CN100475227C - 一种抗肿瘤的药物组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗肿瘤的药物组合物及其制备方法，该药物组合物主要由三七提取物和冬虫夏草菌丝体组成。本发明另一目的在于提供该药物组合物制剂的抗肿瘤的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物组合物及其制备方法，特别涉及一种抗肿瘤的药物组合物及其制备方法。
背景技术
癌症是严重危害人类健康的疾病，世界卫生组织公布的统计资料表明：每年全世界癌症发病约1000万人，死亡约700万人。目前临床应用的抗癌药物的毒副作用多较大。因此研究开发安全高效的抗癌药是当务之急，特别是从博大精深的传统中医药中开发新的抗癌药一直是新药研究的热门课题。
三七是名贵中药，传统中医认为“人参补气第一，三七补血第一”，在我国名贵药材中是治疗广泛、保健作用持久的“扶正固本”食药兼用品。三七对机体免疫系统的影响是相当广泛的，它可促进机体粒细胞单核巨噬细胞系统的增殖和活化。可使T淋巴细胞增殖，较高剂量有促进B淋巴细胞的作用，在病理免疫病情况下起调节的作用，在抗肿瘤中也有一定作用。三七总皂甙有显著的镇静作用，并能协同中枢抑制药的抑制作用。冬虫夏草也是传统名贵药材，最初见于清《本草备要》入肺经止咳，又作为肝肾双补佳品。经现代科学分析表明，虫草含真菌多糖、虫草素及多种氨基酸、维生素、酶、钙、磷、锌等数十种微量元素，具有提高肌体免疫功能，促进造血和新陈代谢功能。冬虫夏草煎剂腹腔注射可明显抑制小鼠自发性活动，延长小鼠戊巴比妥钠睡眠时间。故三七、虫草结合能在提高人体免疫功能、改善睡眠上发挥更好的保健作用。在本发明之前没有关于本发明药物组合物抗肿瘤作用的报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种药物组合物及其制备方法，本发明另一目的在于提供该药物组合物制剂的用途。
本发明目的是通过如下技术方案实现：
本发明是通过如下二味原料组成：
三七提取物10-50重量份 冬虫夏草菌丝体菌粉30-100重量份。
上述二味原料药的最佳配比如下：
三七提取物40重量份 冬虫夏草菌丝体菌粉60重量份。
上述二味原料药的配比如下：
三七提取物20重量份 冬虫夏草菌丝体菌粉80重量份。
上述二味原料药的配比如下：
三七提取物50重量份 冬虫夏草菌丝体菌粉100重量份。
上述三七提取物可以是用常规方法提取的三七提取物，冬虫夏草菌丝体菌粉为冬虫夏草上面的菌体磨成的粉。
上述组合物可以制成片剂、胶囊剂、缓释剂、颗粒剂、滴丸剂、口服液体制剂或冻干粉针剂。
本发明二味原料药的具体制备工艺如下：
取5-15目三七粗粉，用40-100％乙醇回流提取1-4次，每次1-3小时，收集提取液，过滤，滤液回收乙醇，至无乙醇味后，真空浓缩1.5-2小时，浓缩液加入等体积蒸馏水，搅拌均匀，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱吸附；用2-4倍量树脂床体积蒸馏水洗去水溶性杂质，吸附人参皂苷的树脂柱备用；将上述吸附树脂柱用20-50％乙醇洗脱，20-50％乙醇用量为1-5倍量树脂床体积，主要分离去除原人参三醇组皂苷，根据需要另行处理；用薄层色谱法跟踪检测，其中的薄层色谱法是：展开剂为30-100∶10-50∶2-20的氯仿∶甲醇∶水下层；显色剂：5-20％硫酸乙醇溶液；当薄层色谱上出现原人参二醇组皂苷斑点后，停止用20-50％乙醇洗脱，改用30-100％乙醇洗脱，并收集洗脱液；用0.5-2％活性炭加热回流0.5-2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用30-100％乙醇洗脱树脂吸附的原人参二醇组皂苷，回收乙醇，真空浓缩，真空干燥，粉碎，收集原人参二醇组皂苷约为提取物投料量的3-4％；取上述纯化的原人参二醇组皂苷粉溶解于30-70％醋酸、20-50％枸橼酸、20-50％草酸、20-50％丙二酸、0.5-2％盐酸或0.5-2％硫酸的水或乙醇溶液中，控制反应条件：酸浓度为1％-55％，水解温度为20℃-100℃，水解时间为0.5小时-10小时，进行酸水解，反应完成后加入与水解转化液等体积的蒸馏水，用6％氢氧化钠溶液中和至中性，收集水解产物的沉淀，用10倍量蒸馏水，分2-3次洗沉淀，真空干燥，粉碎，备用，收率为投料原人参二醇组皂苷的30-40％；将水解产物溶解于5-10倍量50-140％乙醇中，以60℃-70℃加热，回流加快溶解，过滤，滤液用1％活性炭加热回流0.5-2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用30-100％乙醇洗脱树脂，回收乙醇至总体积的1/4-1，冷却，放置结晶，真空抽滤，收集结晶，真空干燥，粉碎；用高效液相色谱法测定人参皂苷Rh2和Rg3的含量；人参皂苷Rh2含量为24.84％，人参皂苷Rg3含量为44.44％；收率约为原人参二醇组皂苷投料量的4-5％；
