6新世纪型，为北京普析通用仪器有限责任公司生产，仪器编号：18-1650-01-016；高速低温冷冻离心机，5417R型，德国艾本德股份公司生产；电热恒温水浴锅，H.H.S6型，上海浦东荣丰科学仪器有限公司出品。

2.3试验方法

动物分组：昆明种小鼠，90只，雌雄兼有，体重18-22克，按性别体重随机分为6组，即正常对照组、模型组、黄芩素提取物大(200mg/kg/d)、中(100mg/kg/d)及小剂量组(50mg/kg/d)和阳性对照药醋酸泼尼松组(6.67mg/kg/d)，每组小鼠15只。

模型制备：模型组与各治疗组小鼠采用BLM复制动物肺纤维化模型。具体操作步骤如下：实验时，小鼠用4％的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰卧手术台，固定头部及四肢，常规消毒，无菌条件下行颈正中切口，钝性分离暴露气管，1ml注射器刺入模型组、黄芩素提取物各治疗组及醋酸泼尼松组小鼠气管软骨环间隙缓慢注入BLM A5(5mg/kg体重)，正常对照组在相同条件下注入等体积生理盐水。注药后立即将小鼠直立，沿身体纵轴左右旋转3-5min，使药液均匀分布于两侧肺内，然后缝合皮肤、消毒，待小鼠清醒后送清洁级观察室常规饲养。整个手术过程严格遵循无菌操作原则。术前1日及术后3天所有小鼠连续肌肉注射80万单位青霉素钠(0.1ml/只/天)。

给药方案：各组动物经博莱霉素造模后，第二天开始按照相应的体重灌服给药，正常对照组及模型组给予相应体积5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，各治疗组分别给予不同剂量的黄芩素提取物及阳性对照药泼尼松。每隔一天小鼠称重一次，连续给药28天。

血清的制备：各组小鼠眼眶静脉取全血后3500r/min离心10min，小心取上清置于1.5ml离心管内，转移后的上清再次3500r/min离心10min。制备好的血清液-80℃冰箱保存，以测定血清中SOD，MDA，和·OH等生化指标。

生化指标测定：各组小鼠血清内SOD，MDA和·OH等各项生化指标均按照相应检测试剂盒所要求的化学比色法进行测定。

2.4统计方法

采用SPSS 12.0统计软件处理系统，实验数据以

表示，计量资料用t检验比较组间差异性，P＜0.05有统计学意义。

2.5试验结果

模型组小鼠与正常组相比，血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性及抑制羟自由基(·OH)能力明显降低，氧化代谢产物丙二醛(MDA)含量明显增加(P＜0.01)。与模型组相比，黄芩素提取物各剂量组小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和抑制·OH能力增强或明显增强(P＜0.05，P＜0.01)；氧化代谢产物丙二醛(MDA)含量则减少或明显减少(P＜0.05，P＜0.01)，且呈量效趋势。醋酸泼尼松组小鼠血清抑制羟自由基能力明显增强(P＜0.01)，丙二醛含量减少(P＜0.05)，超氧化物歧化酶(SOD)活性增强，但无统计学显著性差异(P＞0.05)，见表2。

表2黄芩素提取物对BLM诱导肺纤维化小鼠血清SOD活性、MDA含量和抑制·OH能力的影响

##P＜0.01vs control；*P＜0.05，**P＜0.01vs model.

2.6结论

经博莱霉素造模28天后，模型组小鼠血清内超氧化物岐化酶活性和抑制羟自由基能力明显降低，而氧化代谢产物丙二醛的含量则明显增加。黄芩素提取物各给药组小鼠血清内超氧化物岐化酶活性和抑制羟自由基能力明显增强，丙二醛含量降低，呈量效趋势。阳性药醋酸泼尼松组小鼠血清中超氧化物岐化酶活性有增强趋势，丙二醛含量减少，抑制羟自由基能力明显增强。上述结果显示：黄芩素提取物可增强肺纤维化小鼠血清清除氧自由基能力，增强抑制羟自由基能力，并可降低体内脂质过氧化反应程度，有利于肺纤维化的防治。

实施例3

3.1实验目的：观察黄芩素提取物对BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织SOD活性、MDA含量及T-AOC的影响

