CN104321426A - 永生化干细胞以及以其生成物为有效成分的药物组合物和药物制剂 - Google Patents

永生化干细胞以及以其生成物为有效成分的药物组合物和药物制剂 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供可产生具有由种种原因所致的各种组织的再生能力的生长因子的永生化干细胞及其产生方法。此外，其目的在于提供损伤组织复原用药物组合物和药物制剂、以及上述培养上清的经皮吸收方法。本发明提供一种永生化干细胞，其是如下选择的：将选自由哺乳类的间叶细胞、初生胚和体细胞组成的组中的干细胞分离出来；对上述干细胞进行初期培养，得到原代培养细胞，向该原代培养细胞中导入4种基因，制作基因导入细胞；从上述基因导入细胞中以STRO-1的表达为指标来选择该永生化干细胞。本发明还提供损伤组织复原用药物组合物和药物制剂，其含有该永生化干细胞的培养上清作为有效成分。

Description

永生化干细胞以及以其生成物为有效成分的药物组合物和药物制剂
技术领域
本发明涉及牙髓来源的永生化干细胞以及以其生成物为有效成分的药物组合物和药物制剂。更详细地说，本发明涉及对于由自然脱落的或拔除的人乳牙或恒牙的牙髓得到的干细胞进行修饰所得到的永生化干细胞、以该细胞所产生的各种生物因子为有效成分的药物组合物以及药物制剂。
背景技术
对于使由于多种原因而受到损伤的生物体的功能复原的方法来说，大致可分为移植医疗和再生治疗。移植医疗是指接受由供体提供的脏器，通过移植该脏器而使生物体的功能复原。
与此相对，再生治疗是指下述治疗：对包括本人在内的几个人的细胞或组织进行培养，对其进行加工，从而来替换具有障碍的脏器，由此来对缺失的组织或脏器进行修复或使其再生，该再生治疗中会使用干细胞等。
目前，在再生治疗中所应用的或者能够应用的干细胞为人体性干细胞、人胚性干细胞(ES细胞)以及人工多能性干(iPS)细胞这3种。
此处，人体性干细胞已经在研究中进行使用，其存在于成人的组织中，具有仅分化成特定的组织、器官或脏器的特性。需要说明的是，在骨髓或脂肪组织中存在的“间叶干细胞”可特别地分化成骨、软骨、血管等多种组织。在使用这样的体性干细胞的情况下，若利用自体细胞，则不会发生免疫排斥，并且植入也较好。另外，并没有关于这些干细胞的长期培养会导致肿瘤化的报告。
另一方面，已知能够进行分化的细胞受到一定程度的限制；在由人体组织进行采集时会伴有侵袭；进行分化的组织的种类受到限制；并且培养可传代数被限制在四十几次、以天数计为100～200天。
人胚性干细胞(ES细胞)为将生殖医疗等中产生的剩余胚(胚胞)中的“内部细胞块”取出、并对其进行培养所得到的干细胞。由于其形成作为具有多分化潜能性的指标的畸胎瘤，因而认为其在三胚层的任意层均可分化。还有报告指出其可分化为心肌、神经、网膜。由于胚性干(ES)细胞为永生化的细胞株，因而一个细胞株能够无限地持续培养。并且，在适当的培养条件下，能够以细胞的形式大量制造均匀的制品。
另一方面，由于其利用受精卵，因而需要有严格的对策以使其在提供时不会产生伦理问题。并且，由于其基本上为异体移植，因而需要处理免疫应答所致的排斥反应。此外还已知，在细胞培养时，需要使用异种细胞或血清；在移植后的再生组织中混有即使少量的未分化细胞时，也容易形成畸胎瘤(良性肿瘤)。
人的人工多能性干(iPS)细胞为通过将在ES细胞中特异性表达的基因的一部分导入到成人细胞(皮肤等)中而确立的细胞。在使用自体来源的iPS细胞时，不会产生免疫排斥的问题，能够直接利用ES细胞的分化技术。
最后，人工多能性干(iPS)细胞不像ES细胞那样利用受精卵，而能够使用成人组织来制作与胚性干细胞大致同样性质的细胞，在利用自体来源的iPS细胞时，也不会出现由于免疫反应所带来的排斥反应的问题。
此外还已知，其不仅容易良性肿瘤化、而且还容易恶性肿瘤(胚细胞癌)化；并且由于从导入了基因的全部细胞中选择形态上与ES细胞类似的细胞，因而作为iPS细胞被确立的细胞的比例低。
在将干细胞本身用于再生治疗中时，由于具有上述这样的问题，因而摸索出了不使用各种干细胞本身、而使用它们产生的各种生物因子、例如各种生长因子的方法(WO 2011/118795号、下文称为“现有技术1”)。
另外，在现有技术1中，公开了一种损伤部治疗用组合物，其含有血管内皮增殖因子(VEGF)、肝细胞增殖因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板来源生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)等生长因子，包括人脱落乳牙牙髓干细胞等干细胞的培养上清。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO 2011/118795号
发明内容
发明所要解决的课题
现有技术1中提供了具有皮肤光老化所致损伤的恢复、骨再生等效果的上述损伤部治疗用组合物，在这方面为优异的技术。
另一方面，由于所使用的牙髓来源的干细胞不是细胞株，因而必须在需要时制备该干细胞、或者使冷冻保存的试样融化来进行细胞的增殖才能获得目的培养上清，存在需要时间来获得培养上清的问题。
一般来说，在培养细胞中，在为由正常细胞确立的细胞株的情况下，在经50～60次传代后细胞不能分裂，该细胞迎来死亡。当然，培养细胞所产生的生物因子的组成也会随着时间的经过而发生变化，因而具有不能使用可无限增殖的细胞株、难以获得具有恒定组成的培养上清的问题。
另一方面，作为代表性的可无限增殖的细胞，可以举出癌细胞。对于癌细胞，通常情况下在生物体的调节下被调节为适当地分裂及增殖的细胞由于该调节产生偏差而变成无限增殖，从而成为癌细胞。因此，即使其为能够无限增殖的细胞，该癌变的细胞也会产生对于生物体有害的生物因子，因而无法进行使用。
如上所述，对于可无限增殖但未发生癌变的永生化干细胞的确立具有强烈的社会需求。
并且，为了将培养上清作为药物组合物使用，上述永生化干细胞需要能够长期持续产生一定的生物因子。
解决课题的手段
本申请发明是基于上述情况而完成的。
即，本申请发明的第1方式为一种永生化干细胞，其是如下选择的：从选自由哺乳类的间叶干细胞、初生胚和除间叶细胞外的体细胞组成的组的细胞组中分离干细胞；对上述干细胞进行初期培养，得到初期培养细胞；向初期培养细胞中导入4种基因，制作基因导入细胞；从上述基因导入细胞中以STRO-1的表达为指标来选择该永生化干细胞。此处，上述间叶干细胞选自由牙髓干细胞、骨髓干细胞、脐带细胞以及脂肪干细胞组成的组。并且优选上述牙髓干细胞为由选自由脱落的乳牙、脱落的恒牙、拔除的乳牙以及拔除的恒牙组成的组中的任意牙齿的牙髓得到的细胞。
上述初生胚优选为胚盘期的胚。并且优选上述哺乳类选自由人、猪、马以及猴组成的组。上述骨髓干细胞优选为具有可分化成可生成骨的成骨细胞、软骨细胞、脂肪干细胞等间叶系与非间叶系这两者的能力的细胞。此外，上述脐带细胞是指维系胎儿和胎盘的脐带血中所含有的造血干细胞和间叶细胞，优选脐带细胞大量含有这些细胞。上述骨髓干细胞优选为具有可分化成可生成骨的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等间叶系与非间叶系这两者的能力的细胞。并且，上述脐带细胞优选为由华通胶(Warton's jelly)得到的细胞。上述脂肪干细胞优选为能够分化为所有干细胞的未分化细胞。
此外，上述4种基因优选为选自由hTERT、bmi-1、E6、E7、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc以及p16INK4a组成的组中的4种。此处，在导入到间叶细胞中的情况下，优选为hTERT、bmi-1、E6和E7。另外，在导入到体细胞中的情况下，优选为选自由Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc以及p16INK4a组成的组中的4种。
并且，上述永生化干细胞优选具有端粒修复能力，具有至少能够分裂200次以上的分裂能力。并优选在个体倍增次数为20次的时刻，细胞个体数的至少40％以上为STRO-1表达细胞，且具有与原代培养细胞等同的新生骨量生成能力。
进而，上述永生化干细胞优选至少向培养上清中分泌IGF-1、VEGF、TGF-β1和HGF。
本发明的第2方式为含有具有上述特性的永生化干细胞的培养上清的药物组合物。
此外，本发明的第3方式为含有上述药物组合物的损伤组织复原用药物制剂。此处，上述损伤组织复原用药物制剂的剂型为选自由粉末、液剂、凝胶剂、喷雾剂和经皮吸收系统组成的组中的任意剂型。并且，上述损伤组织优选为选自由形成了溃疡或褥疮的组织、由于细胞的变性而发生了损伤的脑组织、由于外科操作而发生了缺损的脑组织、由于外伤性脑疾病而发生了损伤的脑组织、由于炎症性脑疾病而发生了损伤的脑组织、损伤的骨组织、损伤的牙周组织、由于中枢神经系疾病而发生了损伤的组织、以及由于难治性皮炎而发生了损伤的组织组成的组中的组织。