将采集的冬虫夏草带回实验室，采用单孢子分离法和组织分离法分离。冬虫夏草菌用PDA培养，10-20℃培养，根据冬虫夏草菌的菌落特征，经过多次挑取接种后，在培养基上未见其他菌落生长，说明菌种已经纯化过程，得到冬虫夏草真菌；冬虫夏草真菌按每袋培养基0.3kg接入1g菌种的比例，使其在PDA培养基上生长，即分离得到冬虫夏草菌菌种菌落；菌落在PDA培养基上生长缓慢，菌落紫褐色，紧实，背面褐色；菌丝无色，分隔，光滑，分生孢子梗无色，单生或簇生与无色球形细胞组成的小子座；菌落圆形，边缘整齐，致密；用接种环将菌种接入PDA培养基， 在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌；将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却；待环冷却后沾取少量菌或袍子，然后将接种环移出接种管，在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管；从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线；取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上；10-20天后，再把试管培养基上的真菌接入固体或液体发酵培养基，保持10～15℃培养；固体培养基为大米与水的比例为0.8-1.2∶0.9～1.2，每升培养基中还要加入蛋白胨10-20克，蔗糖180-220克，牛肉膏20-30克，磷酸二氢钾3-7克，PH5-8；当菌丝充满整个培养基时，将菌丝分离、烘干即为菌丝体成品，菌丝体粉碎即冬虫夏草菌丝体菌；
上述的组织分离法为：将采回的冬虫夏草，用千分之一的升汞消毒3～5分钟，用灭菌水冲洗5遍，切开外皮，将中心组织接入PDA培养基，12度培养，10天后可见有白色菌丝长出，挑选颜色最纯净的白色菌丝再接入PDA培养基进行二次培养，经12度培养，10天后再长出的白色菌丝即可作为菌种保留。
本药物组合物优选制备方法如下：
取10目三七粗粉，用70％乙醇回流提取3次，每次2小时，收集提取液，过滤，滤液回收乙醇，至无乙醇味后，真空浓缩2小时，浓缩液加入等体积蒸馏水，搅拌均匀，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱吸附；用3倍量树脂床体积蒸馏水洗去水溶性杂质，吸附人参皂苷的树脂柱备用；将上述吸附树脂柱用35％乙醇洗脱，35％乙醇用量为2.5倍量树脂床体积，主要分离去除原人参三醇组皂苷，根据需要另行处理；用薄层色谱法跟踪检测，其中的薄层色谱法是：展开剂为65∶35∶10的氯仿∶甲醇∶水下层；显色剂：10％硫酸乙醇溶液；当薄层色谱上出现原人参二醇组皂苷斑点后，停止用35％乙醇洗脱，改用65％乙醇洗脱，并收集洗脱液；用1％活性炭加热回流0.5小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用65％乙醇洗脱树脂吸附的原人参二醇组皂苷，回收乙醇，真空浓缩，真空干燥，粉碎，收集原人参二醇组皂苷约为提取物投料量的4％；取上述纯化的原人参二醇组皂苷粉溶解于50％醋酸或1％盐酸中，水解温度为75℃，盐酸水解1小时，醋酸水解6小时，进行酸水解，反应完成后加入与水解转化液等体积的蒸馏水，用6％氢氧化钠溶液中和至中性，收集水解产物的沉淀，用10倍量蒸馏水，分3次洗沉淀，真空干燥，粉碎，备用，收率为投料原人参二醇组皂苷的40％；将水解产物溶解于10倍量95％乙醇中，以70℃加热，回流加快溶解，过滤，滤液用1％活性炭加热回流2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用95％乙醇洗脱树脂，回收乙醇至总体积的1/2，冷却，放置结晶，真空抽滤，收集结晶，真空干燥，粉碎；用高效液相色谱法测定人参皂苷Rh2和Rg3的含量；人参皂苷Rh2含量为24.84％，人参皂苷Rg3含量为44.44％；收率约为原人参二醇组皂苷投料量的5％；
