CN107921173B - 细胞结构体、非人模型动物、非人模型动物的制造方法及被检验物质的评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供一种具有丰富的间质组织的非人模型动物、在上述非人模型动物的制造中有用的细胞结构体、使用了上述非人模型动物的被检验物质的评价方法以及上述非人模型动物的制造方法。根据本发明，提供一种细胞结构体，其包含生物相容性高分子嵌段物和至少癌细胞及间充质细胞，在多个上述细胞之间的间隙中配置有多个上述生物相容性高分子嵌段物。

Description

细胞结构体、非人模型动物、非人模型动物的制造方法及被检 验物质的评价方法
技术领域
本发明涉及一种在针对癌症疾病的非人模型动物的制造中有用的细胞结构体。本发明还涉及针对癌症疾病的非人模型动物及其制造方法。本发明还涉及一种使用了上述非人模型动物的被检验物质的评价方法。
背景技术
作为癌症的一例的胰腺癌是平均生存期间为3～6个月的难治性癌症。胰腺癌等癌症治疗药物的研发中利用各种动物模型。例如，使用作为将人胰腺癌细胞移植到免疫缺陷小鼠的异种移植(Xenograft)模型的荷瘤小鼠模型。但是，尤其胰腺癌等某种癌症中，间质丰富且纤维化显著，因此在如上述那样的动物模型中，可知间质组织未充分生长，且与实际胰腺癌的状态有很大差异，其结果不适合有效的癌症治疗药物的研发。实际上，已知通过上述动物模型而作为有效的治疗药物而研发的吉西他滨在人体中未显示充分的有效性。报告有其原因为如下：实际胰腺癌中，间质(stroma tissue：基质组织)为纤维性且血管不畅，因此吉西他滨到达不了癌细胞而引起(非专利文献1)。
另一方面，专利文献1中记载有一种细胞结构体，该细胞结构体包含具有生物相容性的高分子嵌段物和细胞，且在上述多个细胞之间的间隙配置有多个上述高分子嵌段物。专利文献1中所记载的细胞结构体中，能够从外部向细胞结构体的内部传递营养，且具有充分的厚度，并且细胞在结构体中均匀存在。专利文献1的实施例中，使用由重组明胶或天然明胶原材料组成的高分子嵌段物证实高细胞生存活性。并且，专利文献2中记载有一种细胞移植用细胞结构体，该细胞移植用细胞结构体包含具有生物相容性的高分子嵌段物和至少一种细胞，且在上述多个细胞之间的间隙配置有多个上述高分子嵌段物。
以往技术文献
非专利文献
非专利文献1：Science 324：1457-1461,2009Inhibition of HedgehogSignaling Enhances Delivery of Chemotherapy in a Mouse Model of PancreaticCancer
专利文献
专利文献1：国际公开WO2011/108517号
专利文献2：日本特开2014-12114号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
为了作为胰腺癌等癌症的评价模型而提供具有丰富的间质组织的评价模型，通过将来源于癌症患者的肿瘤组织移植到小鼠，尝试得到具有间质的评价模型，且作为PDX(Patient-derived xenograft：来源于患者的异种移植)进行了多种研究。然而，得知实际上未形成充分的间质组织。来源于癌症患者的肿瘤组织为肿瘤组织中的多种细胞或细胞外基质等混合物，因此无法确定内容物的组成，其结果，间质形成丰富，或者贫乏，成为通过评价模型得到的结果有偏差的原因。并且，使用来源于癌症患者的组织，因此还无法稳定地增幅，从而还存在能够用作同一评价模型的检查数有界限的问题。
如上述，期待研发一种能够通过体内对癌症进行评价且具有丰富的间质组织的非人模型动物。本发明应解决的课题为提供一种具有丰富的间质组织的非人模型动物。本发明应解决的课题为提供一种在上述非人模型动物的制造中有用的细胞结构体、使用了上述非人模型动物的被检验物质的评价方法、以及上述非人模型动物的制造方法。
用于解决技术课题的手段
本发明人等为了解决上述课题而进行深入研究的结果，发现如下：制作包含生物相容性高分子嵌段物且包含癌细胞及间充质细胞的细胞结构体，并将上述细胞结构体移植到小鼠，由此能够制造具有丰富的间质组织的癌症体内评价模型动物。本发明是基于这些见解而完成的。
即，根据本发明，提供以下发明。
(1)一种细胞结构体，其包含生物相容性高分子嵌段物和至少癌细胞及间充质细胞，在多个上述细胞之间的间隙配置有多个上述生物相容性高分子嵌段物。
(2)根据(1)所述的细胞结构体，为了制作非人模型动物将该细胞结构体移植到非人动物。
(3)根据(1)或(2)所述的细胞结构体，其中，
上述癌细胞为已建株的癌细胞。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的细胞结构体，其中，
上述癌细胞为胰腺癌细胞。
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的细胞结构体，其中，
上述间充质细胞为间充质干细胞。
(6)根据(1)至(5)中任一项所述的细胞结构体，其中，
生物相容性高分子为重组明胶。
(7)根据(6)所述的细胞结构体，其中，
重组明胶由下述式表示，
式：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列，n个X分别独立地表示氨基酸的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸的任一种，n表示3～100的整数，m表示2～10的整数，另外，n个Gly-X-Y可以彼此相同，也可以不同。
(8)根据(6)或(7)所述的细胞结构体，其中，
重组明胶为如下中的任一个：
由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
由序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、替换或添加有一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽；或
由与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽。
(9)一种针对癌症疾病的非人模型动物，其具有细胞结构体来作为移植物，该细胞结构体包含生物相容性高分子嵌段物和至少癌细胞及间充质细胞，在多个上述细胞之间的间隙配置有多个上述生物相容性高分子嵌段物。
(10)根据(9)所述的非人模型动物，其中，
上述癌细胞为已建株的癌细胞。
(11)根据(9)或(10)所述的非人模型动物，其中
上述癌细胞为胰腺癌细胞，上述癌症疾病为胰腺癌。
(12)根据(9)至(11)中任一项所述的非人模型动物，其中，
上述间充质细胞为间充质干细胞。
(13)根据(9)至(12)中任一项所述的非人模型动物，其中，
细胞结构体的移植部位为皮下。
(14)根据(9)至(13)中任一项所述的非人模型动物，其中，
免疫力下降，或者免疫缺陷。
(15)一种针对癌症疾病的非人模型动物的制造方法，其包含将权利要求1至8中任一项所述的细胞结构体移植到非人动物的步骤。
(16)一种被检验物质的评价方法，其包含对(9)至(14)中任一项所述的非人模型动物给予被检验物质的步骤。
发明效果
本发明的细胞结构体在制作具有丰富的间质组织的非人模型动物时有用。本发明的非人模型动物具有丰富的间质组织，因此作为针对癌症疾病的模型动物而有用。根据基于本发明的非人模型动物及其制造方法，能够提供上述针对癌症疾病的模型动物。根据基于本发明的被检验物质的评价方法，能够有效地进行药物的评价。
附图说明
图1表示实施例的条件A的液温分布。
图2表示实施例的条件B的液温分布。
图3表示实施例的条件C的液温分布。
图4表示用显微镜观察添加了生物相容性高分子嵌段物的镶嵌细胞块和未添加生物相容性高分子嵌段物的细胞块的结果。
图5表示将添加了生物相容性高分子嵌段物的镶嵌细胞块或未添加生物相容性高分子嵌段物的细胞块移植到动物并观察的结果。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行详细说明。
本发明涉及一种细胞结构体，该细胞结构体包含生物相容性高分子嵌段物和至少癌细胞及间充质细胞，在多个上述细胞之间的间隙配置有多个上述生物相容性高分子嵌段物。而且本发明涉及一种针对具有上述细胞结构体来作为移植物的癌症疾病的非人模型动物、使用了上述非人模型动物的被检验物质的评价方法及上述非人模型动物的制造方法。
另外，在本说明书中，有时将本发明的细胞结构体称为镶嵌细胞块(呈镶嵌状细胞块)。
