RU2619221C2 - Иммортализованная стволовая клетка и лекарственная композиция и лекарственный препарат, содержащие ее в качестве активного ингредиента - Google Patents
Иммортализованная стволовая клетка и лекарственная композиция и лекарственный препарат, содержащие ее в качестве активного ингредиента Download PDFInfo
- Publication number
- RU2619221C2 RU2619221C2 RU2014143266A RU2014143266A RU2619221C2 RU 2619221 C2 RU2619221 C2 RU 2619221C2 RU 2014143266 A RU2014143266 A RU 2014143266A RU 2014143266 A RU2014143266 A RU 2014143266A RU 2619221 C2 RU2619221 C2 RU 2619221C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- stem cell
- tissue
- immortalized
- disease
- Prior art date
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 129
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 28
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 title abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 252
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 51
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 46
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 18
- 101100058550 Mus musculus Bmi1 gene Proteins 0.000 claims description 16
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 claims description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 13
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 claims description 13
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 11
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 9
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 claims description 9
- 210000004489 deciduous teeth Anatomy 0.000 claims description 9
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 claims description 8
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 8
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 8
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 claims description 8
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 claims description 8
- -1 hTERT Proteins 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 7
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 6
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 5
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims description 5
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 claims description 5
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 claims description 5
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 claims description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 4
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 4
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims description 3
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 3
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims description 3
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 3
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010039203 Road traffic accident Diseases 0.000 claims description 2
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 claims description 2
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 208000025434 cerebellar degeneration Diseases 0.000 claims description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 claims description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 claims 9
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 claims 1
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 claims 1
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 claims 1
- 101000868152 Homo sapiens Son of sevenless homolog 1 Proteins 0.000 claims 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims 1
- 210000004261 periodontium Anatomy 0.000 claims 1
- 229940100640 transdermal system Drugs 0.000 claims 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 8
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 abstract description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 abstract description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 81
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 31
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 30
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 22
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 22
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 15
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 15
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 15
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 13
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 12
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 11
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 206010019468 Hemiplegia Diseases 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 9
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 8
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 8
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 8
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 8
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 8
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 8
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 8
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 7
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 7
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 7
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 7
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 7
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 7
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 7
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 7
- 239000003181 biological factor Substances 0.000 description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 101000733249 Homo sapiens Tumor suppressor ARF Proteins 0.000 description 6
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 6
- 102100033254 Tumor suppressor ARF Human genes 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 6
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 6
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 6
- 208000028169 periodontal disease Diseases 0.000 description 6
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 5
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 5
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 5
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 5
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 5
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 4
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 4
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 4
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 4
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 210000004086 maxillary sinus Anatomy 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 4
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 3
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 3
- 108010022429 Polycomb-Group Proteins Proteins 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 3
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000006996 mental state Effects 0.000 description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 3
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 3
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 3
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 235000019731 tricalcium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 3
- CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylpyrrolidin-2-one;molecular iodine Chemical compound II.C=CN1CCCC1=O CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 206010011985 Decubitus ulcer Diseases 0.000 description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010028570 Myelopathy Diseases 0.000 description 2
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 2
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 2
- 239000004107 Penicillin G sodium Substances 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 102000012425 Polycomb-Group Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 235000019369 penicillin G sodium Nutrition 0.000 description 2
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 description 1
- 208000031091 Amnestic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002381 Brain Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101100070661 Caenorhabditis elegans hint-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N Chlorhexidine Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1NC(N)=NC(N)=NCCCCCCN=C(N)N=C(N)NC1=CC=C(Cl)C=C1 GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 101150071673 E6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150013359 E7 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000017011 Glycated Hemoglobin A Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 206010019728 Hepatitis alcoholic Diseases 0.000 description 1
- 206010019909 Hernia Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 101100510267 Mus musculus Klf4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101150037203 Sox2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 1
- 206010041591 Spinal osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 238000008050 Total Bilirubin Reagent Methods 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 208000002353 alcoholic hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000006986 amnesia Effects 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000006909 anti-apoptosis Effects 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000001172 blastoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 208000036319 cervical spondylosis Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 229960003260 chlorhexidine Drugs 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000225 effect on diabetes Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008451 emotion Effects 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005995 glycated hemoglobin Proteins 0.000 description 1
- 210000004884 grey matter Anatomy 0.000 description 1
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 1
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 210000001847 jaw Anatomy 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008338 local blood flow Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N metformin Chemical compound CN(C)C(=N)NC(N)=N XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003105 metformin Drugs 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000001002 morphogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001167 myeloblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 230000005709 nerve cell growth Effects 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 238000013421 nuclear magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 210000000956 olfactory bulb Anatomy 0.000 description 1
- 210000000196 olfactory nerve Anatomy 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 230000002642 osteogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108700042657 p16 Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000003239 periodontal effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035409 positive regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000036387 respiratory rate Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000019 skin ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 208000005801 spondylosis Diseases 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 201000006134 tongue cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000332 tooth crown Anatomy 0.000 description 1
- 210000003781 tooth socket Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 229940078499 tricalcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000391 tricalcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/067—Hepatocytes
- C12N5/0672—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells; Oval cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1833—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1841—Transforming growth factor [TGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
- A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/30—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0043—Nose
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/24—Antidepressants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0664—Dental pulp stem cells, Dental follicle stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/602—Sox-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/603—Oct-3/4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/604—Klf-4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
- C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
- C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
- C12N2506/1361—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from dental pulp or dental follicle stem cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Описаны иммортализованные стволовые клетки, которые получают путем выделения стволовых клеток, выбранных из группы, состоящей из мезенхимальных клеток млекопитающих и соматических клеток, первичным культивированием клеток, с получением клеток первой стадии культуры, трансфекцией четырех видов генов в клетки первой стадии культуры, с получением трансгенных клеток, и выбором желаемых иммортализованных стволовых клеток из числа трансгенных клеток с использованием экспрессии STRO-1 в качестве индекса. Также представлены лекарственная композиция и лекарственный препарат для восстановления поврежденных тканей, которые содержат супернатант культуры иммортализованных стволовых клеток в качестве активного ингредиента. Изобретение позволяет получать иммортализованные стволовые клетки, которые продуцируют фактор роста, способный регенерировать различные виды тканей, которые были повреждены в результате различных причин, и способа продуцирования указанных выше иммортализованных стволовых клеток. Изобретение расширяет арсенал лекарственных средств для восстановления поврежденных тканей и способов абсорбции супернатанта культуры. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 19 ил., 12 табл., 10 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к иммортализованной стволовой клетке, полученной из пульпы зуба, а также к фармацевтической композиции и фармацевтическому препарату, которые содержат ее в качестве активного ингредиента. В частности, изобретение относится к иммортализованной стволовой клетке, которую получают путем модификации стволовой клетки, полученной из естественно отторгнутых или удаленных, молочных или постоянных человеческих зубов, к фармацевтической композиции, содержащей множество факторов роста, продуцированных иммортализованными клетками, и к содержащему их фармацевтическому препарату.
Уровень техники
Методы восстановления функций поврежденной ткани, вызванной рядом причин, грубо классифицируются на трансплантационную терапию и регенерационную терапию. Трансплантационная терапия подразумевает, что органы, предоставленные донором, пересаживают для восстановления утерянных функций живого организма.
В отличие от этого, регенерационная терапия подразумевает, что клетки или ткани нескольких человек, включая самого пациента, культивируют для их обработки с формированием органов; а затем они заменяют пораженные клетки или органы, подлежащие восстановлению или регенерации, с использованием стволовых клеток.
В настоящее время для регенерационной терапии используют, или полагают, что они применимы, три типа клеток, такие как: человеческие соматические стволовые клетки, человеческие эмбриональные стволовые клетки (ES клетки) и человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS клетки).
В исследовании уже были использованы человеческие соматические стволовые клетки. Они существуют в тканях взрослого организма и обладают свойством дифференцироваться только в определенные ткани или органы. При этом "мезенхимальные клетки", существующие в костном мозге или жировых клетках, могут необычно дифференцироваться в различные ткани, такие как кости, хрящи, артерии и вены. При использовании таких соматических клеток, использование аутологичных клеток предотвращает иммунное отторжение и дает хорошее приживление. Кроме того, отсутствуют сообщения, что долговременное культивирование этих стволовых клеток вызывает их малигнизацию.
С другой стороны, известно, что клетки, которые должны быть дифференцированы, ограничены до некоторой степени, сбор клеток из тканей человека сопровождается инвазией, типы тканей, которые будут образованы дифференцированными клетками, ограничены до некоторой степени, и возможное количество пассажей ограничено до сорока и несколько раз, а именно, от 100 до 200 дней, которые вычисляются исходя из количества дней.
Человеческие эмбриональные стволовые клетки (ES клетки) представляют собой стволовые клетки, из которых получают "внутреннюю клеточную массу" избыточного эмбриона (бластоцисты) для культивирования, полученного из регенерационной терапии и т.п. Поскольку они формируют тератомы в качестве индикатора своей плюрипотентности, полагают, что они могут быть дифференцированы в любую тридермальную фазу. Сообщалось, что они могут быть дифференцированы в миокард, нерв и сетчатку глаза. Поскольку эмбриональные стволовые клетки (ES) являются штаммом иммортализованных клеток, один штамм в их числе является непрерывно бесконечно культивируемым. Кроме того, при соответствующих условиях культивирования, продукт, обладающий сходными с клеткой свойствами, получают в больших масштабах.
С другой стороны, они используют оплодотворенную яйцеклетку так, чтобы она нуждалась в определенной обработке, которая не вызывает этических проблем. Также они представляют собой, в основном, гетеротрансплантацию; требуются средства для предотвращения реакции отторжения - иммунного ответа. Кроме того, известно, что им необходимы гетерологичные клетки или сыворотка при культивировании клеток в неблагоприятных условиях; и они легко образуют тератомы (доброкачественные опухоли), если очень незначительное количество недифференцированных клеток смешаны в трансплантированной регенерированной ткани.
Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки образуются путем введения части генов, которые специфически экспрессируются в ES клетке, в клетку взрослого человека (дерма и подобное). При использовании аутологичных плюрипотентных клеток, проблема иммунного отторжения не возникает; методика дифференциации для ES клеток используется “как таковая”.
Наконец, индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки не используют оплодотворенную яйцеклетку, которая используется в ES клетках, но использует взрослую ткань для того, чтобы продуцировать клетку, обладающую такими же свойствами, что и эмбриональная стволовая клетка. При использовании аутологичных iPS клеток, проблемы реакции отторжения - иммунного ответа не существует.
С другой стороны, известно, что клетки легко превращаются в доброкачественные опухолевые клетки или раковые клетки (опухолевые эмбриональные клетки), и доля клеток, определенных как iPS клетки, является низкой; поскольку морфологически аналогичные клетки ES клеткам выбирают из всех клеток, которым интродуцированы гены.
Применение стволовых клеток в регенерационной терапии как таковых вызывает описанные выше проблемы. Таким образом, осуществляют поиск метода с использованием биологических факторов, продуцируемых различными стволовыми клетками, но не с использованием стволовых клеток “самих по себе”, например, различных факторов роста (WO 2011/118795, в настоящем описании ниже называется как "уровень техники 1").
В уровне техники 1 описана композиция для лечения пораженной области, содержащая культуральный раствор стволовых клеток, полученных, например, от человека, таких как естественно отторгнутых молочных зубов и подобное, а именно, культуральный раствор, включающий факторы роста, такие как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), бета-трансформирующий фактор роста (TGF-β) и тому подобное.
Уровень техники
[Патентные документы]
[Патентный документ 1] WO 2011/118795
Краткое изложение сущности изобретения
Задачи, решаемые изобретением
Предшествующий уровень техники является замечательным с той точки зрения, что в нем описана указанная выше композиция для лечения поврежденного участка, оказывающая эффекты восстановления кожи, пораженной воздействием ультрафиолетовых лучей, и регенерации костной ткани, и тому подобное.
Напротив, поскольку стволовая клетка, полученная из используемой пульпы зубов, не является стабильной клеточной линией, представляющий интерес культуральный раствор стволовых клеток не может быть получен до тех пор, пока стволовая клетка не будет получена в момент использования или не будет разморожен криосохраненный образец для роста клеток. Таким образом, существует проблема, заключающаяся в том, что требуется время, чтобы получить культуральный раствор.
Обычно, в числе культивируемых клеток, клеточный штамм, полученный из нормальной клетки, не может делиться после 50-60 пересевов, и клетка погибает. Естественно, что соотношения в композиции биологических факторов, продуцируемых культивируемыми клетками, изменяются в зависимости от времени. Таким образом, существует трудная задача получения супернатанта культуры, имеющего стабильные их соотношения, если клетки линии способны к неограниченному росту.
С другой стороны, в качестве типичных клеток, способных к неограниченному росту, могут быть указаны раковые клетки. То есть раковая клетка выходит из-под контроля и неограниченно растет, хотя такой рост и деление нормальных клеток находится под контролем живого организма. Таким образом, даже если клетка может неограниченно расти, злокачественная клетка не может быть использована; потому что клетки могут продуцировать вредные биологические факторы для живого организма.
Как описано выше, существует значительная потребность в стабильной иммортализованной клетке, которая не является злокачественной, но способна к неограниченному росту.
Для того чтобы использовать супернатант в качестве фармацевтического препарата, иммортализованная стволовая клетка должна обладать способностью непрерывно продуцировать определенные биологические факторы.
Способы решения задач
Настоящее изобретение было осуществлено в описанных выше условиях.
А именно, первый аспект настоящего изобретения относится к иммортализованной стволовой клетке, изолирующей стволовые клетки, выбранные из группы, состоящей из соматических клеток млекопитающего, за исключением раннего эмбриона млекопитающего, и мезенхимальных стволовых клеток; осуществлению первичного культивирования указанной стволовой клетки; трансфекции 4 генов в указанную первично культивированную стволовую клетку с выполнением генной трансфекции для выбора из их числа иммортализованных стволовых клеток посредством экспрессии STRO 1 в качестве индикатора. В настоящем описании указанные мезенхимальные стволовые клетки предпочтительно выбраны из группы, состоящей из стволовых клеток пульпы зуба, стволовых клеток костного мозга, стволовых клеток пуповины и стволовых клеток жировой ткани. Кроме того, указанные стволовые клетки предпочтительно выбирают из группы, состоящей из естественно отторгнутых молочных зубов, выпавших постоянных зубов, удаленных молочных зубов и удаленных постоянных зубов.
Указанный ранний эмбрион предпочтительно является эмбрионом на стадии бластодермы. Кроме того, указанное млекопитающее, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из человека, свиньи, лошади и обезьяны. Указанные стволовые клетки костного мозга, предпочтительно, являются клетками, способными дифференцироваться в мезенхимальную систему стволовых клеток, таких как остеобласты - клетки костной ткани, хрящевые клетки, жировые клетки и т.п., и немезенхимальную систему. Указанные умбиликальные стволовые клетки представляют собой гемопоэтические стволовые клетки и мезенхимальные клетки, включенные в пуповинную кровь, которые соединяет эмбрион и плаценту. Предпочтительно, умбиликальные стволовые клетки включают многие из этих клеток. Указанные стволовые клетки костного мозга, предпочтительно, являются клетками, способными дифференцироваться в мезенхимальную систему стволовых клеток, таких как остеобласты - клетки костной ткани, хрящевые клетки, жировые клетки и т.п., и немезенхимальную систему. Умбиликальные стволовые клетки предпочтительно получают из Вартонова студня (Warton's jelly). Адипоцитные стволовые клетки представляют собой, предпочтительно, недифференцированные клетки, которые могут дифференцироваться в любые стволовые клетки.
Указанные 4 гена, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из гена hTERT, гена bmi-1, гена E6, гена E7, гена Oct3/4, гена Sox2, гена Klf4, гена c-Myc и гена p16INK4a. В настоящем описании они предпочтительно представляют собой hTERT, bmi-1, Е6 и Е7 для введения в мезенхимную клетку. Кроме того, они предпочтительно представляют собой 4 гена, выбранные из группы, состоящей из Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, p16INK4a для введения в соматические клетки.
Указанная иммортализованная стволовая клетка предпочтительно обладает способностью к восстановлению теломеры и обладает способностью к делению по меньшей мере 200 раз. Кроме того, по меньшей мере 40% клеточной популяции, предпочтительно, представляет собой STRO-1-экспрессирующие клетки при 20 удвоений популяции, и обладает способностью продуцировать неонатальную костную массу, аналогичную первичной культивированной клетке.
