CN103911342A - 一种人骨巨细胞瘤小鼠动物模型及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种动物模型及其构建方法，骨巨细胞瘤（GCT）在我国的发病率较高，目前尚未成功构建人骨巨细胞瘤动物模型。本发明提供了一种人骨巨细胞瘤小鼠动物模型及其构建方法，是将从人骨巨细胞瘤组织分离培养的原代细胞注射到裸小鼠的胫骨内，得到的人骨巨细胞瘤小鼠动物模型。本发明所建立的人骨巨细胞瘤骨损伤小鼠动物模型中的溶骨性损害特征与临床上骨巨细胞瘤的病理特征相似，存活的细胞为来源于人的骨巨细胞瘤基质细胞。应用本发明的动物模型可以用于系统研究骨巨细胞瘤的发病机制和进一步筛选治疗骨巨细胞瘤的药物。

Description

一种人骨巨细胞瘤小鼠动物模型及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种动物模型及其构建方法，尤其是涉及一种人骨巨细胞瘤小鼠动物模型及其构建方法。

背景技术

骨巨细胞瘤（giant cell tumor of bone，GCT）在我国的发病率较高，占全部骨肿瘤的20%左右，其中脊柱是GCT好发部位之一（参见文献Sung H.W.,KuoD.P.,Shu W.P.,et al.Giant-cell tumor of bone:analysis of two hundred and eightcases in Chinese patients[J].J Bone Joint Surg Am,1982,64(5):755-761.）。长征医院骨肿瘤科近5年平均每年收治脊柱GCT患者在60例以上。GCT具有较强的侵袭性和高复发性，术后局部复发率高达30-50%（参见文献Hart R.A.,BorianiS.,Biagini R.,et al.A system for surgical staging and management of spine tumors.Aclinical outcome study of giant cell tumors of the spine[J].Spine(Phila Pa1976),1997,22(15):1773-1782;discussion1783.）。对于脊柱GCT术后复发的患者，由于局部解剖结构的改变，肿瘤恶性程度的升级，使得再次手术切除的难度明显加大，甚至无法进行手术。

因此，预防和治疗脊柱GCT已成为脊柱肿瘤外科领域的一大难题，亟需探寻新的治疗方法。

探寻新的治疗方法和靶向药物，首先需要对GCT的生物学特征进行深入的剖析并建立相应的动物模型。组织学研究表明，GCT包含三种特征的细胞，即具有肿瘤特性的纺锤形基质细胞、破骨细胞特征的多核巨细胞和圆形的单核细胞。多核巨细胞其具有CD14+和CD68+（参见文献Huang T.S.,Green A.D.,Beattie C.W.,et al.Monocyte-macrophage lineage of giant cell tumor of bone.Establishment of a multinucleated cell line[J].Cancer,1993,71(5):1751-1760.；Liao T.S.,Yurgelun M.B.,Chang S.S.,et al.Recruitment of osteoclast precursors bystromal cell derived factor-1(SDF-1)in giant cell tumor of bone[J].J Orthop Res,2005,23(1):203-209.），CD14是外周血单核细胞的特异性标记物之一，而CD68是巨噬细胞的标记物。由此表明，GCT多核巨细胞来源于血液中的单核细胞融合而成。基质细胞由于表达成骨细胞的早期标记物（参见文献Salerno M.,AvnetS.,Alberghini M.,et al.Histogenetic characterization of giant cell tumor of bone[J].Clin Orthop Relat Res,2008,466(9):2081-2091.）被认为来源于骨髓间充质干细胞。通过氚标记和DNA阵列、端粒酶活性、染色体拷贝数等技术证明了GCT基质细胞具有遗传不稳定性的特征（参见文献Roessner A.,von Bassewitz D.B.,Schlake W.,et al.Biologic characterization of human bone tumors.III.Giant celltumor of bone.A combined electron microscopical,histochemical,andautoradiographical study[J].Pathol Res Pract,1984,178(5):431-440.；MoskovszkyL.,Szuhai K.,Krenacs T.,et al.Genomic instability in giant cell tumor of bone.Astudy of 52cases using DNA ploidy,relocalization FISH,and array-CGH analysis[J].Genes Chromosomes Cancer,2009,48(6):468-479.；Gorunova L.,Vult von SteyernF.,Storlazzi C.T.,et al.Cytogenetic analysis of 101giant cell tumors of bone:nonrandom patterns of telomeric associations and other structural aberrations[J].Genes Chromosomes Cancer,2009,48(7):583-602.；Forsyth R.G.,De Boeck G.,Bekaert S.,et al.Telomere biology in giant cell tumour of bone[J].J Pathol,2008,214(5):555-563.；Gebre-Medhin S.,Broberg K.,Jonson T.,et al.Telomericassociations correlate with telomere length reduction and clonal chromosomeaberrations in giant cell tumor of bone[J].Cytogenet Genome Res,2009,124(2):121-127.）。因此，基质细胞被认为是GCT中的肿瘤成分。