将采集的冬虫夏草带回实验室，采用单孢子分离法和组织块分离法分离；冬虫夏草菌用PDA培养，16℃培养，根据冬虫夏草菌的菌落特征，经过多次挑取接种后，在培养基上未见其他菌落生长，说明菌种已经纯化过程，得到冬虫夏草真菌；冬虫夏草真菌按每袋培养基0.3kg接入1g菌种的比例，使其在PDA培养基上生长，即分离得到冬虫夏草菌菌种菌落；菌落在PDA培养基上生长缓慢，菌落紫褐色，紧实，背面褐色；菌丝无色，分隔，光滑，分生孢子梗无色，单生或簇生与无色球形细胞组成的小子座；菌落圆形，边缘整齐，致密；用接种环将菌种接入PDA培养基， 在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌；将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却；待环冷却后沾取少量菌或袍子，然后将接种环移出接种管，在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管；从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线；取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上；15天后，再把试管培养基上的真菌接入固体或液体发酵培养基，保持10～15℃培养；固体培养基为米饭培养基，大米与水的比例为1∶0.9～1.2，每升培养基中还要加入蛋白胨15克，蔗糖200克，牛肉膏25克，磷酸二氢钾5克，PH6.5；当菌丝充满整个培养基时，将菌丝分离、烘干即为菌丝体成品；将菌丝体粉碎即得冬虫夏草菌丝体菌。
下面实验例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1 对大鼠主动脉微血管样结构影响的实验
取雄性健康SD大鼠2只，5～8周龄，120～150g，25％乌拉坦麻醉，超净工作台内75％酒精体表消毒，沿大鼠胸部一侧切开，小心剪取大鼠胸主动脉，放入预冷PBS液中，用眼科镊从胸主动脉近心端将血管外组织清除，只留光滑血管条，反复冲洗，将血管内血凝块除去，并将主动脉小血管分支剪去，放入新鲜PBS液中再漂洗数次，用眼科剪将血管条剪成约1mm宽血管环，剪完后，挑选50个大小相似血管环，放入预冷的M199中备用。称取Fibrinogen，用M199溶解配成3mg/mL溶液，一次性滤器滤过除菌后备用。用M199将Thrombin配成25U/mL溶液，吸取800μl Fibrinogen液，加入适量Thrombin液混匀后加入48孔培养板，植入血管环待凝固后即可，每孔植入一个动脉环，考虑到平行，故随机挑选血管环种植。
实验共分正常模型对照、本发明药物组合物中剂量与小剂量3组。待胶凝后，加入培养基，整个培养基体积为600μl，正常组为600μl M199，给药组皆采用50μl药液加550μl培养基(M199)组成含药培养基，加液完毕后，放入37℃、5％CO2温孵箱中常规培养，隔1天换液1次。换液当天在莱卡显微镜下观察并记录血管环生长情况。以40×10倍镜下观察5视野的细胞数；10×10倍镜下观察4视野的管腔结构数。
1、对血管内皮细胞数影响结果见表1
表1：本发明药物组合物对大鼠主动脉血管内皮细胞的影响
与对照组相比，*P＜0.05
从表1可以看出，第3天，本发明药物组合物中剂量组大鼠主动脉血管内皮细胞明显减少，与对照组比较，有统计学意义(P＜0.05)；第5天、7天实验各组血管内皮数均见明显减少，与对照组比较，有统计学意义(P＜0.05)。
2、对微血管样结构的影响
结果见表2
表2、本发明药物组合物对大鼠主动脉血管管腔结构的影响
与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
从表2可知，实验各组从第9天大鼠主动脉血管管腔结构明显减少，与对照组比较，具有统计学意义(P＜0.05，＜0.01)。
通过本发明药物组合物对大鼠主动脉微血管样结构影响研究表明，两个不同剂量组均可明显抑制大鼠主动脉微血管生成。通过本实验结果可以获得以下初步结论：①本发明药物组合物对无血清培养的大鼠主动脉内皮细胞与微血管样结构影响与时间呈正相关性。②本发明药物组合物可以明显抑制无血清培养的大鼠主动脉微血管生成，说明该活性成分具有潜在的研究价值。
本实验从器官组织水平已经证实，本发明药物组合物提取物合用具有明显的抗血管生成活性，其实验结果为该混合物体内抑瘤研究与抗肿瘤血管生成机制研究提供了预实验基础。
实验例2 对移植性乳腺肿瘤组织微血管密度影响
细胞培养与接种：
EMT6细胞用含10％小牛血清RMPI1640培养液培养，细胞长满单层，用0.25％胰酶消化，培养液吹打离心，收集细胞，PBS稀释，镜下细胞计数，调浓度为5×106，每只小鼠以0.2ml接种于小鼠右后背部。12天后肿瘤长至1g时移植。
