CN109576335A - 间充质干细胞制剂溶血性的评价方法和应用 - Google Patents

间充质干细胞制剂溶血性的评价方法和应用 Download PDF

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CN109576335A CN201811507672.6A CN201811507672A CN109576335A CN 109576335 A CN109576335 A CN 109576335A CN 201811507672 A CN201811507672 A CN 201811507672A CN 109576335 A CN109576335 A CN 109576335A
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徐永胜
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Abstract

本发明提供了一种间充质干细胞制剂溶血性的评价方法和应用，涉及生物技术领域，发明提供的一种间充质干细胞制剂溶血性的评价方法使用多种体积分数的间充质干细胞制剂分别与红血球悬液混合，以降低单一剂量浓度与红血球悬液混合造成的由于浓度不合适而结果不准确的风险，同时还可以得出间充质干细胞制剂的溶血性与剂量的关系。并且本发明提供了多种合理的体积分数用量，避免了由于给药量不合理导致的评价结果不准确的问题。该评价方法能够为提供间充质干细胞制剂的安全性资料，为临床安全用药提供参考。

Description

间充质干细胞制剂溶血性的评价方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种间充质干细胞制剂溶血性的评价方法和应用。
背景技术
间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、神经、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
美国临床试验数据库ClinicalTrials数据显示，目前与间充质干细胞相关的临床试验已涉及300多种疾病，单是在美国开展的与间充质干细胞相关的临床试验就达到了650多件，主要的疾病包括骨损伤、神经退行性疾病、糖尿病、心肌缺血、重症肌无力和肝损伤等。
干细胞制剂制备所用的培养基成分除了要遵循《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》所制定的“应有足够的纯度并符合无菌、无致病微生物及内毒素的质量标准，残留的培养基对受者应无不良影响”的标准外，还要保证其“干性”、增殖及分化能力。但是干细胞作为特殊的药物，在临床前的安全性评价，特别是溶血性方面的评价缺乏评价指标和相应的技术手段。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种间充质干细胞制剂溶血性的评价方法，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供间充质干细胞制剂溶血性的评价方法在制备包含间充质干细胞的药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
本发明提供了一种间充质干细胞制剂溶血性的评价方法，包括使用不同体积分数的所述间充质干细胞制剂与红血球悬液混合孵育，然后按照与所述间充质干细胞制剂混合后的红血球悬液是否出现溶血和/或红细胞凝聚现象评价所述间充质干细胞制剂的溶血性；
所述间充质干细胞制剂的体积分数分别为1.5％-2.5％(v/v)、3.5％-4.5％(v/v)、5.5％-6.5％(v/v)、7.5％-8.5％(v/v)和9.5％-10.5％(v/v)。
进一步地，所述红血球悬液为1-3％的红血球悬液；
进一步地，所述间充质干细胞制剂中的细胞浓度为5～7×105cells/mL。
进一步地，根据直接观察评价所述间充质干细胞制剂的溶血性。
进一步地，当溶液呈澄明红色，管底无红细胞残留或有少量残留时，结果判定为溶血；
当溶液上层红细胞下沉，上清无色澄明时，结果判定为无溶血；
当溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散时，结果判定为红细胞凝聚；