然而，采用分离后的基质细胞进行裸鼠体内荷瘤实验并不能复制出临床GCT的病理学特征（参见文献Haque A.U.,Moatasim A.Giant cell tumor of bone:a neoplasm or a reactive condition?[J].Int J Clin Exp Pathol,2008,1(6):489-501.）。另外，通过将组织块直接接种在鸡胚绒毛囊膜上可短期维持GCT组织的存活，但周期只有10天（参见文献Balke M.,Neumann A.,Szuhai K.,et al.A short-term invivo model for giant cell tumor of bone[J].BMC Cancer,2011,11:241.）。所以，目前尚无文献报道有关成功构建人骨巨细胞瘤动物模型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人骨巨细胞瘤小鼠动物模型。

本发明所要解决的技术问题是提供一种人骨巨细胞瘤小鼠动物模型的构建。

本发明的主要技术方案是，将从人骨巨细胞瘤组织分离培养的原代细胞注射到裸小鼠的胫骨内，得到的人骨巨细胞瘤小鼠动物模型。

本发明的第一方面，是提供了一种人骨巨细胞瘤小鼠动物模型的构建方法，该方法包括如下步骤：

（A）从骨巨细胞瘤的临床手术标本中分离出人的骨巨细胞瘤原代细胞；

（B）将原代培养的骨巨细胞瘤细胞用PBS洗涤，经0.25%胰酶消化，血细胞计数器计数，采用PBS重悬，使细胞终浓度为5×10⁴个/ul人骨巨细胞瘤原代细胞；

（C）采用显微注射器在X线观察下，将10～30ul步骤（B）得到的人骨巨细胞瘤原代细胞注射到裸小鼠的胫骨内；

（D）采用X线观察裸小鼠胫骨的骨质变化情况。

所述的步骤（B），具体为：将原代培养的骨巨细胞瘤细胞用PBS洗涤2遍，经0.25%胰酶37℃消化3分钟，用等体积含有10%FBS的α-MEM中和，800rmp离心5min，血细胞计数器计数，去上清后采用PBS重悬，使细胞终浓度为5×10⁴个/ul人骨巨细胞瘤原代细胞。

所述的步骤（C），具体为：采用显微注射器在X线观察下，将20ul步骤（B）得到的人骨巨细胞瘤原代细胞注射到裸小鼠的胫骨内。

所述的步骤（D）之后，还包括步骤（E）即：取出裸小鼠胫骨，经4%多聚甲醛固定后石蜡包埋，再经切片制成4uM组织切片，采用HE、TRAP和抗人线粒体染色，观察骨组织大体形态、破骨细胞活性及细胞来源。

所述的步骤（E），具体为：胫骨内注射原代骨巨细胞瘤细胞2个月后，麻醉处死裸小鼠，取出胫骨经4%多聚甲醛固定24h后，经0.5M的EDTA脱钙10天，再经梯度乙醇、二甲苯、石蜡浸泡（即脱水至蜡处理），石蜡包埋，切成4uM厚度切片。采用HE、TRAP及抗人线粒体免疫荧光染色，发现人骨巨细胞瘤骨损伤模型中的溶骨性损害特征与临床上骨巨细胞瘤的病理特征相似，可激活大量的破骨细胞从而导致溶骨性破坏，存活在裸小鼠胫骨内的细胞经抗人线粒体免疫荧光染色显示为阳性，表明其来源于人的骨巨细胞瘤基质细胞。