3.2实验材料

实验动物：昆明种小鼠，90只，雌雄兼有，体重18-22克，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物生产许可证号SCXK(苏)2007-0007，实验动物使用许可证号SYXK(苏)2007-0035。试验期间饲养室温度20±3.2℃，相对湿度为55±10％。

试验药物：黄芩素提取物，黄芩素含量为≥50％，棕黄色结晶，批号：090429，由本所植化室从黄芩根中提取而得，4℃冰箱保存。临用加5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)制成混悬液，现用现配；博莱霉素A5(BLM A5)，白色冻干粉末，15mg/支，日本化药株式会社生产，批号：880990，进口药品注册证号：H20040205；注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司生产，国药准字：H13020657；4％水合氯醛；醋酸泼尼松片，5mg/片，江苏徐州平光制药有限责任公司，批号：32022681。

试剂与仪器：超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，总抗氧化能力(T-AOC)等各指标检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号：20090529；紫外可见分光光度计，T6新世纪型，为北京普析通用仪器有限责任公司生产，仪器编号：18-1650-01-016；高速低温冷冻离心机，5417R型，德国艾本德股份公司生产；电热恒温水浴锅，H.H.S6型，上海浦东荣丰科学仪器有限公司出品。

3.3试验方法

动物分组：昆明种小鼠，90只，雌雄兼有，体重18-22克，按性别体重随机分为6组，即正常对照组、模型组、黄芩素提取物大(200mg/kg/d)、中(100mg/kg/d)及小剂量组(50mg/kg/d)和阳性对照药醋酸泼尼松组(6.67mg/kg/d)，每组小鼠15只。

模型制备：模型组与各治疗组小鼠采用BLM复制动物肺纤维化模型。具体操作步骤如下：实验时，小鼠用4％的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰卧手术台，固定头部及四肢，常规消毒，无菌条件下行颈正中切口，钝性分离暴露气管，1ml注射器刺入模型组、黄芩素提取物各治疗组及醋酸泼尼松组小鼠气管软骨环间隙缓慢注入BLM A5(5mg/kg体重)，正常对照组在相同条件下注入等体积生理盐水。注药后立即将小鼠直立，沿身体纵轴左右旋转3-5min，使药液均匀分布于两侧肺内，然后缝合皮肤、消毒，待小鼠清醒后送清洁级观察室常规饲养。整个手术过程严格遵循无菌操作原则。术前1日及术后3天所有小鼠连续肌肉注射80万单位青霉素钠(0.1ml/只/天)。

给药方案：各组动物经博莱霉素造模后，第二天开始按照相应的体重灌服给药，正常对照组及模型组给予相应体积5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，各治疗组分别给予不同剂量的黄芩素提取物及阳性对照药泼尼松。每隔一天小鼠称重一次，连续给药28天。

肺组织匀浆的制备：整个肺组织去除右下叶作病理切片和右侧中叶测定羟脯氨酸含量外，其余肺组织准确称重，加入9倍肺组织质量的冰生理盐水，内切式组织匀浆器制成10％的肺组织匀浆，-80℃冰箱保存，用于测定SOD，MDA，T-AOC等各项生化指标。

生化指标测定：各组小鼠肺组织内SOD，MDA和T-AOC等各项指标均按照相应生化指标检测试剂盒所要求的化学比色法进行测定。

3.4统计方法

采用SPSS 12.0统计软件处理系统，实验数据以

表示，计量资料用t检验比较组间差异性，P＜0.05有统计学意义。

3.5试验结果

与正常组小鼠相比，模型组小鼠肺组织中超氧化物岐化酶(SOD)活性降低(P＜0.05)，氧化代谢产物丙二醛(MDA)含量明显增加(P＜0.01)，总抗氧化能力(T-AOC)降低(P＜0.05)。与模型组相比，黄芩素提取物中、大剂量组小鼠肺组织SOD活性增强(P＜0.05)，T-AOC增强或明显增强(P＜0.05，P＜0.01)，黄芩素小剂量组小鼠肺组织SOD活性及T-AOC有增加趋势，但无统计学意义(P＞0.05)，黄芩素提取物各剂量组肺组织中MDA含量明显减少(P＜0.01)。醋酸泼尼松组小鼠肺组织中SOD活性有增加趋势，但无统计学意义(P＞0.05)，MDA含量减少(P＜0.05)，T-AOC增强(P＜0.05)，见表3。

