CN102311942A

CN102311942A - 一种维生素c诱导的间充质干细胞膜片及其制备方法

Info

Publication number: CN102311942A
Application number: CN201110210523A
Authority: CN
Inventors: 王松灵; 魏福兰; 施松涛; 范志朋; 丁刚
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-07-26
Filing date: 2011-07-26
Publication date: 2012-01-11

Abstract

本发明涉及一种间充质干细胞膜片，具体地说是一种维生素C诱导的间充质干细胞膜片及其制备方法。本发明简便、快捷、无害。本发明对于间充质干细胞膜片应用于细胞替代治疗及再生医学、组织工程学等应用领域的组织再生有十分重要和深远的意义。相信通过不断的探索、研究，随着对间充质干细胞膜片认识的进一步深入，其应用前景将更加广阔。

Description

一种维生素C诱导的间充质干细胞膜片及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种间充质干细胞膜片，具体地说是一种维生素C诱导的间充质干细胞膜片及其制备方法。

背景技术

传统概念中，组织工程技术研究领域主要包括种子细胞、支架材料、生长因子三方面内容。尽管近年来生物材料技术的日新月异使得这种经典构建策略日渐成熟，但这种方法的一些弊端也显现无遗，越来越多的学者开始意识到模拟胚胎发育进行组织构建的重要性。

事实上，干细胞的更新、分化与其所处的微环境密切相关。所谓微环境，简单的讲就是由细胞、生长因子与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)所构成的细胞在体内赖以生存的动态环境。组织工程研究中主要是借助于生长因子和支架材料来模拟细胞在体内生长所需的微环境。支架材料作为人工的细胞外基质，主要作用是模拟细胞在体内的三维空间结构，为细胞提供一个继续增殖、分化的基质微环境。由于作为细胞外基质替代物的支架材料或多或少存在着一些不足，因此运用支架材料构建组织工程化各种组织本身具有很大的局限性。

保存了细胞外基质的细胞膜片技术模拟了细胞在体内生长所需的微环境，克服了作为细胞外基质替代物的支架材料的不足。ECM是由细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要是一些多糖和蛋白，或蛋白聚糖。这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。自从1993年Okano等发明细胞膜片技术以来，细胞膜片技术已经广泛应用于组织工程研究中，包括用来再生角膜、心肌组织、肝脏组织、骨组织。口腔领域，学者们用牙周膜细胞膜片再生牙周组织。由于细胞膜片是通过细胞自身分泌的细胞外基质形成内源性支架，有利于细胞与细胞间、细胞与胞外基质间的交互作用和遗传信息的传递，因此从一定意义上讲，细胞膜片工程能够最大限度地模拟胚胎发育组织形成的过程，其作用和价值远远超过所有的外源性生物支架材料。

细胞膜片的制备，常规采用Recell温度响应培养皿，培养皿的表面使用了一种温度敏感的疏水材料PIPA-Am。当温度高于32℃时，表面具有疏水性，适合细胞的附着和生长，当温度降低，聚合体变得亲水及膨胀，自然释放细胞。收获细胞只需将温度降到20℃即可，无需酶消化和处理，可以保留细胞表面功能和活性。随着研究的深入，学者们在不断改进细胞膜片的制备方法，或通过改建PIPA-Am，或通过在培养皿表面涂层层粘蛋白(素)5(laminin-5)改进细胞膜片的制备。但迄今为止，细胞膜片的制备相对来说还是比较费时、复杂、需要特殊的温度敏感材料PIPA-Am等。

发明内容

本发明目的在于提出一种制备方法简便、成本低廉、不需要特殊材料且对人体无毒副作用的间充质干细胞膜片。

本发明的另一目的在于提出上述间充质干细胞膜片的制备方法。

本发明的第三目的在于提出一种上述方法中使用的培养基。

为实现上述目的，本发明发明思路为：

维生素C(Vitamin C，Vc)又叫抗坏血酸，是一种水溶性维生素，人们口服维生素C对于组织细胞、牙龈、血管、骨骼、牙齿的发育和修复起到有利的作用。在细胞培养过程中未添加过Vit C，因为Vit C属于水溶性维生素，培养基的其他成分如果选择不慎可能会导致Vit C无法发挥正常功效，另外Vit C的浓度也是需要非常谨慎选择的，最佳及浓度下Vit C可以带来事倍功半的效果。

