CN101185764A

CN101185764A - 一种原位移植性小鼠肝癌模型及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101185764A
Application number: CNA2007101333257A
Authority: CN
Inventors: 徐涵文; 张煜; 沈萍萍
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2007-10-17
Filing date: 2007-10-17
Publication date: 2008-05-28

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种以研究肝癌发生发展机制及抗肿瘤药物开发为目的的原位移植性小鼠肝癌模型及其制备方法和应用。将稳定转染EGFP的H22细胞株注射入BALB/c小鼠腹腔扩增，从H22腹水癌小鼠腹腔内抽取腹水，分离细胞并制成细胞悬液，打开小鼠腹腔，用微量注射器抽取细胞悬液注射入小鼠肝脏，用75％酒精棉签按压针孔至肝脏表面不再渗血，用粘合剂封闭针孔，再以生理盐水冲洗肝脏表面，分层关腹。结果显示模型小鼠肝癌发生率为100％，自然消退率为零。该模型是一种可以用于研究原发性肝癌发展及转移的机制、同时也适用于抗肿瘤药物开发、肝癌的实验性治疗及诊断研究的理想的原发性肝癌模型。

Description

一种原位移植性小鼠肝癌模型及其制备方法和应用

一.技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种以研究肝癌发展分子机制及抗肿瘤药物开发为目的的小鼠原位移植性肝癌模型及其制备方法和应用。

二.背景技术

原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，其死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中居第三位。我国每年死于肝癌的人数约11万，占全世界肝癌死亡人数的45％，肝癌的治疗亟待进步。理想的肝癌动物模型是抗肿瘤药物开发、肝癌发生发展机制及诊断治疗研究必不可少的实验工具。故成功地制作肝癌实验动物模型，对于肝癌相关实验研究的开展起着至关重要的作用。

原位肝癌动物模型的建立方法大致分为四类，即自发性肝癌模型、诱发性肝癌模型、移植性肝癌模型和转基因动物肝癌模型，模型动物最常见为鼠。自发性肝癌模型在发生学上与人类肝癌相似，但发生率低且不稳定，发生时间较难预测且参差不齐，荷瘤动物在动物个体(性别、体重、肿瘤发生时间等)和肿瘤(大小、数目、部位等)两方面差异较大；诱发性肝癌模型最为常用，多采用化学药物诱发，但诱导周期长(3～5月，甚至1～2年)，操作烦琐，死亡率高，肝癌出现的时间、部位、病灶数等在个体之间表现不均一，而且这些化学药物多易挥发，有刺激性气味，除致癌作用外还有化学毒性，会对实验动物和实验操作者自身造成伤害；转基因动物肝癌模型制作技术要求极高，价格昂贵，国内开展的尚较少。原位移植性肝癌模型周期短、成功率高，是一种较好的动物肿瘤模型。目前移植性肝癌模型根据植入物可分为瘤组织块肝原位移植和细胞悬液肝原位移植。韩克起等人用H22细胞株接种于ICR小鼠皮下形成实体瘤，再将瘤组织接种于小鼠肝内形成肝原位移植瘤模型。在韩等的实验中，制作程序繁琐，成功率较低，且该模型需先在小鼠皮下种植形成实体瘤，故每次实验内移植的瘤组织块不能来自于同一鼠体，切割的组织块大小不易一致，内容物不均一，且含有其他非癌组织，这会严重影响实验的重复性和可靠性，并不能完全真实反映抗肝癌药物的作用效果。李琦等和邵成伟等采用Walker-256细胞肝内注射建立了大鼠移植型肝癌模型，模型采用的Walker-256细胞株在植入肝内后，虽能较好地模拟人肝癌的膨胀性和浸润性生长方式，但该细胞株来源于Wistar大鼠乳腺自发的癌肉瘤，而非肝癌组织，故该模型不能很好的模拟肝癌的发生发展过程，更不能满足抗肝癌药物研发筛选、肝癌分子生物学研究的需要。加之大鼠价格较贵且需要较大的饲养空间，不易大批制作。现有的人-裸小鼠异种移植性肝癌模型虽有较高的移植成功率，但裸小鼠免疫系统缺陷，不能反映正常生物体的真实情况，无法研究免疫系统在肝癌发生中的作用以及对肝癌后续发展的影响，不能模拟药物在机体中的正常代谢。另外裸鼠-人肝癌移植模型技术条件要求高，裸鼠术后成活率低，且无菌要求高、饲养困难、价格昂贵，因此这种模型的实用性受到了很大的限制。同时，简单的将瘤组织块或细胞悬液移植入肝脏制成的肝癌模型均不足以充当研究肝癌发生发展的分子机制及寻找抗肝癌药物作用的分子靶点的平台。故已存在的各种肝癌动物模型都有一定的缺陷，无法满足目前生物医药领域的需求。