本发明的第二方面，是提供了一种根据上述构建方法得到的人骨巨细胞瘤小鼠动物模型，该人骨巨细胞瘤小鼠动物模型具有以下特征：

1、经注射人骨巨细胞瘤原代细胞后的裸小鼠胫骨的溶骨性损害特征与骨巨细胞瘤的临床X线表现一致，即为单纯性的溶骨性破坏，无骨膜反应；

2、HE染色可观察到与X线部位一致的溶骨性破坏；TRAP染色显示原代骨巨细胞瘤细胞可引起裸小鼠胫骨近端破骨细胞活化，引起溶骨性破坏；抗人线粒体免疫荧光染色可观察到骨破坏区域的细胞具有抗人线粒体免疫荧光阳性染色，表明其来源于人的骨巨细胞瘤细胞。

本发明的第三方面，是提供了上述人骨巨细胞瘤小鼠动物模型在筛选治疗人骨巨细胞瘤的药物中的应用。

本发明的构建方法独特，技术操作简便，动物模型成功率高。实验资料证明：所建立的人骨巨细胞瘤骨损伤小鼠动物模型中的溶骨性损害特征与临床上骨巨细胞瘤的病理特征相似，存活的细胞为来源于人的骨巨细胞瘤基质细胞。应用此种骨巨细胞瘤骨损伤小鼠动物模型可以用于系统研究骨巨细胞瘤的发病机制和进一步筛选治疗骨巨细胞瘤的药物。

附图说明

图1为体外培养的原代骨巨细胞瘤细胞相差图；

其中A-C为3个骨巨细胞瘤患者肿瘤组织分离培养的原代细胞，图中＊所示为多核的巨细胞，＞所示为单核细胞，→所示为梭形或纺锤形的基质细胞。由图可见，分离培养的骨巨细胞瘤原代细胞包含骨巨细胞瘤各种细胞成分。

图2为裸小鼠胫骨内注射方法示意图；

基中A为胫骨注射的示意图；B为X线下观察到的显微注射针的进针位置。胫骨注射时，采用阿弗丁将裸小鼠麻醉后，暴露胫骨，采用纤维注射针缓慢左右旋转进针，经X线确定显微注射针已进入胫骨髓腔，缓慢将20ul的骨巨细胞瘤原代细胞注射到胫骨髓腔内，缝合切口。

图3为骨巨细胞瘤原代细胞注射到裸小鼠胫骨前后的X线表现图；

X线可观察到，在裸小鼠胫骨近端（即干骺端）部位出现了单纯性溶骨性破坏。

图4为胫骨切片的HE染色图。

图5为胫骨切片的TRAP染色图；

其中A和D为4倍物镜观察到的裸小鼠注射原代骨巨细胞瘤细胞后的TRAP染色结果；B和E为局部放大TRAP染色结果；C和F为B和E对应的HE染色结果。由图可见，裸小鼠注射原代骨巨细胞瘤细胞后可引起TRAP染色增强，表明破骨细胞活性明显升高。

图6为抗人线粒体（anti-human mitochondria）免疫荧光染色图；

其中A为抗人线粒体免疫荧光染色(绿色)；B为DAPI染色（蓝色），即所有细胞核着色；C为A和B的叠加图片；D为C对应的HE染色。由图可见，在骨损伤部位可观察到抗人线粒体阳性染色的细胞，提示该细胞来源于人。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：本发明的人骨巨细胞瘤骨损伤小鼠动物模型的构建

1、骨巨细胞瘤原代细胞的分离与培养

将临床组织活检诊断为骨巨细胞瘤的手术标本放置于生理盐水中，在无菌条件下清除肿瘤组织表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织，用灭菌后的眼科剪将组织剪碎，经无菌PBS洗2-3次，加入少量PBS，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm³大小。加入Ⅱ型胶原酶，37℃消化30min，加入5ml含10%FBS的α-MEM培养基终止消化，经100um过滤网过滤，800rmp离心5min，去除上清，加入10ml含10%FBS的α-MEM培养基重悬细胞，将细胞悬液接种于10cm的培养皿中，置于5%CO₂培养箱内，37℃静置培养，两天换液一次，待细胞生长至80%时，经0.25%胰酶37℃消化，按1:3传代培养。待细胞贴壁后倒置相差显微镜可观察到原代分离的骨巨细胞瘤细胞包含骨巨细胞瘤的三种细胞成分。（如图1所示）