此处，上述细胞的变性优选由选自由阿尔兹海默氏病、帕金森氏病、痴呆症、统合失调症、抑郁症、缺氧性脑症、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、脑梗塞、小脑变性症、糖尿病以及肝炎组成的组中的疾病产生。并且，上述外伤性脑疾病优选由交通事故或坠落事故产生。此外，上述炎症性脑疾病优选为选自由脑炎脑症、癫痫、克雅氏病以及小儿麻痹症组成的组中的疾病。进而，上述中枢神经系疾病优选为选自由脊髓损伤和脊髓症组成的组中的疾病。上述难治性皮炎优选为特应性皮炎。
进而，设上述任意的永生化干细胞所产生的培养上清为100％时，优选上述损伤组织复原用药物制剂中的培养上清的含量为50～500％(w/v)。
本发明的第4方式为一种永生化干细胞的产生方法，其具备下述工序：分离工序，从选自由哺乳类的间叶细胞、初生胚和除间叶细胞外的体细胞组成的组的细胞组中分离干细胞；培养工序，对上述干细胞进行初期培养，得到初期培养细胞；基因导入工序，向上述初期培养细胞中导入4种基因，制作基因导入细胞；以及选择工序，以个体倍增次数为20次的时刻的STRO-1的表达量和骨再生能力为指标，从上述基因导入细胞中选择细胞。
此处，优选上述间叶细胞选自由牙髓细胞、骨髓细胞、脐带细胞以及脂肪细胞组成的组。上述牙髓细胞，上述初生胚、上述骨髓干细胞以及上述脐带细胞如上所述。上述哺乳类如上所述。
进一步地，上述4种基因优选为选自由hTERT、bmi-1、E6、E7、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc以及p16INK4a组成的组中的4种。此处，在导入到间叶细胞中的情况下，优选为hTERT、bmi-1、E6和E7。并且，在导入到体细胞中的情况下，优选为选自由Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc以及p16INK4a组成的组中的4种。
上述hTERT为人端粒酶逆转录酶的基因，bmi-1为与干细胞的自体复制、分化调节有关的多梳家族基因。E6和E7为在对用于人乳头瘤病毒的自体复制的初期基因进行编码的开放阅读框中存在的基因。
本发明的第5方式为一种经皮吸收方法，其特征在于，其具备下述工序：剂型制备工序，利用片状保湿性部件吸收上述药物制剂来制成片形制剂；损伤部位覆盖工序，利用上述片形制剂来覆盖损伤的部位；以及电极接触工序，使带正电的电极与所期望的部位接触。
本发明的永生化干细胞即使在40次分裂后，仍含有细胞个体数的至少40％以上的STRO-1表达细胞。此外，由于具有端粒修复能力，因而能够进行至少200次以上的分裂。并且，上述各种生物因子能够长期分泌到培养上清中。
发明的效果
利用本申请发明，从而能够长期提供可长期持续产生一定的生物因子的永生化干细胞。
此外，利用本申请发明的另一方式，能够提供可用于广泛的损伤组织的修复的药物组合物和药物制剂。
进而，能够提供一种新颖的经皮吸收方法，该方法能够提高有效成分从损伤部位吸收的吸收效率。
附图说明
图1为表示从上述牙髓细胞中选择的永生化干细胞与不是永生化干细胞的细胞的个体倍增次数(population doubling time、下文中称为“PD”)与培养期间的关系的曲线图。图1中，SHED-T表示永生化干细胞、SHED-C表示不是永生化干细胞的细胞。
图2为表示SHED-C和SHED-T中的STRO-1的表达结果的曲线图(图2(A)～(D))。图中，PD20表示个体倍增次数＝20次、PD30表示个体倍增次数＝30次、并且PD40表示个体倍增次数＝40次。
图3为表示皮肤溃疡治疗时的恢复状况的照片。(A)表示治疗前的皮肤状态、(B)表示治疗后的皮肤状态。
图4为示出个体倍增时间(次数)与新生骨量的关系的曲线图，图中，**表示p<0.05、***表示p<0.01。新生骨量由下述计算式求出。新生骨量＝新生骨面积/视野面积×100
图5为示出在图4所示的各个体倍增时间时进行SHED-C与SHED-T的移植时的组织染色像的图。
图6为示出对褥疮的溃疡进行治疗时的恢复状况的照片。(A)表示治疗前的皮肤状态、(B)表示治疗后的皮肤状态。
图7为通过CT扫描示出在植入手术时使用上述药物制剂时经过1～6个月后的重构进展状况的图。(A)～(C)为从正面拍摄的图像，并且(D)～(F)为从水平方向拍摄的图像。
图8为示出牙周病患者的牙槽骨状态的照片。(A)表示治疗开始时(术前)的牙槽骨状态、(B)表示术后3个月的牙槽骨状态。
图9为示出对于将β-TCP作为支架时的拔牙窝的骨形成进行观察的结果的照片。(A)表示在拔牙后3个月进行植入的结果、(B)表示在拔牙后6月进行植入的结果。
图10为示出使用β-TCP(β磷酸三钙、3CaO·P2O5)作为支架时β-TCP在骨中的置换等的图。(A)为示出摘出物的照片，(B)为示出组织染色的结果的照片。(C)和(D)为将拍摄图像部分放大的照片。图中，NB表示新生骨、且TCP表示β-TCP。此外，BV表示血管、SF表示摘出物的底部。
图11为示出藉由嗅觉球进行干细胞来源培养上清的经鼻给药的情况下的应用部位的图。
图12为进行经鼻给药时的照片。
图13为示出脑卒中患者的血管的闭塞部的MRA图像。
图14为示出脑卒中患者的脑损伤部位的CT扫描图像。
图15为示出脑卒中患者的脑损伤部位的血流量的MRI图像。(A)为刚脑卒中后的图像、(B)为治疗后的图像。
图16为示出表示治疗期间患者状态的评分(NIHSS)的变化的曲线图。
图17为示出患者功能的恢复状况的照片。(A)为表示手功能的恢复状况的照片、(B)为表示腰腿恢复状况的照片。
图18为示出在给药组和非给药组中进行简易精神状态检査(Mini Mental State：MMS)和长谷川试验任意一者的结果的经时变化的图。图18(A)表示非给药组的结果、图18(B)表示给药组的结果。
图19为示出针对难治性皮炎的治疗效果的照片。图19(A)表示治疗开始前的状态、图19(B)表示治疗终止时的状态。
具体实施方式
下面进一步详细说明本申请发明。
为了得到本申请发明的永生化干细胞，首先从包括哺乳类的间叶细胞、初生胚和除间叶细胞外的体细胞的细胞组中分离干细胞。作为上述哺乳类，从与人细胞的遗传相似性高以及感染危险性低的方面考虑，优选从由人、猪、马以及猴组成的组中选择。
在本说明书中，“间叶细胞”是指具有分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞等属于间叶系的细胞的分化能力的细胞。作为具体的间叶细胞，可以举出上述动物的牙髓细胞、骨髓细胞、脐带细胞和脂肪细胞等。此外，“初生胚”是指为了确立ES细胞所需要的、比受精卵进一步发育的至胚胞为止的初期阶段的胚。“体细胞”是指构成生物体的细胞中生殖细胞以外的细胞的总称。
进一步地，“牙髓细胞”是指具有再生能力的牙齿的神经所含有的干细胞的一种。由于被牙齿之类的硬质材料所保护，因而其具有紫外线或放射线不会穿过、基因也不容易损伤的特性。“骨髓细胞”是在骨髓穿刺液中得到的细胞的总称，包括成髓细胞等白血球系细胞、成红血细胞系的细胞、骨髓巨核细胞以及浆细胞等。
本说明书中的脐带细胞是指在连接胎儿与胎盘的脐带中存在的细胞，其也包括脐带中所含有的富含造血干细胞的脐带血。
作为上述导入到干细胞中的基因，可以举出hTERT、bmi-1、E6、E7、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc以及p16INK4a等。hTERT为端粒修复酶的基因，bmi-1是作为构成多梳家族复合物的蛋白质之一的Bmi-1的基因。此处，Bmi-1对于造血干细胞的维持是必要的，通过其活性增强，具有能够增加造血干细胞的作用。
E6和E7为HPV-16或HPV-18的初期基因。此外，Oct3/4是与Sox2合作来活化靶基因的转录的基因。Klf4(Kruppel型转录因子4)对于与细胞分裂和胚胎有关的基因进行调节，并作为癌抑制因子与消化器系统癌症相关。
Sox2属于SRY相关HMG box基因家族，其为已知与功能的未分化性(多能性)的维持相关的基因。c-Myc为促癌基因，其为在经c-Myc诱导的肿瘤内促进细胞的生存与死亡这两者的基因。p16INK4a为在控制癌细胞的细胞周期方面发挥出重要作用的基因。
下面举出使用来自人的脱落乳牙的牙髓细胞来制作永生化干细胞的情况为例来进行说明。
首先，脱落乳牙利用例如氯己定、聚维酮碘溶液等消毒药消毒，之后分离出齿冠部，利用牙医铰刀回收牙髓组织。
将所采集的牙髓组织悬浮在基本培养基、例如含有5％～15％的牛血清(calfserum、下面称为“CS”)和50单位/mL～150单位/mL抗生物质的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，下面称为“DMEM”)中。接着，使用1mg/mL～5mg/mL的胶原酶和1mg/mL～5mg/mL的分散酶(dispase)，在37℃处理0.5小时～2小时。