三.发明内容

本发明需要解决的问题是建立一种原位移植性小鼠肝癌模型，该模型能满足研究原发性肝癌发生发展及转移的机制、同时也适用于抗肿瘤药物开发、肝癌的实验性治疗及诊断研究的需要。既能真实地模拟原发性肝癌的生物学特性，又简单、迅速、成功率高且价格低廉可以大批制作。

实现上述目的的技术解决方案如下：

原位移植性小鼠肝癌模型的特征为：肝癌肿瘤结节内瘤细胞呈圆形或多边形，体积大，核大异形明显，核分裂相易见；瘤细胞弥散分布或团块状、粗条索状；肿瘤间质量少，可见血管及出血现象；肿瘤无包膜，边缘瘤细胞呈现浸润性生长，侵入正常肝脏组织内；在肺脏、肾上腺、肾脏脂肪囊、胰腺出现转移灶；肿瘤细胞内可转入插入目的基因序列的质粒，可在小鼠肝脏的原位肝癌中过表达或RNA干扰目的蛋白。

原位移植性小鼠肝癌模型建立的方法为：选用H22细胞株(购自南京凯基生物科技发展有限公司)，该细胞株是BALB/c小鼠肝癌细胞株，既可在BALB/c小鼠腹腔内培养制成H22腹水癌，又可在体外培养，保种传代简单方便；将质粒pEGFP-N1(美国Clontech公司)转染进入H22细胞，并用G418筛选(南京大治生物科技有限公司)形成稳定转染的细胞株，注射入BALB/c小鼠(购自南京大学模式动物研究所)腹腔扩增，待小鼠出现腹水后抽取腹水提取H22细胞，以G418筛选后重新注射入小鼠腹腔内形成腹水癌，反复3次，形成可适应体内环境的稳转细胞株；腹水癌小鼠的腹水内有大量EGFP标记的H22细胞，可供多次大量制作动物模型，保证了动物模型的一致性，同时由于该细胞已经适应BALB/c小鼠体内环境，同种移植，增加了细胞肝内移植的成功率；抽取腹水离心弃上清后加入预冷的PBS溶液吹打冲洗1000rpm离心后弃上清，重复以上过程2-3次，再加入预冷的PBS溶液吹匀后500rpm离心，红细胞留于上清，弃上清保留沉淀细胞，加入1640细胞培养基制成H22细胞悬液，以此步骤除去腹水中H22细胞以外的其他成分，减少未知成分对模型动物的影响；将BALB/c小鼠以戊巴比妥钠麻醉，固定后于小鼠剑突下剪开皮肤和腹膜，使小鼠肝左叶暴露出切口，用微量注射器抽取1×10⁷×5μL细胞悬液注射入小鼠肝脏；微量注射器拔出后立即以75％酒精棉签按压针孔至肝脏表面不再渗血，以此步骤杀死漏出的少量细胞，并可避免细胞悬液漏出肝脏；用粘合剂封闭针孔，以防止H22细胞渗出流入腹腔后造成的腹腔内广泛转移灶而导致肿瘤种植失败；以生理盐水冲洗肝脏表面，既能防止穿刺孔漏出的H22细胞进入腹腔导致模型失败，又能湿润暴露的肝脏减少对小鼠的损伤，提高术后存活率。

