CN105251053B - 一种用于牙周组织修复的细胞复合体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于牙周组织修复的细胞复合体及其用途，所述细胞复合体包含人脐带间充质干细胞和牙周膜间充质干细胞，所述细胞复合体含有0.5×104‑5×104个/mL人脐带间充质干细胞和0.5×104‑5×104个/mL牙周膜间充质干细胞。所示细胞复合体可以用于制备牙周组织修复药物。本发明脐带间充质干细胞联合牙周膜间充质干细胞形成的细胞复合体，能够明显的降低炎性因子的表达，对牙周组织修复的效果更加明显。
Description
技术领域
本发明涉及牙周组织修复领域，尤其涉及一种用于牙周组织修复的细胞复合体及其制备方法和用途。
背景技术
牙周病是牙齿支持组织包括牙周膜、牙骨质在内的炎症性疾病，是严重危害人类牙齿和全身健康的常见口腔疾病，其治疗的目的是能够消除牙周组织局部的炎症，再生和重建因验证破坏的牙周组织。体内研究表明牙周炎症部位的IL-1和TNF-α浓度明显升高，而成功治疗后其浓度明显下降。因此，使用IL-1和TNF-α的拮抗剂有可能降低IL-1和TNF-α的浓度，同时降低牙周组织的损伤，促进修复的进行。
目前，临床上常用牙根面的物理与化学处理、自体和异体组织的移植、生长因子的应用以及引导组织再生技术等来治疗牙周病，但是其疗效不甚理想。组织工程重建和细胞制剂技术成为牙周再生医学的研究热点和未来的发展方向。有研究表明骨髓基质干细胞能够进行牙周组织修复，但是需经过骨穿刺才能获取骨髓，对机体造成较大的身体创伤，同时骨髓含有复杂的细胞成分，干细胞在其中的含量较低，需要较长时间的扩增，并不是良好的种子细胞。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种用于牙周组织修复的细胞复合体及其用途。
一种用于牙周组织修复的细胞复合体，包含人脐带间充质干细胞和牙周膜间充质干细胞。
优选地，所述用于牙周组织修复的细胞复合体含有0.5×104-5×104个/mL人脐带间充质干细胞和0.5×104-5×104个/mL牙周膜间充质干细胞。
优选地，所述细胞复合体还包含人血清白蛋白和生理盐水，每毫升细胞复合体中各组分含量如下：
进一步优选地，每毫升细胞复合体中各组分含量如下：
优选地，所述脐带间充质干细胞为P2或P3代细胞，所述牙周膜间充质干细胞为P2或P3代细胞。P2或P3代细胞的增殖能力强，分化性能好，更有利于牙周组织修复。
所述用于牙周组织修复的细胞复合体在制备牙周组织修复药物中的应用。
牙周膜干细胞是存在于牙周组织的干细胞，其具有间充质干细胞的特性，包括多向分化潜能、明显的高增殖活性及克隆形成能力，体外可分化为成脂成骨细胞，体内可分化为牙骨质样和牙周膜样组织，是牙周支持组织再生和重建的基础，是理想的组织工程细胞。
来源于脐带组织的脐带间充质干细胞是一种新型组织工程种子细胞，可用于器官的损伤修复研究。与其他类型间充质干细胞相比较，脐带干细胞无伦理学限制、具有更强的增殖分化能力，可以在短期内达到临床应用的需要；同时，有研究表明，脐带来源的间充质干细胞具有免疫调节作用，调节淋巴细胞增殖从而抑制异常免疫反应，在组织中具有抗炎作用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明选取脐带间充质干细胞作为牙周组织修复的治疗细胞之一，可以促进牙周组织修复、治疗牙周病，其来源丰富、在体外分化能力强，安全性高、治疗效果显著。此外，无需对机体进行穿刺等手术，大大的降低了对机体的创伤，是骨髓干细胞所不能比拟的。
2、本发明脐带间充质干细胞联合牙周膜间充质干细胞形成的细胞复合体，能够明显的降低炎性因子的表达，对牙周组织修复的效果更加明显。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，下面结合具体实施例做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。
实施例1、用于牙周组织修复的细胞复合体
在本实施例中每毫升用于牙周组织修复的细胞复合体中含有脐带间充质干细胞2.5×104个，牙周膜间充质干细胞2.5×104个，人血清白蛋白(奥地利百特国际有限公司)的质量体积百分数为1.5％，余量为生理盐水。
实施例2、用于牙周组织修复的细胞复合体
在本实施例中每毫升用于牙周组织修复的细胞复合体中含有脐带间充质干细胞0.5×104个，牙周膜间充质干细胞5×104个，人血清白蛋白的质量体积百分数为2％，余量为生理盐水。
实施例3、用于牙周组织修复的细胞复合体
在本实施例中每毫升用于牙周组织修复的细胞复合体中含有脐带间充质干细胞5×104个，牙周膜间充质干细胞0.5×104个，人血清白蛋白的质量体积百分数为1％，余量为生理盐水。
实施例4用于牙周组织修复的细胞复合体的制备方法
实施例1-3中的用于牙周组织修复的细胞复合体可以通过以下方法制备：
S1、分离培养脐带间充质干细胞和牙周膜间充质干细胞：
S11、脐带间充质干细胞的分离培养
1)在超净工作台中，去除脐带中的血块和动静脉后，用剪刀剪碎得到组织块；