作为上述基本培养基，除DMEM外，还可使用伊斯科夫改良达尔伯克培养基(IMDM)(GIBCO社制造等)、Ham’s F12培养基(HamF12)(SIGMA社制造、GIBCO社制造等)、RPMI1640培养基等。还可将两种以上的基本培养基合用。作为混合培养基的一例，可以举出将IMDM与HamF12等量混合得到的培养基(例如以商品名IMDM/HamF12(GIBCO社)进行市售)。
此外，作为基本培养基中的添加物，可以举出胎牛血清(fetal bovine serum或fetalcalf serum，下文称为“FBS”或“FCS”)、人血清、羊血清其它血清、血清替代物(Knockoutserum replacement(KSR)等)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin、下文称为“BSA”)；青霉素、链霉素等抗生物质；各种维生素、各种矿物质。
上述的基本培养基也可以在后述的细胞分选用培养以及分选后的细胞培养中使用。
在酶处理后，进行3～10分钟的离心操作(3,000～7,000转/分)，回收牙髓细胞。根据需要使用细胞过滤网进行细胞的分选。分选出的细胞利用例如3～6mL的上述基本培养基进行再悬浮，播种到直径4～8cm的贴壁细胞培养用培养皿中。
接下来，添加培养液、例如添加含有10％FCS的DMEM，之后利用5％CO2培养箱在37℃培养2周左右。除去上述培养液后，利用PBS等将细胞清洗1次～数次。也可不进行培养液的去除和细胞的清洗，而将形成有菌落的贴壁性的牙髓干细胞回收。贴壁性的牙髓干细胞例如利用0.025～0.1％的胰蛋白酶和0.3～1mM的EDTA在37℃处理数分钟，从培养皿剥离，接下来进行细胞回收。
在酶处理后，进行3～10分钟的离心操作(3,000～7,000转/分)，回收牙髓细胞。根据需要使用细胞过滤网进行细胞的分选。分选出的细胞利用例如3～6mL的上述基本培养基进行再悬浮，播种到直径4～8cm的贴壁细胞培养用培养皿中。
接下来，添加培养液、例如添加含有10％FCS的DMEM，之后利用5％CO2培养箱在37℃培养2周左右。除去上述培养液后，利用PBS等将细胞清洗1次～数次。也可不进行培养液的去除和细胞的清洗，而将形成有菌落的贴壁性的牙髓干细胞回收。贴壁性的牙髓干细胞例如利用0.025～0.1％的胰蛋白酶和0.3～1mM的EDTA在37℃处理数分钟，从培养皿剥离，接下来进行细胞回收。
接着，对如上所述分选出的贴壁性细胞进行培养。例如，将如上所述得到的牙髓干细胞播种在贴壁细胞培养用培养皿中，在5％CO2、37℃的条件下利用培养箱进行培养。如上可以得到人脱落乳牙干细胞的原代培养细胞(SHED-P)。
关于传代培养，例如在用肉眼观察达到半融合或融合时，如上述那样使用胰蛋白酶和EDTA将细胞从培养容器剥离并进行回收，再次播种到加入有培养液的培养容器中。
此处，半融合是指在培养容器中的细胞附着面的约70％有细胞附着的状态。例如，进行1～8次传代培养，使分选出的细胞增殖到必要的细胞数、例如约1×107个/mL。在如上述那样进行培养后，回收细胞，保存在液氮中。由各种供体回收的细胞也可以以牙髓干细胞库的形态进行保存。
接下来，向对上述干细胞进行初期培养得到的原代培养细胞中导入4种基因，制作基因导入细胞。导入到其中的基因优选为选自由hTERT、bmi-1、E6、E7、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc以及p16INK4a组成的组中的4种。通过导入hTERT、bmi-1、E6、E7，能够得到个体倍增次数更多的永生化干细胞。此处，hTERT为人端粒酶逆转录酶的基因，bmi-1为与干细胞的自体复制、分化调节有关的多梳家族基因。E6和E7为在对用于人乳头瘤病毒的自体复制的初期基因进行编码的开放阅读框中存在的基因。
这样的基因导入可如下进行。
制备用于插入上述目的基因的质粒，将其插入到穿梭载体、例如pShuttle2中，克隆上述基因。利用该穿梭载体转化大肠杆菌，选择卡那霉素抗性转化体。对所选择的卡那霉素抗性转化体的质粒DNA进行提纯，分析限制酶部位，鉴定重组体。
接着，使用限制酶、例如PI-Sce I和I-Cue I，将表达盒从上述穿梭载体中切出，将其与腺病毒载体、例如Adeno-X病毒DNA连接。将所得到的连接产物利用Swa I切断，使用其来转化大肠杆菌。
从所得到的转化体中选择氨苄青霉素抗性转化体。对插入有上述基因的重组腺病毒DNA进行提纯，分析限制酶部位，鉴定重组体。
接下来，利用Pac I消化重组腺病毒，将其转染至HEK293细胞中。使重组腺病毒增殖，将其收集，测定病毒的滴度。按照常规方法提纯病毒，使其感染靶细胞SHED-P。
将病毒感染后的细胞组按照常规方法利用FITC染色，使用流式细胞仪检测STRO-1阳性细胞。此处，STRO-1被认为是骨髓中具有多分化能力的间叶干细胞的标记之一，为细胞永生化的指标。
通过上述过程可以得到牙髓来源的永生化干细胞。
接着，使用上述基本培养基、例如加入有10％FBS的DMEM，在5％CO2、37℃的条件下对所得到的永生化干细胞进行24～48小时培养，得到培养上清。为了回收培养上清，可使用例如Komagome型移液管等。所回收的培养上清可直接作为本发明药物组合物的有效成分使用，也可以在进行浓缩、溶剂置换、透析、冷冻干燥、稀释等处理后作为本发明药物组合物的有效成分使用。
并且，如后所述，上述得到的永生化干细胞的培养上清含有各种生长因子，即使不进行高度提纯，也显示出各种作用。即，能够用于各种疾病的治疗的本发明的药物组合物能够利用简易的工序进行制造，因而能够避免与高度提纯相伴的各种生长因子生理活性的降低。
需要说明的是，本发明中使用的“永生化干细胞的培养上清”是指对永生化干细胞进行培养得到的含有各种生物因子的培养上清，其是指不含有永生化干细胞等细胞的溶液。在制备不含有血清的培养上清的情况下，可以在从初期培养到传代的全部过程中使用无血清培养基、或者在回收细胞前的数次传代时使用无血清培养基。
利用上述方法选择-培养的牙髓干细胞为从生物体采集的组织或细胞，与最初播种的原代培养细胞具有同样的性质。通常，原代培养细胞与作为其来源的脏器具有类似的性质，接近于正常细胞，这一点是很重要的。但是，与细胞株相比，其增殖缓慢，并且在继续培养时还可能产生去分化，难以保有且维持其性质。
但是，在本发明的永生化干细胞中，在细胞倍增次数为20次或40次的时刻，作为细胞未分化度的标记的STRO-1的表达率显著高于并非为永生化干细胞的牙髓干细胞，优选其显示出约为1.5～3倍的高比例。这是由于STRO-1表达率的高度为显示与原代培养细胞具有同样性质的指标。
此外，本发明的永生化干细胞在培养上清中分泌选自由胰岛素样生长因子(IGF-1)、血管内皮细胞增殖因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGF-β)以及作为肝细胞增殖因子的HGF组成的组中的至少2种以上的生长因子。此处，“生长因子”为促进细胞分裂、致使细胞形态变化或细胞肥大的多肽的总称。根据产生生长因子的细胞种类的不同，因子有所不同，大致分为上皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、肿瘤增殖因子(TGF)等。
进而，在位于各细胞的细胞膜的受体具有酪氨酸激酶活性、并结合生长因子时，蛋白质的酪氨酸残基发生磷酸化，引起细胞的增殖或分化。已知有几个生长因子在个体发生中成为中胚层诱导物质的示例。并且已知有几个调节免疫系统的淋巴因子在个体发生中成为中胚层诱导物质的示例。这样的生长因子可利用公知的ELISA法、微阵列法等进行定量。
上述IGF-1为与胰岛素序列高度类似的多肽，在细胞培养中与胰岛素同样地产生促有丝分裂等反应。已知还会影响神经细胞的成长。此外，上述VEGF为与血管形成和血管新生相关的一组糖蛋白，血管形成是在胚胎形成期在无血管的位置形成新的血管，血管新生是从现有的血管伸出分支来形成血管。上述TGF-β还是针对大量细胞的强力增殖抑制因子，与细胞的分化-迁移-粘附也密切相关，在个体发生、组织再建、创伤治愈、炎症-免疫、癌浸润-转移等广泛的领域发挥出重要的作用。进而，HGF不仅在肝细胞中、而且在各种细胞中具有细胞增殖促进、细胞运动促进、抗凋亡(细胞死亡)、形态发生诱导、血管新生以及组织-脏器的再生与保护等多种生理活性。
将上述各种干细胞在例如添加了15％FCS的DMEM中在37℃培养一定期间，从而可得到含有上述生长因子的培养上清。需要说明的是，在上述干细胞的培养上清中，除了含有IGF-1、VEGF、TGF-β以及HG以外，还含有约70种的蛋白。
将所得到的培养上清中的15mL加入到Amicon Ultra Centrifugal FilterUnits-10K(Millipore社制造)中，以×4,000g离心约60分钟，浓缩至约200μl。接下来，向该管中投入与培养上清同量的灭菌PBS，再次以×4,000g离心约60分钟，将溶剂置换为PBS。将所得到的200μL的溶液回收到微量试管中，制成浓缩干细胞培养上清。