为了实现本发明的目的，本发明的具体技术方案如下：

一种维生素C诱导的间充质干细胞膜片的制备方法，包括如下步骤：

将间充质干细胞传代培养；

取第二代或第三代间充质干细胞加入至含有5.0-50.0μg/ml维生素C的培养基中，培养10-14天；

培养皿边缘细胞出现皱褶时，将细胞膜片整体揭下来即可。

所述间充质干细胞为牙周膜间充质干细胞，所述培养基成分为：必需成份：α-MEM培养液，10-15％胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100U/mL青霉素，100g/mL链霉素。添加成份：5.0-50.0μg/ml维生素C(ascorbic acid 2-phosphate)。维生素C最佳添加量为20μg/ml。

所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞；所述培养基成分为：必需成份：α-MEM培养液，10-15％胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100U/mL青霉素，100g/mL链霉素。添加成份：5.0-50.0μg/ml(ascorbic acid 2-phosphate)。维生素C最佳添加量为20μg/ml。

所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞；所述培养基成分为：必需成份：α-MEM培养液，10-15％胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100U/mL青霉素，100g/mL链霉素。添加成份：5.0-50.0μg/ml维生素C(ascorbic acid 2-phosphate)。维生素C最佳添加量为20μg/ml。

一种制备间充质干细胞膜片用的培养基，所述培养基中含有20.0μg/ml维生素C。

所述培养基具体组成成分如下：α-MEM培养液、10-15％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素、5.0-50.0μg/ml维生素C。

维生素C最佳添加量为20μg/ml。

一种间充质干细胞膜片，其是利用上述方法制备得到的。

本发明的有益效果：

本发明利用在培养基中加入维生素C，提供一种简便、快捷、无害的间充质干细胞膜片的培养制备方法，并对该细胞膜片特性进行研究。说明制备的间充质干细胞细胞膜片，在各种组织工程器官的构建方面均有重要的意义。射电镜超微结构观察发现，本发明制备的牙周膜干细胞膜片保持了细胞间连接，并且保存了细胞外基质连接形成的支架，未破坏细胞表面蛋白的粘附增殖及分化等功能。从基因水平检测发现，Vc诱导制备的牙周膜干细胞膜片，不仅与温度敏感培养皿制备的牙周膜干细胞膜片一样有较高的细胞外基质基因表达，而且，优于温度敏感培养皿制备的牙周膜干细胞膜片表达较高的干细胞干性基因，更利于组织的再生。细胞遗传学检测发现，Vc诱导制备的牙周膜干细胞膜片组及度敏感培养皿制备的牙周膜干细胞膜片组，染色体核型同酶消化细胞一样无变异，但端粒酶活性高于后两者。体内回植后，Vc诱导制备的牙周膜干细胞膜片组，牙周组织再生能力优于温度敏感培养皿制备的牙周膜干细胞膜片组及牙周膜干细胞/材料组。具体实验数据和说明见实施例部分。