Кроме того, указанная иммортализованная стволовая клетка секретирует предпочтительно по меньшей мере IGF-1, VEGF, TGF-β1 и HGF в указанный культуральный раствор.
Вторым аспектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая указанный культуральный раствор указанных иммортализованных стволовых клеток, обладающих описанными выше свойствами.
Кроме того, третий аспект настоящего изобретения представляет собой фармацевтический препарат для восстановления пораженной ткани, содержащий указанную фармацевтическую композицию. В настоящем описании лекарственные формы фармацевтического препарата для восстановления пораженной ткани выбраны из группы, состоящей из порошка, жидкости, геля, спрея и системы для введения через кожу. Кроме того, указанная пораженная ткань является предпочтительно любой тканью, выбранной из группы, состоящей из ткани, пораженной язвой или пролежнем, ткани головного мозга с дегенеративным поражением клеток, ткани головного мозга, частично утраченной после хирургической операции, ткани головного мозга, пораженной травматическим заболеванием головного мозга, ткани головного мозга, пораженной воспалительным заболеванием головного мозга, пораженной костной ткани, пораженного пародонта, ткани, пораженной заболеванием центральной нервной системы, и ткани, пораженной не поддающимся лечению заболеванию кожи.
В настоящем описании, указанная клеточная дегенерация, предпочтительно, вызвана заболеванием, выбранным из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, когнитивных расстройств, шизофрении, депрессии, церебральной гипоксии, бокового амиотрофического склероза, церебрального инфаркта, мозжечковой дегенерации, сахарного диабета и гепатита. Кроме того, указанное травматическое заболевание головного мозга предпочтительно вызвано дорожно-транспортным происшествием или несчастным случаем, вызванным падением. Указанная воспалительная энцефалопатия также предпочтительно является заболеванием, выбранным из группы, состоящей из энцефалита, энцефалопатии, эпилепсии, болезни Крейцфельда-Якоба и полиомиелита. Кроме того, указанное заболевание центральной нервной системы, предпочтительно выбрано из группы, состоящей из травмы спинного мозга и миелопатии. Указанным рефрактерным дерматитом, предпочтительно является атопический дерматит.
Кроме того, содержание культурального раствора для репарации предпочтительно составляет от 50 до 500% (масса/объем), когда раствор, полученный с помощью любых иммортализованных стволовых клеток, составляет 100%.
Четвертый аспект настоящего изобретения представляет собой способ получения иммортализованной стволовой клетки, включающий стадии: отделения стволовой клетки от популяции клеток, отобранных из группы, состоящей из мезенхимальных клеток молочной железы, раннего эмбриона и соматических клеток, отличных от указанных мезенхимальных клеток; культивирования указанных стволовых клеток в качестве первичной культуры с получением первично культивированных клеток; трансфекции 4 генов в указанную первично культивированную клетку для продуцирования ген-трансфицированной клетки; и отбора клеток путем использования STRO-1-экспрессирующего количества при 20 клеточных удвоениях и способности костной регенерации в качестве индексов.
В настоящем описании мезенхимальная клетка предпочтительно выбрана из группы, состоящей из клетки пульпы зуба, клетки костного мозга, умбиликальной клетки и жировой клетки. Клетка пульпы зуба, эмбрион в начальной стадии развития, стволовые клетки костного мозга, а также умбиликальные стволовые клетки являются такими, как описано выше. Млекопитающее является также таким, как описано выше.
Кроме того, 4 гена предпочтительно выбраны из группы, состоящей из hTERT, bmi-1, E6, E7, Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc и p16INK4a. В настоящем описании они предпочтительно представляют собой hTERT, bmi-1, E6 и E7, предназначенных для введения в мезенхимальную клетку. Кроме того, они представляют собой 4 гена, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc и p16INK4a, предназначенных для введения в соматическую клетку.
hTERT является геном обратной транскриптазы теломеразы человека, и bmi также является комплексом белков группы polycomb, который относится к ауторепродукции или контролю пролиферации стволовых клеток. Е6 и Е7 являются генами, которые находятся в открытой рамки считывания, кодирующей “ранний” ген, используемый для ауторепродукции вирусом папилломы человека.
Пятый аспект настоящего изобретения относится к способу чрескожного всасывания для восстановления поврежденной ткани, включающий стадии: получения пленкообразующей лекарственной формы путем растворения указанного фармацевтического препарата для восстановления указанной поврежденной ткани в пленкообразующем, сохраняющем влагу компоненте; покрытия указанного поврежденного участка указанной пленкообразующей лекарственной формой; и контакта положительно заряженного электрода с желаемым участком.
Иммортализованные стволовые клетки по настоящему изобретению содержат по меньшей мере 40% положительных клеток STRO-1 после того как они разделятся 40 раз. Кроме того, поскольку они обладают способностью восстанавливать теломеры, они могут делиться по меньшей мере 200 раз. Альтернативно, они могут секретировать различные биологические факторы в культуральный раствор в течение длительного времени.
Положительный эффект изобретения
Согласно настоящему изобретению, соответственно, могут быть получены иммортализованные стволовые клетки, которые могут непрерывно продуцировать определенные биологические факторы в течение длительного времени.
Кроме того, в соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, предусмотрены фармацевтическая композиция и препарат на ее основе, который может быть использован для восстановления поврежденного участка.
Кроме того, предусмотрен превосходный способ всасывания через кожу для повышения скорости всасывания из поврежденного участка.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлен график, показывающий зависимость времени культивирования от количества удвоений популяции (количество удвоений популяции, здесь ниже называется "PD") между иммортализованными стволовыми клетками и неиммортализованными стволовыми клетками. На фиг. 1, SHED-T представляет иммортализованные клетки, и SHED-C представляет неиммортализованные клетки.
На фиг. 2 представлен график, показывающий результаты экспрессии STRO-1 как в SHED-C, так и SHWD-T (см. фиг. 2(A)-(D)). Где PD20 обозначает, что количество удвоений составляет 20, PD30 обозначает, что количество удвоений составляет 30, и PD40 обозначает, что количество удвоений составляет 40.
На фиг. 3 представлена фотография, на которой изображено лечение язвы на коже. (А) показывает состояние до начала лечения язвы, и (В) показывает состояние кожи после лечения.
На фиг. 4 представлен график, показывающий зависимость между количеством удвоений популяции (число раз) и массы вновь образованной костной ткани. На рисунке, ** показывает р<0,05, *** показывает р<0,01. Массу вновь образованной костной ткани вычисляли с использованием следующего уравнения:
Масса вновь образованной кости=участок вновь образованной костной ткани/видимый участок×100.
На фиг. 5 представлены изображения SHED-C и SHED-T с окрашиванием тканей в каждый момент индивидуального удвоения, показанного на фиг. 4, в момент, когда они были трансплантированы.
На фиг. 6 представлены фотографии, показывающие восстановление пролежня. (А) показывает состояние кожи до лечения, и (B) после лечения.
На фиг. 7 представлены КТ изображения, показывающие развитие изменения формы кости через 1-6 месяцев после пересадки имплантата при использовании фармацевтического препарата. (А)-(С) представляют собой изображения, показывающие фронтальную проекцию, и (D)-(F) представляют собой изображения в горизонтальной плоскости.
На фиг. 8 представлены изображения, показывающие состояние альвеолярного кости пациента с пародонтозом. На (А) показано состояние в начале лечения (до операции), и на (B) показано состояние через 3 месяца после операции.
На фиг. 9 представлены фотографии, показывающие результат остеогенеза в ячейке при использование β-ТСР в качестве матрицы. (А) показывает результат через 3 месяца после удаления зуба, и (В) показывает результат имплантации, выполненной через 6 месяцев после удаления зуба.
На фиг. 10 показаны замещения и другие из β-TCP (β-трикальцийфосфат, 3CaO-P2O5) костной ткани в случае, когда β-TCP используют в качестве матрицы. (А) представляет фотографию, изображающую удаленный материал, и (B) показывает результат гистохимического анализа. (С) и (D) являются частично увеличенными изображениями представленных изображений. На фигурах NB показывает новую кость, и TCP показывает β-TCP. Кроме того, BV показывает кровеносный сосуд, и SF показывает нижнюю часть удаленной ткани.
На фиг. 11 показан участок применения, когда культуральный раствор стволовых клеток вводят в интраназально через обонятельную луковицу.
На фиг. 12 представляет собой фотографию осуществления трансназального введения.
На фиг. 13 представляет собой МРА изображение, показывающее тромбоз кровеносного сосуда у пациента с нарушением мозгового кровообращения.
На фиг. 14 представлено изображение среза КТ, показывающее поврежденный участок мозга у пациента с нарушением мозгового кровообращения.
На фиг. 15 представлено МРТ изображение, показывающее объем кровотока в поврежденном участке головного мозга у пациента с нарушением мозгового кровообращения. (А) представляет собой изображение сразу после инсульта, и (B) представляет собой изображение после лечения.
На фиг. 16 представлен график, показывающий результат изменений (NIHSS) (по шкале тяжести инсульта Национального института здравоохранения США), которое отражает состояние пациента в период лечения.
На фиг. 17 представлена фотография, показывающая восстановление функционального состояния пациента. (A) представляет собой фотографию, показывающую состояние восстановления функции руки, и (B) показывает состояние физических показателей.
На фиг. 18 представлен результат, зависящий от времени изменения после краткой оценки состояния когнитивных функций (Mini Mental State: MMS), или теста Hasegawa, выполненного для группы, которой вводили лекарственный препарат, и для группы, которой не вводили лекарственный препарат. На фиг. 18 (А) показан результат для группы, которой не вводили лекарственный препарат, и на фиг. 18 (В) показан результат для группы, которой вводили лекарственный препарат.
На фиг. 19 представлена фотография, показывающая результаты лечения кожных заболеваний, не поддающихся лечению. На фиг. 19 (A) показано состояние до начала лечения, и на фиг. 19 (В) показано состояние в конце лечения.
Вариант осуществления изобретения
Настоящее изобретение подробно описано ниже.
Для того чтобы получить иммортализованную стволовую клетку по настоящему изобретению, сначала стволовые клетки выделяют из клеточной группы, состоящей из мезенхимальных клеток млекопитающего, клеток эмбриона на ранней стадии развития и соматических клеток за исключением мезенхимальных клеток. В качестве млекопитающего, животное, предпочтительно, выбрано из группы, состоящей из человека, свиньи, лошади и обезьяны, потому что клетки, полученные от млекопитающего, генетически схожи с человеческими клетками и не опасны ввиду инфекционного заболевания.
В настоящем описании термин "мезенхимальная клетка" определяется как клетка, обладающая способностью дифференцироваться в клетку, принадлежащую к мезенхимальным, таким как остеобласты, адипоциты, мышечные клетки, клетки хряща и тому подобное. Конкретными примерами мезенхимальных клеток являются клетка пульпы зуба, клетки костного мозга, умбиликальные клетки и адипоциты указанных выше животных. Кроме того, термин "ранний эмбрион", определяется как эмбрион на ранней стадии - бластоциста, то есть находящийся на более прогрессивной стадии, чем оплодотворенная яйцеклетка, и необходимой для формирования ES клеток. Термин "соматическая клетка", определяется как общий термин для клеток, за исключением половых клеток, из которых состоит живой организм.
Кроме того, термин "клетка пульпы зуба" определяется как одна из стволовых клеток, включенная в нерв зуба, и обладающая способностью к регенерации. Поскольку она защищена твердым материалом зубов, УФ свет или радиоактивное излучение не проникает, и гены в этих клетках нелегко повреждаются. Термин "клетки костного мозга" определяется как общий термин для клеток, полученных из пунктата костного мозга, и клетки костного мозга включают клетки ряда лейкоцитов, таких как миелобласты или клетки ряда эритробластов, мегакариоциты и плазматические клетки, и тому подобное.
В настоящем описании термин "умбиликальная клетка" определяется как клетка, находящаяся в пупочном канатике, который связывает эмбрион и плаценту. Она находится в пуповине, а также в пуповинной крови. Пуповина содержит пуповинную кровь, которая обогащает гемопоэтические стволовые клетки.
Поскольку гены вводят в стволовые клетки, как описано выше, имеются указанные гены, например, hTERT, bmi-1, E6, E7, Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, INK4a и тому подобное. Ген hTERT является теломера-репаративным ферментом; bmi-1 представляет собой ген Bmi-1, который является одним из белков, состоящих из комплекса белков группы polycomb. В настоящем описании Bmi-1 необходим для поддержания гемопоэтических стволовых клеток с эффектом увеличения стволовых клеток путем увеличения активности.
Е6 и Е7, оба представляют собой ранние гены или HPV-16 или HPV-18. Кроме того, Oct3/4 представляет собой ген, который взаимодействует с Sox2, чтобы повысить транскрипцию гена-мишени. Klf4 (фактором транскрипции типа Kruppel 4) регулирует гены, связанные с клеточным делением и эмбриогенезом, и связан со злокачественной опухолью желудочно-кишечного тракта в качестве супрессора опухоли.
Sox2 относится к SRY-связанному семейства генов HMG box и известен как ген, который связан с поддержанием недифференцированных функций (тотипотентность). с-Мус является геном, стимулирующим злокачественную опухоль, и способствует как выживанию, так и гибели клеток в с-Мус-индуцированной опухоли. p16INK4a является геном, который играет важную роль для контроля клеточного цикла опухолевых клеток.
Далее описан пример получения иммортализованной клетки с использованием зубной пульпы, полученной из естественно отторгнутого молочного зуба человека.
Сначала естественно отторгнутый молочный зуб дезинфицируют с помощью дезинфицирующего средства, например, хлоргексидина, изодина и подобного. После этого коронку зуба разделяют в горизонтальном направлении с помощью, например, зубного дрильбора и т.п., для извлечения зубной пульпы.
Полученную ткань пульпы суспендируют в базальной среде, например, такой как среда Игла, модифицированная Дульбекко (далее обозначаемая как "DMEM"), содержащей от 5 до 15% (объем/объем) фетальной сыворотки (здесь далее, иногда обозначаемая как "DMEM"), и от 50 до 150 ед/мл антибиотиков, и подобное. Затем обрабатывают от 1 до 5 мг/мл коллагеназы при 37°C в течение 0,5-2 часов.
В качестве базальной среды могут быть использованы DMEM, среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков (IMDM; GIBCO и т.д.), среда Хэма F12, HamF12; SIGMA, Gibco и т.д.), среда RPMI1640 и тому подобное. Кроме того, может быть использован смешанный носитель, содержащий по меньшей мере две среды. В качестве примера смешанной среды может быть указана среда, включающая IMDM и HamF12 в равном количестве (например, коммерчески доступная под торговым наименованием: IMDM/HamF12 (Gibco)).
В качестве добавляемых в среду компонентов могут быть использованы, например, сыворотка крови (фетальная бычья сыворотка или фетальная телячья сыворотка, обозначенные как "FBS" или "FCS"), сыворотки крови человека, сыворотки овец и заменители сыворотки (нокаутный заменитель сыворотки (KSR) и т.д.), бычий сывороточный альбумин (BSA), антибиотики, такие как пенициллин, стрептомицин и другие, витамины, минералы и тому подобное.
Базальная среда может быть также использована для селекции культуры клеток, как указано ниже, и для культивирования селектированных клеток.
После ферментативной обработки, для извлечения клеток пульпы зуба, выполняют процедуру центрифугирования в течение от 3 до 10 минут (3000-7000 оборотов в минуту). В зависимости от необходимости, клетки селектируют с помощью клеточного фильтра. Селектированные клетки, например, ресуспендируют в 3 до 6 мл базальной среды для посева в чашку с диаметром от 4 до 8 см для культивирования прилипающих клеток.
Далее добавляют среду, например, DMEM, содержащую 10% FCS, и затем клетки инкубируют в инкубаторе с 5% CO2 при 37°C в течение 2 недель. После удаления среды, клетки промывают от 1 до нескольких раз PBS и т.п. Вместо удаления среды и промывки клеток, прилипающие стволовые клетки, полученные из клеток зубов, которые образуют колонии, могут быть собраны. Для отделения от чашки, адгезивные полученные из зубов стволовые клетки обрабатывают раствором, включающим 0,025-0,1% трипсин и 0,3-1 мМ EDTA, в течение нескольких минут при 37°С. Далее отделенные клетки собирают.