也可以利用乙醇沉淀法进行浓缩来替换上述使用Amicon的方法。例如，在5mL的培养上清中加入45mL的100％乙醇并进行混合，在-20℃放置60分钟。其后，以×15,000g于4℃离心15分钟，去除上清。
接下来，例如可加入10mL的90％乙醇进行搅拌，再次以×15,000g于4℃离心5分钟。去除上清，可以将所得到的颗粒溶解在例如500μL的灭菌水中。溶解后，将总量回收到微量试管中，制成浓缩干细胞培养上清。
如上得到的培养上清还可按照常规方法冷冻干燥，制成在使用时进行调整的药物组合物。
该药物制剂所含有的培养上清中的生长因子的量相对于全部干燥重量优选为约50重量％～500重量％。这是由于，在小于50重量％时，发挥不出效果；而即使超过500重量％，也预料不到效果的改善。
作为该药物组合物的剂型，可以举出粉末、液剂、凝胶剂、喷雾剂和经皮吸收系统等。例如，可以加入填充剂、赋形剂、pH调节剂等添加物，装入到灭菌后的玻璃安瓿、血清管等小型容器中，制成药物制剂。在使用时，可溶解在生理盐水或灭菌注射用水中，经鼻给药，此外还可浸润到纱布中，贴在患部。在用于牙槽骨等骨的再生成的情况下，可以作为支架材使用胶原蛋白、β-TCP等，并将它们浸渍在上述溶解液中进行包埋。
作为可应用本申请发明的药物制剂的损伤组织，可以举出形成了溃疡或褥疮的组织、由于血管的闭塞而发生了损伤的脑组织、由于骨、牙周组织和中枢神经系疾病而发生了损伤的组织等。
此处，“溃疡”是指发生了坏死的组织溶解或剥离后，在脏器的表面形成的组织缺损部，其形成于上皮、真皮、粘膜等处。未到达真皮处的称作糜烂。具体地说，在皮肤、鼻口腔粘膜、角膜等与体表相接的位置或消化道、呼吸道、尿道、血管等管腔脏器的内腔面形成溃疡。
关于“褥疮”，是指在临床上患者长期呈相同姿势处于无法翻身状态的情况下，在躯体与支持面(多为床)接触的位置，局部循环功能不全，在周边组织产生坏死的状态。
“由于外科操作而发生了缺损”是指由于脑肿瘤摘除等外科手术而发生缺损。
“血管的闭塞”是指血管由于下述任一理由而闭塞的状态。例如其是指：由于动脉硬化而使血管发生狭窄、血液在该处之前无法流动的状态；在心脏附近的血管动脉硬化部位，该血管内的栓塞(血液、脂肪等的块状物)由血管内壁剥落、阻塞血管，血液在该处无法向前流动的状态；炎症、痉挛、或者血液成分或血流发生变化，而使血液的供给中断。
“脑”具有记忆、情绪、意志决定等功能。脑、脊髓由被称为脑脊髓液的液体所包围。脑脊髓液(cerebrospinal fluid、CSF)具有保护脑、运输营养-代谢物的功能。脑脊髓液可通过脊椎穿刺采集，其性状根据疾病等而发生变化。
此处，“脊髓”是指脊椎动物所具有的神经干。此外，“中枢神经系统”是指将脊髓和脑合在一起的组织。中枢神经系统具有作为根据来自末梢的刺激发生反射的反射中枢来起作用的功能、或具有整合刺激的功能。
中枢神经系统的损伤由于脊髓损伤等而产生。此处，“脊髓损伤”是指脊髓由于外部冲击、脊髓肿瘤、疝气等内在原因而发生了损伤的状态。根据损伤程度的不同，分为脊髓在中途被完全切断的完全型、以及脊髓受到损伤或压迫但脊髓功能得以部分维持的不完全型。
此外，“脊髓症”是由于年龄增加所致的颈椎症(椎间盘的突起-骨刺的形成)的变化使位于颈椎脊柱管中的脊髓受到压迫而发病。
上述的药物制剂可以以液剂或凝胶剂的形式应用于创伤部位，也可以片状制剂的形式来应用。首先使其被保湿性的部件、例如纱布、医疗用保湿片等吸收，制成片状制剂。接着，利用该片状制剂覆盖损伤的部位。使带负电的棒状电极在覆盖了损伤部位的片上一边慢慢地旋转一边进行移动，使与创伤部位离开的所期望的部位与带正电的电极接触。
如上所述，利用在创伤部位上应用的电极与在其它部位应用的电极之间流经的电流，可以有效地对上述药物制剂中的有效成分进行给药。
通过对上述的损伤组织应用本申请发明的药物制剂，能够谋求组织的快速恢复。
实施例1
(永生化SHED的制作和培养方法)
(1)提取用试剂、质粒等
(1-1)试剂等
使用卡那霉素(Kan)、氨苄青霉素(Amp)、LB液体培养基和LB琼脂培养基、糖原、琼脂糖、灭菌水、乙酸铵、乙酸钠、十二烷基硫酸钠和RNase A。制备50mg/mL的卡那霉素(Kan)和氨苄青霉素(Amp)，以储存液的形式保存在-20℃。糖原制备成20mg/ml。制备10mg/ml的RNase A，保存在-20℃。制备10M(饱和)乙酸铵(NH4OAc)、3M乙酸钠(NaOAc；pH5.2)。
(1-2)限制酶等
大肠杆菌感受态细胞(Supercharge EZ10电感受态细胞、产品编码636756)、SwaI(产品编码1111A、Smi I为等同品)、Xho I(产品编码1094A)、T4DNA Ligase(产品编码2011A)、NucleoBond Xtra Midi(产品编码740410.10/.50/.100)、NucleoSpinPlasmid(产品编码740588 10/50/250)均购自Takara Bio Inc。Pac I购自New EnglandBiolabs。
(1-3)缓冲液等
制备1×TE缓冲液(含有1mM EDTA的10mM Tris-HCl[pH8.0])、经100mMTris-HCl(pH8.0)饱和的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1、下文称为“PCI混液”)。乙醇以100％和70％使用。为了提纯在小规模重组中使用的pAdeno-X质粒DNA，制备下述缓冲液1～4。
缓冲液1：含有10mM EDTA和50mM葡萄糖的25mM Tris-HCl(pH8.0)(高压灭菌后在4℃保存)
缓冲液2：含有1％SDS的0.2M NaOH(在即将使用前进行使用时的制备，密封，室温保存)
缓冲液3：5M KOAc(高压灭菌后在4℃保存)
缓冲液4：含有1mM EDTA、20μg/ml RNase的10mM Tris-HCl(pH8.0)(在即将使用前添加RNase。在-20℃保存)
(2)腺病毒提纯和β-gal分析用试剂
使用利用人5型腺病毒转化后的人HEK293细胞(ATCC#CRL1573)。HEK293细胞利用完全培养基培养。完全培养基的组成为添加有100单位/ml的青霉素G钠和100μg/ml的链霉素、4mM的谷氨酰胺和10％FBS的DMEM(Dulbecco's ModifiedEagle's Medium、基本培养基)。以10,000单位/ml制备青霉素G钠溶液、以10,000μg/ml制备硫酸链霉素溶液，以储存液的形式保存。
培养中使用60mm微板、100mm微板、6-孔微板、T75和T175烧瓶。
胰蛋白酶-EDTA(产品编码CC-5012)由Takara Bio Inc购入。制备磷酸缓冲生理盐水(PBS、不含有Ca2+和Mg2+)和Dulbecco's磷酸缓冲生理盐水(DPBS、含有Ca2+和Mg2+)。另外，使用0.33％的中性红染色液、0.4％锥虫蓝染色液。
在β-gal分析中，将X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖(25mg/ml))二甲基甲酰胺(DMF)溶液在-20℃遮光保存。使用Luminescentβ-gal Detection Kit II(产品编码631712、Takara Bio Inc制造)。
(3)预备试验
(3-1)含有lacZ的重组腺病毒(pAdeno-X-lacZ)的构建
将解冻后去除了DMSO的HEK293细胞再悬浮于10mL的上述完全培养基中，将全部量转移至100mm的培养微板中。在HEK293细胞附着后，去除培养液，将细胞利用灭菌PBS进行1次清洗，加入1ml的胰蛋白酶-EDTA溶液，进行约2分钟处理。
接着，加入10ml的完全培养基停止胰蛋白酶的反应，进行平稳悬浮。进行活菌计数，将105个细胞转移至加入有培养液10ml的100mm的微板中，进行均匀扩散。
使用pShuttle2-lacZ(包含在Adeno-X Expression System 1中的阳性对照载体)和包含在试剂盒中的Adeno-X病毒DNA(PI-Sce I和I-Ceu I digested)，按照试剂盒所付的实验方案，构建包含lacZ的重组腺病毒。使其感染靶细胞SHED，分析β-半乳糖苷酶的表达，确认载体的构建。
(3-2)重组pShuttle2质粒的构建
在重组pShuttle2载体(下文中称为“rpShuttle2载体”)构建前，利用试剂盒中含有的pShuttle2载体和pShuttle2-lacZ载体对DH5α大肠杆菌进行转化。在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂微板(下文中称为“LB/Kan”)上进行转化体的选择，将从单一菌落取得的菌体在新的LB/Kan上划线，在37℃培养一夜。
接下来，将hTERT、bmi-1、E6、E7按以下顺序克隆到pShuttle2中。利用适于这些基因的限制酶切断pShuttle2载体。