小鼠肿瘤移植：
断颈处死荷瘤小鼠，75％酒精浸泡3-5分钟，取出放于超净工作台平皿中，用高压灭菌过的手术器械剪开肿瘤皮肤，分离肿瘤包膜，取出肿瘤放入消毒后的PBS液清洗，称重，按每克肿瘤4ml溶液的比例用生理盐水稀释。剪碎瘤体，充分匀浆制成细胞悬液，细胞计数，调浓度为2×106，每只小鼠于右后背部皮下接种0.2ml。
分组与给药：
接种第13天肿瘤长至1mm3时(成瘤36只)随机分本发明药物组合物中、小剂量组与模型对照3组，每组12只动物。按保健食品本发明药物组合物胶囊人服用剂量换算成动物实验用药剂量，中剂量218.4mg/d，小剂量为109.2mg/d。使用时配制成91mg/ml与45.5mg/ml两个不同浓度，每次灌胃0.6ml，每天2次。模型对照组以生理盐水灌胃，每天0.4ml。以上各组连续给药10天，至停药次日处死小鼠，并迅速取出瘤体称重，根据公式计算抑瘤率。同时，用石蜡包埋肿瘤组织，切片进行MDV检测。
随机选择各组中6只小鼠肿瘤组织，常规石腊包埋，HE染色做病理观察。并留6只小鼠肿瘤以石腊切片分别进行免疫组化染色，以检测MVD表达。染色步骤如下：①石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(PH7.4)冲洗3次，每次3～5min。②根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。③每张切片加1滴或50μl过氧化酶阻断液(试剂A)，室温下孵育15min，以阻断内源性过氧化物酶的活性；PBS冲洗3次，每次5min。④除去PBS液，每张切片加1滴或50μl Ultra V Block(试剂B)，室温下孵育5min；PBS冲洗4次，每次5min。⑤除去PBS液，每张切片加1滴或50μl Rodent Block(试剂C)，室温下孵育60～70min。PBS冲洗4次，每次5min。⑥除去PBS液，每张切片加1滴或50μl的第一抗体，4℃过夜。⑦PBS冲洗4次，每次5min，除去PBS液，每张切片加1滴或50μl生物素标记的第二抗体(试剂D)，室温下孵育10～15min。⑧PBS冲洗4次，每次5min。除去PBS液，每张切片加1滴或50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂E)，室温下孵育10～15min。PBS冲洗4次，每次5min。⑨除去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB溶液。显微镜下观察3～10min。染色结果为棕色。⑩自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固。
先用低倍镜(100倍)找出肿瘤中毛细血管热点区，再用高倍镜(400倍)进行计数。凡染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇均为一个血管计数，染色阳性部位在细胞浆。各组统计6张切片，每张切片观察3个视野中的血管数，取其平均值为MVD。管腔大于8个红细胞大小、有较厚肌层的血管不计数。结果见表3。
表3：各组肿瘤组织MVD数
与对照组相比，*P＜0.01
由表3可以看出，本发明药物组合物中、小剂量组肿瘤组织MDV数与模型对照组比较，有统计学意义(P＜0.01)。说明本发明药物组合物能降低小鼠乳腺肿瘤微血管密度。似乎以中剂量为好。
实验结果显示，本发明药物组合物中、小剂量组均具有减少移植性小鼠乳腺肿瘤组织MVD效应，与对照组比较，具有统计学意义(P＜0.01)。结合本发明药物组合物可明显抑制无血清培养的大鼠主动脉微血管结构实验结果可以证明，抗肿瘤新生血管形成可能是本发明药物组合物抗肿瘤机制之一。
实验例3 抗移植性小鼠乳腺肿瘤效应初步研究
细胞培养与接种：
EMT6细胞用含10％小牛血清RMPI1640培养液培养，细胞长满单层，用0.25％胰酶消化，培养液吹打离心，收集细胞，PBS稀释，镜下细胞计数，调浓度为5×106，每只小鼠以0.2ml接种于小鼠右后背部。12天后肿瘤长至1g左右时移植。
肿瘤移植：
断颈处死荷瘤小鼠，75％酒精浸泡3-5分钟，取出放于超净工作台平皿中，用高压灭菌过的手术器械剪开小鼠皮肤，分离肿瘤包膜，取出肿瘤放入消毒后的PBS液清洗，称重，按每克肿瘤4ml溶液比例以生理盐水稀释。剪碎瘤体，充分匀浆制成细胞悬液，细胞计数，调浓度为2×106，每只小鼠于右后背部皮下接种0.2ml。
分组给药：