После ферментативной обработки, для сбора клеток пульпы зуба, образец центрифугируют в течение примерно 3-10 минут (3000-7000 оборотов в минуту). В случае необходимости, клетки отделяют друг от друга с помощью клеточного фильтра. Разделенные клетки ресуспендируют, например, в 3-6 мл базальной среды для посева в чашку для культивирования прилипающих клеток с диаметром от 4 до 8 см.
Затем добавляют культуральную среду, например, DMEM, с добавлением 10% FCS; Затем клетки инкубируют в инкубаторе с 5% при 37°С в течение 2 недель. Культуральный раствор удаляют и клетки промывают PBS от 1 до нескольких раз. Вместо удаления культуральной среды и промывки клеток, могут быть собраны прилипающие клетки пульпы зубов, образующие колонии. Прилипающие клетки пульпы зубов отделяют от чашки, например, с помощью 0,025-0,1% трипсина и 0,3-1 мМ EDTA, в течение нескольких минут при температуре 37°С, и затем их собирают.
Далее селектированные прилипающие клетки, полученные указанным выше способом, культивируют. Например, стволовые клетки, полученные указанным выше способом, высевают в чашки для культивирования прилипающих клеток и затем культивируют в инкубаторе в условиях 5% СО2 и при 37°C. Кроме того, могут быть получены первичные культивированные клетки человеческих стволовых клеток естественно отторгнутых молочных зубов (SHED-P).
В пересеиваемой культуре, когда клетки становятся субконфлюэнтными или конфлюэнтными при макроскопическом наблюдении, как указано выше, клетки собирают с помощью трипсина и EDTA. Затем клетки снова высевают в чашки для культивирования, содержащие культуральную среду.
В настоящем описании термин "субконфлюентный", означает состояние, при котором клетки прикрепляются к около 70% площади дна сосуда для культивирования. Например, пассаж выполняют от 1 до 8 раз, и селектированные клетки размножают до необходимого количества клеток, например, около 1×107 клеток/мл. После культивирования, как описано выше, клетки собирают для хранения в жидком азоте. Клетки, отобранные у различных доноров, могут быть сохранены в виде банка стволовых клеток пульпы зуба.
Далее, для создания ген-трансдуцированных клеток, в первичные культивированные клетки, полученные из первичной культуры стволовых клеток, вводят 4 гена. Гены, трансдуцированные по настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой 4 типа, выбранные из группы, состоящей из hTERT, bmi-1, E6, E7, Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc и p16INK4a. При введении hTERT, bmi-1, E6 и E7 могут быть получены иммортализованные клетки, имеющие самое большое количество удвоений популяции. В настоящем описании hTERT является геном для теломеразной обратной транскриптазы человека; bmi-1 является геном группы Polycomb, относятся к ауторепродукции стволовых клеток или регулирования дифференциации. Е6 и Е7 являются генами, которые присутствуют в открытой рамки считывания, кодирующей ранний ген, используемый для саморепликации вируса папилломы человека.
Эти гены могут быть введены следующим образом.
Для клонирования генов, подготавливают плазмиду для вставки генов-мишеней и затем вставляют в челночный вектор, например, pShuttle2. Для селекции трансформантов, устойчивых к канамицину, трансформируют E. coli с помощью вектора челночного вектора. Для идентификации рекомбинанта посредством анализа сайтов рестрикции, очищают плазмидную ДНК селектированного трансформанта, устойчивого к канамицину.
Затем используют рестриктазу, например, PI-Sce I и I-Cue I, чтобы вырезать кассету экспрессии из челночного вектора; затем лигируют в вектор аденовируса, например, Adeno-X вирусную ДНК. Полученный продукт лигирования расщепляют с помощью SwaI и используют для преобразования E.coli.
В числе полученных трансформантов были селектированы трансформанты, устойчивые к ампициллину. ДНК рекомбинантного аденовируса, в которую вставлены гены, очищают для идентификации трансформанта путем анализа сайтов рестрикции.
Далее, аденовирус обрабатывают PacI для трансфекции клеток НЕК 293. Рекомбинантный аденовирус культивируют и затем собирают для определения их титров. В соответствии с обычным способом очистки вируса, его используют для инфицирования клетки-мишени, SHED-P.
Клеточную популяцию, инфицированную вирусом, окрашивают с помощью FITC в соответствии с обычным способом, и затем положительные клетки STRO-1 обнаруживают с использованием проточного цитометра. В настоящем описании STRO-1 рассматривается как один из маркеров для мезенхимальных стволовых клеток, обладающих плюрипотентностью в костном мозге, и становится показателем клеточной иммортализации.
В соответствии с вышеописанной методикой, могут быть получены иммортализованные стволовые клетки из пульпы зуба.
Далее, полученные иммортализованные стволовые клетки культивируют в базальной среде, например, среде DMEM, дополненной 10% FBS в условиях 5% CO2 при 37°С в течение 24-48 часов с получением культурального раствора. Для того чтобы собрать культуральный раствор, используют, например, пипетки типа Komagome и т.п. Собранный культуральный раствор может быть использован “как таковой” в качестве активного ингредиента для фармацевтических препаратов по настоящему изобретению. Кроме того, он может быть использован в качестве активного ингредиента для фармацевтических препаратов после обработки, такой как конденсация, замена растворителя, диализ, лиофилизация, разбавление и тому подобное.
Как описано ниже, культуральный раствор иммортализованных стволовых клеток, полученных описанным выше способом, включает ряд факторов роста и демонстрирует множество функций без высокой очистки. А именно, композиция по настоящему изобретению для использования при многих заболеваниях может быть получена обычным способом. Таким образом, можно избежать снижения биологической активности факторов роста, вызванного высокой очисткой.
Следует отметить, что "культуральный раствор иммортализованных клеток", используемый в настоящем изобретении, определяется как культуральный раствор, включающий различные биологические факторы, полученные при культивировании иммортализованных стволовых клеток, и он представляет собой раствор, который не включает любые клетки, такие как иммортализованная стволовая клетка и другие клетки. При получении культурального раствора без сыворотки, бессывороточную среду предпочтительно используют в течение всего процесса, от первичной культуры до пассажа, или используют в течение нескольких пассажей перед сбором клеток.
Стволовые клетки пульпы зуба, селектированные и культивированные с использованием вышеописанного метода, являются клетками, полученными из тканей живого организма, и обладают свойствами, аналогично свойствам первичных культивированных клеток. В большинстве случаев, первичные культивированные клетки обладают свойствами, аналогичными свойствам клеток органа, используемого в качестве источника, и важно, что их свойства близки к нормальной клетке. Тем не менее, они растут медленнее по сравнению с клеточной линией, и иногда дедифференцируются в процессе непрерывного культивирования. Таким образом, трудно сохранять обладающие свойствами клетки.
Тем не менее, иммортализованная стволовая клетка по настоящему изобретению имеет значительно более высокий коэффициент экспрессии STRO-1, который становится показателем анапластической степени, по сравнению с коэффициентом стволовых клеток пульпы зуба, которые не являются иммортализованными клетками на момент времени, когда удвоения популяции соответствуют 20 или 40. Предпочтительно, чтобы иммортализованная стволовая клетка имела более высокий коэффициент, например, около 1,5-3, потому что высокий коэффициент экспрессии STRO-1 становится показателем, при котором клетки демонстрируют свойства, аналогичные свойствам первичным культивированным клеткам.
Кроме того, иммортализованные стволовые клетки секретируют по меньшей мере два фактора роста, выбранных из группы, состоящей из инсулиноподобного фактора роста (IGF), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), трансформирующего фактора роста β (TGF-β) и фактора роста гепатоцитов (HGF) в культуральный раствор. В настоящем описании термин "фактор роста" является общим термином для полипептидов, которые способствуют делению клеток, вызывают морфологическое изменение или клеточную гипертрофию. Факторы роста различаются в зависимости от продуцирующих их клеток, и они грубо классифицируются на эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста нервов (NGF), фактор роста опухоли (TGF) и тому подобное.
Кроме того, поскольку рецепторы на клеточной мембране каждой клетки обладают активностью тирозинкиназы, связывание с ними факторов роста вызывает фосфорилирование остатков тирозина в белках и вызывает клеточный рост или пролиферацию. Известно, что существует несколько примеров того, что фактор роста становится индуктором мезодермы в онтогенезе. Кроме того, известно, что существует несколько примеров, того, что лимфокин, который модулирует иммунную систему, становится индуктором мезодерма в онтогенезе. Такие факторы роста могут быть определены посредством известного ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), анализа на микрочипе или тому подобное.
IGF-1 является полипептидом, имеющим в высокой степени аналогичную с инсулином последовательность и, аналогично инсулину, вызывает в культуральных клетках реакции, такие как митогенез и т.п. Также известно, что IGF оказывает влияние на рост нервных клеток. VEGF относится к семейству гликопротеинов, вовлеченных в васкулогенез, посредством которого вновь образуются кровеносные сосуды в области, где кровеносные сосуды еще не сформировались, в период эмбриональной стадии эмбриогенеза, и в ангиогенез, посредством которого вновь образуются кровеносные сосуды путем разветвления и продления уже существующих кровеносных сосудов. TGF-β также становится мощным ингибитором роста различных клеток и принимает значительное участие в дифференциации, миграции и адгезии клеток, и играет важную роль в обширной области, такой как онтогенез, реконструкция тканей, заживление ран, воспаления и иммунитет, инвазия злокачественной опухоли и метастазирование, и тому подобное. Кроме того, HGF обладает рядом физиологических активностей, будучи вовлеченным в регенерацию и защиту тканей и органов, например, стимуляцию пролиферации клеток и движение клеток, антиапоптоз (клеточная смерть), морфогенетическую индукцию, ангиогенез и другие, для различных клеток, включая гепатоциты.
Каждую стволовую клетку, описанную выше, культивируют, например, в среде DMEM, дополненной 15% FCS, при 37°С в течение определенного времени, при этом может быть получен культуральный раствор, включающий указанные выше факторы роста. Следует отметить, что культуральный раствор стволовых клеток включает около 70 типов белков, за исключением IGF-1, VEGF, TGF-β и HGF.
15 мл культурального раствора из полученного культурального раствора выливают на ультрацентрифужный фильтр Amicon Units-10K (Millipore Limited). Затем центрифугируют при 4000×g в течение приблизительно 60 минут, чтобы сконденсировать около 200 мкл. Далее, тот же объем PBS в виде культурального раствора выливают в пробирку и вновь центрифугируют при 4000×g в течение приблизительно 60 минут, для замены растворителя на PBS. Полученные 200 мкл раствора собирают в микропробирку с получением культурального раствора конденсированных стволовых клеток.
Вместо метода с использованием Amicon, как описано выше, концентрирование может быть выполнено методом осаждения этанолом. Например, 45 мл 100% этанола добавляют к 5 мл культурального раствора, для их смешивания, и затем оставляют при -20°С в течение 60 минут. Затем, для удаления супернатанта, центрифугируют при 15000×g в течение 15 минут при 4°С.
Далее, например, 10 мл 90% этанола добавляют в лунку со смесью, и затем снова центрифугируют при 15000×g в течение 5 минут при 4°С. После удаления супернатанта, полученный осадок может быть растворен, например, в 500 мкл стерилизованной воды. После растворения, весь объем собирают в микропробирку и получают конденсированный культуральный раствор стволовых клеток.
Культуральный раствор, полученный описанным выше способом, может быть также лиофилизирован обычным способом, с получением фармацевтического препарата, который подготавливают во время применения.
Содержание фактора роста в культуральном растворе, включенном в фармацевтический препарат, предпочтительно составляет приблизительно от 50 до 500% масс. от его общей сухой массы. Поскольку, когда содержание составляет не более 50% масс., он не оказывает какого-либо эффекта; и когда превышает 500% масс., улучшение эффекта не ожидается.
В качестве лекарственной формы фармацевтического препарата, указаны, например, порошок, жидкость, гель, спрей, системы для чрескожного введения и тому подобное. Например, фармацевтический препарат может быть получен путем добавления наполнителя, эксципиента, регулятора кислотности и подобного, для разлива в контейнер небольшого размера, например, стерильные стеклянные ампулы, пробирки для разделения сыворотки и тому подобное. При применении препарат растворяют с помощью физиологического раствора или стерильной дистиллированной воды для инъекций, и затем он может быть введен путем трансназального введения. Альтернативно, для адгезии на пораженный участок, его вводят с помощью слоя марли, пропитанной раствором. В случае применения препарата для остеогенеза альвеолярной кости и других костей, в качестве матричного компонента используют коллаген, β-ТСР и другие вещества, которые погружают в жидкий раствор для заливки.
В качестве поврежденных тканей, в отношении которых применяется фармацевтический препарат по настоящему изобретению, указаны, например: ткани, в которых формируется язва или пролежни, мозговая ткань, поврежденная закупоркой кровеносных сосудов, и ткани, поврежденные костным заболеванием, пародонтозом и заболеванием центральной нервной системы, и подобным.
В настоящем описании, "язва" определяется как участок с поражением ткани, образованный на поверхности органа с лизисом или отслоением ткани в результате некроза, и язва формируется в эпидермисе, дерме, слизистой оболочке и т.д. Если поражение ткани пальцев стопы не достигают дермы, его называют эрозией. Конкретно, язва образуется на участке контакта с поверхностью тела, такой как кожа, слизистая оболочка полости рта и носа, роговицы и т.д., или поверхностью полых органов, таких как желудочно-кишечный тракт, дыхательный путь, мочевыводящие пути, кровеносные сосуды и других органов
Клинический термин "пролежни" означает, что в тканях, прилегающих к участку поверхности организма, который контактирует с поддерживающей поверхностью (главным образом с кроватью), нарушено местное кровообращение и возникает некроз, когда пациент введен в состояние, при котором он может удерживать одно и то же положение, и не может перевернуться.
Термин "нарушения, вследствие хирургической операции", обозначает нарушение, которое вызвано хирургической операцией, такой как удаления опухоли головного мозга и других опухолей.
Термин "закупорка кровеносных сосудов" означает состояние, при котором кровеносный сосуд закупоривается по любой из следующих причин. Например, ситуация, при которой кровеносный сосуд сужается вследствие атеросклероза и кровоток останавливается; эмбола (сгусток крови или жирных кислот) отрывается от выстилки кровеносного сосуда, блокируя кровоток, и кровоток не достигает атеросклеротического участка кровеносного сосуда близко к сердцу; и кровоснабжение останавливается воспалением, спазмом или изменением компонента крови или кровотока.
"Головной мозг" обладает функциями запоминания, проявления эмоций, принятия решений и т.п. Головной мозг покрыт жидкостью, называемой спинномозговой жидкостью. Спинномозговая жидкость (ликвор, CSF) обладает защитной функцией мозга и осуществляет транспорт питания и метаболитов. Спинномозговая жидкость может быть получена путем спинномозговой пункции пациента, однако свойства зависят от заболевания пациента и подобного.
В настоящем описании термин "спинной мозг" означает нервный ствол позвоночных. Кроме того, термин "центральная нервная система" означает ткань, включающую спинной мозг и головной мозг. Центральная нервная система работает в качестве рефлекторного центра для стимуляций из периферии или объединения стимуляций.
Повреждение центральной нервной системы вызывается травмой спинного мозга и подобного. В настоящем описании термин "повреждение спинного мозга" является состоянием, при котором спинной мозг поврежден под воздействием внешних или внутренних факторов, таких как опухоль, грыжа спинного мозга и других факторов. В зависимости от степени, повреждение классифицируются на полное, при котором спинной мозг полностью расщеплен, и неполное, при котором спинной мозг поврежден или сдавлен, но функция спинного мозга частично сохраняется.
"Миелопатия" возникает вследствие развития шейного спондилеза, вызванного старением (отек вверх межпозвоночного диска или формирование остистого отростка).
Фармацевтический препарат может быть нанесен на пораженный участок в жидкой форме или в форме геля, и наносится в виде пленкообразующего препарата. Во-первых, он абсорбируется компонентом, удерживающим влагу, например, марлей, удерживающей влагу пленкой для медицинского применения и т.п., для получения препарата в форме пленки. Далее, препарат в форме пленки наносят на пораженный участок, покрывая его. Отрицательно заряженный электрод в виде стержня помещают на пленку, которая покрывает пораженный участок, осторожно вращая стержень. Положительно заряженный электрод контактирует с желаемым участком, за исключением пораженного участка.
Как описано выше, активный ингредиент в фармацевтической композиции эффективно вводиться с использованием электрического тока между электродом, прикрепленным к пораженному участку, и электродом, контактирующим с областью, не являющейся пораженным участком.