接下来，参照上述试剂盒中所附的pShuttle2载体Information Packet(PT3416-5)，确定与插入的DNA匹配的多克隆位点。将限制酶处理后的上述质粒利用碱性磷酸酶处理，进行提纯。
按照常规方法制备靶DNA碎片、进行提纯。将上述利用限制酶消化的载体与上述基因碎片连接，利用连接产物转化DH5α细胞(感受态细胞)。取上述感受态细胞的一部分，利用试剂盒中包含的对照载体pShuttle2-lacZ载体进行转化，作为阳性对照。
将含有转化后的大肠杆菌的混合液接种于LB/Kan琼脂微板，选择卡那霉素抗性(Kanr)转化体(菌落)。选择5～10个Kan抗性克隆，接种于少量的液体培养基中，进行扩增。在确认这些克隆具有rpShuttle2载体后，进行一夜培养。其后，使用市售的二氧化硅吸附柱，按照常规方法对所构建的质粒DNA进行提纯。
将该质粒DNA利用限制酶处理，进行1％琼脂糖凝胶电泳，鉴定目的重组质粒。通过测序确认所插入的碎片的方向和插入部位，鉴定阳性克隆。
将重组pShuttle2质粒DNA(下文中称为“rpShuttle2质粒DNA”)直接转染至靶细胞中，进行Western印迹法，对目的蛋白质的表达进行预检测。
(3-3)rpShuttle2质粒DNA的PI-Sce I/I-Ceu I双消化
利用PI-Sce I和I-Ceu I从如上制作的rpShuttle2质粒DNA中切出所导入的基因的表达盒。按照试剂盒中所附的实验方案所记载的体外(in vitro)连接方法，将切出的表达盒插入到Adeno-X病毒DNA中。制备rpShuttle2质粒DNA的PI-Sce I/I-Ceu I双消化液30μl，将下述表1中记载的试剂装入到1.5ml的灭菌微量离心管中，进行混合。
[表1]
接下来，在充分混合后装入微量离心管中轻柔地离心，其后在37℃培养3小时。
将1kb条带(DNA尺寸标记)与上述双消化后的反应液(5μl)一起利用1％琼脂糖/EtBr凝胶进行电泳。
(3-4)苯酚：氯仿：异戊醇提取
在离心管中，向上述双消化液的残留物(25μl)中添加70μL的1×TE缓冲液(pH8.0)与100μL的PCI混液，利用漩涡混匀器充分搅拌。接下来，使用微量离心机，在4℃以14,000rpm离心5分钟，将水层转移至1.5ml的干净微量离心管中。向其中添加400μL的95％乙醇、25μL的10M乙酸铵以及1μL的糖原(20mg/ml)，利用漩涡混匀器充分搅拌。
接下来，在4℃于14,000rpm离心5分钟，吸引去除上清，得到颗粒。向该颗粒中加入300μL的70％乙醇，在室温下于14,000rpm离心2分钟。小心地吸引去除上清，将颗粒在室温下风干约15分钟。
颗粒干燥后，将其溶解在10μL的1×TE灭菌缓冲液(pH8.0)中，使用前保存在-20℃。
(4)重组Adeno-X质粒DNA的构建
(4-1)表达盒在Adeno-X病毒基因组中的亚克隆化
将下述表2所示的试剂依序加入到1.5ml的灭菌微量离心管中，温和地混合，轻柔离心后，在16℃培养一夜。
[表2]
试剂等 液量(μL)
PI-Sce I/I-Ceu I消化pShuttle2质粒DNA 2.0
PI-Sce I/I-Ceu I消化pShuttle2-lac Z质粒DNA －
灭菌水 3.0
10×DNA连接缓冲液 1.0
Adeno-X病毒DNA(250ng/μl) 3.0
DNA连接酶(1单位/μL) 1.0
合计 10.0
在各样品中加入90μL的1×TE缓冲液(pH8.0)和100μL的PCI混液，利用漩涡混匀器温和地搅拌。在4℃于14,000rpm离心5分钟，将水层转移至1.5ml的干净微量离心管中，向其中添加400μL的95％乙醇、25μL的10M乙酸铵溶液以及1μL的糖原(20mg/ml)，利用漩涡混匀器温和地搅拌。
在4℃于14,000rpm离心5分钟，通过吸引去除上清，得到颗粒。与上述(3-4)同样地进行下述的乙醇沉淀操作。
颗粒干燥后，将其溶解在15μL的灭菌去离子水中。
(4-2)重组Adeno-X质粒DNA的Swa I消化
制备下表3所示的消化液，加入到装入离心管中的各样品中，于25℃培养2小时。
[表3]
试剂等 液量(μL)
连接产物 15
10×Swa I消化缓冲液 2.0
10×BSA 2.0
Swa I(10单位/μL) 1.0
合计 20.0
在各样品中加入80μL的1×TE缓冲液(pH8.0)和100μL的PCI混液，利用漩涡混匀器温和地搅拌。利用微量离心管在4℃于14,000rpm离心5分钟。与上述(3-4)同样地进行下述乙醇沉淀的操作，颗粒的溶解液在使用前保存于-20℃。
(4-3)利用重组Adeno-X质粒DNA进行的大肠杆菌转化的确认
使用Supercharge EZ10电感受态细胞(产品编码636756)，利用上述(4-2)中得到的Swa I消化产物对电穿孔用感受态细胞(大肠杆菌)进行转化。
将转化混合液接种在向LB培养基中加入有氨苄青霉素(最终浓度100μg/mL)的琼脂微板(下文中称为“LB/Amp琼脂微板”)上，在37℃培养一夜。得到作为氨苄青霉素抗性(Ampr)转化体的约106个菌落。将所得到的菌落利用产品所附的Adeno-XSystem PCR Screening Primer Set进行检测。
在5mL新鲜的LB/Amp液体培养基中接种来自单一菌落的菌体，培养一夜。翌日按照后述的小规模法提纯Adeno-X质粒DNA。
(4-4)重组Adeno-X质粒DNA的小规模制备
将处于对数增殖期的培养液5mL于14,000rpm离心30秒，去除上清。将颗粒再次于10,000rpm离心1分钟，使用微量移液管去除上清。
向其中加入150μL的上述缓冲液1，温和地吸液，进行再悬浮。向该细胞悬浮液中添加150μL的缓冲液2，温和地转倒混合，在冰上放置5分钟。向冷却的细胞悬浮液中加入150μL的缓冲液3，再次转倒混合，在冰上放置5分钟。
将该细胞悬浮液在4℃于14,000rpm离心5分钟，将透明的上清转移到1.5ml的干净离心管中。向该上清中添加450μL的PCI混液，转倒混合，进行搅拌。其后在4℃于14,000rpm离心5分钟，将水层转移到1.5ml的干净微量离心管中。
与上述(4-1)同样地进行下述乙醇沉淀的操作，颗粒的溶解液在使用前保存于-20℃。靶rDNA利用后述的基于限制酶的分析以及PCR进行鉴定。
(5)所得到的rAdeno-X质粒DNA的限制酶部位分析
使用PI-Sce I和I-Ceu I进行分析。将下述表4所示的试剂装入1.5ml的灭菌微量离心管中，加入30μL的PI-Sce I/I-Ceu I双消化反应液，充分搅拌，轻柔地旋转，收集内容物。
[表4]
试剂等 液量(μL)
灭菌水 19.5
10×双消化液 3.0
rpAdeno-X DNA(500ng/μl)(500ng/μl) 2.0
pShuttle2-lac Z质粒(500ng/μl) －
PI-Sce I(1单位/μl) 2.0
I-Ceu I(5单位/μl) 0.5
10×BSA 3.0
合计 30.0
在37℃培养3小时，进行限制酶处理。将该处理后的反应液利用1％琼脂糖/EtBr凝胶进行电泳。
(6)重组腺病毒的产生
(6-1)HEK23细胞转染用rAdeno-X质粒DNA的制备
将下表5所示的试剂等装入到1.5ml的灭菌离心管中、进行混合，利用微量离心机轻柔地离心。其后在37℃培养2小时，对rAdeno-X质粒DNA进行Pac I限制酶处理。
[表5]
试剂等 液量(μL)
灭菌水 20
pAdeno-X质粒DNA(500ng/μl) 10
10×Pac I消化缓冲液 4
10×BSA 4
Pac I(10单位/μL) 2
合计 40
添加60μL的1×TE缓冲液(pH8.0)与100μL的PCI混液，利用漩涡混匀器温和地搅拌，利用微量离心机在4℃以14,000rpm离心5分钟。将水层小心地转移至1.5ml的干净灭菌离心管中。
与上述(3-4)同样地进行下述乙醇沉淀的操作，颗粒的溶解液在使用前保存于-20℃。
(6-2)Pac I消化Adeno-X质粒DNA向HEK293细胞中的转染
在上述质粒DNA转染前24小时，按照在每一60mm的培养微板中的细胞数为1～2×106(大致为100cells/mm2)的方式进行HEK293细胞的接种，在37℃、5％CO2存在下进行培养。
将Pac I消化的10μL的Adeno-X质粒DNA转染至各培养微板中，按照标准的转染法(CalPhos Mammalian Transfection Kit产品编码631312、Takara Bio Inc制造)将Adeno-X DNA导入至HEK293细胞中。自转染的翌日起确认是否发生CPE(细胞变性效果)。
1周后，对于附着于培养微板的底面和侧面的细胞进行温和的搅拌，使之剥离。将所得到的细胞悬浮液转移至15ml的灭菌后的圆锥离心管中，在室温下于1,500×g离心5分钟。