本发明中，通过将包含生物相容性高分子嵌段物和癌细胞及间充质细胞的细胞结构体移植到非人动物，能够制造具有丰富的间质组织的癌症体内评价模型动物。与不使用生物相容性高分子嵌段物，将包含癌细胞及间充质细胞的细胞块移植到非人动物来制造模型动物的情况相比，能够制作具有更丰富的间质组织的非人模型动物的情况为通过本发明初次发现的见解，是以往完全无法预料的意外的情况。
通过实现了本发明，从其结果考虑，认为生物相容性高分子嵌段物有助于癌细胞和间充质细胞的植入的同时对癌细胞与间充质细胞之间提供适当的空间，由此能够良好地提供用于间质形成的空间。能够考察到通过提供用于间质形成的空间，形成无法仅由间充质细胞和癌细胞生成的间质组织。
(1)生物相容性高分子嵌段物
(1-1)生物亲和性高分子
生物亲和性是指，与生物接触时，不会引起如长期且慢性炎症反应等明显的不良反应。若本发明中所使用的生物相容性高分子对生物具有相容性，则对于是否在生物内被降解并无特别限定，优选为生物降解性高分子。作为非生物降解性材料，具体而言，可列举聚四氟乙烯(PTFE)、聚氨酯、聚丙烯、聚酯、氯乙烯、聚碳酸酯、丙烯、不锈钢、钛、硅及MPC(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)等。作为生物降解性材料，具体而言，可列举重组肽或化学合成肽等多肽(例如，以下进行说明的明胶等)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、甲壳素及壳聚糖等。上述中，尤其优选重组肽。可以将这些生物相容性高分子设计成提高细胞粘合性。具体而言，能够使用“基于对基材表面的细胞粘合基质(纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白)或细胞粘合序列(以氨基酸单字母符号表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列)肽的涂层”、“基材表面的氨基酸化、阳离子化”或“基材表面的等离子体处理、基于电晕放电的亲水处理”等方法。
若包含重组肽或化学合成肽的多肽的种类具有生物相容性，则并无特别限定，例如优选明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、Pronectin、层粘连蛋白、肌腱蛋白、腱生蛋白、纤维蛋白、丝蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白，最优选为明胶、胶原蛋白、去端肽胶原蛋白。作为本发明中所使用的明胶，优选为天然明胶、重组明胶或化学合成明胶，更优选为重组明胶。在此所述的天然明胶是指由天然来源的胶原蛋白制成的明胶。
化学合成肽或化学合成明胶是指人工合成的肽或明胶。明胶等肽的合成可以是固相合成，也可以是液相合成，优选为固相合成。本领域技术人员熟知肽的固相合成，例如可列举作为氨基的保护而使用Fmoc基(Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基：芴-甲氧基-羰基)的Fmoc基合成法、以及作为氨基的保护而使用Boc基(tert-Butyl Oxy Carbonyl基：叔丁基氧基羰基)的Boc基合成法等。另外，化学合成明胶的优选方式能够套用本说明书中后述的(1-3)重组明胶中所记载的内容。
关于重组明胶，在本说明书中进行后述。
本发明中所使用的生物相容性高分子的亲水性值“1/IOB”值优选0～1.0。更优选为0～0.6，进一步优选为0～0.4。IOB为基于由藤田穆提出的表示有机化合物的极性/非极性的有机示意图的亲疏水性的指标，其详细内容例如在“Pharmaceutical Bulletin：药学通报”，vol.2,2,pp.163-173(1954)、“化学领域”vol.11,10,pp.719-725(1957)、“Fragrance Journal”，vol.50,pp.79-82(1981)等中进行了说明。简单而言，将所有的有机化合物的来源设为甲烷(CH4)，且将其他化合物均视为甲烷的衍生物来将其碳原子数、取代基、转变部、环等分别设定为规定数值，相加其分数来求出有机性值(OV)、无机性值(IV)，并将该值标绘在以有机性值作为X轴，以无机性值作为Y轴的图上。有机示意图中的IOB是指，有机示意图中的无机性值(IV)相对于有机性值(OV)之比、即“无机性值(IV)/有机性值(OV)”。关于有机示意图的详细内容，可参考“新版有机示意图-基础与应用”(甲田善生等编著，三共出版、2008)。本说明书中，以取IOB的倒数的“1/IOB”值表示亲疏水性。标注为“1/IOB”值越小(接近0)，越表示亲水性。
通过将本发明中所使用的高分子的1/IOB”值设为上述范围，亲水性高，并且吸水性变高，因此有效地作用于营养成分的保持。
当本发明中所使用的生物相容性高分子为多肽时，由Grand average ofhydropathicity(亲水性平均值)(GRAVY)值表示的亲疏水性指标中，优选为0.3以下且负9.0以上，更优选为0.0以下且负7.0以上。Grand average of hydropathicity(GRAVY)值能够通过“Gasteiger E.,Hoogland C.,Gattiker A.,Duvaud S.,Wilkins M.R.,AppelR.D.,Bairoch A.；Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASyServer；(In)John M.Walker(ed)：The Proteomics Protocols Handbook,Humana Press(2005).pp.571-607”及“Gasteiger E.,Gattiker A.,Hoogland C.,Ivanyi I.,AppelR.D.,Bairoch A.；ExPASy：the proteomics server for in-depth protein knowledgeand analysis.；Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003).”的方法而得到。
通过将本发明中所使用的高分子的GRAVY值设为上述范围，亲水性高，并且吸水性变高，因此有效地作用于营养成分的保持。
(1-2)交联
本发明中所使用的生物相容性高分子可以被交联，也可以不被交联，但优选被交联。通过使用被交联的生物相容性高分子，可得到防止在培养基中培养时及移植到生物时瞬间降解的效果。作为通常的交联方法，已知有热交联、基于醛类(例如，甲醛、戊二醛等)的交联、基于缩合剂(碳二亚胺、氰胺等)的交联、酶交联、光交联、紫外线交联、疏水性相互作用、氢键、离子性相互作用等，本发明中也能够使用上述交联方法。作为本发明中所使用的交联方法，更优选为热交联、紫外线交联或酶交联，尤其优选为热交联。
当进行基于酶的交联时，作为酶，若具有高分子材料之间的交联作用，则并无特别限制，优选能够使用谷氨酰胺转氨酶及漆酶，最优选使用谷氨酰胺转氨酶来进行交联。作为用谷氨酰胺转氨酶进行酶交联的蛋白质的具体例，若为具有赖氨酸残基及谷氨酰胺残基的蛋白质，则并无特别限制。谷氨酰胺转氨酶可以是哺乳类来源的谷氨酰胺转氨酶，也可以是微生物来源的谷氨酰胺转氨酶，具体而言，可列举AJINOMOTO CO.,INC.制ACTIVA系列、作为试剂而出售的哺乳类来源的谷氨酰胺转氨酶、例如，Oriental Yeast Co.,ltd.制、UpstateUSA Inc.制、Biodesign International制等豚鼠肝脏来源谷氨酰胺转氨酶、山羊来源谷氨酰胺转氨酶、兔子来源谷氨酰胺转氨酶等、人来源凝血因子(Factor XIIIa，HaematologicTechnologies,Inc.)等。
进行交联(例如，热交联)时的反应温度只要能够进行交联，则并无特别限定，优选为-100℃～500℃，更优选为0℃～300℃，进一步优选为50℃～300℃，进一步优选为100℃～250℃，进一步优选为120℃～200℃。其中，T〔开尔文：K〕＝t〔摄氏度：℃〕+273.15。
(1-3)重组明胶