При применении фармацевтического препарата по настоящему изобретению, его наносят на поврежденную ткань, что может обеспечить быстрое восстановление ткани.
Пример 1
(Получение иммортализованных SHED и способ культивирования)
(1) Агенты для экстракции, плазмиды и т.п.
(1-1) Реагент и другие компоненты
Использовали канамицин (KAN), ампициллин (Amp), жидкую среду LB и среду с агаром LB, гликоген, агарозу, стерилизованную воду, ацетат аммония, ацетат натрия, додецилсульфат натрия и РНКазу А. Подготавливали 50 мг/мл канамицин (KAN) и ампициллин (Amp) для хранения их в качестве исходных растворов при -20°C. Подготавливали гликоген при концентрации 20 мг/мл. Подготавливали 10 мг/мл РНКазу A для хранения при -20°C. Подготавливали 10М (насыщенный) ацетат аммония (NH4OAc) и 3М ацетат натрия (NaOAc; pH 5,2).
(1-2) Рестрикционный фермент и т.п.
Компетентные клетки E.coli (компетентные клетки Supercharge EZ10 Electro, код продукта 636756), Swa I (код продукта 1111A, Smi I является аналогичным), Xho I (код продукта 1094A), T4 ДНК-лигаза (код продукта 2011A), NucleoBond Xtra Midi (код продукта 740410.10/0.50/0.100), плазмиды NucleoSpin (код продукта 740588 10/50/250) были приобретены у компании Takara Bio Inc. Pac I приобретали у компании New England Biolabs.
(1-3) Буфер и т.п.
Получали 1×ТЕ буфер (10 мМ Трис-HCl (рН 8,0), включая 1 мМ EDTA), который представляет собой смесь фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1), насыщенный 100 мМ Трис-HCl (рН 8,0). Далее в настоящем описании он называется “раствор PCI". Этанол использовали или 100%-ый или 70%-ый. Для очистки pAdeno-X плазмидной ДНК, использованной в рекомбинации на малом участке, получали следующие буферы 1-4.
Буфер 1: 25 мМ Трис-HCl, включающий 10 мМ EDTA и 50 мМ глюкозы (рН 8,0) (после автоклавирования хранили при 4°C).
Буфер 2: 0,2М NaOH, содержащий 1% SDS (получали непосредственно перед использованием, плотно закрывали и хранили при комнатной температуре).
Буфер 3: 5M KOAc (после автоклавирования хранили при 4°C).
Буфер 4: 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0), включающий 1 мМ EDTA и 20 мкг/мл РНКазы (непосредственно перед применением добавляли РНКазу, хранили при -20°C).
(2) Очистка аденовируса и реагенты для β-gal анализа
Использовали клетки HEK293 (ATCC #CRL1573), трансформированные аденовирусом человека типа V. Клетки HEK293 культивировали в полной среде. Композиция полной среды представляла собой DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла, базальная среда) с добавлением 100 ед/мл пенициллина G натрия, 100 мкг/мл стрептомицина, 4 мМ глутамина и 10% FBS. Получали раствор пенициллина G натрия при концентрации 10000 ед/мл, и получали раствор сульфата стрептомицина при концентрации 10000 мкг/мл. Их хранили в виде исходных растворов.
При культивировании использовали 60 мм планшет, 100 мм планшет, 6-луночный планшет, сосуды Т75 и Т175.
Трипсин-EDTA (код продукта CC-5012) приобретали у компании Takara Bio Inc. Получали забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS, без Ca2+ и Mg2+) и забуференный фосфатом физиологический раствор по Дульбекко (DPBS, с Ca2+ и Mg2+). Кроме того, использовали 0,33% нейтральный раствор красного красителя, и 0,4% трипановый раствор синего красителя.
В анализе β-gal, X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (25 мг/мл)) в растворе диметилформамида (ДМФА) хранили при -20°C в светонепроницаемом контейнере. Использовали набор Luminescent β-gal Detection II (код продукта 631712, Takara Bio Inc).
(3) Предварительный тест
(3-1) Конструирование рекомбинантного аденовируса, включающего LacZ (pAdeno-X-LacZ)
После размораживания клеток НЕК293 и удаления ДМСО из раствора, клетки HEK293 ресуспендировали в 10 мл полной среды. Затем все количество переносили на культуральный планшет, имеющий диаметр 100 мм. После адгезии НЕК293 на планшете, культуральную среду удаляли. Затем клетки промывали один раз стерильным PBS. Затем добавляли 1 мл трипсина-EDTA для их обработки в течение 2 минут.
Далее, для прекращения взаимодействия трипсина добавляли 10 мл в полной среде, и затем клетки мягко суспендировали. Используя количество жизнеспособных микроорганизмов, 105 клеток переносили на чашку с диаметром 100 мм, содержащую 10 мл среды для равномерного рассеивания.
Использовали pShuttle2-LacZ (вектор позитивного контроля, включенный в Adeno-X экспрессионную систему 1) и Adeno-X вирусную ДНК (ферментативно обработанную PI-Sce I и I-Ceu I), включенные в набор. В соответствии с протоколом, прилагаемым к набору, конструировали рекомбинантный аденовирус, включающий LacZ. Им инфицировали клетку-мишень, SHED, и анализировали экспрессию β-галактозидазы для подтверждения того, что вектор был сконструирован.
(3-2) Конструирование рекомбинантной плазмиды pShuttle2
До конструирования рекомбинантного вектора pShuttle2 (здесь ниже называемый "вектор rpShuttle2"); E. coli DH5α трансформировали с помощью включенных в набор вектора pShuttle2 и вектора pShuttle2-LacZ. Трансформированные клетки селектировали на планшете с агаром LB, включающим 50 мкг/мл канамицина (здесь ниже называемый "LB/Kan"). Бактериальные клетки, полученные из одной колонии, высевали на новой LB/Kan для инкубирования при 37°C в течение ночи.
Далее, hTERT, bmi-1, Е6 и Е7 клонировали в pShuttle2. Вектор pShuttle2 расщепляли с помощью фермента рестрикции, подходящего для этих генов.
Далее, было решено встроить информационный пакет вектора pShuttle2 (PT3416-5), прилагаемый к набору, сайт множественного клонирования ДНК. Плазмиду, обработанную рестриктазой, обрабатывали с использованием щелочной фосфатазы для очистки.
Согласно общепринятому способу получали целевые ДНК-фрагменты, подлежащие очистке. Вектор обрабатывали ферментом рестрикции и лигировали фрагменты гена. Используя продукт лигирования, трансформировали клетки DH5α (компетентные клетки). Часть компетентной клетки подвергали трансформации с помощью контрольного вектора, pShuttle2-lacZ, включенного в набор для использования в качестве позитивного контроля.
Смесь, включая трансформированную E.coli, высевали на планшеты с агаром LB/Kan для селекции устойчивых к канамицину (Kanr) трансформированных клеток (колония). Выбирали от пяти до 10 Kan резистентных клонов, и их высеивали в небольшом количестве жидкой среды для амплификации. После подтверждения того, что эти клоны содержат вектор rpShuttle2, их инкубировали в течение ночи. Затем, с использованием коммерчески доступной адсорбционной колонки с силикагелем, сконструированную плазмидную ДНК очищали обычным способом.
Плазмидную ДНК обрабатывали ферментом рестрикции, которые будут подвергнуты электрофорезу в 1% агарозном геле; тем самым идентифицировали целевую рекомбинантную плазмиду. При секвенированием подтверждали направление встроенного фрагмента и встроенного сайта для определения позитивного клона.
Рекомбинантную pShuttle2 плазмидную ДНК (здесь далее обозначаемую как "rpShuttle2 плазмидная ДНК") непосредственно трансфицировали в клетку-мишень, и затем ее подвергали вестерн-блоттингу для предварительной оценки экспрессии целевого белка.
(3-3) Двойная ферментная обработка rpShuttle2 плазмидной ДНК c помощью PI-Sce I/I-Ceu I
От rpShuttle2 плазмидной ДНК, полученной указанным выше способом, получали кассету экспрессии встроенного гена с помощью PI-Sce I и I-Ceu I. В соответствии с in vitro методом лигирования, описанном в протоколе прилагаемой к набору, полученную кассету экспрессии встраивали в Adeno-X вирусную ДНК. Получали 30 мкл раствора для двойной ферментной обработки с помощью PI-Sce I/I-Ceu I для rpShuttle2 плазмидной ДНК. Смешивали с реагентами, представленными в следующей таблице 1, помещенными в 1,5 мл-овую стерилизованную микроцентрифужную пробирку.
Таблица 1 | ||
Реагент и другие компоненты | Мера жидкости (мкл) | |
Пробирка 1 | Пробирка 2 (lacZ контроль) |
|
стерилизованная вода | 19,5 | 19,5 |
10× раствор для двойной ферментной обработки | 3,0 | 3,0 |
rpShuttle2 плазмидная ДНК (500 нг/мкл) | 2,0 | - |
pShuttle2-lac Z плазмида (500 нг/мкл) | - | 2,0 |
PI-Sce I (1 ед/мкл) | 2,0 | 2,0 |
I-Ceu I (5 ед/мкл) | 0,5 | 0,5 |
10× BSA | 3,0 | 3,0 |
Всего | 30,0 | 30,0 |
Далее, после полного смешивания, микроцентрифужную пробирку слегка центрифугировали, и затем инкубировали в течение 3 часов при 37°C.
Реакционную смесь для двойной ферментной обработки (5 мкл) подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле с EtBr вместе с лэддером размером 1 т.н. (размер ДНК маркера).
(3-4) Экстрагирование смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт
В центрифужную пробирку добавляли остатки раствора для двойной ферментной обработки (25 мкл), 70 мкл 1×ТЕ буфера (рН 8,0) и 100 мкл смеси PCI, содержимое пробирки смешивали на вихревой мешалке. Затем пробирку центрифугировали на микроцентрифуге при 4°C при 14000 оборотов в минуту в течение 5 минут. Затем водный слой переносили в 1,5 мл-овую чистую центрифужную пробирку. В этот момент добавляли 400 мкл 95% этанола, 25 мкл 10М ацетата аммония и 1 мкл гликогена (20 мг/мл), и затем перемешивали на вихревой мешалке.
Далее, центрифугировали при 4°C при 14000 оборотов в минуту в течение 5 минут. Затем супернатант удаляли аспирацией с получением осадка. 300 мкл 70% этанола добавляли к осадку, центрифугировали в течение 2 минут при 14000 оборотов в минуту. Супернатант осторожно аспирировали для удаления, осадок сушили воздухом около 15 мин.
После того, как осадок высушили, его растворяли в 10 мкл стерилизованного 1×ТЕ-буфера (рН 8,0), и раствор хранили при -20°C.
(4) Конструирование рекомбинантной Adeno-X плазмидной ДНК
(4-1) Субклонирование кассеты экспрессии в Adeno-X вирусный геном
Реагенты, представленные в следующей таблице 2, последовательно добавляли в 1,5 мл-овую стерилизованную микроцентрифужную пробирку. Затем содержимое мягко перемешивали и слегка центрифугировали. Затем инкубировали при 16°C в течение ночи.
Таблица 2 | |
Реагент и другие компоненты | Мера жидкости (мкл) |
PI-Sce I/I-Ceu I обработанная pShuttle2 плазмидная ДНК | 2,0 |
PI-Sce I/I-Ceu I обработанная pShuttle2-lac Z плазмидная ДНК | - |
Стерилизованная вода | 3,0 |
10× ДНК буфер для лигирования | 1,0 |
Adeno-X вирусная ДНК (250 нг/мкл) | 3,0 |
ДНК-лигаза(1 ед/мкл) | 1,0 |
Всего | 10,0 |
К каждому образцу добавляли 90 мкл 1×ТЕ буфера (pH 8,0) и 100 мкл смеси PCI, и затем полученную смесь мягко перемешивали на вихревой мешалке. Центрифугировали при 4°C при 14000 оборотов в минуту в течение 5 минут, и водный слой переносили в 1,5 мл чистую микропробирку. Затем в пробирку добавляли 400 мкл 95% этанола, 25 мкл 10М раствора ацетата аммония и 1 мкл гликогена (20 мг/мл), и затем смесь слегка перемешивали на вихревой мешалке.
Полученную смесь подвергали центрифугированию при 4°C в течение 5 минут при 14000 оборотов в минуту, и супернатант удаляли путем аспирации с получением осадка. Следующие процедуры осаждения этанолом аналогичны описанным в (3-4).
После сушки осадок растворяли в 15 мкл стерильной деионизированной воды.
(4-2) Swa I ферментная обработка рекомбинантной Adeno-X плазмидной ДНК
Получали раствор для ферментной обработки как показано в следующей таблице 3, и добавляли каждый образец в центрифужную пробирку. Затем их инкубировали в течение 2 часов при 25°C.
Таблица 3 | |
Реагент и другие компоненты | Мера жидкости (мкл) |
Продукт лигирования | 15 |
10× Swa I буфер для ферментативной обработки | 2,0 |
10× BSA | 2,0 |
Swa I (10 ед/мкл) | 1,0 |
Всего | 20,0 |
К каждому образцу добавляли 80 мкл буфера 1×TE (pH 8,0) и 100 мкл смеси PCI, и затем смесь мягко перемешивали на вихревой мешалке. Следующие процедуры осаждения этанолом аналогичны описанным в (3-4), и разведенный раствор осадка хранили до использования при -20°C.
(4-3) Подтверждение результата трансформации клеток E. coli посредством рекомбинантной Adeno-X плазмидной ДНК
Электропорированные компетентные клетки (E. coli) трансформировали с помощью SWA I обработанных продуктов, полученных в примере (4-2), используя Supercharge EZ10 Electrocompetent Cell (код продукта 636756).
Смесь трансформированных клеток высевали на чашки с агаровой средой, которая представляет собой смесь среды LB и ампициллина (конечная концентрация 100 мкг/мл) (здесь далее называемая "чашка с LB/Amp-агаром"), и затем инкубировали при 37°C в течение ночи. Около 106 клеток колоний получали в виде трансформированных клеток, устойчивых к ампициллину (AMPR). Полученные колонии проверяли с помощью набора Adeno-X System PCR Screening Primer, прилагаемому к продукту.
Бактериальные клетки одной колонии высевали в 5 мл свежей жидкой среды LB/Amp и инкубировали в течение ночи. На следующий день, в соответствии со способом на малом участке, как описано ниже, очищали Adeno-X плазмидную ДНК.
(4-4) Мини-масштабное получение рекомбинантной Adeno-X плазмидной ДНК
5 мл log-фазы культуральной среды центрифугировали при 14000 оборотах в минуту в течение 30 секунд для удаления супернатанта. Осадок снова центрифугировали при 10000 оборотах в минуту в течение 1 минуты, и затем супернатант удаляли с помощью микропипетки.
Добавляли 150 мкл буфера 1 и мягко пипетировали для повторного суспендирования. 150 мкл буфера 2 добавляли к клеточной суспензии. Затем клеточную суспензию мягко преобразовывали в смесь и оставляли в течение 5 минут на льду. К охлажденной суспензии клеток добавляли 150 мкл буфера 3, и затем эту суспензию вновь преобразовывали в смесь и оставляли в течение 5 минут на льду.
Суспензию клеток центрифугировали при 4°C при 14000 оборотов в минуту в течение 5 минут, и прозрачный супернатант переносили в 1,5 мл-овую чистую центрифужную пробирку. 450 мкл смеси PCI добавляли в супернатант, и затем преобразовывали в смесь. Затем центрифугировали при 4°C при 14000 оборотов в минуту в течение 5 минут, и водный слой переносили в чистую 1,5 мл микроцентрифужную пробирку.
Следующие процедуры осаждения этанолом аналогичны описанным в (4-1), и разведенный раствор осадка хранили до использования при -20°C. Представляющую интерес рДНК идентифицировали, используя анализ с ферментами рестрикции и ПЦР, как описано ниже.
(5) Анализ сайта рестрикции полученной rAdeno-X плазмидной ДНК
Анализ проводили с использованием PI-SCE I и I-Ceu I. Представленные в следующей таблице 4 реагенты помещали в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. Затем добавляли 30 мкл PI-Sce I/I-Ceu I раствора для двойной ферментной обработки, затем полностью перемешивали и затем пробирку слегка вращали, чтобы собрать содержимое.