当溶液中无絮状沉淀，或有沉淀但振摇后可均匀分散时，结果判定为无红细胞凝聚。
进一步地，所述评价方法还包括设置本底对照组。
进一步地，所述评价方法还包括设置阴性对照组和阳性对照组；
优选地，所述阴性对照组为所述红血球悬液的溶剂，所述阳性对照组为水。
进一步地，根据酶标仪测定评价所述间充质干细胞制剂的溶血性。
进一步地，使用酶标仪测定孵育后上清液的吸光度，其中：
待测样品溶血率＝(上清液吸光度-阴性对照吸光度-本底对照吸光度)/(阳性对照吸光度-阴性对照吸光度)×100％；
阴性对照溶血率＝(试验管吸光度－阴性对照管吸光度)/(阳性对照管吸光度－阴性对照管吸光度)×100％；
阳性对照溶血率＝(试验管吸光度－阴性对照管吸光度)/(阳性对照管吸光度－阴性对照管吸光度)×100％；
当所述待测样品溶血率小于5％时，结果判定为无溶血。
另外，本发明还提供了上述的间充质干细胞制剂溶血性的评价方法在制备包含间充质干细胞的药物中的应用；
发明提供了一种间充质干细胞制剂溶血性的评价方法，一方面该方法使用多种体积分数的间充质干细胞制剂分别与红血球悬液混合，以降低单一剂量浓度与红血球悬液混合造成的由于浓度不合适而结果不准确的风险，同时还可以得出间充质干细胞制剂的溶血性与剂量的关系；另一方面，本发明提供了多种合理的体积分数用量，避免了由于给药量不合理导致的评价结果不准确的问题。该评价方法能够为提供间充质干细胞制剂的安全性资料，为临床安全用药提供参考。基于上述发明构思，本发明还提供了间充质干细胞制剂溶血性的评价方法在制备包含间充质干细胞的药物中的应用，以协助间充质干细胞作为活性成分或者辅助成分的药物的开发。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是：
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“1.5～2.5”表示本文中已经全部列出了“1.5～2.5”之间的全部实数，“1.5～2.5”只是这些数值组合的缩略表示。
本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。
本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
根据本发明的一个方面，提供了一种间充质干细胞溶血性的评价方法，该评价方法包括使用不同体积分数的所述间充质干细胞与红血球悬液混合孵育，然后按照与所述间充质干细胞混合后的红血球悬液是否出现溶血和/或红细胞凝聚现象评价所述间充质干细胞的溶血性；
所述间充质干细胞的体积分数分别为1.5％-2.5％(v/v)，例如可以为，但不限于1.5％(v/v)、1.6％(v/v)、1.7％(v/v)、1.8％(v/v)、1.9％(v/v)、2％(v/v)、2.1％(v/v)、2.2％(v/v)、2.3％(v/v)、2.4％(v/v)或2.5％(v/v)；3.5％-4.5％(v/v)，例如可以为，但不限于3.5％(v/v)、3.6％(v/v)、3.7％(v/v)、3.8％(v/v)、3.9％(v/v)、4％(v/v)、4.1％(v/v)、4.2％(v/v)、4.3％(v/v)、4.4％(v/v)或4.5％(v/v)；5.5％-6.5％(v/v)，例如可以为，但不限于5.5％(v/v)、5.6％(v/v)、5.7％(v/v)、5.8％(v/v)、5.9％(v/v)、6％(v/v)、6.1％(v/v)、6.2％(v/v)、6.3％(v/v)、6.4％(v/v)或6.5％(v/v)；7.5％-8.5％(v/v)，例如可以为，但不限于7.5％(v/v)、7.6％(v/v)、7.7％(v/v)、7.8％(v/v)、7.9％(v/v)、8％(v/v)、8.1％(v/v)、8.2％(v/v)、8.3％(v/v)、8.4％(v/v)或8.5％(v/v)；和9.5％-10.5％(v/v)，例如可以为，但不限于9.5％(v/v)、9.6％(v/v)、9.7％(v/v)、9.8％(v/v)、9.9％(v/v)、10％(v/v)、10.1％(v/v)、10.2％(v/v)、10.3％(v/v)、10.4％(v/v)或10.5％(v/v)。