表3黄芩素提取物对BLM诱导肺纤维化小鼠肺组织SOD活性、MDA含量和T-AOC的影响

#P＜0.05，##P＜0.01vs control；*P＜0.05，**P＜0.01vs model

3.6结论

模型组小鼠肺组织内超氧化物岐化酶活性和总抗氧化能力降低，而丙二醛含量明显增加。给予黄芩素提取物可不同程度地提高各剂量组小鼠肺组织内超氧化物岐化酶活性和总抗氧化能力，并可明显减少各剂量组小鼠肺组织中氧化代谢产物丙二醛的含量。阳性药醋酸泼尼松可增加肺组织内总抗氧化能力，减少丙二醛的含量。上述结果显示，黄芩素提取物可能通过增强小鼠肺组织清除氧自由基作用，降低脂质过氧化作用及提高总抗氧化能力来实现其对BLM诱导肺纤维化小鼠肺组织的保护作用。

实施例4

4.1实验目的：观察黄芩素提取物对BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织抑制·OH能力和T-NOS活性的影响

4.2实验材料

实验动物：昆明种小鼠，90只，雌雄兼有，体重18-22克，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物生产许可证号SCXK(苏)2007-0007，实验动物使用许可证号SYXK(苏)2007-0035。试验期间饲养室温度20±3.2℃，相对湿度为55±10％。

试验药物：黄芩素提取物，黄芩素含量为≥50％，棕黄色结晶，批号：090429，由本所植化室从黄芩根中提取而得，4℃冰箱保存。临用加5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)制成混悬液，现用现配；博莱霉素A5(BLM A5)，白色冻干粉末，15mg/支，日本化药株式会社生产，批号：880990，进口药品注册证号：H20040205；注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司生产，国药准字：H13020657；4％水合氯醛；醋酸泼尼松片，5mg/片，江苏徐州平光制药有限责任公司，批号：32022681。

试剂与仪器：羟自由基(·OH)，总一氧化氮合酶(T-NOS)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号：20090529；紫外可见分光光度计，T6新世纪型，北京普析通用仪器有限责任公司生产，仪器编号：18-1650-01-016；高速低温冷冻离心机，5417R型，德国艾本德股份公司生产；电热恒温水浴锅，H.H.S6型，上海浦东荣丰科学仪器有限公司出品。

4.3试验方法

动物分组：昆明种小鼠，90只，雌雄兼有，体重18-22克，按性别体重随机分为6组，即正常对照组、模型组、黄芩素提取物大(200mg/kg/d)、中(100mg/kg/d)及小剂量组(50mg/kg/d)和阳性对照药醋酸泼尼松组(6.67mg/kg/d)，每组小鼠15只。

模型制备：模型组与各治疗组小鼠采用BLM复制动物肺纤维化模型。具体操作步骤如下：实验时，小鼠用4％的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰卧手术台，固定头部及四肢，常规消毒，无菌条件下行颈正中切口，钝性分离暴露气管，1ml注射器刺入模型组、黄芩素提取物各治疗组及醋酸泼尼松组小鼠气管软骨环间隙缓慢注入BLM A5(5mg/kg体重)，正常对照组在相同条件下注入等体积生理盐水。注药后立即将小鼠直立，沿身体纵轴左右旋转3-5min，使药液均匀分布于两侧肺内，然后缝合皮肤、消毒，待小鼠清醒后送清洁级观察室常规饲养。整个手术过程严格遵循无菌操作原则。术前1日及术后3天所有小鼠连续肌肉注射80万单位青霉素钠(0.1ml/只/天)。

给药方案：各组动物经博莱霉素造模后，第二天开始按照相应的体重灌服给药，正常对照组及模型组给予相应体积5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，各治疗组分别给予不同剂量的黄芩素提取物及阳性对照药泼尼松。每隔一天小鼠称重一次，连续给药28天。

肺组织匀浆的制备：整个肺组织去除右下叶作病理切片和右侧中叶测定羟脯氨酸含量外，其余肺组织准确称重，加入9倍肺组织质量的冰生理盐水，内切式组织匀浆器制成10％的肺组织匀浆，-80℃冰箱保存，以检测·OH和T-NOS等生化指标。