Таблица 4 | |
Реагент и другие компоненты | Мера жидкости (мкл) |
стерилизованная вода | 19,5 |
10× раствор для двойной ферментной обработки | 3,0 |
rpAdeno-X ДНК (500 нг/мкл)(500 нг/мкл) | 2,0 |
pShuttle2-lac Z плазмида (500 нг/мкл) | - |
PI-Sce I (1 ед/мкл) | 2,0 |
I-Ceu I (5 ед/мкл) | 0,5 |
10× BSA | 3,0 |
Всего | 30,0 |
Это содержимое инкубировали при 37°C в течение 3 часов, чтобы выполнить рестрикционную обработку. Реакционную смесь после обработки подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле с EtBr.
(6) Получение рекомбинантного аденовируса
(6-1) Получение rAdeno-X плазмидной ДНК для трансфекции клеток НЕК293
Реагенты, представленные в следующей таблице 5, помещали в 1,5 мл-овую стерилизованную центрифужную пробирку для смешивания, и затем ее слегка центрифугировали на микроцентрифуге. Затем ее инкубировали при 37°C в течение 2 часов для обработки rAdeno-X плазмидной ДНК с использованием рестрикционного фермента Pac I.
Таблица 5 | |
Реагент и другие компоненты | Мера жидкости (мкл) |
Стерилизованная вода | 20 |
pAdeno-X плазмидная ДНК (500 нг/мкл) | 10 |
10× Pac I буфер для ферментативной обработки | 4 |
10× BSA | 4 |
Pac I (10 ед/мкл) | 2 |
Всего | 40 |
Добавляли 60 мкл 1× буфера TE (pH 8,0) и 100 мкл смеси PCI, и затем мягко перемешивали на вихревой мешалке. Затем центрифугировали на микроцентрифуге при 4°C в течение 5 минут при 14000 оборотов в минуту. Водный слой осторожно переносили в 1,5 мл-вую чистую стерилизованную центрифужную пробирку.
Следующие процедуры осаждения этанолом аналогичны описанным в примере (3-4), и разведенный раствор осадка хранили при -20°C перед использованием.
(6-2) Трансфекция Adeno-X плазмидной ДНК, обработанной Pac I, в клетки HEK293
За 24 часа до трансфекции плазмидной ДНК, клетки НЕК 293 высевали на 60 мм культуральный планшет так, чтобы число клеток составляло примерно 1-2×106 (около 100 клеток/мм2). Затем их инкубировали при 37°C в присутствии 5% СО2.
10 мкл Adeno-X плазмидной ДНК, обработанной PacI, трансфицировали в каждый культуральный планшет для введения Adeno-X ДНК в клетки HEK293 в соответствии со стандартным методом трансфекции (набор CalPhos Mammalian Transfection, код продукта 631312, Takara Bio Inc.). Наличие CPE (цитопатический эффект) подтверждали со следующего дня трансфекции.
Через одну неделю, клетки, прилипшие на дне или стенке культурального планшета, высвобождали посредством мягкого перемешивания. Полученную клеточную суспензию переносили в 15 мл стерилизованную центрифужную пробирку с коническим дном и центрифугировали при комнатной температуре в течение 5 минут при 1500×g.
Полученный осадок суспендировали в 500 мкл стерилизованного PBS. Раствор 3-х кратно подвергали процедуре свободного размораживания, который замораживали в смеси сухой лед/этанол и размораживали в инкубаторе при 37°C с получением лизата, в котором клетки были полностью разморожены. Далее, раствор слегка центрифугировали для удаления взвешенных веществ, и затем супернатант переносили в другую стерилизованную пробирку для немедленного использования. Лизат, не использованный немедленно, хранили при -20°C.
К клеткам, культивируемым в планшете с диаметром 60 мм, добавляли 250 мкл лизата и продолжали культивирование. Следует отметить, что при использовании анти-Hexon антитела, включенного в набор Adeno-X Rapid Titer (код продукта 631028, Takara Bio Inc), титрование аденовируса выполняли согласно руководству (PT3651-1), прилагаемому к набору.
(6-3) Вирусная амплификация для получения вируса, имеющего высокий титр
За 24 часа до начала титрования, клетки HEK293 высевали в сосуд T75 и инкубировали при 37°C при 5% CO2 в течение ночи, для подтверждения, что они достигли 50-70%-ной конфлюентности.
На следующий день среду заменяли средой, содержащей вирус для инфицирования при MOI=10. После инкубации при 37°C в присутствии 5% СО2 в течение 90 минут, сосуд извлекали, и в сосуд добавляли 10 мл среды.
Клетки культивировали при 37°C 3-4 часа в присутствии 5% CO2, и подтверждали наличие CPE. После высвобождения 50% клеток, суспензию высвобожденных клеток получали способом, описанным выше; суспензию помещали в 15 мл-овую стерилизованную центрифужную пробирку с коническим дном. Выполняли описанную выше процедуру замораживания и размораживания, и клетки размораживали. При использовании набора Adeno-X Rapid Titer (код продукта 631028), получали титр, составляющий 107 БОЕ/мл.
Выполняли вестерн-блоттинг, и с его помощью подтверждали, имеет ли упакованный геном аденовируса копии специфической транскрипционной единицы относительно гена-мишени в качестве функциональной формы.
(7) Инфицирование клетки-мишени аденовирусом
(7-1) Инфицирование клетки-мишени
За 24 часа до инфицирования, 1×106 клеток SHED высевали на 6-луночный планшет. На следующий день после посева, среду удаляли и в каждую лунку планшета добавляли 1,0 мл среды, содержащей вирус. Раствор наносили на монослой, образованный SHED.
Клетки инкубировали при 37°C в течение 4 часов в присутствии 5% CO2, и SHED инфицировали вирусом. Затем добавляли свежую среду и затем инкубировали при 37°С в присутствии 5% СО2. Через 24-48 часов после инфицирования, анализировали экспрессию интродуцированного гена в зависимости от времени.
(7-2) Анализ экспрессии β-галактозидазы инфицированных клеток
Экспрессию β-галактозидазы в прилипающих клетках, инфицированных Adeno-X-LacZ, анализировали с помощью набора Luminescent β-gal Detection II (код продукта 631712, Clontec Laboratories Inc.).
Пример 2
(1) Получение SHED
Использовали естественно отторгнутые молочные зубы здорового 10-ти летнего мальчика. После того, как естественно отторгнутые молочные зубы дезинфицировали раствором Isodine, венец зуба горизонтально разрезали с помощью зубного дрильбора, и затем ткань пульпы собирали с помощью зубной фрезы. Полученную ткань пульпы зуба ферментативно обрабатывали в растворе, включающем 3 мг/мл коллагеназы I типа и 4 мг/мл дисперсии, при 37°C в течение 1 часа. Далее, раствор фильтровали с использованием 70 мм клеточного фильтра (Falcon).
Отфильтрованные клетки ресуспендировали в 4 мл среды для посева в чашку для культивирования с диаметром 6 см. DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла), включающая 10% FCS, добавляли в чашку и культивировали в течение 2 недель в инкубатор в 5% CO2 при 37°C. Прилипшие клетки, образующие колонии (стволовые клетки пульпы зуба), обрабатывали смесью 0,05% трипсин-EDTA 0,2 мМ в течение 5 минут при 37°C, и затем клетки, отделенные от чашки, собирали.
Далее, прилипшие клетки, селектированные указанным выше способом, высевали на чашки для культивирования для прилипающих клеток (чашка с коллагеновым покрытием), и клетки инкубировали в инкубаторе в атмосфере 5% CO2 при 37°C в качестве первичной культуры с получением клеток первичной культуры. Когда клетки стали макроскопически субконфлюентными (около 70% поверхности культурального контейнера была покрыта клетками), либо конфлюентными, клетки обрабатывали смесью 0,05% трипсина-EDTA 0,2 мМ при 37°C в течение 5 минут, для отделения клеток от контейнера и затем собирали.
Полученные таким образом клетки снова высевали на чашке, содержащей среду, и несколько раз выполняли пассаж для роста с получением количества клеток, составляющего приблизительно 1×107 клеток/мл. Полученные клетки хранили в жидком азоте.
После этого, используя клетки первичной культуры, выполняли пассаж при концентрации клеток 1×104 клеток/см2. В эксперименте использовали клетки, пассированные от 1 до 3 раз. BMMSC человека (мезенхимальная стволовая клетка костного мозга, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга) приобретали у компании Lonza Group Ltd. и культивировали в соответствии с инструкцией, прилагаемой производителем.
Как описано выше, получали стволовые клетки пульпы естественно отторгнутых молочных зубов (SHED) человека. Среди полученных SHED, около 1×106 клеток из клеток, экспрессирующих STRO-1, были сортированы из каждого образца с использованием FACSTARPLUS (Becton, Dickinson and Company).
Согласно инструкции производителя, прилагаемой к набору для окрашивания бромдезоксиуридином, BrdU (Invitrogen), BrdU вводили в клетки в течение 12 часов для оценки темпов роста SHED (n=3 в каждой группе). Эти эксперименты повторяли 5 раз. После однофакторного дисперсионного анализа, для оценки статистически значимого расхождения выполняли тест Тьюки-Крамера.
Для обнаружения STRO-1 посредством иммунофлуоресценции, SHED фиксировали с помощью 3% параформальдегида и дважды промывали PBS, и затем обрабатывали с использованием 100 мМ глицина в течение 20 минут. Далее проницаемость этих клеток нарушали с помощью 0,2% Triton-X (Sigma-Aldrich) в течение 30 минут. Затем их инкубировали в смеси 5% ослиной сыворотки и 5% бычьего сывороточного альбумина в течение 20 минут.
Далее, клетки инкубировали первичными антителами, мышиными антителами против STRO-1 человека (1:100, R&D Inc.) в течение 1 часа, и затем инкубировали с вторичным антителом, козьим антителом к мышиному иммуноглобулину М-FITC (1:500, Southern Biotech Корпорация) в течение 30 минут, и затем подготавливали для исследования с использованием вектора Shield DAPI (Vector Laboratories Inc.).
После этого, в 6-ти луночный планшет добавляли α-МЕМ с добавлением 15% FBS, и затем отсортированные клетки высевали в каждую лунку с получением клонов. Для исследования объединяли около 300 колоний в числе пролиферирующих клеток.
(2) Трансгенез
Как описано выше, 4 гена, bmi-1, Е6, Е7 и hTERT, интегрировали в вектор аденовируса с получением вирусного вектора для экспрессии генных продуктов. В качестве контроля подготавливали контрольный вектор, в который эти гены не интегрировали.
SHED высевали на чашку с коллагеновым покрытием диаметром 100 мм при концентрации 1×106 клеток, а затем добавляли DMEM с добавлением 10% FBS. Клетки культивировали до тех пор, пока они не стали субконфлюентными. Среду удаляли путем аспирации и добавляли 500 мкл вирусного раствора, разведенного средой (MOI=10), и затем инкубировали при 37°C в течение 1 часа в инкубаторе с 5% CO2 для инфицирования вирусным вектором. Через 48 часов от инфицирования, среду заменяли указанной выше средой. Инфицированные клетки инкубировали в течение 10 дней в среде с добавлением пуромицина (1 пг/мл) для отбора устойчивого клона, и объединяли 500-600 устойчивых клонов. Каждые 3-4 дня, около 0,5×105 клеток SHED высевали в чашку с культурой, имеющей диаметр 100 мм, для выполнения пассажа. SHED, в который были перенесены гены, назвали SHED-T, и SHED, в который не были перенесены гены, назвали SHED-C.
Пример 3
(1) Измерение скорости роста SHED-C и SHED-T
Статус времени удвоения популяции SHED-T (SHED, в который были перенесены гены) показан на фиг. 1. На фигуре вертикальная ось показывает количество удвоений популяции (количество клеточных делений, раз), и ось абсцисс показывает период времени (день культивирования). Стандартом оценки созревания было состояние, при котором SHED в культуре не делились в течение 1 месяца.
Рост SHED-C остановился на примерно 30 разе для вхождения в фазу созревания или завершения пролиферации. В отличие от этого, SHED-T превысили этот рост и пролифелировали после того, как прошло 800 дней.
(2) Анализ с использованием проточной цитометрии
Для получения суспензии отдельных клеток, монослой прилипающих клеток обрабатывали смесью трипсин/EDTA. К 2×105 клеткам добавляли моноклональные анти-STRO-1 антитела (1:100) и оставляли для анализа с использованием проточного цитометра FACS Calibur (Becton, Dickinson и компании). Когда относительный уровень флуоресценции был больше, чем 99%, по сравнению с контрольными антителами, относящимися к одному и тому же изотипу, экспрессия была позитивной. Как в SHED-T, так и в SHED-C клетки первичной культуры и позже пассированные клетки фиксировали и окрашивали FITC связывающими STRO-1 антителами. Затем анализировали с применением проточной цитометрии. Тест повторяли дважды. Доля STRO-1 положительных клеток в SHED-C составляла 27% при PD20, и уменьшилась на 15% при PD30 (фиг. 2(А) и (B)). Доля STRO-1 положительных клеток в SHED-T составляла 46% при PD20 и 41% при PD40, соответственно (фиг. 2(C) и (D)).
(3) Исследование дифференцирующей способности
Дифференцирующие способности SHED-C или SHED-T при PD0, PD10 и PD20 исследовали посредством способности формировать новую костную массу и гистологического окрашивания ткани.
Во-первых, 2,0×106 клеток SHED-С или SHED-Т смешивали с 40 мг керамического порошка гидроксиапатита/трикальцийфосфат (HA/TCP) (Olympus Corporation), и затем смесь инокулировали подкожно ниже дорсальной поверхности мыши с ослабленным иммунитетом 10-ти недельного возраста (NIH-bgnu-xid, самка, Harlan Sprague Dawley Inc.).
Через восемь недель после инокуляции, инокулянт извлекали и фиксировали с использованием 4% формалина для удаления солей кальция. Затем его буферировали с использованием раствора PBS, включающего 10% EDTA для заливки в парафин. Часть его хранили в 70% этаноле для заливки в смоле.
Парафиновый срез депарафинировали и гидратировали. После этого, срез окрашивали гематоксилином и эозином (здесь ниже обозначаются как "H&E"). На фиг. 5(А)-(С) показаны окрашенные изображения SHED-T (иммортализованные стволовые клетки) при PD0-PD20, и на фигурах (D)-(F) показаны окрашенные изображения SHED-C (нормальные клетки) при PD0-PD20. Для определения новорожденной формации in vivo, отбирали заданные положения и вычисляли площадь новорожденного и видимого участка для получения новорожденной массы этих значений для инокулянта, образованного после инокуляции SHED-T или инокуляции SHED-C.
Новорожденная масса = Новорожденная площадь/видимая площадь×100
На фиг. 4 показаны изменения новорожденной массы SHED-T и SHED-C при каждом количестве удвоения популяции (время удвоения). На фигуре, ** показывает, что р<0,05, *** показывает, что р<0,01. Следует отметить, что новорожденная масса была получена с помощью следующего уравнения.
Как показано на фиг. 4, новорожденная масса уменьшалась в зависимости от увеличения удвоений популяции SHED-C, и уменьшалась до значения около 1/5 при PD20 по сравнению со значением при PD0. В отличие от этого, костная масса не изменялась при PD20 в SHED-T, и костная масса в SHED-T была в 5 раз больше, чем у SHED-C при PD20.
(4) Оценка активности развития злокачественной опухоли
1×106 клетки SHED-C или клетки SHED-T инокулировали в подкожную ткань мышам с ослабленным иммунитетом. После инокуляции, проводили наблюдение в течение более чем 30 дней. Тем не менее, опухоль не была сформирована в течение срока наблюдения у любой из мышей, которым были пересажены клетки. Кроме того, все клоны культивируемых клеток не показали морфологического изменения в пределах от 40 до 200 PD в клетках SHED-Т.
Тем самым было показано, что SHED-T не обладают активностью развития злокачественной опухоли.
(5) Оценка
Было показано, что SHED-T обладают пролиферативной способностью, поддерживая способность к дифференциации даже после 260PD. Тем не менее, SHED-C обладает способностью дифференциации, но уже в течение не более чем 30PD.
Как описано выше, было показано, что SHED-T превращаются в иммортализованные стволовые клетки и подходят для крупномасштабного производства супернатанта SHED, обладающего более высокой активностью.