将所得到的沉淀悬浮在500μL的灭菌PBS中。反复进行3次在干冰/乙醇中冷冻、在37℃的恒温槽中融解的冰冻融解操作，得到细胞充分融解的裂解液。接下来，轻柔地离心，除去悬浮物，将上清转移到其它的灭菌管中，立即进行使用。未立即使用的部分保存于-20℃。
在60mm微板的培养细胞中加入250μL的上述裂解液，继续进行培养。另外，使用Adeno-X Rapid Titer Kit(产品编码631028、Takara Bio Inc制造)中包含的的抗Hexon抗体，按照该试剂盒的操作说明书(PT3651-1)测定腺病毒的滴度。
(6-3)为制造高滴度病毒所进行的病毒的扩增
在开始进行该滴度测定的约24小时前，将HEK293细胞接种在T75烧瓶中，在37℃、5％CO2存在下培养一夜，确认到50％～70％融合。
翌日，更换为含有病毒的新的培养基，利用MOI＝10感染。在37℃、5％CO2存在下培养90分钟后，取出烧瓶，加入10mL的培养基。
在37℃、5％CO2存在下培养3～4天，确认CPE。在50％的细胞发生剥离时，与上述同样地制成游离细胞悬浮液，转移到15mL的灭菌圆锥离心管中。进行与上述同样的冰冻融解操作，使细胞融解。使用Adeno-X Rapid Titer Kit(产品编码631028)，得到了107PFU/mL的滴度。
进行Western印迹法，对包装的腺病毒基因组是否以具有功能的形态具有针对靶基因特异性的转录单元的复制进行确认。
(7)腺病毒向靶细胞的感染
(7-1)向靶细胞的感染
在感染24小时前，将1×106个SHED接种至6孔微板。在接种的翌日去除培养基，将含有病毒的1.0mL培养基添加到各微板的中心。使该溶液在SHED所形成的整个单层均匀扩展。
在37℃、5％CO2存在下培养4小时，使病毒感染SHED。接下来，添加新鲜的培养基，进一步在37℃、5％CO2存在下进行培养。在感染24小时后～48小时后对导入基因的表达进行经时性分析。
(7-2)感染细胞的β-半乳糖苷酶表达的分析
使用Luminescentβ-gal Detection Kit II(产品编码631712、Clontec社)对于经Adeno-X-lacZ感染的贴壁性细胞中的β-半乳糖苷酶的表达进行分析。
实施例2
(1)SHED的制作
使用由10岁健康男孩得到的脱落乳牙。将该脱落乳牙利用聚维酮碘溶液消毒后，使用牙科用金刚钻，将齿冠沿水平方向切断，使用牙医铰刀回收牙髓组织。将所得到的牙髓组织在3mg/mL的I型胶原酶和4mg/mL的分散酶的溶液中于37℃消化1小时。接着，将该溶液使用70mm的细胞过滤网(Falcon社制造)进行过滤。
将滤出的细胞再悬浮于4mL的上述培养基中，播种在直径6cm的贴壁细胞培养用培养皿中。向该培养皿中添加含有10％FCS的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium)，在调整为5％CO2、37℃的培养箱中培养2周左右。将形成了菌落的贴壁性细胞(牙髓干细胞)利用0.05％胰蛋白酶-0.2mMEDTA在37℃处理5分钟，回收从培养皿剥离的细胞。
接着，将如上所述选择出的贴壁性细胞播种于贴壁细胞培养用培养皿(胶原蛋白包覆培养皿)，在调整为5％CO2、37℃的培养箱中进行一次培养，作为原代培养细胞。在经肉眼观察呈半融合(细胞占领培养容器的约70％表面的状态)或融合时，利用0.05％胰蛋白酶-0.2mMEDTA在37℃处理5分钟，从培养容器剥离细胞，进行回收。
将如此得到的细胞再次播种在加入有上述培养基的培养皿中，进行数次传代培养，增殖到约1×107个/mL。将所得到的细胞保存在液氮中。
其后，使用上述培养基，以约1×104细胞/cm2的浓度对一次培养细胞进行传代培养。将1～3次传代的细胞用于实验。人BMMSC(骨髓间叶干细胞、Bone MarrowMesenchymal stem cells)购自Lonza社，按照制造商的操作说明书进行培养。
如上得到人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)。对于所得到的SHED，使用FACSTARPLUS(Becton·Dickinson社制造)，如下对于各试样进行约1×106个STRO-1阳性细胞的分选。
按照溴脱氧尿苷BrdU染色试剂盒的制造商(Invitrogen社制造)的操作说明书，进行12小时BrdU的插入，对SHED的增殖速度进行评价(各组中n＝3)。实验反复进行5次。在单因素方差分析后进行Tukey-Kramer检测，评价统计的显著差异。
为了利用免疫荧光检测出STRO-1，将SHED利用3％多聚甲醛固定，其后利用PBS漂洗2次，利用100mM的甘氨酸处理20分钟。接下来，将这些细胞利用0.2％的Triton-X(Sigma-Aldrich社)进行30分钟透过处理，其后在5％的驴血清和0.5％的牛血清白蛋白的混合物中培养20分钟。
接着，将细胞与作为一次抗体的小鼠抗人STRO-1抗体(1：100、R&D社制造)一起培养1小时，与作为二次抗体的山羊抗小鼠免疫球蛋白M-FITC抗体(1：500、Southern Biotech社制造)一起培养30分钟，使用VECTASHIELD DAPI(VectorLaboratories Inc)进行装配。
其后，将添加有15％FBS的α-MEM加入到6孔微板中，播种分选出的细胞用于制作克隆体。将增殖的细胞中的约300菌落汇合(pool)用于试验。
(2)基因的导入
如上所述，将bmi-1、E6、E7和hTERT这4个基因插入到腺病毒载体中，制作表达这些基因的产物的病毒载体。作为对照，制作未插入这些基因的对照载体。
将SHED以1×106个播种在100mmφ的胶原蛋白包覆培养皿中，加入添加有10％FBS的DMEM，培养至半融合。吸引去除该培养基，加入利用上述培养基稀释的病毒溶液500μL(MOI＝10)，在37℃于5％CO2培养箱中培养1小时，使上述病毒载体感染。感染48小时后，将培养基换为上述培养基，在加入有嘌呤霉素(1pg/mL)的上述培养基中对感染细胞培养10天进行选择，汇合500～600个抗性克隆。每3～4天将约0.5×105个SHED播种至100mmφ的培养皿中，进行传代。将导入有基因的SHED作为SHED-T、将未导入有基因的SHED作为SHED-C。
实施例3
(1)SHED-C和SHED-T的生长速度的测定
图1中示出了SHED-T(进行了基因导入的SHED)个体数的倍增状态。图中，纵轴为个体倍增次数(细胞分裂次数、次)，横轴为时间(培养天数)。此外，将培养中的SHED在1个月中未发生分裂的状态作为细胞老化的判断基准。
SHED-C在30次时停止增殖，进入老化或增殖停止阶段。与此相对，对于SHED-T，超过250PD，在经过800天后仍在增殖。
(2)流式细胞分析
为了得到单一细胞的悬浮液，将贴壁性的单层细胞利用胰蛋白酶/EDTA进行消化。在2×105个细胞中加入抗STRO-1单克隆抗体(1：100)，进行放置，使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson社)进行分析。与相应的同种型相同的对照抗体相比，在荧光水平为99％以上比例的高水平的情况下，表达为阳性。在SHED-T和SHED-C中，均将初期和后期的传代细胞固定，利用FITC结合STRO-1抗体进行染色。其后利用流式细胞术进行分析。试验分别进行二次。在SHED-C中，STRO-1阳性细胞的比例在PD20时为27％，在PD30时减少至15％(图2(A)和(B))。在SHED-T中，STRO-1阳性细胞的比例在PD20时为46％、在PD40时为41％(图2(C)和(D))。
(3)分化能力的研究
利用新生骨量的形成能力和组织染色对于PD0、PD10和PD20中的SHED-C和SHED-T的分化能力进行研究。
首先，将2.0×106个SHED-C或SHED-T与40mg的羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)陶瓷粉末(奥林巴斯工业(株))混合，移植到10周龄的免疫缺陷状态小鼠(NIH-bgnu-xid,雌、Harlan Sprague Dawley社制造)的背侧表面的皮下。
移植8周后回收移植物，利用4％福尔马林固定、脱灰后，为了进行石蜡包埋，利用含有10％EDTA的PBS溶液进行缓冲。为了进行塑料包埋，将一部分保存在70％乙醇溶液中。
将石蜡切片脱石蜡化，对其进行水合后，利用苏木素和曙红(下文中称为“H&E”)进行染色。图5(A)～(C)中示出了SHED-T(永生化干细胞)的PD0～PD20的染色图像，图5(D)～(F)中示出了SHED-C(正常细胞)的PD0～PD20的染色图像。为了对生物体内的新骨形成进行定量，选择特定的区域，对于SHED-T移植后形成的移植物或SHED-C移植后形成的移植物，分别计算出新生骨面积和视野面积，由这些数值求出新生骨量。
新生骨量＝新生骨面积/视野面积×100
图4中示出了在各个体数倍增次数(倍增时间)时SHED-T与SHED-C的新生骨量的变化。图中，**表示P<0.05、***表示P<0.01。需要说明的是，新生骨量由下述计算式求出。