本发明中所述的重组明胶是指，通过基因重组技术制成的类似明胶的具有氨基酸序列的多肽或蛋白样物质。本发明中能够使用的重组明胶优选具有对胶原蛋白由特征性Gly-X-Y表示的序列(X及Y分别独立地表示氨基酸的任一种)的重复。其中，多个Gly-X-Y可以分别相同，也可以不同。优选在一分子中含有两个序列以上的细胞粘合信号。作为本发明中所使用的重组明胶，能够使用具有来源于胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶。例如，能够使用EP1014176、US专利6992172号、国际公开WO2004/85473、国际公开WO2008/103041等中所记载的重组明胶，但并不限定于此。作为本发明中所使用的重组明胶而优选的重组明胶为以下形态的重组明胶。
重组明胶因天然明胶本来的性能而生物相容性优异，并且因非天然来源而不存在牛海绵状脑病(BSE)等忧患，从而非感染性优异。并且，与天然明胶相比，重组明胶均匀，且序列已确定，因此在强度及降解性方面也能够通过交联等而模糊较少且精密设计。
重组明胶的分子量并无特别限定，优选为2000以上且100000以下(2kDa以上且100kDa以下)，更优选为2500以上且95000以下(2.5kDa以上且95kDa以下)，进一步优选为5000以上且90000以下(5kDa以上且90kDa以下)，最优选为10000以上且90000以下(10kDa以上且90kDa以下)。
重组明胶优选具有对胶原蛋白由特征性Gly-X-Y表示的序列的重复。其中，多个Gly-X-Y可以彼此相同，也可以彼此不同。Gly-X-Y中，Gly表示甘氨酸，X及Y表示任意氨基酸(优选为除甘氨酸以外的任意氨基酸)。对胶原蛋白由特征性Gly-X-Y表示的序列为与明胶-胶原蛋白的氨基酸组成及序列中的其他蛋白质相比非常特殊的部分结构。在该部分，甘氨酸占整体的约3分之1，在氨基酸序列按三个重复一个。甘氨酸为最简单的氨基酸，对分子链的配置的束缚也较少，且在凝胶化时大大有助于螺旋结构的再生。由X及Y表示的氨基酸含有较多的亚氨基酸(脯氨酸、氧脯氨酸)，优选占整体的10％～45％。优选重组明胶的序列的80％以上，更优选95％以上，最优选99％以上的氨基酸为Gly-X-Y的重复结构。
通常的明胶中，极性氨基酸中的带电荷的氨基酸与无电荷的氨基酸以1:1存在。在此，极性氨基酸具体指半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸及精氨酸，其中极性无电荷氨基酸是指半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸。本发明中所使用的重组明胶中，构成的所有的氨基酸中的极性氨基酸的比例为10～40％，优选为20～30％。并且，优选上述极性氨基酸中的无电荷氨基酸的比例为5％以上且小于20％，优选为小于10％。而且，优选在序列上不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸中的任一个氨基酸，优选不包含两个以上的氨基酸。
通常多肽中，已知作为细胞粘合信号而作动的最小氨基酸序列(例如，NagaiShoten Co.,Ltd.发行的“病状生理”Vol.9、No.7(1990年)527页)。本发明中所使用的重组明胶优选在一分子中具有两个以上的这些细胞粘合信号。作为具体的序列，从粘合的细胞的种类多的方面考虑，优选以氨基酸单字母符号表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列的序列。更优选为RGD序列、YIGSR序列、PDSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列及HAV序列，尤其优选为RGD序列。RGD序列中，优选为ERGD序列。通过使用具有细胞粘合信号的重组明胶，能够提高细胞的基质产量。例如，作为细胞，在使用了间充质干细胞的软骨分化的情况下，能够提高糖胺聚糖(GAG)的产生。
作为本发明中所使用的重组明胶中的RGD序列的配置，优选RGD之间的氨基酸数在0～100之间，优选在25～60之间并不均匀。
关于该最小氨基酸序列的含量，从细胞粘合、增生的观点考虑，在蛋白质1分子中优选为3～50个，更优选为4～30个，尤其优选为5～20个。最优选为12个。
本发明中所使用的重组明胶中，优选RGD基序相对于氨基酸总数的比例至少为0.4％。当重组明胶包含350以上的氨基酸时，优选350个氨基酸的各段至少包含一个RGD基序。RGD基序相对于氨基酸总数的比例进一步优选至少为0.6％，进一步优选至少为0.8％，进一步优选至少为1.0％，进一步优选至少为1.2％，最优选至少为1.5％。重组肽内的RGD基序的数量在每250个氨基酸优选至少为4个，进一步优选为6个，进一步优选为8个，进一步优选为12个以上且16个以下。RGD基序的0.4％的比例对应于在每250的氨基酸为至少一个RGD序列。RGD基序的数量为整数，因此为了满足0.4％的特征，由251个氨基酸组成的明胶应至少包含两个RGD序列。优选本发明的重组明胶在每250个氨基酸至少包含两个RGD序列，更优选在每250个氨基酸至少包含三个RGD序列，进一步优选在每250个氨基酸包含至少4个RGD序列。作为本发明的重组明胶的又一方式，包含至少4个RGD基序，优选包含6个，更优选包含8个，进一步优选包含12个以上且16个以下的RGD基序。
重组明胶可以部分水解。
优选本发明中所使用的重组明胶由式1：A-[(Gly-X-Y)n]m-B表示。n个X分别独立地表示氨基酸的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸的任一种。m优表示2～10的整数，更优选表示3～5的整数。n优选为3～100的整数，更优选为15～70的整数，最优选为50～65的整数。A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列。另外，n个Gly-X-Y可以分别相同，也可以不同。
更优选本发明中所使用的重组明胶由式：Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly(式中，63个X分别独立地表示氨基酸的任一种，63个Y分别独立地表示氨基酸的任一种。另外，63个Gly-X-Y可以分别相同，也可以不同。)表示。
优选重复单元与多个天然存在的胶原蛋白的序列单元结合。在此所述的天然存在的胶原蛋白只要是天然存在的，则并无限制，优选为I型、II型、III型、IV型或V型胶原蛋白。更优选为I型、II型或III型胶原蛋白。根据另一方式，上述胶原蛋白的来源优选为人、牛、猪、小鼠或大鼠，更优选为人。
本发明中所使用的重组明胶的等电点优选为5～10，更优选为6～10，进一步优选为7～9.5。关于重组明胶的等电点的测定，如等电点电泳法(Maxey,C.R.(参考1976；Phitogr.Gelatin 2,Editor Cox,P.J.Academic,London,Engl.))中所记载，能够通过对将1质量％明胶溶液通入阳离子及阴离子交换树脂的混晶柱之后的pH进行测定来实施。
优选重组明胶没有被脱氨化。
优选重组明胶不具有端肽。
优选重组明胶为由对氨基酸序列进行编码的核酸制备的实质上纯多肽。
作为本发明中所使用的重组明胶，尤其优选如下中的任一个：
(1)由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
(2)由序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、替换或添加有一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽；或
(3)由与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上(更优选为90％以上，尤其优选为95％以上，最优选为98％以上)的序列同源性的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽。
“缺失、替换或添加有一个或多个氨基酸的氨基酸序列”中的“一个或多个”是指，优选1～20个，更优选1～10个，进一步优选1～5个，尤其优选1～3个。
关于本发明中所使用的重组明胶，本领域技术人员能够通过公知的基因重组技术而制造，例如能够依照EP1014176A2号公报、美国专利第6992172号公报、国际公开WO2004/85473号、国际公开WO2008/103041号等中所记载的方法来制造。具体而言，获取对规定的重组明胶的氨基酸序列进行编码的基因，将其安装于表达载体来制作重组表达载体，并将其导入适当的宿主来形成转化体。通过使用适当的培养基对所得到的转化体进行培养而产生重组明胶，因此能够通过回收从培养物产生的重组明胶来制备本发明中所使用的重组明胶。