Пример 4
(1) Лечебное действие в отношении лучевой язвы в цервикальной области
64-летнему пациенту со злокачественной опухолью языка (мужчина) в правой части языка (T3N0M0) была выполнена резекция половины языка. Через 6 месяцев, поскольку был выявлен метастаз в лимфоузле правой стороны шеи, выполняли облучение в дозе 60 Гр и тотальное рассечение шеи. Через 3 недели после рассечения, наблюдали неполное заживление раны от подчелюстной области до шеи, и образование язвы (фиг. 3(A)). Соответственно был поставлен диагноз: лучевая язва шеи.
Для облегчения заживления раны, в слой марли размером, который обеспечивает покрытие пораженного участка, помещали 10 мл культурального раствора SHED-T, полученного описанным выше способом. Затем его прикрепляли на пораженный участок. Через два дня марлю с культуральным раствором меняли 14 раз. Через 1 месяц, язва заживилась (фиг. 3(В)). Исходя из вышеизложенного, было показано, что культуральный раствор оказывает лечебный эффект на язву.
(2) Лечебное действие в отношении пролежня
Пролежень, образовавшийся в бедре 60-летнего мужчины, обрабатывали культуральным раствором SHED-T. Мужчина 2 года назад перенес инсульт, и возникла гемиплегия. Для того чтобы вылечить пролежни, он пришел в нашу больницу.
Грануляционная ткань с инфекцией (фиг. 6(А)) была полностью удалена; для покрытия пораженного участка наносили 10 мл культурального раствора SHED-Т без разведения. Марлю меняли каждый день. Через 2 недели сформировался новый эпидермис от края кожи с покрытием пораженного участка (фиг. 6(B)).
Исходя из вышеизложенного, было показано, что культуральный раствор имел лечебный эффект на язву и пролежень.
Пример 5
(1) Лечебное действие культурального раствора SHED-Т в области стоматологии
Лечебные эффекты культурального раствора SHED-T в области стоматологии исследовали в 28 участках всех 16 пациентов (возраст 35-70), включая 11 мужчин и 5 женщин.
Случаи заболевания распределялись следующим образом: 14 пациентов (18 участков) имели отношение к имплантату, и 7 пациентов (10 участков) имели отношение к пародонтозу. Случаи заболевания пациентов, имеющих отношение к имплантату, распределялись следующим образом: 11 пациентов имели отношение к направленной костной регенерации (GBR) - сохранение лунки зуба (15 участков), и 3 пациента имели отношение к синус-лифтингу (3 участка).
В настоящем описании процедура GBR (направленная костная регенерация) является методом лечения для ускорения регенерации костной ткани, например, пораженной альвеолярной кости, челюсти и тому подобное. Ее применяют в случаях, когда имеется недостаточное количество костной ткани для встраивания имплантата. Кроме того, сохранение лунки зуба представляет собой способ регенерации кости путем вставки искусственной кости и т.п. в "отверстие" в момент удаления зуба для предотвращения резорбции кости.
Синус-лифтинг (поднятие дна верхнечелюстной пазухи) выполняется в случае, когда верхнечелюстная пазуха внутри верхней челюсти увеличена, и толщина определенной части альвеолярной кости становится недостаточной для введения имплантата. Это метод включает надавливание на нижнюю стенку верхнечелюстной пазухи, введение костного трансплантата или костного протезного материала (в последнее время используют часть тела имплантата) в область верхнечелюстной пазухи, имеющей недостаточную толщину.
Оценку исследуемых случаев выполняли на 26 участках до сентября 2011 с использованием рентгенограммы (включая КТ) на 3 месяц или 6 месяц после операции. Их оценивали на следующие 5 классов. Результаты показаны в таблице 6, фиг. 7(А)-7(F), фиг. 8(А)-8(B) и фиг. 9(А)-9(B).
На фиг. 7(A) отмечено, что порошкообразный β-TCP был уложен на участке, указанном белой стрелкой. В отличие от этого, на фиг. 7(C) структура аналогичного участка, указанного стрелкой, изменилась с превращением в бесструктурную, такую же, как и костная ткань, расположенная на участке ниже. Таким образом, продемонстрировано способствование формированию костной ткани.
Кроме того, наблюдалось, что грануляционная ткань образовывалась на участке, отмеченном белой стрелкой, но костная ткань и незрелая кость не образовывались на участке, отмеченном черной стрелкой на фиг. 7(D). В отличие от этого, было подтверждено, что участок, отмеченный черной стрелкой, становился зрелой костью и способствовал остеогенезу, как показано на фиг. 7(F).
Исходя из вышеизложенного, было подтверждено способствование остеогенезу в области стоматологии.
5 (замечательно): остеогенез было выявлен на более 30% дефектного участка
4 (эффективно): остеоанагенез был выявлен на дефектном участке (менее чем приблизительно 30%)
3 (без изменений): остеоанагенез не был ясен, но какая-то резорбция костной ткани
2 (резорбция): был выявлена резорбция костной ткани
1 (плохо): протекала тяжелая костная резорбция или было неблагоприятное событие
Таблица 6
Из 28 случаев случаи № 27 и 28 не были оценены, потому что не было времени для их оценки. Из всех оцененных случаев (26 случаев) замечательных (5) было 10 случаев (38,5%), эффективных (4) было 7 случаев (26,9%), никаких изменений (3) было 8 случаев (30,8%), резорбции (2) был 1 случай (3,8%), и отрицательный эффект (1) было 0 случаев.
Сумма замечательных и эффективных случаев составляла 17 (65,4%), и частота ответа была высокой.
В детализации каждого заболевания, замечательных (5) было 9 (52,9%), в случаях, относящихся к имплантатам эффективных (4) было 4 (23,5%), без изменений (3) было 3 (17,7%), резорбции (2) был 1 (5,9%) и неблагоприятное событие (1) 0. Таким образом, в случаях имплантатов, сумма замечательных и эффективных случаев составляла 13 (79,4%), и частота ответа была очень высокой.
В 9 случаях, относящихся к пародонтозу, замечательных был 1 (11,1%), эффективных было 3 (33,3%), без изменений было 5 (55,6%), и резорбции и неблагоприятного события не было ни одного. В случаях, относящихся к пародонтозу, сумма замечательных и эффективных случаев составляла 4 (44,4%), и частота ответа была хорошей.
Кроме того, в зависимости от матрицы, в 8 случаях, имеющих β-TCP матрицу, замечательных было 4 (50,0%), эффективных было 3 (37,5%), без изменений и неблагоприятного события не было ни одного, и резорбции был 1 (12,5%). Когда β-TCP был использован в качестве матрицы, сумма замечательных и эффективных случаев была 7 (87,5%), и частота ответа была превосходной.
В 18 случаях, Terudermis или Teruplug (Col) был использован в качестве матрицы, и замечательных было 6 (33,3%), эффективными оказались 4 (22,2%), никаких изменений не было 8 (44,5%), резорбции было 1 (0,1%), и неблагоприятного события не было. При использовании в качестве матрицы Terudermis или Teruplug (Col) сумма замечательных и эффективных случаев была 10 (55,5%), и частота ответа была высокой.
В случае имплантатов, как показано на фиг. 7-9, все случаи показали регенерацию костной ткани.
Кроме того, при использовании в качестве матрицы β-TCP, с использованием окрашивания ткани гематоксилином и эозином было показано, как происходила замена β-TCP на костную ткань и тому подобное. Результаты показаны на фиг. 10(А)-(D). На фигуре отчетливо наблюдалось образование новой костной ткани, как показано NB, а также было выявлен кровеносный сосуд, как показано BV.
Исходя из вышеизложенного, было подтверждено, что культуральный раствор SHED-T обладает остеогенезной активностью.
Пример 6
(1) Интраназальное введение цитокинов, полученных из стволовых клеток пульпы зуба пациенту с нарушениями мозгового кровообращения
Для изучения действия лечения 8 пациентам, страдающим каким-либо видом ишемии в сером веществе, ишемии в белом веществе или ишемии в смешанной области (6 мужчин, 2 женщины) вводили культуральный раствор SHED-T. Перед началом данного клинического исследования все восемь пациентов получали стандартное лечение. Они были продиагностированы с помощью МРТ, и прошли неврологический тест и их оценивали по балльной шкале NIHSS. Для пациентов, указанных в таблице 1, прошло от 20 до 133 дней после развития симптомов ишемии. Сведения о пациентах представлены в следующей таблице 7.
SHED-CM (культуральный раствор SHED-T), приготовленный в примере 1, поступал путем интраназального введения с участка, где расположены обонятельные нервы в полости носа (фиг. 11 и 12). Период введения отсчитывали от начала введения.
Таблица 7 | |||||||||
№ | Пациент | Пол | Возраст | Симптом | Дата появления | Начальная дата | Дата перед началом (день) | Стадия | Результат |
1 | DM | M | 31 | гемиплегия | 2010/3/24 | 2011/4/9 | 381 | хроническая | без изменений |
2 | TK | M | 58 | гемиплегия | 2011/3/22 | 2011/4/9 | 20 | острая | заметный |
3 | NO | M | 72 | гемиплегия | 2007/6/1 | 2011/4/11 | 1410 | хроническая | без изменений |
4 | YS | F | 70 | гемиплегия | 2010/9/1 | 2011/5/9 | 250 | хроническая | без изменений |
5 | IM | M | 58 | гемиплегия | 2010/9/27 | 2011/9/6 | 344 | хроническая | без изменений |
6 | AU | F | 72 | гемиплегия | 2010/3/25 | 2011/9/19 | 543 | хроническая | без изменений |
7 | MK | M | 55 | гемиплегия | 2010/11/6 | 2011/10/8 | 336 | хроническая | без изменений |
8 | KT | M | 60 | гемиплегия | 2010/12/10 | 2011/1/10 | 31 | острая | заметный |
Статусы восстановления оценивали нейрохирургом или невропатологом на момент времени 1 день, 2 дня, 4 дня, 7 дней, 14 дней, 1 месяц, 3 месяца, 6 месяцев и 1 год от начала приема. Слепой тест не проводили. Для всех пациентов проводили МРТ и МРА головного мозга. МРА называется магнитно-резонансной ангиографией, и она является исследованием по определению состояние кровеносных сосудов в пространственном изображении. Изображение МРА и изображение МРТ одного пациента показаны на фиг. 13 или фиг. 14, соответственно.
Уровень кислорода крови, температура тела, артериальное давление, частота сердечных сокращений, частота дыхания и т.п. до и после введения культурального раствора SHED-T тщательно контролировали с помощью электрокардиограммы. До и после введения также делали рентген грудной клетки.
Перед интраназальным введением SHED-CM и спустя 1 год всем пациентам делали магнитно-резонансную ангиографию для определения сосудистого участка, и наблюдаемое изображение фотографировали с использованием цветной ядерной магнитно-резонансной томографии (МРТ). Неврологический статус оценивали по шкале инсульта Национального института здоровья (NIHSS).
У 2 из 8 пациентов (оба были в острой фазе) было обнаружено заметное восстановление по стандарту NIH и изображению МРТ (фиг. 15(А) и 15(В) и фиг. 16). Пациент № 2 восстановился до такой степени, что мог переставлять чашки парализованной правой рукой, как показано на фиг. 17(A), и стать амбулаторным пациентом, как показано на фиг. 17(B).
Ни у кого из пациентов, получавших лечение SHED-CM, не наблюдалось образования опухоли, аномального роста клеток в центральной нервной системе и неврологического повреждения. Кроме того, ни у кого из пациентов не было каких-либо проблем в носовой полости, системной злокачественной опухоли и системного инфекционного заболевания.
Исходя из вышеизложенного, было показано, что культуральный раствор может быть неограниченно получен с использованием иммортализованных стволовых клеток. Кроме того, было показано, что когда получают фармацевтический препарат с использованием данного культурального раствора, это позволяло продуцировать большое количество факторов роста. Таким образом, имеется преимущество в том, что это позволяет снизить производственную стоимость фармацевтического препарата.
Как указано выше, можно поддерживать количество содержимого и типы факторов роста в растворе клеток почти постоянным, поскольку конкретные иммортализованные стволовые клетки используется в качестве источника клеток, и стволовые клетки продолжают устойчиво продуцировать конкретные факторы роста. Таким образом, имеется преимущество в том, что компоненты, содержащиеся в культуральном растворе легко стандартизировать, когда раствор производится в больших масштабах.
Пример 7
(1) Интраназальное введение цитокинов, полученных из стволовых клеток пульпы зуба пациентам с болезнью Альцгеймера
SHED-T интраназально вводили пациентам с болезнью Альцгеймера для изучения эффекта лечения. Средний возраст пациентов, 3 женщин, были 79,5±3.
Культуральный раствор SHED-T вводили интраназально один раз в день всего 28 раз. Результаты введения оценивали с использованием теста минимальной оценки психического состояния и шкалы деменции Hasegawa, показанных в следующих таблицах 8 и 9.
Как показано на фиг. 18(A), в группе без введения не было большого улучшения, даже когда для оценки был использован либо тест MMS, либо Hasegawa.
В отличие от этого, в группе, которой вводился культуральный раствор SHED-T, значение индекса начало увеличиваться через 3 месяца. Через 7 месяцев степень повышения становилась больше в обоих тестах MMS и Hasegawa по достижению облегчения симптомов болезни Альцгеймера.
В группе пациентов, у одной 78 летней пациентки с болезнью Альцгеймера было показано заметное улучшение. У пациентки был инфаркт мозга 11 мая, период Хэйсэй 22 (2010 год), и появилась серьезная амнезия (Cornell Medical Index (Корнелльский медицинский опросник): CMI=27). Поэтому она пришла в профилактическое учреждение 20 декабря, период Хэйсэй 22.
С 9 февраля, период Хэйсэй 23 (2011 год), культуральный раствор SHED-T вводили интраназально один раз в день всего 28 раз. Затем результаты ведения оценивали с использованием теста минимальной оценки психического состояния и шкалы деменции Hasegawa, показанных в таблицах 8 и 9. Было обнаружено превосходное улучшение высшей функции мозга. Поскольку пациент выздоровел достаточно, чтобы самостоятельно готовить и ходить, его выпустили из профилактического учреждения и возвратили в собственный дом 16 апреля, период Хэйсэй 23.
Таблица 8 | |
Вопросы теста минимальной оценки психического состояния (Mini Mental State:MMS) | |
Вопросы | Вопросы |
1. Дата и время (5 баллов) - Какой сейчас год? - Какое сейчас время года? - Какой сегодня день недели? - Какое сегодня число? |
7. Чтение символов (1 балл) - Повторите следующую фразу “Каждый рисует чистый берег вместе” |
2. Местоположение в настоящее время (5 баллов) - Из какой Вы префектуры? - Из какого Вы города? - В какой Вы больнице? - Из какого вы района? |
8. Понимание инструкций (3 балла) - Следующие 3 инструкции даны три раза устно, выполнены после того, как услышаны “Возьмите бумагу в правую руку” “Сложите бумагу пополам” “Положите ее на стол” |
3. Запоминание - Три названия предметов, не связанные друг с другом, даются пациенту, и ему/ей предлагается точно повторить 1 балл дан 1 ответ Если нет верных ответов, повторяют 6 раз |
9. Понимание изречения (3 балла) - После прочтения изречения, выполнить его “Закройте глаза” |
4. 7 серий - Последовательно вычесть 7 из 100 5 баллов дается за выполнение за 5 раз Остановка, когда делается ошибка |
10. Написание предложения (1 балл) - Пожалуйста, напишите какое-нибудь предложение. |
5. Память (3 балла) - предлагается опять повторить названия товаров, предложенных в пункте 3 |
11. Копирование фигур - Скопируйте следующие фигуры |
6. Названия (2 балла) - Пациенту по очереди показывают часы и карандаш, и предлагается ему/ей их назвать |
Таблица 9
Исходя из вышеуказанного, культуральный раствор SHED-T обладает превосходным эффектом в случае болезни Альцгеймера.
Пример 8
(1) Лечебный эффект культурального раствора SHED-T в отношении гепатита
Радикальным лечением серьезного заболевания печени, такого как декомпенсированный цирроз и т.п., является пересадка печени. Тем не менее, осуществляется также симптоматическая терапия, ввиду таких причин, как нехватка доноров и т.п. Для того чтобы решить эту проблему, была проведена регенерационная терапия печени путем введения факторов роста, полученных из иммортализованных стволовых клеток молочных зубов (SHED-T).
Субъектами были 3 пациента, мужчины без активного периода гепатомы (58 до 70 лет), но с классификацией по Child-Pugh не менее 7, общим билирубином не более 3,0 мг/дл, и количеством тромбоцитов не менее 5,0×1010, как представлено в таблице 10. Следует отметить, что у пациентов была хроническая фаза инфаркта головного мозга, и они проходили лечение от болезни Паркинсона (не менее 1 года прошло с момента появления симптомов).