如图4所示，在SHED-C中，随着个体数倍增次数增加，新生骨量减少，以PD20计时，降低至PD0的约1/5。与此相对，在SHED-T中，直至PD20时为止，新生骨量几乎无变化；在PD20时，显示SHED-T形成了SHED-C的5倍以上的骨。
(4)癌变活性的评价
将1×106个SHED-C和SHED-T细胞移植到免疫缺陷状态小鼠的皮下组织中。移植后进行30天以上的观察，但在此期间，在移植了上述细胞的任一小鼠中均未形成肿瘤。并且，在SHED-T细胞中，40～200PD的培养细胞的全部克隆无形态变化。
如上所述，显示出在SHED-T中无癌变活性。
(5)评价
在SHED-T中，即使在超过260PD时，也显示出了具有在保持分化能力的同时进行增殖的能力；在SHED-C中，虽具有分化能力，但在30PD以下发生老化。
如上所述，显示出SHED-T为永生化干细胞，适于大量生产高活性的SHED培养上清。
实施例4
(1)对于颈部放射线性溃疡的治愈效果
对于64岁的右舌癌(T3N0M0)患者(男性)进行舌半侧切除。在约6个月后确认到转移至右颈部的淋巴节，因而进行60GY放射线照射和全颈部廓清术。在术后3周，从颚下到颈部发生了创口愈合不全、形成了溃疡(图3(A))。因此诊断为放射线性颈部溃疡。
为了促进患部的创口愈合，将如上得到的SHED-T的培养上清10mL浸渗到可覆盖患部的尺寸的纱布中，贴在患部。每2天更换一次浸渗有上述培养上清的纱布，更换14次，结果在1个月后溃疡闭合(图3(B))。如上所述，显示出上述培养上清对于上皮溃疡是有效的。
(2)对于褥疮的治愈效果
利用上述SHED-T的培养上清对于60岁男性的腰部形成的褥疮进行治疗。该男性在2年前发生脑卒中，呈偏瘫。为治疗褥疮入院。
完全剔除发生了感染的肉芽组织(图6(A))，将10mL的SHED-T的培养上清在不进行稀释的情况下浸渗到纱布中，覆盖患部。每日进行纱布更换，结果在2周后从皮肤端部形成了覆盖患部的新的上皮(图6(B))。
由上述内容显示出SHED-T的培养上清对于上皮的溃疡和褥疮的治愈具有效果。
实施例5
(1)SHED-T的培养上清在齿科领域的治疗效果
对于11名男性、5名女性计16名患者(35岁～70岁)的28个部位，进行SHED-T的培养上清在齿科领域中的治疗效果的研究。
病例详情为：植入相关病例14名(18个部位)、以及牙周病相关病例7名(10个部位)。进一步仔细观察植入相关病例时，骨再生引导(GBR)-拔牙窝洞保存术病例为11名(15个部位)、上颌窦提升术病例为3名(3部位)。
此处，GBR(骨引导再生)法为促进缺损的牙槽骨或颚骨等骨组织的再生的治疗方法，其在并无充分的骨量用于植入埋入的情况等时进行使用。此外，拔牙窝洞保存术是指在拔牙时为了防止骨的吸收将人工骨等添入“孔”中使骨进行再生的方法。
关于上颌窦提升术(上颌窦底提升术)，其在上颚骨内部存在的上颚洞扩大、牙槽骨的某些部分的厚度不足以进行植入的情况下来进行。其是指在其厚度不足的上颚洞的部位插入移植骨或骨填补材(近期是插入植入主体的一部分)，将上颌窦底部分上推的技术。
关于实施病例的评价，对于截止2011年9月为止的26个部位，在术后3个月或者6个月利用X射线(包括CT)进行评价。分下述5级进行评价。结果如表6、图7(A)～(F)、图8(A)和(B)、以及图9(A)和(B)所示。
在图7(A)中，在白色箭头所示的部分观察到有β-TCP粉末的填塞。与此相对，在图7(C)中的相同部分，箭头所示部分的结构发生变化，与位于下侧的骨同样地呈无结构状态，确认到促进了骨形成。
另外，在图7(D)中，观察到在白色箭头部分无骨、形成了肉芽组织，并且在黑色箭头部分观察到形成了未成熟的成骨。与此相对，在图7(F)中，在黑色箭头部分为成熟骨，确认到促进了骨形成。
如上所述确认到，该培养上清在齿科领域中促进了骨形成。
5(显效)：缺损部观察到了30％以上的骨再生
4(有效)：缺损部观察到了骨再生(大致为低于30％的程度)
3(不变)：骨再生不明显，但无吸收
2(吸收)：观察到了骨吸收
1(不良)：显著发生了骨吸收、或有不良现象发生
在上述28例病例之中，对于未达到评价时期的No.27和28未进行评价。在进行了评价的全部病例(26例)中，显效(5)为10例(38.5％)、有效(4)为7例(26.9％)、不变(3)为8例(30.8％)、吸收(2)为1例(3.8％)、不良(1)为0例。
将显效与有效合并为17例(65.4％)，显示出高有效率。
对各疾病进行观察，在植入相关病例(17例)中，显效(5)为9例(52.9％)、有效(4)为4例(23.5％)、不变(3)为3例(17.7％)、吸收(2)为1例(5.9％)、不良(1)为0例。在植入相关病例中，将显效与有效合并为13例(79.4％)，显示出非常高的有效率。
此外，在9例牙周病相关病例中，显效为1例(11.1％)、有效为3例(33.3％)、不变为5例(55.6％)、未确认到吸收和不良。在牙周病相关病例中也显示出了显效与有效合并为4例(44.4％)的良好的有效率。
进一步地，若以支架来看，则在以β-TCP为支架的8例中，结果显效为4例(50.0％)、有效为3例(37.5％)、无不变和不良、吸收为1例(12.5％)。作为支架使用β-TCP的情况下，显示出了显效与有效合并为7例(87.5％)的非常高的有效率。
在作为支架使用Terudermis/Teruplug(Col)的18例中，显效为6例(33.3％)、有效为4例((22.2％)、不变为8例(44.5％)、吸收为1例(0.1％)、无不良。在作为支架使用Terudermis/Teruplug(Col)的情况下，显示出了显效与有效合并为10例(55.5％)的高有效率。
在植入病例中，如图7～9所示，在各病例中均观察到了骨的再形成。
此外，在作为支架使用β-TCP时，利用苏木素和曙红对所取出的组织进行染色，来确认β-TCP如何对骨进行置换等。结果如图10(A)～(D)所示。图中，明显观察到了NB所表示的新生骨的形成，还确认到了BV所表示的血管。
如上确认到，SHED-T的培养上清具有骨形成能力。
实施例6
(1)牙髓干细胞来源细胞因子对脑卒中患者的经鼻给药
对于任意伴有灰白质区域缺血、白质区域缺血、或者混合区域缺血的8名患者(男性6名、女性2名)，进行SHED-T的培养上清的给药，对治疗效果进行研究。8名患者在加入该治验前均接受了脑卒中的标准治疗，接受了MRI诊断、使用神经学试验和NIHSS进行评分的评价。表1中示出的患者在脑卒中发病后经过了20天～133天。患者特征如下表7所示。
将实施例1中制备的SHED-CM(SHED-T的培养上清)通过鼻腔内的嗅神经集中的部位进行经鼻给药(图11和12)。给药期间自给药开始的时间起算。
[表7]
关于恢复状况，在给药开始后的1天、2天、4天、7天、14天、1个月、3个月、6个月和1年的各时刻由神经外科医生和神经科医生进行评价。未进行盲检实验。对全部患者进行脑MRI和MRA。MRA也被称为磁共振血管造影，其为能够立体显示血管状态的检査。图13中示出了某一患者的MRA图像，并且图14中示出了其MRI图像。
使用心电图仔细地监测SHED-T培养上清给药前后的血中氧浓度、体温、血压、心率、呼吸数等。还在给药前后进行胸部X射线拍摄。
在SHED-CM鼻腔内给药前和给药经过1年后，对于所有的患者进行用于确定血管病变的核磁共振血管拍摄，利用彩色核磁共振图像法(MRI)对拍摄结果进行观察。神经学状态基于美国国立保健研究所(NIH)的脑卒中基准(NIHSS)来评分。
8名患者中的2名(均为急性期)中，在NIH基准和MRI图像中观察到了显著的恢复(图15(A)和15(B)、图16)。在No.2的患者中，如图17(A)所示，能够利用麻痹的右手来转运杯子，并且如图17(B)所示，恢复到能够步行。
在进行了SHED-CM给药的任一患者中，在中枢神经系统中均未观察到肿瘤、异常的细胞增殖以及神经学恶化。并且，在任一患者中均未观察到鼻异常、全身性恶性肿瘤、全身性感染症状。
如上所述，显示出通过使用永生化干细胞，能够得到几乎无限的培养上清，在由该培养上清制造药剂的情况下，能够进行生长因子的大量生产。并且，由此具有能够以低成本来制造药剂的优点。
如上所述，由于使用特定的永生化干细胞作为细胞来源，并且该永生化干细胞持续地以相同的比例产生特定的生长因子，因而能够保证细胞上清中的生长因子的含量及种类大致一定。由此具有在量产化的情况下容易使培养上清的内容成分标准化的优点。
实施例7
(1)牙髓干细胞来源细胞因子对阿尔兹海默氏病患者的滴鼻给药
对于阿尔兹海默氏病的患者进行SHED-T培养上清的经鼻给药，对治疗效果进行研究。患者的平均年龄为79.5±3岁、为3名女性。
将SHED-T的培养上清通过滴鼻进行给药，给药每日1次、计28次。给药的效果由下述表8和表9所示的简易精神状态检査和长谷川式检査来进行。
如图18(A)所示，在非给药组的情况下，在MMS和长谷川式的任一评价中均未确认到较大的改善。