接种第13天肿瘤长至1mm3时(成瘤36只)随机分本发明药物组合物中、小剂量与模型对照3组。每组12只动物。所有实验用药均采用人用药剂量换算成动物用药剂量确定。本发明药物组合物组按保健食品本发明药物组合物胶囊人服用剂量换算成动物实验用药剂量，中剂量218.4mg/d，小剂量为109.2mg/d。使用时配制成91mg/ml与45.5mg/ml两个不同浓度，每次灌胃0.6ml，每天2次。模型对照组以生理盐水灌胃，每天0.4ml。以上各组连续给药10天，至停药次日处死小鼠，并迅速取出瘤体称重，根据公式计算抑瘤率。同时，用石蜡包埋肿瘤组织，切片进行组织病理学观察。
一般观察：
通过实验过程中的动态观察，模型对照组小鼠活动减少，毛发稀疏无光泽，反应迟钝；而本发明药物组合物各组小鼠状态较好，毛发有光泽，活动灵活。
肿瘤抑制率
结果见表4。
表4：实验各组肿瘤重量与抑瘤率
与对照组比较，*P＜0.05
病理学观察：
将预先用石蜡包埋的肿瘤组织进行切片，HE染色，在光学显微镜下行肿瘤组织病理学观察。结果显示，模型组癌细胞呈癌巢状排列，瘤细胞呈异型性，细胞核大小不等，胞核着色深，未见坏死。实验用药各组除见有肿瘤组织片状坏死外，其他病理学特征与对照组比较无明显差别。可以推测本发明药物组合物抑制移植性小鼠乳腺肿瘤生长可能与其对肿瘤细胞的直接杀伤有一定的关系。但是否存在着其他机制有待研究。
本次实验结果证明，本发明药物组合物具有较为明显的抗肿瘤效应。按保健食品“本发明药物组合物胶囊”成人用剂量推算，中、小剂量对移植性乳腺癌抑瘤率分别为48.95％与37.64％。两种结果均已经达到国家食品药品监督管理局关于中药抗肿瘤实验规定的抑瘤率。因此，本发明药物组合物胶囊可试用作为肿瘤，特别中晚期肿瘤的临床治疗。
实验例4 对移植性小鼠乳腺肿瘤血管相关因子表达影响研究
细胞培养与接种：
EMT6细胞用含10％小牛血清RMPI1640培养液培养，细胞长满单层，用0.25％胰酶消化，培养液吹打离心，收集细胞，PBS稀释，镜下细胞计数，调浓度为5×106，每只小鼠以0.2ml接种于小鼠右后背部。12天后肿瘤长至1g时移植。
小鼠肿瘤移植：
断颈处死荷瘤小鼠，75％酒精浸泡3-5分钟，取出放于超净工作台平皿中，用高压灭菌过的手术器械剪开肿瘤皮肤，分离肿瘤包膜，取出肿瘤放入消毒后的PBS液清洗，称重，按每克肿瘤4ml溶液的比例用生理盐水稀释。剪碎瘤体，充分匀浆制成细胞悬液，细胞计数，调浓度为2×106，每只小鼠于右后背部皮下接种0.2ml。
分组与给药：
接种第13天肿瘤长至1mm3时(成瘤36只)，随机分本发明药物组合物中、小剂量组与模型对照3组，每组12只动物。按保健食品本发明药物组合物胶囊人服用剂量换算成动物实验用药剂量，中剂量218.4mg/d，小剂量为109.2mg/d。使用时配制成91mg/ml与45.5mg/ml两个不同浓度，每次灌胃0.6ml，每天2次。模型对照组以生理盐水灌胃，每天0.4ml。以上各组连续给药10天，至用药第11天处死小鼠，并迅速取出瘤体称重，根据公式计算抑瘤率。同时，用石蜡包埋肿瘤组织，切片进行VEGF、TIMP-2检测。
检测方法：
随机选择各组中6只小鼠肿瘤组织，常规石腊包埋，HE染色病理观察。并留6只小鼠肿瘤石腊切片分别进行免疫组化染色，以检测VEGF、TIMP-2表达。染色步骤如下：①石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(PH7.4)冲洗3次，每次3～5min。②根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。③每张切片加1滴或50μl过氧化酶阻断液(试剂A)，室温下孵育15min，以阻断内源性过氧化物酶的活性；PBS冲洗3次，每次5min。④除去PBS液，每张切片加1滴或50μl Ultra V Block(试剂B)，室温下孵育5min；PBS冲洗4次，每次5min。⑤除去PBS液，每张切片加1滴或50μl RodentBlock(试剂C)，室温下孵育60～70min。PBS冲洗4次，每次5min。⑥除去PBS液，每张切片加1滴或50μl的第一抗体，4℃过夜。⑦PBS冲洗4次，每次5min，除去PBS液，每张切片加1滴或50μl生物素标记的第二抗体(试剂D)，室温下孵育10～15min。⑧PBS冲洗4次，每次5min。除去PBS液，每张切片加1滴或50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂E)，室温下孵育10～15min。PBS冲洗4次，每次5min。⑨除去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB溶液。显微镜下观察3～10min。染色结果为棕色。⑩自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固。