间充质干细胞是一种多能干细胞，具有自我更新和多向分化能力，促进骨、软骨、韧带、肌肉和脂肪组织等间质组织再生。因间充质干细胞来源丰富、制备简单、多能性和低致瘤性具有很大的临床利用价值。发明提供了一种间充质干细胞溶血性的评价方法，一方面该方法使用多种体积分数的间充质干细胞分别与红血球悬液混合，以降低单一剂量浓度与红血球悬液混合造成的由于浓度不合适而结果不准确的风险，同时还可以得出间充质干细胞的溶血性与剂量的关系；另一方面，本发明提供了多种合理的体积分数用量，避免了由于给药量不合理导致的评价结果不准确的问题。该评价方法能够为提供间充质干细胞制剂的安全性资料，为临床安全用药提供参考。
需要说明的是，本发明所述的间充质干细胞制剂指的是包含人间充质干细胞的试剂、药物或者间充质干细胞本身；发明所述的给药剂量，是以间充质干细胞制剂中起到活性成分的间充质干细胞的数量计算的。所述间充质干细胞分离自例如可以为但不限于为骨髓、骨膜、血管、脂肪、肌肉、外周循环、脐带血、皮肤或牙体组织等；所述间充质干细胞例如可以为但不限于为实验室分离得到的细胞或者市售细胞系；所述间充质干细胞的来源例如可以为但不限于为人或者其他可分离到间充质干细胞的动物；所述间充质干细胞也不限制为通过本领域可接受的手段得到的经诱变、突变或者经基因工程的改造得到的间充质干细胞。可以理解的是，本发明的目的是评价间充质干细胞制剂的溶血性，因此对间充质干细胞的来源不做限制。
在一些优选的实施方式中，所述红血球悬液为1-3％的红血球悬液，例如可以为，但不限于1％、1.5％、2％、2.5％或3％，优选为2％的红血球悬液。
典型的红血球悬液的溶剂为0.9％氯化钠注射液。
通过优化和调整红血球悬液的浓度，可以进一步优化间充质干细胞制剂溶血性的评价效果。
在一些优选的实施方式中，所述间充质干细胞制剂中的细胞浓度为5～7×105cells/mL，例如可以为，但不限于5×105cells/mL、5.5×105cells/mL、6×105cells/mL、6.5×105cells/mL或7×105cells/mL。
通过优化和调整间充质干细胞制剂中细胞浓度，可以进一步优化间充质干细胞制剂溶血性的评价效果。
在一些优选的实施方式中，根据直接观察评价所述间充质干细胞制剂的溶血性。
直接观察法无需借助仪器即可得出实验结果，更加方便、快捷，能够一定程度上节约成本。
在一个具体的实施方式中，分别在15min、30min、45min、1hr、2hr、3hr的时间点观察待测样品是否出现溶血和/或红细胞凝聚的现象。若供试品管溶液在3小时内发生溶血或/和红细胞凝聚现象，则供试品不宜注射使用。
在一些优选的实施方式中，当溶液呈澄明红色，管底无红细胞残留或有少量残留时，结果判定为溶血；
当溶液上层红细胞下沉，上清无色澄明时，结果判定为无溶血；
当溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散时，结果判定为红细胞凝聚；
当溶液中无絮状沉淀，或有沉淀但振摇后可均匀分散时，结果判定为无红细胞凝聚。
该实施方式中根据经间充质干细胞制剂与红血球悬液混合孵育出现的现象划分为不同的等级，以评价间充质干细胞制剂的溶血性，该方法只需按照不同的溶血/凝血等级中分别对应的现象划分间充质干细胞制剂的溶血性即可。
在一些优选的实施方式中，所述评价方法还包括设置本底对照组。
由于本发明所提供的供试品为细胞悬液，透明度较差，因此设置供试品本底对照，能够扣除供试品本底颜色对实验结果的影响，使实验结果更加准确。
在一些优选的实施方式中，所述评价方法还包括设置阴性对照组和阳性对照组；
优选地，所述阴性对照组为所述红血球悬液的溶剂，所述阳性对照组为水。
典型的红血球悬液的溶剂为0.9％氯化钠注射液。
在一些优选的实施方式中，根据酶标仪测定评价所述间充质干细胞制剂的溶血性。
根据酶标仪评定所述间充质干细胞制剂的溶血性，其结果更客观、准确。
典型的酶标仪设定波长为545nm。
在一些优选的实施方式中，使用酶标仪测定孵育后上清液的吸光度，其中：
待测样品溶血率＝(上清液吸光度-阴性对照吸光度-本底对照吸光度)/(阳性对照吸光度-阴性对照吸光度)×100％；
阴性对照溶血率＝(试验管吸光度－阴性对照管吸光度)/(阳性对照管吸光度－阴性对照管吸光度)×100％；
阳性对照溶血率＝(试验管吸光度－阴性对照管吸光度)/(阳性对照管吸光度－阴性对照管吸光度)×100％；
当所述待测样品溶血率小于5％时，结果判定为无溶血。
若供试品管溶血率小于5％，表明无溶血发生，则供试品可以注射使用，否则不宜注射使用。