下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。

附图说明

图1为实施例1制备的Vc诱导构建牙周膜干细胞膜片；

图2为实施例1制备的牙周膜干细胞膜片超微结构观察；

图3为实施例1制备的牙周膜干细胞膜片的基因表达；

图4为实施例1制备的牙周膜干细胞膜片的细胞遗传学分析；

图5为实施例1制备的牙周膜干细胞膜片裸鼠体内回植后组织再生能力情况；

图6为实施例1制备的牙周膜干细胞膜片介导的小型猪牙周组织再生；

图7为实施例2成功构建来源于其他组织的间充质干细胞膜片；

培养液中加入20μg/ml Vc，也可成功构建来源于其他组织的骨髓间充质干细胞膜片(A，B)及脐带间充质干细胞膜片(C，D)。

具体实施方式

本具体实施方式中所使用牙周膜间充质干细胞细胞库由和泽生物科技有限公司筹建，本领域技术人员可以通过该细胞库获得。本具体实施方式所采用牙周膜间充质干细胞来自于临床拔除的废弃牙齿，经分离、培养、纯化获得；骨髓间充质干细胞及脐带间充质来自于细胞来自天津市脐带血造血干细胞库，北科干细胞库等，本领域技术人员可通过该细胞库获得。

本发明中所用的牙周膜间充质干细胞也可以利用医院门诊患者拔除的牙齿培养得到，该牙齿属于医用废料。

实施例1牙周膜干细胞膜片的制备

1、细胞培养

牙周膜干细胞可以通过购买得到，购买途径见上述。如果通过培养方式获得，培养方法如下：将患者拔除的废弃牙齿立即放入无菌装有预冷PBS的离心管，移送进细胞室，在24h内分离培养牙周膜干细胞。轻轻剥离牙齿周围的牙周组织，取中段的牙周组织，用PBS反复清洗，剪碎，置于含Ⅰ型胶原酶(3g/L)和Dispase(4g/L)的消化液，37℃下消化1小时，过70μm细胞筛收集细胞，1000rpm离心10min，用培养液重新悬浮成单细胞悬液。将细胞接种于25cm2细胞培养瓶中，在α-MEM培养基(含15％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中37℃、5％CO2培养，每2～3天换液1次。每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况。当细胞生长至80％汇合状态时，用0.25％胰蛋白酶按1∶2消化传代。小型猪牙齿PDLSCs的分离和培养方法同人PDLSCs。

2、间充质干细胞膜片制备

首先，利用牙周膜干细胞制备干细胞膜片，找出所需的最佳Vc浓度。将生长旺盛的第三代牙周膜干细胞接种在60mm培养皿中，为获得完整的细胞膜片，在培养基中加入不同浓度的维生素C(Vc)(0μg/ml，5.0μg/ml，10.0μg/ml，20.0μg/ml，50.0μg/ml)，培养10-14天，培养皿边缘细胞出现皱褶，用较钝刀片或弯注射器针头将细胞膜片整体揭下来，即制备得到牙周膜干细胞膜片。制备过程中细胞膜片不要干燥。

如图1所示，培养液中加入0μg/ml(A)，5.0μg/ml(B)，10μg/ml维生素C(C)，细胞生长至10-13天时，不能获得完整的牙周膜干细胞膜片；HE染色显示：(D)。但当培养液中加入20μg/ml维生素C，细胞生长至10-13天时，可获得完整的牙周膜干细胞膜片(E)，与在培养液中加入50μg/ml维生素C(F)及用温度敏感培养皿制备的膜片一样(G)；HE染色(H)显示：牙周膜干细胞膜片由2-3层细胞构成，细胞之间紧密连接。Scale bar：40um。

3、牙周膜干细胞膜片的特性研究

对获得的牙周膜干细胞膜片进行特性研究，采用透射电镜及real-time PCR检测：

(1)透射电镜：将制备的牙周膜干细胞膜片用二甲砷酸钠缓冲液(pH 7.2)冲洗3次，4℃下1％锇酸固定2h；双蒸水冲洗后，梯度酒精脱水；环氧丙烷、树脂置换；然后环氧树脂Epon812包埋，聚合。将包埋块修整为1u半薄切片，青—美兰染色，光学显微镜定位。醋酸双氧铀/枸橼酸铅染色超薄切片，EM208透射电镜(荷兰PHILIPS公司)观察。