1、血管内皮生长因子测定
光学显微镜下观察，VEGF阳性细胞为棕黄色颗粒状，阳性表达位于细胞浆。肿瘤细胞中阳性＜5％为(+)，5％-15％为(++)，＞15％为(+++)。各组观察8张切片，结果见表5。
表5：各组VEGF阳性表达结果(n＝8)
由表5可以看出，本发明药物组合物中、小剂量VEGF阳性表达主要以+-++多见，模型对照组则以+++为主。经Ridit检验，中剂量组与对照组比较，u＝2.819，具有统计学意义(P＜0.01)；小剂量组与对照组比较，u＝2.33，具有统计学意义(P＜0.05)。
2、金属蛋白酶组织抑制因子II测定
以免疫组织化学法半定量判断，TIMP-2阳性细胞为棕黄色颗粒状，阳性表达位于细胞浆。肿瘤组织中未见阳性细胞为(-)，阳性细胞在肿瘤细胞团中＜1/3为(+)，1/3～2/3为(++)，＞2/3为(+++)。各组观察8张切片，结果见表6
表6、各组TIMP-2表达结果(n＝8)
由表6可以看出，本发明药物组合物中、小剂量组的TIMP-2阳性细胞表达多在++-+++，而对照组则在+-++。经Ridit检验，中剂量组与对照组比较，u＝2.875，具有统计学意义(P＜0.05)；小剂量组与对照组比较，u＝2.389，具有统计学意义(P＜0.05)。
研究结果显示：本发明药物组合物灌胃中、小剂量均可明显降低移植性小鼠乳腺肿瘤组织的VEGF表达水平、增高TIMP-2表达水平。结合本发明药物组合物可明显抑制无血清培养的大鼠主动脉微血管结构研究结果，充分证明抗肿瘤新生血管生成机制可能是本发明药物组合物抗肿瘤机制之一。
具体实施例如下：
实施例1：口服凝胶的制备
三七提取物40kg 冬虫夏草菌丝体菌粉60kg，加常规辅料制成口服凝胶。
三七提取物的制备工艺为：
取10目三七粗粉，用70％乙醇回流提取3次，每次2小时，收集提取液，过滤，滤液回收乙醇，至无乙醇味后，真空浓缩2小时，浓缩液加入等体积蒸馏水，搅拌均匀，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱吸附；用3倍量树脂床体积蒸馏水洗去水溶性杂质，吸附人参皂苷的树脂柱备用；将上述吸附树脂柱用35％乙醇洗脱，35％乙醇用量为2.5倍量树脂床体积，主要分离去除原人参三醇组皂苷，根据需要另行处理；用薄层色谱法跟踪检测，其中的薄层色谱法是：展开剂为65∶35∶10的氯仿∶甲醇∶水下层；显色剂：10％硫酸乙醇溶液；当薄层色谱上出现原人参二醇组皂苷斑点后，停止用35％乙醇洗脱，改用65％乙醇洗脱，并收集洗脱液；用1％活性炭加热回流0.5小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用65％乙醇洗脱树脂吸附的原人参二醇组皂苷，回收乙醇，真空浓缩，真空干燥，粉碎，收集原人参二醇组皂苷约为提取物投料量的4％；取上述纯化的原人参二醇组皂苷粉溶解于50％醋酸或1％盐酸中，水解温度为75℃，盐酸水解1小时，醋酸水解6小时，进行酸水解，反应完成后加入与水解转化液等体积的蒸馏水，用6％氢氧化钠溶液中和至中性，收集水解产物的沉淀，用10倍量蒸馏水，分3次洗沉淀，真空干燥，粉碎，备用，收率为投料原人参二醇组皂苷的40％；将水解产物溶解于10倍量95％乙醇中，以70℃加热，回流加快溶解，过滤，滤液用1％活性炭加热回流2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用95％乙醇洗脱树脂，回收乙醇至总体积的1/2，冷却，放置结晶，真空抽滤，收集结晶，真空干燥，粉碎；用高效液相色谱法测定人参皂苷Rh2和Rg3的含量。人参皂苷Rh2含量为24.84％，人参皂苷Rg3含量为44.44％；收率约为原人参二醇组皂苷投料量的5％；
冬虫夏草菌丝体菌粉的制备工艺为：