本发明的有益效果是，用此方法建立的肝癌模型具有以下特点：(1)肿瘤位于肝脏，且以单发性为主；肿瘤生长与血供特征与人类原发性肝癌相似；出现血道转移(肝内及肺转移)和淋巴道转移；(2)肿瘤结节为肝癌组织，生物学特性稳定而均一，其病理形态与人的肝癌结节相似；(3)肿瘤形成周期短、肿瘤生长快、病程发展快、患体生存期短，肿瘤可控性好且生长环境符合真实机体情况；(4)肿瘤细胞用绿色荧光蛋白(EGFP)标记，可以随时活体监测肿瘤的生长以及转移状况；(5)可以在转入肿瘤细胞的EGFP-N1质粒内插入目的基因序列，过表达或RNA干扰目的蛋白，研究该蛋白在肝癌发展及转移过程中的作用；(6)经过体外-体内筛选的肿瘤细胞在动物体内生长过程中质粒不容易丢失，可更准确地检测肿瘤生长过程中分子的表达，以便研究该分子在肝癌发生发展过程中的功能；(7)操作安全简单，操作所致死亡率低，动物模型稳定性、重复性好、成功率高；(8)可大批制作且同步性好，适用于药物筛选及较大规模的实验性治疗。故该模型是一种可以用于研究原发性肝癌发展及转移机制、同时也适用于抗肿瘤药物开发、肝癌的实验性治疗及诊断研究的理想的原发性肝癌模型。

四.附图说明

下面结合附图和实施例对本发明结果进一步说明。

图1是模型小鼠腹腔近照，结节大小约为1.3cm×1.1cm，肿瘤境界不清，附近有附生的小结节。

图2是模型小鼠肝左叶肿瘤结节近照(正面)。

图3是模型小鼠肝左叶肿瘤结节近照(背面)。

图4是肝癌肿瘤的病理照片，细胞形态多样，异型性明显(HE染色，100×)。

图5是肝癌细胞侵入肾周围脂肪囊(HE染色，200×)。

图6是肝癌的肺多发性早期转移灶(HE染色，200×)。

图7是肝癌细胞侵入肾周的EGFP免疫组化阳性细胞分布(400×)。

图8是肝癌的肺多发性早期转移灶的EGFP免疫组化阳性细胞分布(400×)。

图9是肝癌细胞侵入门管区的EGFP免疫组化阳性细胞分布(400×)。

图10是用荧光显微镜观察的体内稳定转染EGFP的H22细胞的照片(200×)。

五.具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

将质粒EGFP-N1转染进入H22细胞，并用G418筛选形成稳定转染的细胞株，注射入BALB/c小鼠腹腔扩增，待小鼠出现腹水后，抽取腹水提取H22细胞，以G418筛选后重新注射入小鼠腹腔形成腹水癌，反复上述过程3次，形成的腹水癌小鼠的腹水内有大量适应体内环境且稳定转染EGFP的H22细胞株。用注射器从腹水癌小鼠的腹腔内抽取腹水2mL，置于离心管内，1000rpm离心，弃上清。加入5mL预冷的PBS液重悬、吹洗，再1000rpm离心5分钟，弃上清。用预冷的PBS溶液以同样方法重复洗一遍。在沉淀内加入5mL预冷的PBS溶液吹散细胞，500rpm离心5分钟，保留下层白色细胞沉淀。用1mL培养基重悬细胞，计数，再加入适量培养基稀释成1×10⁷个/mL的细胞悬液备用。将BALB/c小鼠以50mg/kg腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后固定。在上腹部备皮，再以碘伏消毒、75％酒精脱碘。在小鼠上腹部开口，在腹膜上沿腹白线切开，使小鼠肝左叶暴露出腹腔，用微量注射器抽取5μL细胞悬液以30度注射入肝叶，出针后立即用75％酒精棉签按压至肝脏表面无渗血后，用少量粘合剂涂抹于针孔，待干后用生理盐水冲洗暴露的肝叶。将肝叶轻轻送回腹腔，缝合切口。以75％酒精擦拭切口后，涂抹一层金霉素眼药膏。待小鼠苏醒后送回动物房，保证食水供应。三周后将小鼠断颈处死，切开皮肤腹膜，可见在小鼠肝脏和脾脏明显肿大，肝左叶注射部位有明显的单发白色结节。取肝和肺在福尔马林溶液中固定保存后做病理切片检查。经东南大学基础医学院病理教研室病理检查结论为：瘤细胞呈圆形或多边形，体积大，胞浆丰富，核大异形明显，核分裂相易见。瘤细胞弥散分布或团块状、粗条索状。肿瘤间质量少，可见血管及出血现象。肿瘤无包膜，边缘瘤细胞呈现浸润性生长，侵入正常肝脏组织内，有的肿瘤边缘可见增生的胆管，胆管上皮细胞轻度异形。多数肿瘤出现大片凝固性坏死，即肿瘤细胞死亡，但细胞轮廓仍在。肿瘤组织内无明显炎细胞浸润，少数肿瘤边缘与正常肝组织交界处有少量单核细胞及中性粒细胞浸润。在肺脏、肾上腺、肾脏脂肪囊、胰腺发现转移灶。此方法建立的模型小鼠肝癌发生率为100％，自然消退率为零，可以模拟出人类肝癌病程中常见的临床症状，如原发性肝癌的消瘦、水肿、肝脾肿大、腹水、黄疸、癌灶转移、消化道出血、肝癌肿块破裂出血等。以此方法建立的原发性肝癌小鼠模型的效果大大优于目前已有的原发性肝癌动物模型，可用于具有更加真实性和实用性。