图2透射电镜超微结构观察发现，牙周膜干细胞膜片保持了细胞间连接，并且保存了细胞外基质连接形成的支架，未破坏细胞表面蛋白的粘附增殖及分化等功能。如图2所示，透射电镜观察可见完整的细胞形态(A)，获得的牙周膜干细胞膜片保持了细胞间的紧密连接(B)，细胞生长分化很好，胞浆内大量微丝，沿细胞膜表面可见胞吐小泡(C)。细胞周围可见基质和胶原纤维(纤维直径较细为Ⅱ型胶原)(D)。

(2)real-time PCR

本研究中所用引物：

Primer ID Accession No. Sequence(5′-3′) Expect size(bp)

Collagen Type INM_000088 GCTGATGATGCCAATGTGGTT 155

CCAGTCAGAGTGGCACATCTTG

Integrinβ1NM_002211 GTGAGTGCAACCCCAACTACACT 219

AAGGCTCTGCACTGAACACATTC

Fibronectin NM_212476 CACCCAATTCCTTGCTGGTATC 162

TATTCGGTTCCCGGTTCCA

Oct4 NM_002701 CACTGTACTCCTCGGTCCCTTTC 147

CAGGCACCTCAGTTTGAATGC

Sox2 NM_003106 CCAGCTCGCAGACCTACATGA 153

CTGGAGTGGGAGGAAGAGGTAAC

Nanog NM_024865.2 CCTTGGCTGCCGTCTCTGGCT 150

AGCAAAGCCTCCCAATCCCAAACAA

β-actin NM_001101 TGCCGACAGGATGCAGAAG 147

GCTGATCCACATCTGCTGGAA

提取牙周膜干细胞膜片总RNA，合成第一链cDNA。取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：

2XS YBR Mix(with 4mM Mg2+)25μl

PCR Forward Primer(10μM)1μl

PCR Reverse Primer(10μM)1μl

Taq DNA Polymerase 0.3μl

第一链cDNA 2μl

然后加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。混匀，置于SLAN荧光定量PCR仪中。反应程序如下：95℃5min预变性后，95℃15s→65℃35s(荧光检测)，40个循环。

如图3所示，Real-time PCR结果显示，Vc诱导制备的牙周膜干细胞膜片与温度敏感培养皿制备的细胞膜片及酶消化下来的细胞相比，细胞外基质的Ⅰ型胶原(collagenⅠ，COLⅠ)，整联蛋白β1(integrinβ1)及纤维连接蛋白(fibronectin)都显著性增高(p＜0.01，p＜0.05)，代表细胞干性的基因Oct4，Sox2，Nanong也显著性增高(p＜0.01，p＜0.05)。但温度敏感培养皿制备的细胞膜片及酶消化下来的细胞相比，Oct4，Sox2，Nanong没有显著性差异。从上述检测的基因水平检测发现，Vc诱导制备的牙周膜干细胞膜片，不仅与温度敏感培养皿制备的牙周膜干细胞膜片一样有较高的细胞外基质基因表达，而且，优于温度敏感培养皿制备的牙周膜干细胞膜片表达较高的干细胞干性基因，更利于组织的再生。