将采集的冬虫夏草带回实验室，采用单孢子分离法和组织块分离法分离。冬虫夏草菌用PDA培养，16℃培养，根据冬虫夏草菌的菌落特征，经过多次挑取接种后，在培养基上未见其他菌落生长，说明菌种已经纯化过程，得到冬虫夏草真菌；冬虫夏草真菌按每袋培养基0.3kg接入1g菌种的比例，使其在PDA培养基上生长，即分离得到冬虫夏草菌菌种菌落；菌落在PDA培养基上生长缓慢，菌落紫褐色，紧实，背面褐色；菌丝无色，分隔，光滑，分生孢子梗无色，单生或簇生与无色球形细胞组成的小子座；菌落圆形，边缘整齐，致密；用接种环将菌种接入PDA培养基，在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌；将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却；待环冷却后沾取少量菌或袍子，然后将接种环移出接种管，在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线；取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上；15天后，再把试管培养基上的真菌接入固体或液体发酵培养基，保持10～15℃培养。固体培养基为米饭培养基，大米与水的比例为1∶0.9～1.2，每升培养基中还要加入蛋白胨15克，蔗糖200克，牛肉膏25克，磷酸二氢钾5克，PH6.5。当菌丝充满整个培养基时，将菌丝分离、烘干即为菌丝体成品。将菌丝体粉碎即得冬虫夏草菌丝体菌。
实施例2：胶囊剂的制备
三七提取物20kg冬虫夏草菌丝体菌粉80kg，加常规辅料制成胶囊剂。
三七提取物的制备工艺为：
取15目三七粗粉，用80％乙醇回流提取4次，每次3小时，收集提取液，过滤，滤液回收乙醇，至无乙醇味后，真空浓缩1.5小时，浓缩液加入等体积蒸馏水，搅拌均匀，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱吸附；用4倍量树脂床体积蒸馏水洗去水溶性杂质，吸附人参皂苷的树脂柱备用；将上述吸附树脂柱用45％乙醇洗脱，45％乙醇用量为5倍量树脂床体积，主要分离去除原人参三醇组皂苷，根据需要另行处理；用薄层色谱法跟踪检测，其中的薄层色谱法是：展开剂为80∶50∶10的氯仿∶甲醇∶水下层；显色剂20％硫酸乙醇溶液；当薄层色谱上出现原人参二醇组皂苷斑点后，停止用45％乙醇洗脱，改用80％乙醇洗脱，并收集洗脱液；用2％活性炭加热回流2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用80％乙醇洗脱树脂吸附的原人参二醇组皂苷，回收乙醇，真空浓缩，真空干燥，粉碎，收集原人参二醇组皂苷约为提取物投料量的3％；取上述纯化的原人参二醇组皂苷粉溶解于70％醋酸或50％枸橼酸的水或乙醇溶液中，水解温度为90℃，水解时间为8小时，进行酸水解，反应完成后加入与水解转化液等体积的蒸馏水，用6％氢氧化钠溶液中和至中性，收集水解产物的沉淀，用10倍量蒸馏水，分3次洗沉淀，真空干燥，粉碎，备用，收率为投料原人参二醇组皂苷的40％；将水解产物溶解于7量100％乙醇中，以70℃加热，回流加快溶解，过滤，滤液用1％活性炭加热回流2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用90％乙醇洗脱树脂，回收乙醇至总体积的1/3，冷却，放置结晶，真空抽滤，收集结晶，真空干燥，粉碎；用高效液相色谱法测定人参皂苷Rh2和Rg3的含量。人参皂苷Rh2含量为24.84％，人参皂苷Rg3含量为44.44％；收率约为原人参二醇组皂苷投料量的4％；
冬虫夏草菌丝体菌粉的制备工艺为：
将采集的冬虫夏草带回实验室，采用单孢子分离法和组织块分离法分离。冬虫夏草菌用PDA培养，15℃培养，根据冬虫夏草菌的菌落特征，经过多次挑取接种后，在培养基上未见其他菌落生长，说明菌种已经纯化过程，得到冬虫夏草真菌；冬虫夏草真菌按每袋培养基0.3kg接入1g菌种的比例，使其在PDA培养基上生长，即分离得到冬虫夏草菌菌种菌落；菌落在PDA培养基上生长缓慢，菌落紫褐色，紧实，背面褐色；菌丝无色，分隔，光滑，分生孢子梗无色，单生或簇生与无色球形细胞组成的小子座；菌落圆形，边缘整齐，致密；用接种环将菌种接入PDA培养基，在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌；将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却；待环冷却后沾取少量菌或袍子，然后将接种环移出接种管，在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线；取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上；18天后，再把试管培养基上的真菌接入固体或液体发酵培养基，保持12℃培养。固体培养基为大米与水的比例为1.2∶1.1，每升培养基中还要加入蛋白胨18克，蔗糖210克，牛肉膏25克，磷酸二氢钾5克，PH7。当菌丝充满整个培养基时，将菌丝分离、烘干即为菌丝体成品，菌丝体粉碎即冬虫夏草菌丝体菌。
实施例3：滴丸的制备