(1-4)生物相容性高分子嵌段物
本发明中，使用由上述生物相容性高分子组成的嵌段物(块)。
本发明中的生物相容性高分子嵌段物的形状并无特别限定。例如，为无规则形、球状、粒状(颗粒)、粉状、多孔状、纤维状、纺锤状、扁平状及片状，优选无规则形、球状、粒状(颗粒)、粉状及多孔状。无规则形表示表面形状不均匀的形状，例如表示具有如岩石那样的凹凸的物体。另外，上述形状的例示并不是分别独立的，例如有时作为粒状(颗粒)的下位概念的一例而成为无规则形。
本发明中的一个生物相容性高分子嵌段物的大小并无特别限定，优选为1μm以上且700μm以下，更优选为10μm以上且700μm以下，进一步优选为10μm以上且300μm以下，进一步优选为20μm以上且200μm以下，进一步优选为20μm以上且150μm以下，尤其优选为53μm以上且106μm以下。通过将一个生物相容性高分子嵌段物的大小设定在上述范围内，能够良好地从外部向细胞结构体的内部传递营养成分。另外，一个生物相容性高分子嵌段物的大小并不是指多个生物相容性高分子嵌段物的大小的平均值在上述范围内，而是指对多个生物相容性高分子嵌段物进行过筛而得到的每一个的生物相容性高分子嵌段物的尺寸。
一个嵌段物的大小能够由对嵌段物进行区分时所使用的筛子的大小来定义。例如，能够将用180μm的筛子进行过筛，并用106μm的筛子对所通过的嵌段物过筛时残留于筛子上的嵌段物设为106～180μm大小的嵌段物。接着，能够将用106μm的筛子进行过筛，并用53μm的筛子对所通过的嵌段物进行过筛时残留于筛子上的嵌段物设为53～106μm大小的嵌段物。接着，能够将用53μm的筛子进行过筛，并用25μm的筛子对所通过的嵌段物进行过筛时残留于筛子上的嵌段物设为25～53μm大小的嵌段物。
(1-5)生物相容性高分子嵌段物的制造方法
生物相容性高分子嵌段物的制造方法并无特别限定，例如使用粉碎机(新动力磨机等)对含有生物相容性高分子的固体物质(生物相容性高分子的多孔体等)进行粉碎，由此能够得到生物相容性高分子嵌段物。含有生物相容性高分子的固体物质(多孔体等)例如能够通过对含有生物相容性高分子的水溶液进行冷冻干燥来得到。
如上述，能够通过对含有生物相容性高分子的固体物质进行粉碎来制造表面形状不均匀的无规则形生物相容性高分子嵌段物。
作为生物相容性高分子的多孔体的制造方法的一例，能够列举如下方法，该方法包括：
工序(a)，在溶液内液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下，并且在溶液内液温最高的部分的温度为溶剂的融点以下，将生物相容性高分子的溶液冷却至未冷冻状态；
工序(b)，对在工序(a)中所得到的生物相容性高分子的溶液进行冷冻；及
工序(c)，对在工序(b)中所得到的已冷冻的生物相容性高分子进行冷冻干燥。
将生物相容性高分子的溶液冷却至未冷冻状态时，液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下(优选2.3℃以下，更优选2.1℃以下)，即通过减小温度差，所得到的多孔体的孔的大小偏差得以减少。另外，液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差的下限并无特别限定，0℃以上即可，例如可以是0.1℃以上、0.5℃以上、0.8℃以上或0.9℃以上。
关于工序(a)的冷却，例如优选经由导热率比水低的原材料(优选特氟龙(注册商标))进行冷却，能够将在溶液内液温最高的部分假设为最远离冷却侧的部分，且能够将在溶液内液温最低的部分假设为冷却面的液温。
优选在工序(a)中，在即将产生凝固热之前的、在溶液内液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下，更优选为2.3℃以下，进一步优选为2.1℃以下。其中，“即将产生凝固热之前的温度差”是指，产生凝固热时的1秒钟前～10秒钟前之间温度差变最大时的温度差。
优选在工序(a)中，在溶液内液温最低的部分的温度为溶剂融点-5℃以下，更优选为溶剂融点-5℃以下且溶剂融点-20℃以上，进一步优选溶剂融点-6℃以下且溶剂融点-16℃以上。另外，溶剂融点的溶剂为生物相容性高分子的溶液的溶剂。
在工序(b)中，对在工序(a)得到的生物相容性高分子的溶液进行冷冻。在工序(b)用于冷冻的冷却温度并无特别限制，还取决于进行冷却的机器，但优选为比在溶液内液温最低的部分的温度低3℃～30℃的温度，更优选为低5℃～25℃的温度，更优选为低10℃～20℃的温度。
在工序(c)中，对在工序(b)得到的已冷冻的生物相容性高分子进行冷冻干燥。冷冻干燥能够通过常规方法进行，例如能够通过在比溶剂的融点低的温度下进行真空干燥，进而在室温(20℃)下进行真空干燥来进行冷冻干燥。
本发明中，优选能够通过对在上述工序(c)得到的多孔体进行粉碎来制造生物相容性高分子嵌段物。
(2)细胞
本发明的细胞结构体至少包含癌细胞及间充质细胞。
作为由癌细胞衍生的具体例，可列举恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、消化道癌、肺癌、食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、结肠癌、尿道肿瘤、胆囊癌、胆管癌、胆道癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、睾丸肿瘤、上颌癌、舌癌、唇癌、口腔癌、咽癌、喉癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、甲状腺癌、脑肿瘤、卡波济氏肉瘤、血管瘤、白血病、真性红细胞增多症、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、骨髓瘤、膀胱癌、肉瘤、骨肉瘤、肌肉瘤、皮肤癌、基底细胞癌、皮肤附属癌、皮肤转移癌等，但并不限定于这些。作为癌细胞的一例，可列举胰腺癌细胞。
本发明中所使用的癌细胞可以是已建株的癌细胞或未建株的癌细胞中的任一个，优选为已建株的癌细胞。
已建株的癌细胞为从生物采集的细胞，且在适当的培养条件下培养的情况下为几乎能够无限细胞块生长的状态的细胞。在此所述的适当的培养条件是指，提供符合各细胞的温度、营养分、生长因子、贴合面等的条件。作为未建株的癌细胞，可列举作为最先种植从生物采集的组织或细胞而进行培养的细胞的原代培养细胞。
本发明中使用的癌细胞的种类可以是一种也可以是两种以上，优选为一种或两种，进一步优选为一种。
间充质细胞是指，骨细胞、软骨细胞、肌细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、毛乳头细胞、牙髓细胞等结合组织的细胞、以及具有分化为上述细胞的能力的细胞。具体而言，可列举成纤维细胞、毛乳头细胞、脂肪细胞、牙髓细胞等。作为存在间充质细胞的组织，可列举骨、软骨、肌肉、肌腱、脂肪组织、毛乳头、牙髓等。间充质细胞还存在于血管、肝脏或胰腺等实质器官内部和周围、以及骨髓和脐带中。骨髓中，作为具有对多个结合组织细胞的多分化能的细胞而存在间充质干细胞。本发明中，优选能够使用间充质干细胞。间充质细胞能够通过从动物摘取作为目标的组织，并进行分离培养来得到。
本发明中使用的间充质细胞的种类可以是一种也可以是两种以上，优选为一种或两种，进一步优选为一种。
本发明的细胞结构体中的癌细胞与间充质细胞的细胞数的比率并无特别限定，优选为10:1～1:10，更优选为5:1～1:5，进一步优选为2:1～1:2。
除了癌细胞及间充质细胞以外，本发明的细胞结构体还可以包含其他细胞。作为其他细胞，可列举血管内皮细胞、胚胎干(ES)细胞、人造多能干细胞(iPS)、基质细胞、成纤维细胞、脂肪来源干细胞及脐带源干细胞等，且无特别限定。
一细胞是否为上述规定的细胞的确认能够通过确认对象细胞是否具有各细胞的功能来进行，或者能够通过确认对象细胞是否对各细胞显示特异标记来进行，并无特别限定。
可以将上述的本发明中使用的各细胞设为表示各术语的最广义范围，且可以是从生物采集的细胞、对从生物采集的细胞实施了操作(基因导入操作等)的细胞、以及通过从其他细胞变换而得到的细胞(例如，从iPS细胞分化衍生的细胞)等中的任一种。
作为所使用的细胞，优选为动物细胞，更优选为脊椎动物来源细胞，尤其优选为人来源细胞。
(3)细胞结构体