4、牙周膜干细胞膜片的细胞遗传学分析

(1)染色体核型分析

采用胰蛋白酶-Giemsa显示G带法进行染色体核型分析，步骤如下：

a.取对数生长期细胞，加秋水仙素至终浓度0.4μg/ml，培养3小时。

b.用0.25％胰蛋白酶消化细胞，悬浮于无血清培养基中，移入离心管内。

c.以1000转/分钟离心5分钟，弃上清液。

d.将沉淀细胞小心重悬浮于5ml低渗液中(0.075mol/L KCl)，室温放置8分钟。

e.在低渗液中先加一滴甲醇-冰醋酸固定剂，小心混匀，在4℃低速离心，使细胞沉降成团。

f.吸出上清液，沿管壁缓缓加入新鲜固定剂，不要重悬浮细胞，在4℃继续放置30分钟。

g.重悬浮细胞，离心，弃上清液，再加新鲜固定剂，吹打混匀，再离心。

h.弃上清液，细胞悬浮于0.25ml新鲜固定剂，吸出适量细胞悬液，向清洁剂处理过的载玻片上滴一滴细胞悬液，使染色体充分分散，空气干燥。

i.将制好的中期染色体标本浸入0.025％胰蛋白酶/0.02％EDTA溶液中，在30℃消化1-2分钟。

j.取出载玻片，分别通过70％，80％，100％甲醇溶液，取出，空气干燥。

k.将载玻片浸入Giemsa染色液中，染色10分钟。

l.用蒸馏水洗净玻片，空气干燥，中性树胶封片。然后镜检，摄影，分析核型。

(2)端粒酶活性分析

操作按照TRAPEZE

RT Telomerase Detection Kit(Millipore Corp.，MA，US)进行。阳性对照细胞取自人卵巢癌细胞。

①细胞端粒酶的提取

将实施例1制备的Vc诱导制备的牙周膜干细胞膜片、温度敏感培养皿制备的牙周膜干细胞膜片及酶消化的细胞按试剂盒的说明加入裂解液，把离心上清转移至新的管中，放置冰上并测定其蛋白浓度。获取其端粒酶提取物；

②PCR扩增

将2μL的提取物加入PCR反应液中，进行PCR反应。设定程序：30℃/30min/1个循环，95℃/2min/1个循环；94℃/15s，59℃/60s，45℃/10s，循环45次。

③Smart Cycler II software program进行分析。

图4细胞遗传学检测发现，Vc诱导制备的牙周膜干细胞膜片组及度敏感培养皿制备的牙周膜干细胞膜片组，染色体核型同酶消化细胞一样无变异，但端粒酶活性高于后两者。如图4所示，Vc诱导制备的牙周膜干细胞膜片(A)及温度敏感培养皿制备的细胞膜片(B)与酶消化细胞(C)的染色体核型一致；端粒酶活性检测显示：Vc诱导制备的牙周膜干细胞膜片的端粒酶活性明显高于温度敏感培养皿制备的细胞膜片及酶消化细胞的端粒酶活性(D)。

5、牙周膜干细胞膜片裸鼠体内回植后组织再生能力观察

24只5周龄裸鼠分为Vc诱导牙周膜干细胞膜片组(12只)、温度敏感培养皿制备的牙周膜干细胞膜片组(12只)及酶消化的牙周膜干细胞+明胶海绵组(12只)，分别其植入裸鼠背部皮下。4w后，处死动物，从实验部位获取标本，固定、脱钙、石蜡包埋，行HE染色，观察组织再生情况。

体内回植后，如图5所示，A，D，G，J：Vc诱导的牙周膜干细胞膜片组形成大量规则致密的牙骨质-牙周膜样结构。B，E，H，K：温度敏感培养皿制备的牙周膜干细胞膜片组也可形成规则致密的牙骨质-牙周膜样结构，但少于Vc诱导的牙周膜干细胞膜片组。C，F，I，L：牙周膜干细胞/材料组形成少量牙骨质-牙周膜样结构，有大量的材料存留。

6、牙周膜干细胞膜片小型猪体内回植后组织再生能力观察

按照本课题组报道的方法，制备9只小型猪的牙周炎骨缺损模型，总共制备18处牙周炎骨缺损。18处缺损随机分为以下3个组：(1)实施例1制备的Vc诱导牙周膜干细胞膜片移植组，翻瓣、刮治、每个缺损处移植2块牙周膜干细胞膜片、明胶海绵覆盖缺损、缝合；(2)温度敏感培养皿制备的牙周膜干细胞膜片移植组，翻瓣、刮治、每个缺损处移植2块牙周膜干细胞膜片、明胶海绵覆盖缺损、缝合；(3)酶消化牙周膜干细胞移植组，翻瓣、刮治、移植明胶海绵支架材料+相同数目牙周膜干细胞、明胶海绵覆盖缺损、缝合。在治疗后12w，处死动物，从实验部位获取标本，固定、脱钙、石蜡包埋，行HE染色，观察组织再生情况。