2、人骨巨细胞瘤裸小鼠动物模型的制备

将原代培养的骨巨细胞瘤细胞采用PBS洗涤2遍，经0.25%胰酶37℃消化3分钟，倒置相差显微镜下观察，发现细胞变圆、收缩突起时，以等体积含有10%FBS的α-MEM终止消化，收集细胞悬液，800rmp离心5min，经血细胞计数器计数后，去除上清后采用PBS重悬，使细胞终浓度为5×10⁴个/ul人骨巨细胞瘤原代细胞。

如图2所示的方法，采用眼科剪剪开裸小鼠膝关节处皮肤，暴露胫骨，在X线观察下显微注射器针头插入裸小鼠胫骨内，将20ul上述人骨巨细胞瘤原代细胞注射到裸小鼠的胫骨髓腔内，每周经X线观察一次裸小鼠胫骨的骨质变化情况。

实施例2：实施例1构建方法得到的人骨巨细胞瘤小鼠动物模型的特征研究

实施例1胫骨内注射原代骨巨细胞瘤细胞2个月后，麻醉处死裸小鼠，取出胫骨经4%多聚甲醛固定24h后，0.5M的EDTA脱钙处理10天，再经梯度乙醇、二甲苯、石蜡浸泡（即脱水至蜡处理），石蜡包埋，切成4uM厚度切片。采用HE、TRAP及抗人线粒体免疫荧光染色，观察裸小鼠胫骨大体形态学变化、破骨细胞活性及细胞来源的情况。

1、经注射人骨巨细胞瘤原代细胞后的裸小鼠胫骨的溶骨性损害特征与骨巨细胞瘤的临床X线表现一致，即为单纯性的溶骨性破坏，无骨膜反应（如图3所示）；

2、HE染色可观察到与X线部位一致的溶骨性破坏（如图4所示）；TRAP染色显示原代骨巨细胞瘤细胞可引起裸小鼠胫骨近端破骨细胞活化，引起溶骨性破坏（如图5所示）；抗人线粒体免疫荧光染色可观察到骨破坏区域的细胞具有抗人线粒体免疫荧光阳性染色，表明其来源于人的骨巨细胞瘤细胞（如图6所示）。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (7)

1.一种人骨巨细胞瘤小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（A）从骨巨细胞瘤的临床手术标本中分离出人的骨巨细胞瘤原代细胞；

（B）将原代培养的骨巨细胞瘤细胞用PBS洗涤，经0.25%胰酶消化，血细胞计数器计数，采用PBS重悬，使细胞终浓度为5×10⁴个/ul人骨巨细胞瘤原代细胞；

（C）采用显微注射器在X线观察下，将10～30ul步骤（B）得到的人骨巨细胞瘤原代细胞注射到裸小鼠的胫骨内；

（D）采用X线观察裸小鼠胫骨的骨质变化情况。

2.根据权利要求1所述的一种人骨巨细胞瘤小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述的步骤（B），具体为：将原代培养的骨巨细胞瘤细胞用PBS洗涤2遍，经0.25%胰酶37℃消化3分钟，用等体积含有10%FBS的α-MEM中和，800rmp离心5min，血细胞计数器计数，去上清后采用PBS重悬，使细胞终浓度为5×10⁴个/ul人骨巨细胞瘤原代细胞。

3.根据权利要求1所述的一种人骨巨细胞瘤小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述的步骤（C），具体为：采用显微注射器在X线观察下，将20ul步骤（B）得到的人骨巨细胞瘤原代细胞注射到裸小鼠的胫骨内。

4.根据权利要求1所述的一种人骨巨细胞瘤小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述的步骤（D）之后，还包括步骤（E）即：取出裸小鼠胫骨，经4%多聚甲醛固定后石蜡包埋，再经切片制成4uM组织切片，采用HE、TRAP和抗人线粒体染色，观察骨组织大体形态、破骨细胞活性及细胞来源。

5.根据权利要求4所述的一种人骨巨细胞瘤小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述的步骤（E），具体为：胫骨内注射原代骨巨细胞瘤细胞2个月后，麻醉处死裸小鼠，取出胫骨经4%多聚甲醛固定24h后，经0.5M的EDTA脱钙10天，再经梯度乙醇、二甲苯、石蜡浸泡，石蜡包埋，切成4uM厚度切片。

6.一种如权利要求1至5任一所述的人骨巨细胞瘤小鼠动物模型的构建方法得到的人骨巨细胞瘤小鼠动物模型。

7.根据权利要求6所述的人骨巨细胞瘤小鼠动物模型在筛选治疗人骨巨细胞瘤的药物中的应用。