与此相对，在SHED-T培养上清给药组中，从第3个月起指数值开始上升，在第7个月以后，在MMS和长谷川式的任一评价中上升幅度均增大，确认到阿尔兹海默氏病的症状的改善。
在给药组的患者中，78岁的阿尔兹海默氏病患者显示出了特别显著的改善。该患者在2010年5月11日脑梗塞发病，出现高度的健忘症(康奈尔医学指数：CMI＝27)。因此，在2010年12月20日入住护理机构。
自2011年2月9日起通过滴鼻进行SHED-T培养上清的给药，每日给药1次、计28次，利用下述表8和表9所示简易精神状态检査和长谷川式检査进行给药效果的确认，确认到高级脑功能的大幅改善。由于恢复到了自己做饭和自主步行，因而该患者在2011年4月16日出院回家。
[表8]
如上所述，显示出SHED-T培养上清对于阿尔兹海默氏病也是有效的。
实施例8
(1)SHED-T培养上清对于肝炎的治疗效果
以失代偿期肝硬化为代表的重症肝病的根治疗法是肝移植，但由于供体不足等原因，在现实中仅进行对症治疗。为对其进行补充，进行了基于永生化乳牙干细胞来源生长因子(SHED-T)的给药的肝再生疗法。
如表10所示，将Child-Pugh值为7以上、并且总胆红素值为3.0mg/dL以下、血小板数为5.0×10*10以上、且并无活性期肝肿瘤的3名男性患者(58～70岁)作为对象。另外，这些患者患有慢性期脑梗塞(发病后经过了1年以上)，为进行了帕金森氏病治疗的病例。
在实验方案中，将永生化乳牙干细胞来源生长因子(2μg)溶解在5ml生理盐水中，每天进行1次经鼻给药，连日进行给药。将28次作为1个疗程，进行2个疗程。
病例详情和效果列于表11。
[表10]
1分 2分 3分
肝性脑病 无 轻度 时时昏睡
腹水 无 少量 中等量
血清胆红素(g/dl) 小于2.0 2.0～3.0 大于3.0
血清白蛋白(g/dl) 大于3.5 2.8～3.5 小于2.8
凝血酶原时间(％) 大于70 40～70 小于40
[表11]
*1：Child-Pugh值 *2：总蛋白 *3：白蛋白
(2)结果
在任一患者中，总蛋白值和血清白蛋白值均增加，CP从B类变成A类，认为发生了肝的再生。
实施例9
(SHED-T培养上清对于II型糖尿病的治疗效果)
研究了SHED-T对于II型糖尿病患者的治疗效果。关于治疗方法，将SHED-T(2μg)溶解在5ml生理盐水中，每日1次经鼻给药。将给药28次作为1个疗程，进行2个疗程。
将治疗前与12周后的HbA1c(糖化血红蛋白)的变化作为指标进行效果判定。另外，病例在整个治疗期间未发现有头痛、鼻痛、血糖变动等不良现象。另外，各患者均内服了作为糖尿病治疗药的二甲双胍、进行了运动疗法，但并未见到效果。
[表12]
在各患者中，与治疗前相比，HbA1c(％)均降低、均发现有糖尿病的改善。如上所述，显示出SHED-T对于糖尿病也是有效的。
实施例10
(SHED-T培养上清对于难治性皮炎的治疗效果)
对于产生了难治性皮炎(特应性皮炎)的犬(拉布拉多寻回犬、8岁、雌性)，将SHED-T(2μg)溶解在5ml生理盐水中，每日1次涂布至患部。将14次作为1个疗程。
在使用SHED-T之前，在2个月间使用了犬干扰素-γ制剂，但未取得治疗效果，因而替换为SHED-T。
在SHED-T治疗开始前，如图19A所示，在发生了难治性皮炎的部分，毛脱落见白；但在治疗后，毛长得整齐，完全治愈到了产生皮炎的部位分辨不出的程度。
如上所述，显示出SHED-T对于难治性皮炎也是有效的。
工业实用性
本发明在用于医科和齿科领域的药剂的制造等中是极为有用的。

Claims (26)

1.一种永生化干细胞，其是如下选择的：从选自由哺乳类的间叶细胞、初生胚和除间叶细胞外的体细胞组成的组的细胞组中分离干细胞；对所述干细胞进行初期培养，得到原代培养细胞；向原代培养细胞中导入4种基因，制作基因导入细胞；从所述基因导入细胞中以STRO-1的表达为指标来选择该永生化干细胞。
2.如权利要求1所述的永生化干细胞，其特征在于，所述间叶干细胞选自由牙髓干细胞、骨髓干细胞、脐带干细胞以及脂肪干细胞组成的组。
3.如权利要求1或2所述的永生化干细胞，其特征在于，所述牙髓干细胞为由选自由脱落的乳牙、脱落的恒牙、拔除的乳牙以及拔除的恒牙组成的组中的任意牙齿得到的干细胞。
4.如权利要求1所述的永生化干细胞，其特征在于，所述初生胚为胚盘期的胚。
5.如权利要求1～4的任一项所述的永生化干细胞，其特征在于，所述哺乳类选自由人、猪、马以及猴组成的组。
6.如权利要求1～5的任一项所述的永生化干细胞，其特征在于，所述4种基因选自由hTERT、bmi-1、E6、E7、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc以及p16INK4a组成的组。
7.如权利要求1～6的任一项所述的永生化干细胞，其特征在于，其具有端粒修复能力，具有至少能够分裂200次以上的分裂能力。
8.如权利要求1～7的任一项所述的永生化干细胞，其特征在于，在个体倍增次数为20次的时刻，细胞个体数的至少40％以上为STRO-1表达细胞，且具有与原代培养细胞等同的新生骨量生成能力。
9.如权利要求1～8的任一项所述的永生化干细胞，其特征在于，所述永生化干细胞至少向培养上清中分泌IGF-1、VEGF、TGF-β1和HGF。
10.一种药物组合物，其含有权利要求1～9的任一项所述的永生化干细胞的培养上清。
11.一种损伤组织复原用药物制剂，其含有权利要求10所述的药物组合物。
12.如权利要求11所述的损伤组织复原用药物制剂，其特征在于，所述损伤组织复原用药物制剂的剂型为选自由粉末、液剂、凝胶剂、喷雾剂和经皮吸收系统组成的组中的任意剂型。
13.如权利要求11或12所述的损伤组织复原用药物制剂，其特征在于，所述损伤组织为选自由形成了溃疡或褥疮的组织、由于细胞的变性而发生了损伤的脑组织、由于外科操作而发生了缺损的脑组织、由于外伤性脑疾病而发生了损伤的脑组织、由于炎症性脑疾病而发生了损伤的脑组织、损伤的骨组织、损伤的牙周组织、由于中枢神经系疾病而发生了损伤的组织、以及由于难治性皮炎而发生了损伤的组织组成的组中的组织。
14.如权利要求13所述的损伤组织复原用药物制剂，其特征在于，所述细胞的变性是由选自由阿尔兹海默氏病、帕金森氏病、痴呆症、统合失调症、抑郁症、缺氧性脑症、肌萎缩性侧索硬化症、脑梗塞、小脑变性症、糖尿病以及肝炎组成的组中的疾病产生的。
15.如权利要求13所述的损伤组织复原用药物制剂，其特征在于，所述外伤性脑疾病是由交通事故或坠落事故产生的。
16.如权利要求13所述的损伤组织复原用药物制剂，其特征在于，所述炎症性脑疾病为选自由脑炎脑症、癫痫、克雅氏病以及小儿麻痹症组成的组中的疾病。
17.如权利要求13所述的损伤组织复原用药物制剂，其特征在于，所述中枢神经系疾病为选自由脊髓损伤和脊髓症组成的组中的疾病。
18.如权利要求13所述的损伤组织复原用药物制剂，其特征在于，所述难治性皮炎为特应性皮炎。
19.如权利要求11～17的任一项所述的损伤组织复原用药物制剂，其特征在于，设权利要求1～9的任一项所述的永生化干细胞所产生的培养上清为100％时，所述损伤组织复原用药物制剂中的培养上清的含量为50～500％(w/v)。
20.一种永生化干细胞的产生方法，其具备下述工序：
分离工序，从选自由哺乳类的间叶细胞、初生胚和除间叶细胞外的体细胞组成的组的细胞组中分离干细胞；
培养工序，对所述干细胞进行初期培养，得到初期培养细胞；
基因导入工序，向所述初期培养细胞中导入4种基因，制作基因导入细胞；以及
选择工序，以个体倍增次数为20次的时刻的STRO-1的表达量和骨再生能力为指标，从所述基因导入细胞中选择细胞。
21.如权利要求19所述的永生化干细胞的产生方法，其特征在于，所述间叶细胞选自由牙髓细胞、骨髓细胞、脐带细胞以及脂肪细胞组成的组。
22.如权利要求20所述的永生化干细胞的产生方法，其特征在于，所述牙髓细胞为由选自由脱落的乳牙、脱落的恒牙、拔除的乳牙以及拔除的恒牙组成的组中的任意牙齿得到的细胞。
23.如权利要求19所述的永生化干细胞的产生方法，其特征在于，所述初生胚为胚盘期的胚。
24.如权利要求19～21的任一项所述的永生化干细胞的产生方法，其特征在于，所述哺乳类选自由人、猪、马以及猴组成的组。
25.如权利要求19～22的任一项所述的永生化干细胞的产生方法，其特征在于，所述4种基因为选自由hTERT、bmi-1、E6、E7、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc以及p16INK4a组成的组中的4种。
26.一种经皮吸收方法，其特征在于，其具备下述工序：
剂型制备工序，利用片状保湿性部件吸收权利要求11～18的任一项所述的损伤组织复原用药物制剂来制成片形制剂；
损伤部位覆盖工序，利用所述片形制剂来覆盖损伤的部位；以及
电极接触工序，使带正电的电极与所期望的部位接触。
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