生化指标测定：各组小鼠肺组织内·OH和T-NOS等指标均按照相应的生化指标检测试剂盒所要求的化学比色法进行测定。

4.4统计方法

采用SPSS 12.0统计软件处理系统，实验数据以

表示，计量资料用t检验比较组间差异性，P＜0.05有统计学意义。

4.5试验结果

模型组小鼠肺组织抑制羟自由基(·OH)能力降低(P＜0.05)，总一氧化氮合酶(T-NOS)活性明显增强(P＜0.01)。与模型组相比，黄芩素提取物中、大剂量组小鼠肺组织抑制·OH能力增强(P＜0.05)，而黄芩素提取物各剂量组T-NOS活性均降低(P＜0.05)。醋酸泼尼松组小鼠肺组织内T-NOS活性降低(P＜0.05)，抑制·OH能力呈增强趋势，但无统计学显著性差异，见表4。

表4黄芩素提取物对BLM诱导肺纤维化小鼠肺组织抑制·OH能力和T-NOS活性的影响

#P＜0.01，##P＜0.01vs control；*P＜0.05vs model.

4.6结论

模型组小鼠与正常对照组相比，肺组织抑制羟自由基能力降低，总一氧化氮合酶活性明显增强。黄芩素提取物中、大剂量组可增强肺纤维化小鼠肺组织抑制羟自由基的能力，且各剂量组均可降低肺组织中总一氧化氮合酶的活性。阳性药醋酸泼尼松组小鼠肺组织抑制羟自由基能力有增强趋势，总一氧化氮合酶的活性降低。由此提示：黄芩素提取物对小鼠肺组织的保护作用可能与其抑制肺组织内羟自由基的产生及降低总一氧化氮合酶活性从而减少一氧化氮的产生有关。

实施例5

5.1实验目的：观察黄芩素提取物对BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织HYP含量的影响

5.2实验材料

实验动物：昆明种小鼠，90只，雌雄兼有，体重18-22克，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物生产许可证号SCXK(苏)2007-0007，实验动物使用许可证SYXK(苏)2007-0035。试验期间饲养室温度20±3.2℃，相对湿度为55±10％。

试验药物：黄芩素提取物，黄芩素含量为≥50％，棕黄色结晶，批号：090429，由本所植化室从黄芩根中提取而得，4℃冰箱保存。临用加5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)制成混悬液，现用现配；博莱霉素A5(BLM A5)，白色冻干粉末，15mg/支，日本化药株式会社生产，批号：880990，进口药品注册证号：H20040205；注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司生产，国药准字：H13020657；4％水合氯醛；醋酸泼尼松片，5mg/片，江苏徐州平光制药有限责任公司，批号：32022681。

试剂与仪器：羟脯氨酸(HYP)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，批号：20090529；紫外可见分光光度计，T6新世纪型，为北京普析通用仪器有限责任公司生产，仪器编号：18-1650-01-016；高速低温冷冻离心机，5417R型，德国艾本德股份公司生产；电热恒温水浴锅，H.H.S6型，上海浦东荣丰科学仪器有限公司出品。

5.3试验方法

动物分组：昆明种小鼠，90只，雌雄兼有，体重18-22克，按性别体重随机分为6组，即正常对照组、模型组、黄芩素提取物大(200mg/kg/d)、中(100mg/kg/d)及小剂量组(50mg/kg/d)和阳性对照药醋酸泼尼松组(6.67mg/kg/d)，每组小鼠15只。

模型制备：模型组与各治疗组小鼠采用BLM复制动物肺纤维化模型。具体操作步骤如下：实验时，小鼠用4％的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰卧手术台，固定头部及四肢，常规消毒，无菌条件下行颈正中切口，钝性分离暴露气管，1ml注射器刺入模型组、黄芩素提取物各治疗组及醋酸泼尼松组小鼠气管软骨环间隙缓慢注入BLM A5(5mg/kg体重)，正常对照组在相同条件下注入等体积生理盐水。注药后立即将小鼠直立，沿身体纵轴左右旋转3-5min，使药液均匀分布于两侧肺内，然后缝合皮肤、消毒，待小鼠清醒后送清洁级观察室常规饲养。整个手术过程严格遵循无菌操作原则。术前1日及术后3天所有小鼠连续肌肉注射80万单位青霉素钠(0.1ml/只/天)。

给药方案：各组动物经博莱霉素造模后，第二天开始按照相应的体重灌服给药，正常对照组及模型组给予相应体积5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，各治疗组分别给予不同剂量的黄芩素提取物及阳性对照药泼尼松。每隔一天小鼠称重一次，连续给药28天。