2)将组织块接种至10cm培养皿中，加入含10％FBS的DMEM/F12培养液(Gibco，下称DMEM/F12+10％FBS培养液)中，置于二氧化碳培养箱(thermo)中37℃、5％CO2条件下培养，每隔3天补液一次；
3)当在倒置显微镜(奥林巴斯)下观察到有克隆形成时，去除组织块，当细胞生长达至80％汇合时，用0.25％的胰蛋白酶(sigma)溶液进行消化传代。
S12、牙周膜间充质干细胞的分离培养
1)将新鲜拔除的第三磨牙用PBS液体(广州斯佳生物科技有限公司)反复冲洗3-4次，刮取根中1/3牙周膜组织；用剪刀剪碎后加入1-5mg/ml的I型胶原酶(sigma)溶液，放入恒温震荡箱(广州斯佳生物科技有限公司)中37℃、200rpm消化15-30min；
2)消化完成后加入等量的DMEM/F12+10％FBS培养液终止消化，离心收集沉淀，接种于6孔板中，同时放置盖玻片，加入DMEM/F12+10％FBS培养液置于二氧化碳培养箱中37℃、5％CO2条件下培养，每3天换液一次；
3)倒置显微镜下观察，当细胞生长达至80％汇合时，用胰蛋白酶进行消化传代。
S2、制备用于牙周组织修复的细胞复合体：
当步骤S1中的传代培养至P2或P3代的脐带间充质干细胞和牙周膜间充质干细胞汇合度达到70-80％时，加入0.25％的胰蛋白酶消化细胞2-3min，弃去胰蛋白酶，用培养基重悬细胞计数，1000rpm离心5min，去上清，按照相应比例将二者与人血清白蛋白和生理盐水混合，得到本发明用于牙周组织修复的细胞复合体。
实施例5、大鼠牙周组织修复实验
为了更好的证明本发明用于牙周组织修复的细胞复合体的效果，对使用本发明细胞复合体修复大鼠牙周组织进行了实验。同时设置3个对比例。对比例1每毫升细胞复合体含有人骨髓间充质干细胞2.5×104个，牙周膜间充质干细胞2.5×104个，人血清白蛋白1.5％m/v，余量为生理盐水。对比例2每毫升细胞复合体含有人脐带间充质干细胞2.5×104个，人血清白蛋白1.5％m/v，余量为生理盐水。对比例3每毫升细胞复合体含有牙周膜间充质干细胞2.5×104个，人血清白蛋白1.5％m/v，余量为生理盐水。为了更直观的理解，将实施例1-3和对比例1-3的各组分列于表1。
表1实施例1-3和对比例1-3各组分含量表
从动物中心购买牙周炎大鼠动物模型35只，分为7组，每组5只。一组作为对照组，不做任何处理；三组作为对比例组，在牙周炎部位注入对比例1-3中的复合体；其余作为实验组，分别注入实施例1-3中的复合体。
在实验前，所有大鼠抽取少量牙周炎症部位的龈沟液，存放于-20摄氏度备用。放在同一环境下喂养7-8周后，观察大鼠牙周炎恢复情况，并在和实验前同一部位的地方抽取少量龈沟液，存放于-20摄氏度备用。
在喂养7-8周后，由专业医生观察大鼠的牙周炎恢复情况，对照组不仅没有任何缓解症状，牙周炎甚至有加重的趋势；对比例和实施例均有一定程度的缓解，但是实施例中的缓解程度比对比例好，并且使用实施例1中细胞复合体的部分大鼠的牙周炎症状消失，牙周炎治愈。
利用市场上购买的IL-1(白细胞介素-1)和TNF-α(肿瘤坏死因子-α)ELISA检测试剂盒对实验前后的龈沟液中的IL-1和TNF-α进行浓度检测，结果如表2所示。
表2实验前后IL-1和TNF-α浓度检测结果
| 组别 | IL-1(ng/ml) | TNF-α(ng/ml) |
| 实验前 | 39.2±7.13 | 5.98±1.06 |
| 对照组 | 39.5±6.86 | 5.93±1.15 |
| 对比例1 | 18.96±3.60** | 3.14±0.84** |
| 对比例2 | 30.91±7.54* | 5.02±1.05* |
| 对比例3 | 28.84±5.60** | 4.32±0.96** |
| 实施例1 | 8.43±1.45** | 2.84±0.68** |
| 实施例2 | 14.05±2.06** | 2.97±0.82** |
| 实施例3 | 16.09±3.12** | 3.04±0.75** |
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
由表2可知，对照组实验前后的IL-1和TNF-α因子浓度无明显差别，对比例组和实验组实验前后的IL-1和TNF-α浓度均有所降低，但是实验组的IL-1和TNF-α浓度降低程度要比对比例组降低程度更为显著，因此脐带间充质干细胞和牙周膜干细胞复合体具有更好的牙周组织修复效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (4)
1.一种用于牙周组织修复的细胞复合体，其特征在于，包含人脐带间充质干细胞和牙周膜间充质干细胞，所述细胞复合体还包含人血清白蛋白和生理盐水，每毫升细胞复合体中各组分含量如下：
2.根据权利要求1所述的用于牙周组织修复的细胞复合体，其特征在于，每毫升细胞复合体中各组分含量如下：
3.根据权利要求1或2任一项所述的用于牙周组织修复的细胞复合体，其特征在于，所述脐带间充质干细胞为P2或P3代细胞，所述牙周膜间充质干细胞为P2或P3代细胞。
4.权利要求1-3任一项所述的用于牙周组织修复的细胞复合体在制备牙周组织修复药物中的应用。
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