本发明还提供了间充质干细胞制剂溶血性的评价方法在制备包含间充质干细胞的药物中的应用，以协助间充质干细胞作为活性成分或者辅助成分的药物的开发。在一些优选的实施方式中，所述药物包括人脐带间充质干细胞，人脐带间充质干细胞(humanumbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)可分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经元和内皮细胞。人脐带间充质干细胞来源广泛、取材方便、成本低廉，具有高的可塑性和分化潜能，因此人脐带间充质干细胞在制备药物的应用中越加广泛，使用上述间充质干细胞溶血性的评价方法可为人脐带间充质干细胞在制备药物的研究中提供安全性资料，为临床安全用药提供参考。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果：
实施例1
1、试验设计
1.1、供试品浓度及选择理由
脐带间充质干细胞(MSCs)具有多向分化功能，可分化为多种细胞，此研究拟将MSCs用于多种疾病的临床治疗。临床静脉输注剂量为1×106cells/kg，临床给药浓度6×105cells/ml。静脉给药制剂的溶血试验采用临床浓度进行试验，本实施例检测浓度为6×105cells/ml。
因为本试验供试品为细胞悬液，透明度较差，因此需设置供试品本底对照管，扣除供试品本底颜色对实验结果的影响。
2、试验方法
2.1、动物接收与检验
实验动物由实验人员、动物保障部门人员和兽医共同接收。接收时动物供应单位提供的动物合格证明、购买发票齐全，动物的种属、级别、数量和性别符合要求。对动物进行检查(包括性别、体重、头部、躯干部、尾部、四肢、皮毛、精神、活动等)，并填写《实验动物接收单》和《动物接收检验单》。用标记笔在家兔耳朵标记检疫号，将检疫后动物放入饲养观察室中的动物饲养笼中进行适应期饲养，并在笼具上悬挂标签。
2.2、动物适应期观察
动物共适应性饲养8天，适应期第1天和第8天分别对动物进行全面检查并称重，其它时间每天观察1次。
2.3、取血
适应期结束，观察动物无异常后，用20％乌来糖溶液3mL/只对家兔进行轻微麻醉，抓住家兔背部皮肤使其处于侧卧位，用20mL注射器经心脏采血15mL。
2.4、2％红血球混悬液的制备
将血液迅速转移入三角瓶中，放入玻璃珠不断摇动10分钟以上，以除去纤维蛋白。血液经充分摇动后分装转移入离心管中(每管1～2mL)，并在每管加入5mL左右0.9％氯化钠注射液，混匀，1500转/min离心10min，弃去上清液；再次加入0.9％氯化钠注射液混匀离心，如此反复清洗3次至上清呈无色透明。取红细胞2mL，用0.9％氯化钠注射液稀释成2％的红血球混悬液100mL备用。
2.5、供试品准备
阴性对照直接取用0.9％氯化钠注射液，阳性对照直接取用去离子水。
供试品管所需脐带间充质干细胞即送达即试验。在运输、接收、试验过程中，脐带间充质干细胞使用冰袋进行低温保存。试验前药液经充分混匀，使细胞分布均匀，以免对结果造成影响。
2.6、溶血试验操作
取试管24支，均分为2组并进行编号：每组第1～5管为脐带间充质干细胞管，第6管为阴性对照管，第7管为阳性对照管，第8～12管分别为第1～5管的本底对照管。各管按表2依次加入2％红血球混悬液、0.9％氯化钠注射液或去离子水、脐带间充质干细胞。将各管轻轻摇匀，37℃孵育并开始计时。因本供试品为细胞悬液，孵育时进行低速震摇，以使供试品与红细胞充分作用，转速60转/min。
表1溶血性试验加液参照表
2.7、供试品废弃处理
本供试品为具有生物活性的生物制品，给药后剩余药液高压灭活后作为医疗废弃物统一处理。
2.8、结果观察和判定
2.8.1、直接观察法
按表2观察并记录1～7管在15min、30min、45min、1hr、2hr、3hr是否出现溶血(各个时间点)和红细胞凝聚(3hr时间点)现象。若供试品管溶液在3小时内发生溶血或/和红细胞凝聚现象，则供试品不宜注射使用。
表2溶血性试验结果判定标准
2.8.2、酶标仪测定法
孵育3hr后，各管以2000转/min离心5min，酶标仪测定上清液545nm波长下吸光度。计算1～7管溶血率：供试品管溶血率(％)＝(试验管吸光度－阴性对照管吸光度-本底对照管吸光度)/(阳性对照管吸光度－阴性对照管吸光度)×100％，阴性和阳性对照管溶血率(％)＝(试验管吸光度－阴性对照管吸光度)/(阳性对照管吸光度－阴性对照管吸光度)×100％。若供试品管溶血率小于5％，表明无溶血发生，则供试品可以注射使用，否则不宜注射使用。
3、试验结果
3.1、直接观察法