羟脯氨酸(HYP)的测定：动物处死当日，取右肺中叶约30克置于有刻度的10ml玻璃试管中，-20℃冰箱保存，以备测定各实验组小鼠肺组织中羟脯氨酸的含量；具体测定方法如下：将0.5ml水解液准确加入冷冻保存小块肺组织的刻度玻璃试管内，混匀，加盖后沸水浴水解20分钟，其中10分钟混匀一次。之后将试管内液体PH值调至6.5左右，加适量活性炭，混匀，转移至1.5ml离心管中，3500r/min离心10min，取上清0.5ml，依次加入三种反应试剂，混匀，60℃水浴15min，冷却后3500r/min离心10min，取上清液于紫外可见分光光度计上(型号：T6新世纪)550nm，1cm光径下测定各管的吸光度，按说明书公式计算肺组织中HYP含量。

5.4统计方法

采用SPSS 12.0统计软件处理系统，实验数据以

表示，计量资料用t检验比较组间差异性，P＜0.05有统计学意义。

5.5试验结果

模型组小鼠肺组织与正常组小鼠相比，肺组织羟脯氨酸(HYP)含量明显增加(P＜0.01)。与模型组小鼠相比，黄芩素提取物各剂量组及醋酸泼尼松组小鼠肺组织中羟脯氨酸(HYP)含量明显减少(P＜0.01)，见表5。

表5黄芩素提取物提取物对BLM诱导肺纤维化小鼠肺组织HYP含量的影响

##P＜0.01vs control；*P＜0.05，**P＜0.01vs model.

5.6结论

模型组小鼠肺组织内间接反映肺组织细胞间质胶原生成的羟脯氨酸含量显著增加。给予黄芩素提取物可明显减少肺纤维化小鼠肺组织内羟脯氨酸含量。阳性药醋酸泼尼松亦可明显减少纤维化小鼠肺组织内羟脯氨酸的含量。提示黄芩素提取物抗纤维化作用可能与其减少肺组织内羟脯氨酸含量从而抑制肺组织内胶原的生成有关。

实施例6

6.1实验目的：观察黄芩素提取物对BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织肺泡炎及肺纤维化程度的影响

6.2实验材料

实验动物：昆明种小鼠，90只，雌雄兼有，体重18-22克，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物生产许可证号SCXK(苏)2007-0007，实验动物使用许可证号SYXK(苏)2007-0035。试验期间饲养室温度20±3.2℃，相对湿度为55±10％。

试验药物：黄芩素提取物，黄芩素含量为≥50％，棕黄色结晶，批号：090429，由本所植化室从黄芩根中提取而得，4℃冰箱保存。临用加5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)制成混悬液，现用现配；博莱霉素A5(BLM A5)，白色冻干粉末，15mg/支，日本化药株式会社生产，批号：880990，进口药品注册证号：H20040205；注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司生产，国药准字：H13020657；4％水合氯醛；醋酸泼尼松片，5mg/片，江苏徐州平光制药有限责任公司，批号：32022681。

实验仪器：光学显微镜，OLYMPUS CX31，由日本奥林巴斯公司生产。

6.3试验方法

动物分组：昆明种小鼠，90只，雌雄兼有，体重18-22克，按性别体重随机分为6组，即正常对照组、模型组、黄芩素提取物大(200mg/kg/d)、中(100mg/kg/d)及小剂量组(50mg/kg/d)和阳性对照药醋酸泼尼松组(6.67mg/kg/d)，每组小鼠15只。

模型制备：模型组与各治疗组小鼠采用BLM复制动物肺纤维化模型。具体操作步骤如下：实验时，小鼠用4％的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰卧手术台，固定头部及四肢，常规消毒，无菌条件下行颈正中切口，钝性分离暴露气管，1ml注射器刺入模型组、黄芩素提取物各治疗组及醋酸泼尼松组小鼠气管软骨环间隙缓慢注入BLM A5(5mg/kg体重)，正常对照组在相同条件下注入等体积生理盐水。注药后立即将小鼠直立，沿身体纵轴左右旋转3-5min，使药液均匀分布于两侧肺内，然后缝合皮肤、消毒，待小鼠清醒后送清洁级观察室常规饲养。整个手术过程严格遵循无菌操作原则。术前1日及术后3天所有小鼠连续肌肉注射80万单位青霉素钠(0.1ml/只/天)。