По протоколу факторы роста, полученные из иммортализованных стволовых клеток молочных зубов (2 мкг), разводили в 5 мл физиологического раствора и вводили интраназально каждый день. 1 курс составлял 28 раз, и осуществляли 2 курса.
Подробности описания заболевания и результаты представлены в таблице 11.
Таблица 10 | ||||
1 балл | 2 балла | 3 балла | ||
Энцефалопатия печени | Нет | легкая | Частая кома | |
Асциты | Нет | немного | среднее | |
Билирубин в сыворотке крови (г/дл) | не более 2,0 | 2,0-3,0 | более 3,0 | |
Сывороточный альбумин (г/дл) | более 3,5 | 2,8-3,5 | не более 2,8 | |
Протромбиновое время (%) | более 70 | 40-70 | не более 40 | |
Классификация по Child-Pugh | A 5-6 баллов | |||
B 7-9 баллов | ||||
C 10-15 баллов |
Таблица 11 | |||||||||
№ | Пациент | Возраст | Название болезни | Перед операцией | Через 12 месяцев | ||||
(мг/дл) | (мг/дл) | ||||||||
CP*1 | TP*2 | Alb*3 | CP*1 | TP*2 | Alb*3 | ||||
1 | A | 70 | Алкогольный гепатит | 7 | 7,5 | 2,8 | 5 | 8,5 | 3,4 |
2 | B | 58 | гепатит B | 7 | 6,5 | 2,9 | 5 | 8,0 | 3,5 |
3 | C | 65 | неизвестно | 7 | 5,0 | 2,4 | 5 | 6,5 | 3,8 |
*1: значение по Child-Pugh *2: общий белок *3: альбумин |
(2) Результаты
У всех пациентов как содержание общего белка, так и уровень сывороточного альбумина повышались, и CP изменялось от класса B до класса А. Поэтому считалось, что печень восстанавливается.
Пример 9
(Действие лечения культуральным раствором SHED-T в отношении сахарного диабета II типа)
Изучали действие лечения с помощью SHED-T в отношении сахарного диабета II типа. По протоколу факторы роста, полученные из иммортализованных стволовых клеток молочных зубов (2 мкг), разводили в 5 мл физиологического раствора и вводили интраназально каждый день. 1 курс составлял 28 раз, и осуществляли 2 курса.
Результаты оценивали по изменению HbAlc (гликированный гемоглобин) в качестве показателя перед лечением и через 12 недель после начала. Следует обратить внимание, что любые неблагоприятные события, такие как головная боль, риналгия, колебания глюкозы в крови и т.п., у пациента не обнаруживались. Кроме того, всем пациентам вводили метформин в качестве внутренней медицины и применяли кинезиологию. Тем не менее, каких-либо эффектов не наблюдалось.
Таблица 12 | ||||||
№ | Пациент | Возраст | История болезни | BMI | Перед лечением | Спустя 12 недель |
(лет) | (кг/м2) | HbAlc (%) | HbAlc (%) | |||
1 | F | 51 | 5 | 32,2 | 8,6 | 6,9 |
2 | M | 52 | 6 | 32,3 | 8,23 | 7,0 |
3 | M | 60 | 4 | 31,0 | 8,5 | 6,5 |
У всех пациентов HbAlc (%) снижался по сравнению с началом лечения, и показания сахарного диабета были улучшены. Исходя из вышеизложенного, было показано, что SHED-Т также обладает действием в отношении сахарного диабета.
Пример 10
(Действие лечения культуральным раствором SHED-T в отношении не поддающихся лечению кожных заболеваний)
SHED-T (2 мкг) разводили в 5 мл физиологического раствора и наносили на пораженную область у собаки (лабрадор ретривер, 8 лет, самка) с не поддающимся лечению кожным заболеванием (атопический дерматит) один раз в день. 1 курс составлял обработку 14 раз.
Перед использованием SHED-T в течение 2 месяцев вводили препарат интерферона-γ собаке, но эффект от лечения не был достигнут. Поэтому препарат был заменен на SHED-T.
Перед началом лечения SHED-T, как показано на фиг. 19А, пораженные участки выглядели белыми из-за выпадения волос. После лечения волосы отросли, и пораженные участки были полностью излечены до такой степени, что трудно было распознать, на каком участке был дерматит.
Исходя из вышеизложенного, было показано, что SHED-T обладает положительным действием в отношении не поддающихся лечению кожных заболеваний.
Промышленная применимость
Настоящее изобретение может быть использовано при получении фармацевтического препарата, используемого в области медицины и стоматологии.
Таблица 6 | ||||||||||
№ | Пациент | Возраст | Пол | Участок | Операция | Дата операции | Время (месяц) | Структура | Оценка | Неблагоприятное событие |
1 | HS | 46 | F | ⎣56 | остеоанагенез | 2011.2.11 | 11M | искусственная костная ткань | 5 | Нет |
2 | KT | 60 | M | ⎡6 | остеоанагенез | 2011.5.16 | 8M | коллаген | 3 | Нет |
3 | KT | 60 | M | 2⎦ | остеоанагенез | 2011.5.16 | 8M | коллаген | 4 | Нет |
4 | YF | 40 | M | ⎡7 | остеоанагенез | 2011.5.23 | 8M | коллаген | 3 | Нет |
5 | YF | 40 | M | ⎡6 | регенерация* | 2011.5.23 | 8M | коллаген | 3 | Нет |
6 | HN | 35 | M | 7⎤ | остеоанагенез | 2011.5.30 | 8M | искусственная костная ткань | 4 | Нет |
7 | TO | 45 | F | ⎡56 | остеоанагенез | 2011.5.30 | 8M | искусственная костная ткань | 4 | Нет |
8 | TY | 70 | M | 1⎦ | остеоанагенез | 2011.6.13 | 7M | коллаген | 4 | Нет |
9 | AM | 66 | M | 43⎤ | регенерация* | 2011.6.13 | 7M | коллаген | 3 | Нет |
10 | TT | 51 | F | 7⎤ | остеоанагенез | 2011.6.25 | 7M | коллаген | 5 | Нет |
11 | TS | 59 | M | ⎣7 | остеоанагенез | 2011.7.4 | 6M | искусственная костная ткань | 5 | Нет |
12 | TS | 59 | M | ⎣6 | регенерация* | 2011.7.4 | 6M | искусственная костная ткань | 4 | Нет |
13 | EO | 59 | F | ⎡45 | регенерация* | 2011.7.25 | 6M | коллаген | 3 | Нет |
14 | EO | 59 | F | ⎣67 | регенерация* | 2011.7.25 | 6M | коллаген | 4 | Нет |
15 | NK | 58 | M | ⎡567 | остеоанагенез | 2011.8.1 | 5M | коллаген | 5 | Нет |
16 | HS | 67 | F | ⎡5 | остеоанагенез | 2011.8.8 | 5M | коллаген | 5 | Нет |
17 | HS | 67 | F | 5⎤ | остеоанагенез | 2011.8.8 | 5M | коллаген | 5 | Нет |
18 | HS | 67 | F | 7⎤ | остеоанагенез | 2011.8.8 | 5M | искусственная костная ткань | 5 | Нет |
19 | KM | 51 | M | 7⎤ | остеоанагенез | 2011.8.8 | 5M | коллаген | 5 | Нет |
20 | MK | 63 | M | 1⊥1 | остеоанагенез | 2011.8.29 | 5M | искусственная костная ткань | 2 | Нет |
21 | HM | 61 | M | ⎡67 | регенерация* | 2011.8.29 | 5M | коллаген | 4 | Нет |
22 | HM | 61 | M | 76⎦ | регенерация* | 2011.8.29 | 5M | коллаген | 5 | Нет |
23 | TS | 59 | M | 6⎦ | регенерация* | 2011.8.30 | 5M | коллаген | 3 | Нет |
24 | TS | 59 | M | 6⎤ | регенерация* | 2011.8.30 | 5M | коллаген | 3 | Нет |
25 | TS | 59 | M | 7⎤ | остеоанагенез | 2011.8.30 | 5M | коллаген | 3 | Нет |
26 | TH | 64 | M | ⎣567 | остеоанагенез | 2011.9.13 | 4M | искусственная костная ткань | 5 | Нет |
27 | NK | 58 | M | 7⎤ | регенерация* | 2012.1.23 | 0M | коллаген | - | Нет |
28 | TY | 70 | M | 1⎦ | остеоанагенез | 2012.1.24 | 0M | искусственная костная ткань | - | Нет |
* регенерация пародонта |
Таблица 9 | |||||
№ | Вопросы | Ответы | № | Вопросы | Ответы |
1 | Сколько вам лет? (Ошибка в 2 года является приемлемой) |
○ Правильно 1 ○ Неправильно 0 |
6 | Произнесите, пожалуйста, сказанное число в обратном порядке. Предложите "скажете числа 6-8-2, 3-5-2-9" в обратной последовательности. Если пациент не произнесет в обратном порядке с 3 попыток, завершите тест. |
Для каждого, ○ Правильно 1 ○ Неправильно 0 |
2 | Какой сегодня день какого года? Какой день недели сегодня? (Если год, месяц, день и день недели будут правильны, 1 балл дается каждому правильному ответу.) |
Год, месяц, день и день недели, для каждого ○ Правильно 1 ○ Неправильно 0 |
|||
7 | Скажите снова, пожалуйста, слова, которые вы запоминали. Самостоятельный ответ, даются 2 балла за каждый. Если нет ответа, предоставляются следующие подсказки. Дается 1 балл за правильный ответ. Подсказка: а) растение, b) животное, c) транспортное средство |
Для каждого a), b) и c) ○ Правильно (самостоятельно) 1 балл ○ Правильный ответ с подсказкой 1 балл ○ Неправильный ответ 0 |
|||
3 | Где мы находимся? (Если ответ дается самостоятельно, присваиваются 2 балла. Если нет, выжидается 5 секунд; дается подсказка, "Ваш дом? Больница? Медицинское учреждение?" Если он/она выбирает правильно одно, дается 1 балл.) |
○ Ответ дается самостоятельно 2 ○ Ответ дан с подсказкой 1 ○ Неправильный ответ 0 |
4 | Повторите, пожалуйста, 3 слова, которые я скажу. Кроме того, поскольку я повторю ту же самую просьбу, пожалуйста, запомните. Скажите одно из следующих. 1): а) сакура, b) кошка, c) поезд. 2): а) слива, b) собака, с) велосипед. |
Для каждого a), b) и c) ○ Правильно 1 ○ Неправильно 0 |
8 | Сейчас я покажу вам 5 предметов и спрячу их. Скажите, пожалуйста, что вы видели. Предложить несвязанные между собой предметы, такие как часы, табак, ключ, ручка, монета и т.п. |
○ 5 правильно 5 ○ 4 правильно 4 ○ 3 предмета правильно 3 ○ 2 предмета правильно 2 ○ 1 предмет правильно 1 ○ нет, неправильный ответ 0 |
5 | Пожалуйста, последовательно вычтите 7 из 100. Задайте вопросы, такие как 'вычесть из 100? Тогда снова вычесть 7? Если первый ответ неправильный, тест завершают. | Для каждого одного, ○ Правильный ответ 1 ○ Неправильный ответ 0 |
9 | Назовите, пожалуйста, как можно больше названий овощей. Напишите названия растений на листке. Если пауза становится более 10 секунд, этот тест завершают. |
○ 10 названий вспомнено 5 ○ 9 названий вспомнено 4 ○ 8 названий вспомнено 3 ○ 7 названий вспомнено 2 ○ 6 названий вспомнено 1 ○ не более 5 названий 0 |
Claims (33)
1. Иммортализованная стволовая клетка, полученная путем: выделения стволовой клетки из клеток млекопитающих, выбранных из группы, состоящей из стволовой клетки пульпы зуба, умбиликальной стволовой клетки и адипозной стволовой клетки, осуществления первичного культивирования указанной стволовой клетки для получения указанных первично культивированных стволовых клеток; трансфекции 4 генов, hTERT, bmi-1, Е6 и Е7, в указанную первично культивированную стволовую клетку для получения подвергшихся трансдукции гена клеток; и отбора из указанных подвергшихся трансдукции гена клеток иммортализованной стволовой клетки с использованием следующих показателей, где
по меньшей мере 40% от числа клеток являются экспрессирующими STRO-1 клетками, обладающими способностью к продукции неонатальной костной ткани, равной таковой первичных культивированных клеток с числом удвоения популяции, равным 20,
клетки обладают способностью репарации теломеров, и
клетки обладают способностью к делению, позволяющей им делиться по меньшей мере 200 раз.
2. Иммортализованная стволовая клетка по п. 1, где указанная стволовая клетка представляет собой любую из зуба, выбранного из группы, состоящей из естественно отторгнутых молочных зубов, выпавших постоянных зубов, удаленных молочных зубов и удаленных постоянных зубов.
3. Иммортализованная стволовая клетка по п. 1, где указанное млекопитающее выбрано из группы, состоящей из человека, свиньи, лошади и обезьяны.
4. Иммортализованная стволовая клетка по п. 3, где указанная иммортализованная стволовая клетка секретирует в супернатант культуры по меньшей мере IGF-1, VEGF, TGF-β1 и HGF.
5. Фармацевтическая композиция для восстановления поврежденных тканей, содержащая указанный супернатант культуры указанной иммортализованной стволовой клетки по любому из пп. 1-4.
6. Фармацевтическое средство для восстановления поврежденных тканей, содержащее указанную фармацевтическую композицию по п. 5.
7. Фармацевтическое средство для восстановления поврежденных тканей по п. 6, причем лекарственная форма указанного фармацевтического средства для восстановления поврежденных тканей является формой, выбранной из группы, состоящей из формы порошка, формы жидкости, формы геля, формы спрея и формы чрескожной системы.
8. Фармацевтическое средство для восстановления поврежденных тканей по п. 6, где указанная поврежденная ткань представляет собой любую ткань, выбранную из группы, состоящей из ткани, поврежденной язвой или пролежнем, ткани головного мозга, поврежденной клеточной дегенерацией, ткани головного мозга, поврежденной травматическим заболеванием головного мозга, ткани головного мозга, поврежденной воспалительным заболеванием головного мозга, поврежденной костной ткани, поврежденного периодонта и ткани, поврежденной не поддающимся лечению кожным заболеванием.
9. Фармацевтическое средство для восстановления поврежденных тканей по п. 8, где указанная дегенерация клеток вызвана заболеванием, выбранным из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, церебрального инфаркта, мозжечковой дегенерации, сахарного диабета и гепатита.
10. Фармацевтическое средство для восстановления поврежденных тканей по п. 8, где указанное травматическое заболевание головного мозга вызвано дорожно-транспортным происшествием или падением.
11. Фармацевтическое средство для восстановления поврежденных тканей по п. 8, где указанное воспалительное заболевание мозга является заболеванием, выбранным из группы, состоящей из энцефалитного заболевания мозга, эпилепсии, болезни Якоба и полиомиелита.
12. Фармацевтическое средство для восстановления поврежденных тканей по п. 8, где указанным не поддающимся лечению кожным заболеванием является атопический дерматит.
13. Фармацевтическое средство для восстановления поврежденных тканей по любому из пп. 6-12, где
иммортализованная стволовая клетка получена с использованием способа, включающего стадии:
выделения стволовой клетки из клеток млекопитающих, выбранных из группы, состоящей из стволовой клетки пульпы зуба, умбиликальной стволовой клетки и адипозной стволовой клетки;
осуществления первичного культивирования указанной стволовой клетки для получения указанных первично культивированных стволовых клеток;
трансфекции 4 генов, hTERT, bmi-1, Е6 и Е7, в указанную первично культивированную стволовую клетку для получения подвергшихся трансдукции гена клеток; и
отбора из указанных подвергшихся трансдукции гена клеток иммортализованной стволовой клетки с использованием следующих показателей, где
по меньшей мере 40% от числа клеток являются экспрессирующими STRO-1 клетками, обладающими способностью к продукции неонатальной костной ткани, равной таковой первичных культивированных клеток с числом удвоения популяции, равным 20,
клетки обладают способностью репарации теломеров, и
клетки обладают способностью к делению, позволяющей им делиться по меньшей мере 200 раз.