阴性对照管：加样后15min见管内溶液为鲜红色悬浊液，顶部极少量液体颜色略浅；加样后30min，顶部有少量澄清液体，此后顶部上清液逐渐增多，管内底部逐渐出现深红色沉淀。孵育3hr自培养箱取出试管，振摇后见管底沉淀均匀分散，无红细胞凝聚发生。经2000转/min离心5分钟，见试管底部有少量沉淀，上清液无色澄清，无溶血现象。
阳性对照管：自加样15min后管中液体呈澄明鲜红色，除试管底部出现少量沉淀外无其他明显变化。孵育3hr振摇见管底沉淀均匀分散，无红细胞凝聚发生。离心后试管底部有少量沉淀，上清液鲜红澄明，发生明显溶血现象。
脐带间充质干细胞管的改变与阴性对照管相同，均未见溶血和红细胞凝聚现象。具体结果见表3。
表3脐带间充质干细胞溶血性试验直接观察结果
备注：(1)有溶血用+表示，无溶血用－表示，有红细胞凝聚用*表示，无红细胞凝聚用－表示。
(2)1-2号试管为1-1号试管的复管，其它与此相同。
3.2、酶标仪测定法
结果如表4所示，脐带间充质干细胞各管溶血率均小于5％，结合直接观察结果，可以认为本试验脐带间充质干细胞对家兔红细胞无体外溶血和致凝聚作用。
表4脐带间充质干细胞溶血性试验酶标仪测定结果
备注：OD值＝总吸光度检测值-本底吸光度基础值。
4、试验结论
本试验以临床用药浓度6×105cells/ml检测脐带间充质干细胞对家兔红细胞的体外溶血和致凝聚作用，直接观察法未见红细胞溶血和凝聚现象，酶标仪测定法溶血率低于5％，因此本试验脐带间充质干细胞对家兔红细胞无体外溶血和致红细胞凝聚作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞制剂溶血性的评价方法，其特征在于，包括使用不同体积分数的所述间充质干细胞制剂与红血球悬液混合孵育，然后按照与所述间充质干细胞制剂混合后的红血球悬液是否出现溶血和/或红细胞凝聚现象评价所述间充质干细胞制剂的溶血性；
所述间充质干细胞制剂的体积分数分别为1.5％-2.5％(v/v)、3.5％-4.5％(v/v)、5.5％-6.5％(v/v)、7.5％-8.5％(v/v)和9.5％-10.5％(v/v)。
2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述红血球悬液为1-3％的红血球悬液。
3.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述间充质干细胞制剂中的细胞浓度为5～7×105cells/mL。
4.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，根据直接观察评价所述间充质干细胞制剂的溶血性。
5.根据权利要求4所述的评价方法，其特征在于，当溶液呈澄明红色，管底无红细胞残留或有少量残留时，结果判定为溶血；
当溶液上层红细胞下沉，上清无色澄明时，结果判定为无溶血；
当溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散时，结果判定为红细胞凝聚；
当溶液中无絮状沉淀，或有沉淀但振摇后可均匀分散时，结果判定为无红细胞凝聚。
6.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述评价方法还包括设置本底对照组。
7.根据权利要求6所述的评价方法，其特征在于，所述评价方法还包括设置阴性对照组和阳性对照组；
优选地，所述阴性对照组为所述红血球悬液的溶剂，所述阳性对照组为水。
8.根据权利要求7所述的评价方法，其特征在于，根据酶标仪测定评价所述间充质干细胞制剂的溶血性。
9.根据权利要求8所述的评价方法，其特征在于，使用酶标仪测定孵育后上清液的吸光度，其中：
待测样品溶血率＝(上清液吸光度-阴性对照吸光度-本底对照吸光度)/(阳性对照吸光度-阴性对照吸光度)×100％；
阴性对照溶血率＝(试验管吸光度－阴性对照管吸光度)/(阳性对照管吸光度－阴性对照管吸光度)×100％；
阳性对照溶血率＝(试验管吸光度－阴性对照管吸光度)/(阳性对照管吸光度－阴性对照管吸光度)×100％；
当所述待测样品溶血率小于5％时，结果判定为无溶血。
10.如根据权利要求1-9任一项所述的间充质干细胞制剂溶血性的评价方法在制备包含间充质干细胞的药物中的应用；
优选地，所述药物包括人脐带间充质干细胞。
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