本发明中，使用生物相容性高分子嵌段物和癌细胞及间充质细胞，在多个细胞之间的间隙以镶嵌状三维配置多个生物相容性高分子嵌段物，从而能够具有适合细胞移植的厚度。而且，通过将生物相容性高分子嵌段物与细胞以镶嵌状三维配置，能够形成细胞均匀存在于结构体中的细胞结构体，且从外部向细胞结构体的内部传递营养。
本发明的细胞结构体中，在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物，在此“细胞之间的间隙”无需为被所构成的细胞封闭的空间，而被细胞夹持即可。另外，无需在所有的细胞之间存在间隙，可以存在细胞彼此接触的部位。隔着生物相容性高分子嵌段物的细胞之间的间隙的距离、即选择一细胞与存在于与该细胞最短距离内的细胞时的间隙距离并无特别限制，优选为生物相容性高分子嵌段物的大小，优选的距离也为生物相容性高分子嵌段物的优选的大小范围。
并且，生物相容性高分子嵌段物成为被细胞夹持的结构，但无需在所有的生物相容性高分子嵌段物之间存在细胞，也可以存在生物相容性高分子嵌段物彼此接触的部位。隔着细胞的生物相容性高分子嵌段物之间的距离、即选择生物相容性高分子嵌段物和存在于与该生物相容性高分子嵌段物最短距离内的生物相容性高分子嵌段物时的距离并无特别限制，优选为所使用的细胞聚集1～数个时的细胞的块的大小，例如为10μm以上且1000μm以下，优选为10μm以上且100μm以下，更优选为10μm以上且50μm以下。
另外，本说明书中，使用“细胞均匀存在于结构体中的细胞结构体”等“均匀存在”这一表达方式，但并不是指完全均匀，而指能够从外部向细胞结构体的内部传递营养。
本发明的细胞结构体的厚度或直径能够设为所希望的厚度，作为下限，优选为215μm以上，更优选为400μm以上，最优选为730μm以上。厚度或直径的上限并无特别限定，作为使用上的通常的范围优选3cm以下，更优选2cm以下，进一步优选1cm以下。并且，作为细胞结构体的厚度或直径的范围，优选400μm以上且3cm以下，更优选500μm以上2cm以下、进一步优选720μm以上且1cm以下。通过将细胞结构体的厚度或直径设为上述范围内，从外部向细胞结构体的内部传递营养的情况变更良好。
本发明的细胞结构体中，优选由生物相容性高分子嵌段物组成的区域和由细胞组成的区域被配置成镶嵌状。另外，本说明书中的“细胞结构体的厚度或直径”表示如下。选择了细胞结构体中的某一点A时，在通过该点A的直线内，将以距离细胞结构体外界的距离变最短的方式对细胞结构体进行分断的线段的长度设为线段A。在细胞结构体中选择该线段A成为最长的点A，并将此时的线段A的长度设为“细胞结构体的厚度或直径”。
本发明的细胞结构体中，细胞与生物相容性高分子嵌段物的比率并无特别限定，优选每一个细胞的生物相容性高分子嵌段物的比率为0.0000001μg以上且1μg以下，更优选为0.000001μg以上且0.1μg以下，进一步优选为0.00001μg以上且0.01μg以下，最优选为0.00002μg以上且0.006μg以下。通过将细胞与生物相容性高分子嵌段物的比率设为上述范围，能够使细胞更加均匀的存在。通过将下限设为上述范围，能够发挥在所希望的用途中使用时的细胞的效果，通过将上限设为上述范围，能够向细胞供给任意存在的生物相容性高分子嵌段物中的成分。在此，生物相容性高分子嵌段物中的成分并无特别限制，可列举后述的培养基中所含有的成分。
(4)细胞结构体的制造方法
本发明的细胞结构体能够通过对生物相容性高分子嵌段物和癌细胞及间充质细胞进行混合来制造。更具体而言，本发明的细胞结构体能够通过将生物相容性高分子嵌段物与上述细胞交替配置来制造。制造方法并无特别限定，优选在形成生物相容性高分子嵌段物之后，将细胞与生物相容性高分子嵌段物进行混合的方法。具体而言，通过对生物相容性高分子嵌段物与含有癌细胞及间充质细胞的培养液的混合物进行孵化，能够制造本发明的细胞结构体。含有癌细胞及间充质细胞的培养液中的癌细胞与间充质细胞的细胞数的比率并无特别限定，优选为10:1～1:10，更优选为5:1～1:5，进一步优选为2:1～1:2。
本发明中，例如在容器中，能够在保持于容器的液体中，将细胞与预先制作的生物相容性高分子嵌段物配置成镶嵌状。作为配置方法，优选通过利用自然凝聚、自然落下、离心、搅拌来促进或控制由细胞和生物相容性高分子嵌段物组成的细胞结构体的形成。
作为所使用的容器，优选由细胞低粘合性材料或细胞非粘合性材料组成的容器，更优选由聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、玻璃、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯组成的容器。优选容器底面的形状为平底型、U字型、V字型。
通过上述方法得到的细胞结构体(镶嵌细胞块)例如可以通过如下等方法来制造所希望大小的细胞结构体，
(a)使分别制备的细胞结构体(镶嵌细胞块)彼此融合或
(b)在分化培养基或增长培养基下增量。
融合方法、增量方法并无特别限定。
例如，在对生物相容性高分子嵌段物与细胞含有培养液的混合物进行孵化的工序中，通过将培养基交换为分化培养基或增长培养基，能够对细胞结构体进行增量。优选在对生物相容性高分子嵌段物与细胞含有培养液的混合物进行孵化的工序中，通过进一步添加生物相容性高分子嵌段物，能够制造规定大小的细胞结构体，且细胞均匀存在的细胞结构体。
使分别制备的细胞结构体彼此融合时，例如包含多个生物相容性高分子嵌段物和多个细胞，且能够使在由上述多个细胞形成的多个间隙的一部分或全部配置有一个或多个上述生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体融合多个。如上述(a)中所记载，通过使本发明的细胞结构体的多个融合而得到的细胞结构体也在本发明的范围内。
本发明的细胞结构体的制造方法所涉及的“生物相容性高分子嵌段物(种类、大小等)”、“细胞”、“细胞之间的间隙”、“所得到的细胞结构体(大小等)”、“细胞与生物相容性高分子嵌段物的比率”等优选的范围与本说明书中上述的内容相同。
上述融合前的各细胞结构体的厚度或直径优选为10μm以上且1cm以下，更优选为10μm以上且2000μm以下，进一步优选为15μm以上且1500μm以下，最优选为20μm以上且1300μm以下。融合后的厚度或直径优选为400μm以上且3cm以下，更优选为500μm以上且2cm以下，进一步优选为720μm以上且1cm以下。
通过进一步添加上述生物相容性高分子嵌段物，作为制造所希望大小的细胞结构体的方法，具体而言，能够列举包含多个第一生物相容性高分子嵌段物和多个细胞，且对在由上述多个细胞形成的多个间隙的一部分或全部配置有一个或多个上述生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体进一步添加第二生物相容性高分子嵌段物来进行孵化的方法。在此，“生物相容性高分子嵌段物(种类、大小等)”、“细胞”、“细胞之间的间隙”、“所得到的细胞结构体(大小等)”、“细胞与生物相容性高分子嵌段物的比率”等优选范围与本说明书中上述的内容相同。
欲融合的细胞结构体彼此优选设置在0以上且50μm以下的距离内，更优选为0以上且20μm以下，进一步优选为0以上且5μm以下的距离。使细胞结构体彼此融合时，认为通过细胞的增长、伸展而细胞或产生细胞的基质发挥粘合剂的作用，由此接合，通过设为上述范围，细胞结构体彼此的粘合变轻松。
作为通过本发明的细胞结构体的制造方法得到的细胞结构体的厚度或直径范围，优选为400μm以上且3cm以下，更优选为500μm以上且2cm以下，进一步优选为720μm以上且1cm以下。
优选对细胞结构体进一步添加第二生物相容性高分子嵌段物来进行孵化时的添加第二生物相容性高分子嵌段物的进度对应于所使用的细胞的增长速度而适当选择。具体而言，若添加第二生物相容性高分子嵌段物的进度早则细胞向细胞结构体的外侧移动，且细胞的均匀性降低，若添加进度慢，则形成细胞的比例变多的部位，且细胞的均匀性减少，因此考虑所使用的细胞的增长速度来进行选择。
(5)非人模型动物及其制造方法
为了制造非人模型动物而能够将本发明的细胞结构体移植到非人动物。用于制造由本发明的细胞结构体组成的非人模型动物的移植物包含于本发明中。而且，根据本发明，提供具有上述本发明的细胞结构体来作为移植物的针对癌症疾病的非人模型动物。
针对癌症疾病的非人模型动物是指具有癌症的模型动物。
癌症疾病优选为人类癌症疾病。
作为癌症疾病，作为“来源于癌细胞的癌症的具体例”，可列举本说明书中上述的例，但并不限定于此。
构成细胞结构体的生物相容性高分子嵌段物、癌细胞及间充质细胞、以及优选的范围与本说明书中上述的内容相同。