给药方案：各组动物经博莱霉素造模后，第二天开始按照相应的体重灌服给药，正常对照组及模型组给予相应体积5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，各治疗组分别给予不同剂量的黄芩素提取物及阳性对照药泼尼松。每隔一天小鼠称重一次，连续给药28天。

肺组织病理切片染色：右下肺组织在4％中性福尔马林溶液中固定，经逐级酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡，石蜡包埋，常规切片4μm，后行HE染色。根据Szapiel等方法确定肺泡炎和肺纤维化的程度。进行HE染色的病理切片根据肺泡炎程度分为4级。0分：无明显病理改变，无肺泡炎或极少数炎性细胞浸润(-)；1分：轻度病理改变，较少炎性细胞浸润，轻度肺泡炎改变(+)；病变范围局限在全肺的20％以下；2分：中度病理改变，少量炎性细胞浸润致中度肺泡炎(++)，病变范围占全肺的20％-50％；3分：重度病理改变，大量炎性细胞浸润，重度肺泡炎改变(+++)，病变范围大于50％。肺间质纤维化程度亦分为4级，0分：无明显病理改变，无肺间质纤维化(-)；1分：轻度病理改变，肺泡间隔因细胞浸润增宽，成纤维细胞轻度增生，轻度肺间质纤维化(+)，病变范围局限在全肺20％以下；2分：中度病理改变，中度成纤维细胞增生聚集，肺泡结构紊乱，中度肺间质纤维化(++)，病变范围占全肺的20％-50％；3分：重度病理改变，大量成纤维细胞增生聚集，肺泡融合，肺实质结构紊乱，发生重度肺间质纤维化，病变范围大于50％。

6.4统计方法

采用SPSS 12.0统计软件处理系统，实验数据以

表示，等级计数资料转化为计量资料后进行t检验，比较组间差异性，P＜0.05有统计学意义。

6.5试验结果

小鼠肺组织经石蜡切片并行HE染色，光学显微镜下观察其病理组织学变化显示：正常组小鼠肺组织结构清晰，肺泡腔透亮，肺泡壁完整，肺泡间隔未见增厚及炎细胞浸润。模型组小鼠肺组织结构紊乱，肺泡腔变窄或消失，肺泡间隔显著增厚，肺间质大量成纤维细胞增生和胶原纤维沉积，大量炎细胞浸润，肺间质纤维化形成。黄芩素提取物各剂量组小鼠与模型组相比，肺泡结构、肺泡腔、肺泡间隔、胶原纤维沉积、成纤维细胞增生等病理改变均有不同程度改善，肺组织的肺泡炎程度减轻或明显减轻(P＜0.05，P＜0.01)，肺纤维化病变程度减轻或明显减轻(P＜0.05，P＜0.01)。醋酸泼尼松组小鼠肺组织的肺泡炎及肺纤维化病变程度均减轻(P＜0.05)，见表6、图1。

表6黄芩素提取物对BLM诱导肺纤维化小鼠肺组织形态学的影响

##P＜0.01vs control；*P＜0.05，**P＜0.01vs model.

6.6结论

BLM造模28天后，模型组小鼠肺泡炎和间质肺纤维化程度明显，呈现典型的肺纤维化病理改变。给药28天后，黄芩素提取物可减轻或明显减轻小鼠肺泡炎程度，并可不同程度地减轻肺纤维化程度。阳性药醋酸泼尼松亦可减轻小鼠肺组织的肺泡炎和纤维化程度，提示黄芩素提取物具有一定的抗肺泡炎症作用和抗肺纤维化形成的作用。

综上所述，黄芩素提取物对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化具有一定的防治作用，该作用机制与其改善机体机能状态，增强机体抗氧化能力、抗炎症反应、抗脂质过氧化反应、抑制羟自由基产生、加强氧自由基清除、抑制肺组织内胶原生成及成纤维细胞增殖有关。

Claims (3)

1.一种黄芩素提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用。

2.权利要求1所述的黄芩素提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用，其特征在于：所述的药物黄芩素提取物其中黄芩素的含量为≥50％。

3.权利要求1所述的黄芩素提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用，其特征在于：所述的药物为含有治疗有效量的黄芩素提取物可与药学上可接受的载体结合制备药物。

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