14. Способ продуцирования иммортализованной стволовой клетки, включающий стадии:
выделения стволовой клетки из клеток млекопитающих, выбранных из группы, состоящей из стволовой клетки пульпы зуба, умбиликальной стволовой клетки и адипозной стволовой клетки;
осуществления первичного культивирования указанной стволовой клетки для получения указанных первично культивированных стволовых клеток;
трансфекции 4 генов, hTERT, bmi-1, Е6 и Е7, в указанную первично культивированную стволовую клетку для получения подвергшихся трансдукции гена клеток; и
отбора из указанных подвергшихся трансдукции гена клеток иммортализованной стволовой клетки, где по меньшей мере 40% от числа клеток являются экспрессирующими STRO-1 клетками, обладающими способностью к продукции неонатальной костной ткани, равной таковой первичных культивированных клеток с числом удвоения популяции, равным 20,
клетки обладают способностью репарации теломеров, и
клетки обладают способностью к делению, позволяющей им делиться по меньшей мере 200 раз.
15. Способ получения иммортализованной стволовой клетки по п. 14, где указанная стволовая клетка представляет собой клетку зуба, выбранного из группы, состоящей из естественно отторгнутых молочных зубов, выпавших постоянных зубов, удаленных молочных зубов и удаленных постоянных зубов.
16. Способ получения иммортализованной стволовой клетки по п. 15, где млекопитающим является животное, выбранное из группы, состоящей из человека, свиньи, лошади и обезьяны.
Applications Claiming Priority (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012-073594 | 2012-03-28 | ||
JP2012073594 | 2012-03-28 | ||
JP2012187321 | 2012-08-28 | ||
JP2012-187321 | 2012-08-28 | ||
JP2012275169 | 2012-12-17 | ||
JP2012-275169 | 2012-12-17 | ||
JP2013-026886 | 2013-02-14 | ||
JP2013026886 | 2013-02-14 | ||
PCT/JP2013/059376 WO2013147082A1 (ja) | 2012-03-28 | 2013-03-28 | 不死化幹細胞及びその産生物を有効成分とする医薬組成物並びに医薬製剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014143266A RU2014143266A (ru) | 2016-05-20 |
RU2619221C2 true RU2619221C2 (ru) | 2017-05-12 |
Family
ID=49260325
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014143266A RU2619221C2 (ru) | 2012-03-28 | 2013-03-28 | Иммортализованная стволовая клетка и лекарственная композиция и лекарственный препарат, содержащие ее в качестве активного ингредиента |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20150203821A1 (ru) |
EP (1) | EP2832851B1 (ru) |
JP (1) | JP6010112B2 (ru) |
KR (2) | KR101930718B1 (ru) |
CN (2) | CN104321426A (ru) |
CA (1) | CA2868251C (ru) |
IN (1) | IN2014DN08862A (ru) |
RU (1) | RU2619221C2 (ru) |
SG (1) | SG11201406141UA (ru) |
WO (1) | WO2013147082A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2679082C1 (ru) * | 2017-12-13 | 2019-02-05 | Общество с ограниченной ответственностью "Покровский банк стволовых клеток" | Способ извлечения пульпы зуба для получения культуры стволовых клеток |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20150108843A (ko) * | 2012-12-26 | 2015-09-30 | 가부시키가이샤 쿠오리맨 | 고기능 임플란트 재료 |
CN106102754B (zh) * | 2014-01-24 | 2020-04-17 | 石匠株式会社 | 癌治疗用医药组合物以及将该组合物作为有效成分的癌治疗用医药制剂 |
JP2017507123A (ja) * | 2014-01-27 | 2017-03-16 | ベイジン ストマトロジー ホスピタル,キャピタル メディカル ユニバーシティ | 歯原性幹細胞および遺伝的に改変された歯原性幹細胞の使用 |
JP2016150919A (ja) * | 2015-02-18 | 2016-08-22 | ピアス株式会社 | 塗布用化粧品組成物 |
JP2016210730A (ja) * | 2015-05-08 | 2016-12-15 | 上田 実 | 医薬組成物及びその製造方法並びに医薬品 |
CN105251053B (zh) * | 2015-09-23 | 2018-09-04 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种用于牙周组织修复的细胞复合体及其用途 |
JP6868565B2 (ja) * | 2015-11-05 | 2021-05-12 | 株式会社Cysay | 不死化幹細胞、及びその作製方法 |
JP6830768B2 (ja) * | 2016-06-16 | 2021-02-17 | 株式会社Cysay | 創傷被覆剤及び創傷被覆用シート |
JP6152205B1 (ja) * | 2016-08-09 | 2017-06-21 | 仁幸 小林 | 化粧品、医薬用組成物、およびそれらの製造方法 |
CN106267165A (zh) * | 2016-08-29 | 2017-01-04 | 楼秀余 | Hgh和igf‑1脂质体复合胶囊及其制备方法 |
TWI649422B (zh) * | 2016-12-30 | 2019-02-01 | 中國醫藥大學 | 成體多功能嗅幹細胞、其分離方法及其應用 |
FR3068366B1 (fr) * | 2017-06-30 | 2023-11-24 | Francais Du Sang Ets | Procede de production de progeniteurs erythroides |
KR20190015154A (ko) * | 2017-08-04 | 2019-02-13 | 주식회사 에스엘바이젠 | Trail 및 cd를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
KR20190015153A (ko) * | 2017-08-04 | 2019-02-13 | 주식회사 에스엘바이젠 | 간세포성장인자를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
CN108070567A (zh) * | 2018-01-19 | 2018-05-25 | 皓昇莱生物制药有限公司 | 一种永生化的尿液来源细胞株及其构建方法 |
JP6923137B2 (ja) * | 2018-06-15 | 2021-08-18 | 有限会社大阪空気機械サービス | 組織治癒剤 |
KR20200129266A (ko) * | 2019-05-08 | 2020-11-18 | 경상대학교산학협력단 | 치아 주변조직 유래 다분화능 줄기세포를 포함하는 남성 불임 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
CN110951683A (zh) * | 2020-01-06 | 2020-04-03 | 深圳华云生物科技发展有限公司 | 一种牙髓干细胞的制备方法 |
KR102572595B1 (ko) * | 2020-12-02 | 2023-08-31 | 충북대학교 산학협력단 | 불멸화 고양이줄기세포 또는 이의 엑소좀풍부배양액을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
KR102456805B1 (ko) * | 2020-12-02 | 2022-10-24 | 충북대학교 산학협력단 | 불멸화 개줄기세포 또는 이의 엑소좀풍부배양액을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
JPWO2022244851A1 (ru) * | 2021-05-19 | 2022-11-24 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
UA42726C2 (ru) * | 1993-05-24 | 2001-11-15 | Імм'Юнекс Корпорейшн | Выделенный полипептид, связывающий flt3, выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, связывающий flt3 (варианты), выделенный полинуклеотид, гибридизирующийся с таковым (варианты), вектор экспрессии (варианты), линия клеток-хозяев (варианты), способ получения полипептида, связывающего flt3 (варианты), фармацевтическая композиция, способ проведения аутологической трансплантации больному, получающему цитовосстановительную терапию, среда для размножения гемопоэтических клеток, способ трансфекции экзогенного гена в недиферинцированную раннюю гемопоэтическую клетку, способ переноса экзогенного гена млекопитающему, способ стимуляции пролиферации т-клеток у млекопитающего, способ стимуляции пролиферации клеток эритроидного ряда диференциирования в селезенке млекопитающего, способ лечения больного, имеющего симптомы миелодиспластического синдрома, способ лечения больного, имеющего симптомы анемии, способ лечения больного, имеющего симптомы синдрома приобретенного иммунодефицита, способ отделения клеток, имеющих рецептор flt3 на поверхности, от смеси клеток в суспензии, антитело, проявляющее иммунореактивность к полипептиду, связывающему flt3 |
WO2007149548A2 (en) * | 2006-06-22 | 2007-12-27 | Medistem Laboratories, Inc. | Treatment of erectile dysfunction by stem cell therapy |
WO2009061442A1 (en) * | 2007-11-06 | 2009-05-14 | Children's Medical Center Corporation | Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells form non-embryonic human cells |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030049236A1 (en) * | 2001-07-27 | 2003-03-13 | Arhus Amt | Immortalized stem cells |
JP3897717B2 (ja) * | 2002-04-23 | 2007-03-28 | オリンパス株式会社 | 細胞移植治療材料およびその製造方法 |
JP4831687B2 (ja) | 2004-07-23 | 2011-12-07 | 株式会社カネカ | 間葉系幹細胞から象牙芽細胞への分化誘導方法 |
CN101063150B (zh) * | 2007-04-24 | 2010-05-26 | 浙江大学 | 人端粒酶基因转导骨髓间充质干细胞的方法 |
JP2008307007A (ja) * | 2007-06-15 | 2008-12-25 | Bayer Schering Pharma Ag | 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞 |
CN101617043B (zh) * | 2007-10-31 | 2014-03-12 | 国立大学法人京都大学 | 核重编程方法 |
CA2697621C (en) * | 2008-07-30 | 2017-01-17 | Kyoto University | Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells |
JP2010046019A (ja) * | 2008-08-21 | 2010-03-04 | Toyama Univ | ヒト羊膜由来間葉系細胞及びこれを用いた糖尿病治療薬 |
CN102272292A (zh) * | 2008-09-22 | 2011-12-07 | 新加坡科技研究局 | 增加软骨形成祖细胞分化的方法 |
WO2010105257A2 (en) * | 2009-03-13 | 2010-09-16 | The Salk Institute For Biological Studies | Generation of mouse induced pluripotent stem cells bytransient expression of a single non- viral polycistronic vector |
CA2755870C (en) * | 2009-03-20 | 2019-04-09 | Angioblast Systems, Inc. | Production of reprogrammed pluripotent cells |
US20130195991A1 (en) * | 2010-03-26 | 2013-08-01 | National University Corporation Nagoya University | Composition for Treatment of Damaged Part |
JP6132459B2 (ja) * | 2011-07-13 | 2017-05-24 | 株式会社 バイオミメティクスシンパシーズ | 間葉系幹細胞の培養上清を含む腸炎の予防・治療剤 |
-
2013
- 2013-03-28 EP EP13769656.3A patent/EP2832851B1/en active Active
- 2013-03-28 CA CA2868251A patent/CA2868251C/en active Active
- 2013-03-28 KR KR1020177030820A patent/KR101930718B1/ko active IP Right Grant
- 2013-03-28 SG SG11201406141UA patent/SG11201406141UA/en unknown
- 2013-03-28 CN CN201380027178.9A patent/CN104321426A/zh active Pending
- 2013-03-28 WO PCT/JP2013/059376 patent/WO2013147082A1/ja active Application Filing
- 2013-03-28 RU RU2014143266A patent/RU2619221C2/ru active
- 2013-03-28 KR KR20147029890A patent/KR20150009528A/ko active Application Filing
- 2013-03-28 IN IN8862DEN2014 patent/IN2014DN08862A/en unknown
- 2013-03-28 JP JP2014508058A patent/JP6010112B2/ja active Active
- 2013-03-28 CN CN201910232961.8A patent/CN110079503A/zh active Pending
-
2014
- 2014-09-27 US US14/499,171 patent/US20150203821A1/en not_active Abandoned
-
2017
- 2017-06-26 US US15/632,831 patent/US10494606B2/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
UA42726C2 (ru) * | 1993-05-24 | 2001-11-15 | Імм'Юнекс Корпорейшн | Выделенный полипептид, связывающий flt3, выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, связывающий flt3 (варианты), выделенный полинуклеотид, гибридизирующийся с таковым (варианты), вектор экспрессии (варианты), линия клеток-хозяев (варианты), способ получения полипептида, связывающего flt3 (варианты), фармацевтическая композиция, способ проведения аутологической трансплантации больному, получающему цитовосстановительную терапию, среда для размножения гемопоэтических клеток, способ трансфекции экзогенного гена в недиферинцированную раннюю гемопоэтическую клетку, способ переноса экзогенного гена млекопитающему, способ стимуляции пролиферации т-клеток у млекопитающего, способ стимуляции пролиферации клеток эритроидного ряда диференциирования в селезенке млекопитающего, способ лечения больного, имеющего симптомы миелодиспластического синдрома, способ лечения больного, имеющего симптомы анемии, способ лечения больного, имеющего симптомы синдрома приобретенного иммунодефицита, способ отделения клеток, имеющих рецептор flt3 на поверхности, от смеси клеток в суспензии, антитело, проявляющее иммунореактивность к полипептиду, связывающему flt3 |
WO2007149548A2 (en) * | 2006-06-22 | 2007-12-27 | Medistem Laboratories, Inc. | Treatment of erectile dysfunction by stem cell therapy |
WO2009061442A1 (en) * | 2007-11-06 | 2009-05-14 | Children's Medical Center Corporation | Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells form non-embryonic human cells |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2679082C1 (ru) * | 2017-12-13 | 2019-02-05 | Общество с ограниченной ответственностью "Покровский банк стволовых клеток" | Способ извлечения пульпы зуба для получения культуры стволовых клеток |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101930718B1 (ko) | 2018-12-19 |
EP2832851A1 (en) | 2015-02-04 |
IN2014DN08862A (ru) | 2015-05-22 |
SG11201406141UA (en) | 2014-10-30 |
CA2868251C (en) | 2019-02-12 |
EP2832851A4 (en) | 2015-09-02 |
RU2014143266A (ru) | 2016-05-20 |
CN110079503A (zh) | 2019-08-02 |
JPWO2013147082A1 (ja) | 2015-12-14 |
US10494606B2 (en) | 2019-12-03 |
US20150203821A1 (en) | 2015-07-23 |
JP6010112B2 (ja) | 2016-10-19 |
WO2013147082A1 (ja) | 2013-10-03 |
CN104321426A (zh) | 2015-01-28 |
KR20150009528A (ko) | 2015-01-26 |
EP2832851B1 (en) | 2019-04-17 |
US20170355960A1 (en) | 2017-12-14 |
KR20170121340A (ko) | 2017-11-01 |
CA2868251A1 (en) | 2013-10-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2619221C2 (ru) | Иммортализованная стволовая клетка и лекарственная композиция и лекарственный препарат, содержащие ее в качестве активного ингредиента | |
JP6600299B2 (ja) | 創傷治癒および組織工学 | |
KR102250027B1 (ko) | 골아 세포 및 그 조제 방법 | |
US20060247195A1 (en) | Method of altering cell properties by administering rna | |
CN105492597B (zh) | 利用hmga2制备由非神经元细胞重编程的诱导神经干细胞的方法 | |
Meng et al. | Co‐transplantation of bFGF‐expressing amniotic epithelial cells and neural stem cells promotes functional recovery in spinal cord‐injured rats | |
US10675382B2 (en) | Schwann cells and method for preparing same | |
Yang et al. | Subarachnoid transplantation of human umbilical cord mesenchymal stem cell in rodent model with subacute incomplete spinal cord injury: preclinical safety and efficacy study | |
US20200206272A1 (en) | Treatment agent for epidermolysis bullosa | |
Lu et al. | Retrovirus delivered neurotrophin-3 promotes survival, proliferation and neuronal differentiation of human fetal neural stem cells in vitro | |
Takeda et al. | Osteogenic potential of human bone marrow–derived mesenchymal stromal cells cultured in autologous serum: A preliminary study | |
JP2016210730A (ja) | 医薬組成物及びその製造方法並びに医薬品 | |
CN113785068A (zh) | 杂合启动子及其在治疗中,特别是在治疗ii型胶原病中的用途 | |
JP2015160820A (ja) | 慢性腎障害治療のための多能性幹細胞 | |
JP7072777B2 (ja) | 慢性腎障害治療のための多能性幹細胞 | |
Gao et al. | Identification of rat respiratory Mucosa stem cells and comparison of the early neural differentiation potential with the bone marrow mesenchymal stem cells in vitro | |
EP4227404A1 (en) | Osteoblasts differentiated from mesenchymal stem cells and composition for treating bone disease comprising same | |
Fortuna et al. | Three-dimensional Collagen Scaffolds in Cultures of Olfactory Ensheathing Cells Used for Severed Spinal Cord Regeneration | |
JP2021073305A (ja) | 慢性腎障害治療のための多能性幹細胞 | |
JP2020058333A (ja) | 脳卒中のための神経幹細胞治療 | |
WO2016072105A1 (ja) | 重層上皮組織形成能を有する細胞、及びその製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HC9A | Changing information about inventors | ||
PD4A | Correction of name of patent owner |