非人模型动物中的细胞结构体的移植部位并无特别限定，例如可列举皮下、腹腔内或器官或组织(优选为来源于移植的癌细胞的器官或组织)等，优选为皮下。
作为移植细胞结构体的动物，只要是非人动物，则并无特别限定，优选为哺乳类动物。哺乳动物中，从易操作的观点考虑，优选小鼠、大鼠、兔或仓鼠等啮齿动物
并且，作为非人动物，优选为免疫力降低的动物或免疫缺陷动物。免疫力降低的非人动物只要是免疫力降低到能够移植细胞结构体的程度的动物即可。例如，能够列举裸小鼠、裸大鼠、SCID(severe combined immunodeficiency；重症联合免疫缺陷症)小鼠、NOD(non-obese diabetic：非肥胖型糖尿病)-SCID小鼠、ALY(遗传性淋巴结缺陷)小鼠等免疫缺陷动物，并能够使用市售品。为了降低免疫力，可以对非人动物照射X射线等放射线。准备的非人动物例如是小鼠或大鼠的情况下，能够使用4～12周龄的鼠。非人动物能够根据免疫力降低的程度而在不受感染的环境下培养。为了防止受感染，可以对非人动物使用抗生素。
根据本发明，提供一种包括将上述本发明的细胞结构体移植到非人动物的针对癌症疾病的非人模型动物的制造方法。
作为细胞结构体的移植方法，能够使用切割、注射、内窥镜等。
细胞结构体能够以悬浮在培养基(例如，Lonza公司的MSCGM BulletKitTM等)或磷酸缓冲生理盐水(PBS)等的状态移植到移植部位。
细胞结构体能够对每一匹非人动物移植1～1000个，优选移植1～100个。
本发明的细胞结构体包含癌细胞，因此能够通过将本发明的细胞结构体移植到非人动物而在上述非人动物形成癌症。
本发明的非人模型动物在癌症治疗药的研发、癌症治疗效果的验证、因癌症引起的副作用的验证、检测出癌症并使其成像的试剂的研发等中有用。
(6)被检验物质的评价方法
根据本发明，提供一种包括对上述本发明的非人模型动物给予被检验物质的被检验物质的步骤的评价方法。作为被检验物质，在使用抗癌药等癌症治疗药的候选物质时，能够筛选癌症治疗药。
基于本发明的被检验物质的评价方法优选包括对本发明的非人模型动物给予被检验物质的工序及对上述非人模型动物中的癌症的病状进行评价的工序。
被检验物质并无特别限定，能够根据目的来适当选择，例如可列举有机低分子化合物等化合物、肽、蛋白质、抗体、核酸、碳水化合物、脂质、细胞提取物、细胞培养上清液、植物提取物、微生物产物等。化合物、肽、蛋白质、抗体还能够使用各自的文库。例如，能够使用利用组合化学技术制作的化合物文库、通过固相合成或噬菌体展示法制作的随机肽文库或抗体文库等。
被检验物质的给药路径可以是口服给药也可以是肠胃外给药。作为肠胃外给药，例如可列举静脉内、动脉内或肌肉内等全身给药或局部给药等。被检验物质的给药量、给药间隔、给药开始时期及给药期间并无特别限定，能够根据目的而适当选择，且能够根据给药对象的非人动物的种类、被检验物质的种类等而适当选择。
在对非人模型动物中的癌症的病状进行评价的工序中，能够作为癌症治疗药的候选物质而选择将能够缩小癌症(肿瘤)或抑制癌症(肿瘤)增大的被检验物质。关于缩小癌症(肿瘤)或抑制癌症(肿瘤)增大的情况，能够通过测定癌症(肿瘤)的大小(体积等)来进行评价。或者，在对非人模型动物中的癌症的病状进行评价的工序中，可以将因癌症引起的症状或癌症相关的数值作为指标。
并且，非人模型动物中的癌症的病状的评价中，能够将不给予被检验物质的非人模型动物作为阴性对照来进行评价。
如上述那样选择的被检验物质可成为癌症治疗药的候选。
通过以下实施例对本发明进行具体地说明，但本发明并不限定于实施例。
实施例
[实施例1]重组肽(重组明胶)
作为重组肽(重组明胶)准备了以下CBE3(记载于国际公开WO2008/103041号公报中)。
CBE3：
分子量：51.6kD
结构：GAP[(GXY)63]3G
氨基酸数：571个
RGD序列：12个
亚氨基酸含量：33％
大致100％的氨基酸为GXY的重复结构。CBE3的氨基酸序列中不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸。CBE3具有ERGD序列。
等电点：9.34
GRAVY值：-0.682
1/IOB值：0.323
氨基酸序列(序列表的序列号1)(与国际公开WO2008/103041号公报的序列号3相同。但将末尾的X修正为“P”)
GAP
(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
[实施例2]重组肽多孔体的制作
[PTFE厚/圆筒形容器]
准备了底面厚度3mm、直径51mm、侧面厚度8mm、高度25mm的聚四氟乙烯(PTFE)制圆筒杯状容器。圆筒杯中，将曲面设为侧面时，侧面被8mm的PTFE密封，且底面(平板的圆形)也被3mm的PTFE密封。另一方面，上面呈打开的形状。从而，圆筒杯的内径成为43mm。以下，将该容器称为PTFE厚/圆筒形容器。
[铝合金玻璃板/圆筒形容器]
准备了厚度1mm、直径47mm的铝合金制圆筒杯状容器。圆筒杯中，将曲面设为侧面时，侧面被1mm的铝合金密封，且底面(平板圆形)也被1mm的铝合金密封。另一方面，上面呈打开的形状。并且，仅在侧面的内部均匀地铺满壁厚1mm的特氟龙(注册商标)，其结果，圆筒杯的内径成为45mm。并且，该容器的底面呈在铝合金的外侧接合2.2mm的玻璃板的状态。以下，将该容器称为铝合金玻璃/圆筒形容器。
[温度差小的冷冻工序及干燥工序]
将CBE3水溶液流入PTFE厚/圆筒形容器、铝合金玻璃板/圆筒形容器，并在真空冷冻干燥机(TF5-85ATNNN：TAKARA.Co.Ltd)内使用冷却搁板从底面冷却了CBE3水溶液。此时的容器、CBE3水溶液的最终浓度、液量及搁板温度的设定的组合按照如下所述进行了准备。
条件A：
PTFE厚/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量4mL。关于搁板温度的设定，冷却至-10℃，在-10℃下进行1小时，然后在-20℃下进行2小时，进而在-40℃下进行3小时，最后在-50℃下进行了1小时冷冻。本冷冻产品在此之后将搁板温度返回设定到-20℃而在-20℃下进行24小时的真空干燥，在24小时之后直接持续进行真空干燥的状态下将搁板温度上升至20℃，直至真空度充分降低(1.9×105Pa)为止，进一步在20℃下实施48小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。
条件B：
铝合金/玻璃板/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量4mL。关于搁板温度的设定，冷却至-10℃，在-10℃下进行1小时，然后在-20℃下进行2小时，进而在-40℃下进行3小时，最后在-50℃下进行1小时冷冻。本冷冻产品在此之后将搁板温度返回设定到-20℃而在-20℃下进行24小时的真空干燥，在24小时之后直接持续进行真空干燥的状态下将搁板温度上升至20℃，直至真空度充分降低(1.9×105Pa)为止，进一步在20℃下实施48小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。
条件C：
PTFE厚/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量10mL。关于搁板温度的设定，冷却至-10℃，在-10℃下进行1小时，然后在-20℃下进行2小时，进而在-40℃下进行3小时，最后在-50℃下进行1小时冷冻。本冷冻产品在此之后将搁板温度返回设定到-20℃而在-20℃下进行24小时的真空干燥，在24小时之后直接持续进行真空干燥的状态下将搁板温度上升至20℃，直至真空度充分降低(1.9×105Pa)为止，进一步在20℃下实施48小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。
[各冷冻工序中的温度测定]
关于条件A～条件C的每一个，作为在溶液内最远离冷却侧的部位的液温(非冷却面液温)测定了容器内的圆中心部的水表面液温，并且，作为在溶液内最接近冷却侧的液温(冷却面液温)测定了容器内的底部的液温。
其结果，各自的温度与其温度差的分布成为如图1～图3。