如图6所示：Vc诱导制备的牙周膜干细胞膜片组，牙周组织再生能力优于温度敏感培养皿制备的牙周膜干细胞膜片组及牙周膜干细胞/材料组。

结果分析

1、Vc诱导制备间充质干细胞膜片

本发明中，利用Vc能促进胶原等细胞外基质分泌的特性，我们首先利用牙周膜干细胞，摸索在培养基内加入Vc后应用普通的培养皿制备牙周膜细胞膜片的方法。我们发现在培养基中加入20.0μg/ml的Vc，可以促进细胞快速增殖，并能分泌大量细胞外基质胶原成分，将所有细胞连接在一起，生长到一定程度后，我们将整个细胞膜片完整揭下来，形成的细胞膜片具有足够的强度和大小并能满足组织工程组织构建的要求。

组织再生涉及很多领域，牙周组织再生只是其中很小一部分。因此，我们又探索此方法是否可以应用于其他组织来源的干细胞。

本发明方法的优点及应用前景

Vc诱导制备的间充质干细胞膜片，由于既促进及保存了细胞外基质，又有较高的干细胞特性。与常规细胞膜片制备方法相比，本发明方法简便快捷，不需要特殊的材料，并且，我们所采用的Vc是一种人体必需的水溶性维生素，对人体有益而无害。

间充质干细胞膜片具有多方面的应用前景，其中包括：

(1)牙周病牙周组织再生中的应用：牙周疾病造成的牙周附着丧失和牙槽骨缺损是导致牙齿缺失的一个重要原因，因而牙周治疗的主要目的在于使牙槽骨、牙骨质和牙周膜获得再生，形成牙周新附着。常用的牙周再生方法，如根面平整术、骨移植术、引导组织再生术等，都有一定的局限性。近年来，牙周组织工程技术的出现和发展为牙周再生提供了崭新的思路和方法，而保存了细胞外基质的细胞膜片可以模拟细胞在体内生长所需的微环境，克服作为细胞外基质替代物的支架材料的不足，可以更好地促进牙周再生。

(2)牙齿缺失牙齿再生中的应用：牙齿缺失对患者的咀嚼、言语、美观和心理等有显著影响，给人们的工作和生活带来诸多不便。目前针对患者的牙齿缺失主要采用活动义齿、固定义齿和种植义齿来修复，但这些方法都是非生物的赝复体修复，缺乏真正生理意义的修复。牙齿再生是修复牙齿缺失的终极目标，但鉴于全牙再生尚存在相当大的困难，再生在行使功能等方面有重要作用得牙根是一个良好的过渡。牙周膜干细胞膜片对牙根牙周组织的再生起着举足轻重的作用。

实施例2骨髓间充质干细胞膜片的制备

1、细胞培养

骨髓间充质干细胞可以通过细胞库购买获得，也可以利用医用废弃物培养获得：骨髓5-10ml，用等体积15％FBSα-MEM培养基稀释(内含5mg肝素钠)。采用全骨髓培养法，将骨髓α-MEM混合液1000rpm离心10min，弃上清和脂肪团块，加入α-MEM培养基(含15％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)20ml重悬，吹打混匀后接种于培养瓶内，置于37℃，5％CO2培养箱培养，于第3天进行半量换液，弃去未贴壁细胞，以后每三四天换液1次。直至细胞长至80％融合，用0.25％胰蛋白酶按1∶2消化传代。

2、骨髓间充质干细胞膜片制备

将生长旺盛的第三代骨髓干细胞接种在60mm培养皿中，在α-MEM培养基(含15％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，20.0μg/ml维生素C)中37℃、5％CO2培养，每2～3天换液1次。培养10-14天，培养皿边缘细胞出现皱褶，用较钝刀片或弯注射器针头将细胞膜片整体揭下来，即制备得到骨髓干细胞膜片。制备过程中细胞膜片不要干燥。