Claims

1.一种原位移植性小鼠肝癌模型，其特征是肝癌肿瘤结节内瘤细胞呈圆形或多边形，体积大，核大异形明显，核分裂相易见；瘤细胞弥散分布或团块状、粗条索状；肿瘤间质量少，可见血管及出血现象；肿瘤无包膜，边缘瘤细胞呈现浸润性生长，侵入正常肝脏组织内；在肺脏、肾上腺、肾脏脂肪囊、胰腺出现转移灶；肿瘤细胞内转入插入目的基因序列的质粒，过表达或RNA干扰目的蛋白，研究该蛋白在肿瘤发展及转移过程中的作用。

2.根据权利要求1所述原位移植性小鼠肝癌模型的建立方法，其特征在于：选用H22细胞株，选用的BALB/c小鼠是我国常用的实验动物品系，将H22细胞制成稳定转染EGFP的H22细胞株，并将稳定转染EGFP的H22细胞保种培养在BALB/c小鼠腹腔中，抽取腹水，分离细胞并制成细胞悬液，用微量注射器抽取细胞悬液注射入小鼠肝脏，用75％酒精棉签按压针孔至肝脏表面不再渗血，用粘合剂封闭针孔，以生理盐水冲洗肝脏表面。

3.根据权利要求2所述原位移植性小鼠肝癌模型的建立方法，其特征在于体内稳定转染EGFP的H22细胞株的制备方法：将质粒EGFP-N1转染进入H22细胞，并用G418筛选形成稳定转染的细胞株，注射入BALB/c小鼠腹腔扩增，待小鼠出现腹水后，抽取腹水提取H22细胞，以G418筛选后重新注射入小鼠腹腔待腹水癌生成，重复3次后，形成的腹水癌小鼠的腹水内有稳定转染EGFP细胞株。

4.根据权利要求2所述原位移植性小鼠肝癌模型的建立方法，其特征在于细胞悬液的制备方法：抽取腹水，1000rpm离心5分钟，弃上清，加入预冷的PBS溶液吹打洗涤沉淀，1000rpm离心5分钟后弃上清，重复洗涤过程2-3次，再加入预冷的PBS溶液吹匀后500rpm离心5分钟，红细胞留于上清，弃上清保留沉淀细胞，加入细胞培养基制成H22细胞悬液。

5.根据权利要求2所述原位移植性小鼠肝癌模型的建立方法，其特征在于BALB/c小鼠以戊巴比妥钠麻醉，固定后于小鼠上腹部分层剪开皮肤和腹膜，将小鼠肝左叶按压出切口，用微量注射器抽取1×107×5μL稳定转染EGFP的H22细胞悬液注射入小鼠肝脏。

6.根据权利要求1所述的原位移植性小鼠肝癌模型在研究肝癌发生发展机制中的应用。

7.根据权利要求1所述的原位移植性小鼠肝癌模型在抗肿瘤药物开发及肝癌实验治疗和诊断中的应用。