从图1、图2、图3可知，在条件A、条件B、条件C下，液温在搁板温度-10℃设定区间(降低到-20℃之前)低于融点即0℃，并且其状态处于不会引起冷冻(未冷冻/过于冷却)状态。并且，在该状态下，冷却面液温与非冷却面液温的温度差为2.5℃以下。另外，本说明书中，“温度差”是指“非冷却面液温”-“冷却面液温”。然后，将搁板温度进一步降低到-20℃，由此确认到液温向0℃附近急速上升的时刻，在此可知产生凝固热而开始冷冻。并且，确认到在该时刻实际上开始形成冰。然后，温度在0℃附近经过一定时间。在此，成为存在水与冰的混合物的状态。最后，温度从0℃再次开始下降，此时，液体部分消失而成为冰。从而，所测定的温度成为冰内部的固态温度，即并非液温。
以下，关于条件A、条件B、条件C，记载非冷却面液温成为融点(0℃)时的温度差、将搁板温度从-10℃降低至-20℃紧前的温度差及产生凝固热紧前的温度差。另外，本发明中所述的“紧前的温度差”表示能够在活动(产生凝固热等)的1秒钟前～20秒钟前的期间检测出的温度差内的最高温度。
条件A
非冷却面液温成为融点(0℃)时的温度差：1.1℃
从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：0.2℃
产生凝固热紧前的温度差：1.1℃
条件B
非冷却面液温成为融点(0℃)时的温度差：1.0℃
从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：0.1℃
产生凝固热紧前的温度差：0.9℃
条件C
非冷却面液温成为融点(0℃)时的温度差：1.8℃
从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：1.1℃
产生凝固热紧前的温度差：2.1℃
[实施例3]生物相容性高分子嵌段物的制作(多孔体的粉碎和交联)
利用新动力磨机(OSAKA CHEMICAL Co.,Ltd.，新动力磨机PM-2005)粉碎了在实施例2中得到的条件A及条件B的CBE3多孔体。关于粉碎，以最大转速1分钟×5次，合计进行了5分钟的粉碎。对所得到的粉碎物，利用不锈钢制筛区分尺寸，从而得到了25～53μm、53～106μm、106～180μm的未交联嵌段物。然后，在减压下在160℃下实施热交联(实施了交联时间为8小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时这6种)来得到了生物相容性高分子嵌段物(CBE3嵌段物)。
以下，将实施了48小时交联的条件A的多孔体来源嵌段物称为E，将实施了48小时交联的条件B的多孔体来源嵌段物称为F。E及F为由通过温差小的冷冻工序制造的多孔体制成的温差小的嵌段物。另外，未发现交联时间的不同在本申请的评价中影响性能，因此以下以实施了48小时交联的嵌段物为代表而使用。并且，在E及F中未发现性能差异。以下，还将在实施例3中得到的生物相容性高分子嵌段物称为“花瓣状嵌段物”。以下的实施例中，使用了在条件A、尺寸53～106μm、交联时间48小时下制作的生物相容性高分子嵌段物。
[实施例4]细胞结构体的制作(hMSC和Capan-1)
以人骨髓来源间充质干细胞(hMSC：human mesenchymal stem cell、从Lonza公司购入)的最终浓度成为4x105个细胞/mL及已建株的人胰腺、腺癌细胞(Capan-1、从ATCC购入)的最终浓度成为4x105个细胞/mL的方式，准备用MSCGM BulletKitTM培养基(公司名：Lonza Japan、产品名MSCGMTMMesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKitTM)调整的细胞悬浮液，并按25μL进行了混合。以成为0.1mg/mL的方式对该细胞悬浮液添加了在实施例3中制作的生物相容性高分子嵌段物(尺寸53～106μm)。将所得到的混合物200μL植入到SUMILONCELLTIGHT X96U微孔板(Sumitomo Bakelite Company Limited、底部为U字型)，用台式微孔板离心机进行离心(600g、5分钟)，并静置24小时，从而制作了直径1mm或直径1.3mm左右的球状的由生物相容性高分子嵌段物、Capan-1及hMSC组成之镶嵌细胞块(每一个细胞为0.001μg的嵌段物)。将所得到的16个镶嵌细胞块聚集于96U微孔板的一个孔中，进而静置24小时而制备了聚集有镶嵌细胞块的组织。
并且，作为比较例，未添加生物相容性高分子嵌段物而制作了细胞块(hMSC和Capan-1)。
制作添加了生物相容性高分子嵌段物的镶嵌细胞块和未添加生物相容性高分子嵌段物的细胞块并经过4天之后，用10质量％中性福尔马林缓冲液进行固定，并使用显微镜通过苏木精·伊红染色观察了细胞块。将结果示于图4。
当未添加生物相容性高分子嵌段物时，在细胞块内部观察到hMSC的坏死，且相对地观察到较多的Capan-1细胞。所残留的hMSC呈未分化的状态，且针对成纤维的分化弱。
当添加生物相容性高分子嵌段物时，hMSC在细胞块内部也没有坏死，且以与Capan-1细胞大致1:1的比例存在。尽管hMSC不完整，但观察到分化为成纤维细胞。
[实施例5]镶嵌细胞块及细胞块的移植(通过动物模型进行的评价)
在麻醉下的NOD-SCID(非肥胖糖尿病-重症联合免疫缺陷症)小鼠6周龄的雌性的皮下，使用刮勺(PP刮勺AS ONE#1-9404-01)，移入实施例4中制作的镶嵌细胞块(添加了生物相容性高分子嵌段物)或细胞块(未添加生物相容性高分子嵌段物)之后，缝合插入部。
移植7天之后，在麻醉下实施放血和屠宰，从而确认到镶嵌细胞块或细胞块。按周边的皮下组织进行采集，用10质量％中性福尔马林缓冲液进行固定，并通过标准方法制备苏木精·伊红染色标本之后，用显微镜进行了观察。将结果示于图5。
当移植了镶嵌细胞块时，在认为是花瓣状嵌段物的嗜碱性结构体的间隙，确认到成纤维细胞和纤维状组织。表示纤维状组织比较丰富，且在来源于Capan-1胰腺癌细胞的细胞以岛状存在的间质细胞丰富的组织形态的肿瘤(图5的右图)。
当移植了细胞块时，认为是来源于hMSC的间充质组织中，认为是来源于Capan-1的呈腺管结构的细胞以岛状存在。与移植了镶嵌细胞块的情况相比，纤维状组织不足(图5的左图)。
如上述，将Capan-1和hMSC移植到镶嵌细胞块时，在体内确认到丰富的纤维化、间质形成，从而能够构筑接近人类胰腺癌的病状的模型。
序 列 表
<110> 富士胶片株式会社
<120> 细胞结构体、非人模型动物、非人模型动物的制造方法及被检验物质的评价方法
<130> 16F00586
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 571
<212> PRT
<213> Recombinant
<400> 1
Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly
1 5 10 15
Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu
20 25 30
Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro
35 40 45
Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly
50 55 60
Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala
65 70 75 80
Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro
85 90 95
Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly
100 105 110
Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val
115 120 125
Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro
130 135 140
Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly
145 150 155 160
Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala
165 170 175
Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro
180 185 190
Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly
195 200 205
Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp
210 215 220
Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln
225 230 235 240
Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly
245 250 255
Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys
260 265 270
Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg
275 280 285
Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly
290 295 300
Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu
305 310 315 320
Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro
325 330 335
Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly
340 345 350
Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala
355 360 365
Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro
370 375 380
Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly
385 390 395 400
Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro
405 410 415
Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro
420 425 430
Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly
435 440 445
Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val
450 455 460
Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala
465 470 475 480
Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly
485 490 495
Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro
500 505 510
Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln
515 520 525
Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly
530 535 540
Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys
545 550 555 560
Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly
565 570
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 2
Arg Glu Asp Val
1
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 3
Tyr Ile Gly Ser Arg
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 4
Pro Asp Ser Gly Arg
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 5
Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 6
Leu Gly Thr Ile Pro Gly
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 7
Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile
1 5 10
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 8
Ile Lys Val Ala Val
1 5
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 9
Asp Gly Glu Ala
1
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 10
Glu Arg Gly Asp
1

Claims (12)

1.一种细胞结构体，其包含生物相容性高分子嵌段物和至少癌细胞及间充质细胞，在多个所述细胞之间的间隙配置有多个所述生物相容性高分子嵌段物，所述癌细胞所来源的癌为恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、消化道癌、肺癌、尿道肿瘤、胆囊癌、胆管癌、胆道癌、乳腺癌、胰腺癌、睾丸肿瘤、上颌癌、舌癌、唇癌、喉癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、甲状腺癌、脑肿瘤、卡波济氏肉瘤、血管瘤、白血病、真性红细胞增多症、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、骨髓瘤、膀胱癌、肉瘤、皮肤癌或基底细胞癌。
2.根据权利要求1所述的细胞结构体，其被移植到非人动物以制作非人模型动物。
3.根据权利要求1或2所述的细胞结构体，其中，
所述消化道癌为食道癌、胃癌、大肠癌、口腔癌或咽癌，所述肉瘤为骨肉瘤或肌肉瘤，所述皮肤癌为皮肤附属癌或皮肤转移癌。
4.根据权利要求3所述的细胞结构体，其中，
所述大肠癌为直肠癌或结肠癌。
5.根据权利要求1或2所述的细胞结构体，其中，
所述癌细胞为已建株的癌细胞。
6.根据权利要求1或2所述的细胞结构体，其中，
所述癌细胞为胰腺癌细胞。
7.根据权利要求1或2所述的细胞结构体，其中，
所述间充质细胞为间充质干细胞。
8.根据权利要求1或2所述的细胞结构体，其中，
生物相容性高分子为重组明胶。
9.根据权利要求8所述的细胞结构体，其中，
重组明胶由下述式表示，
式：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列，n个X分别独立地表示氨基酸的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸的任一种，n表示3～100的整数，m表示2～10的整数，另外，n个Gly-X-Y可以彼此相同，也可以不同。
10.根据权利要求8所述的细胞结构体，其中，
重组明胶为如下中的任一个：
由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
由序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、替换或添加有一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽；或
由与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽。
11.一种针对癌症疾病的非人模型动物的制造方法，其包含将权利要求1或2所述的细胞结构体注射到非人动物的步骤。
12.一种被检验物质的评价方法，其包含对具有权利要求1或2所述的细胞结构体作为移植物的非人模型动物给予被检验物质的步骤。
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