如图7A、B所示：在α-MEM培养基中加入20.0μg/ml维生素C，可获得完整的骨髓间充质干细胞膜片(A)，HE染色显示：膜片由两三层细胞组成，细胞之间存在连接(B)。

3、结果分析：

多种组织修复再生中的应用：骨髓间充质干细胞具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，在不同的诱导条件下，可分化为骨及软骨组织，肌肉及肌腱组织，心肌细胞，神经细胞等，用于多种组织的修复再生。骨髓间充质干细胞膜片更优于骨髓间充质干细胞，可用于骨及软骨组织损伤的修复，有望再造肌肉组织，使冠心病得到有效治疗，治疗神经系统疾病的可行性。

实施例3脐带间充质干细胞膜片培养方法

1、细胞培养

取新生婴儿废弃的脐带组织，浸泡于α-MEM培养基中，超净台内取出脐带，D-Hank’s平衡液充分洗涤残留的血液，去除脐静脉、脐动脉及脐带外膜，剥离Wharton胶，并将其剪碎至1mm×1mm×1mm大小组织块。将组织块移至0.5％胶原酶Ⅱ中，加入少许α-MEM，在37℃恒温振荡仪内消化，直至Wharton胶全部消化。将含细胞的消化液吸入无菌离心管，以30倍体积的α-MEM反复吹打稀释，大于2,000rpm离心10min，弃上清液，用含体积分数为15％胎牛血清的α-MEM培养基清洗，使细胞悬液均匀分布，转移至普通培养瓶中，在37℃、5％CO2培养箱内培养。细胞贴壁后，第3天首次半量换液，弃去未贴壁细胞，以后每三四天换液1次。细胞达80％融合后，用0.25％胰蛋白酶按1∶2消化传代。

2、脐带间充质干细胞膜片制备

将生长旺盛的第三代脐带干细胞接种在60mm培养皿中，在α-MEM培养基(含15％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，20.0μg/ml维生素C)中37℃、5％CO2培养，每2～3天换液1次。培养10-14天，培养皿边缘细胞出现皱褶，用较钝刀片或弯注射器针头将细胞膜片整体揭下来，即制备得到脐带膜干细胞膜片。制备过程中细胞膜片不要干燥。

3、结果分析：

人脐带间充质干细胞具有取材方便，来源广，数量充足，增殖能力强，长期传代不改变，分泌具有合适构成的细胞外基质等特点，并且免疫功能不够成熟，处于一种缄默状态，不会触发免疫反应及引起移植物抗宿主病。因此，脐带间充质干细胞有可能替代骨髓间充质干细胞，用于神经系统疾病、心血管系统疾病、糖尿病、生殖系统疾病、肝脏疾病及肿瘤疾病的干细胞移植，而移植脐带间充质干细胞膜片比移植离散的脐带间充质干细胞更具有可操作性及更好的效果。

Claims

1.一种维生素C诱导的间充质干细胞膜片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将间充质干细胞传代培养；

(2)取第二代或第三代间充质干细胞加入至含有5.0-50.0μg/ml维生素C的培养基中，培养10-14天；

(3)培养皿边缘细胞出现皱褶时，将细胞膜片整体揭下来即可。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞为牙周膜间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述培养基成分为：α-MEM培养液，10-15％胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100U/mL青霉素，100g/mL链霉素、5.0-50.0μg/ml维生素C。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述培养基成分为：α-MEM培养液、10-15％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素、5.0-50.0μg/ml维生素C。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述培养基成分为：α-MEM培养液、10-15％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素、5.0-50.0μg/ml维生素C。

8.一种制备间充质干细胞膜片用的培养基，其特征在于，所述培养基中含有20.0μg/ml维生素C。

9.根据权利要求8所述的制备间充质干细胞膜片用的培养基，其特征在于，所述培养基由下列成分组成：α-MEM培养液、10-15％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素、5.0-50.0μg/ml维生素C。

10.一种间充质干细胞膜片，其特征在于，其是利用权利要求1至7中任意一项所述方法制备得到的。