三七提取物50kg冬虫夏草菌丝体菌粉100kg，加常规辅料制成滴丸。
三七提取物的制备工艺为：
取12目三七粗粉，用65％乙醇回流提取3次，每次2小时，收集提取液，过滤，滤液回收乙醇，至无乙醇味后，真空浓缩2小时，浓缩液加入等体积蒸馏水，搅拌均匀，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱吸附；用4倍量树脂床体积蒸馏水洗去水溶性杂质，吸附人参皂苷的树脂柱备用；将上述吸附树脂柱用40％乙醇洗脱，40％乙醇用量为3倍量树脂床体积，主要分离去除原人参三醇组皂苷，根据需要另行处理；用薄层色谱法跟踪检测，其中的薄层色谱法是：展开剂为40∶50∶10的氯仿∶甲醇∶水下层；显色剂：10％硫酸乙醇溶液；当薄层色谱上出现原人参二醇组皂苷斑点后，停止用40％乙醇洗脱，改用85％乙醇洗脱，并收集洗脱液；用1.5％活性炭加热回流2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用80％乙醇洗脱树脂吸附的原人参二醇组皂苷，回收乙醇，真空浓缩，真空干燥，粉碎，收集原人参二醇组皂苷约为提取物投料量的3-4％；取上述纯化的原人参二醇组皂苷粉溶解于2％盐酸或1％硫酸的水或乙醇溶液中，水解温度为90℃，水解时间为9小时，进行酸水解，反应完成后加入与水解转化液等体积的蒸馏水，用6％氢氧化钠溶液中和至中性，收集水解产物的沉淀，用10倍量蒸馏水，分3次洗沉淀，真空干燥，粉碎，备用，收率为投料原人参二醇组皂苷的30％；将水解产物溶解于7倍量50％乙醇中，以60℃加热，回流加快溶解，过滤，滤液用1％活性炭加热回流2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用30-100％乙醇洗脱树脂，回收乙醇至总体积的1/4，冷却，放置结晶，真空抽滤，收集结晶，真空干燥，粉碎；用高效液相色谱法测定人参皂苷Rh2和Rg3的含量。人参皂苷Rh2含量为24.84％，人参皂苷Rg3含量为44.44％；收率约为原人参二醇组皂苷投料量的4.5％；
冬虫夏草菌丝体菌粉的制备工艺为：
将采集的冬虫夏草带回实验室，采用单孢子分离法和组织块分离法分离。冬虫夏草菌用PDA培养，20℃培养，根据冬虫夏草菌的菌落特征，经过多次挑取接种后，在培养基上未见其他菌落生长，说明菌种已经纯化过程，得到冬虫夏草真菌；冬虫夏草真菌按每袋培养基0.3kg接入1g菌种的比例，使其在PDA培养基上生长，即分离得到冬虫夏草菌菌种菌落；菌落在PDA培养基上生长缓慢，菌落紫褐色，紧实，背面褐色；菌丝无色，分隔，光滑，分生孢子梗无色，单生或簇生与无色球形细胞组成的小子座；菌落圆形，边缘整齐，致密；用接种环将菌种接入PDA培养基，在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌；将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却；待环冷却后沾取少量菌或袍子，然后将接种环移出接种管，在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线；取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上；10-20天后，再把试管培养基上的真菌接入固体或液体发酵培养基，保持10～15℃培养。固体培养基为大米与水的比例为1.1∶1.2，每升培养基中还要加入蛋白胨15克，蔗糖200克，牛肉膏25克，磷酸二氢钾6克，PH8。当菌丝充满整个培养基时，将菌丝分离、烘干即为菌丝体成品，菌丝体粉碎即冬虫夏草菌丝体菌。
实施例4：口服溶液的制备
三七提取物30kg冬虫夏草菌丝体菌粉70kg，按常规工艺加常规辅料制成口服溶液。
实施例5：胶囊的制备
三七提取物20kg 冬虫夏草菌丝体菌粉80kg，按常规工艺加常规辅料制成胶囊。
实施例6：片剂的制备
三七提取物40kg冬虫夏草菌丝体菌粉60kg，按常规工艺加常规辅料制成片剂。
实施例7：颗粒剂的制备
三七提取物10kg冬虫夏草菌丝体菌粉90kg，按常规工艺加常规辅料制成颗粒剂。
Claims (18)
1、一种治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于该药物组合物是由如下方法制成：
原料药：三七提取物10-50重量份冬虫夏草菌丝体菌粉30-100重量份；
工艺步骤：取5-15目三七粗粉，用40-100％乙醇回流提取1-4次，每次1-3小时，收集提取液，过滤，滤液回收乙醇，至无乙醇味后，真空浓缩1.5-2小时，浓缩液加入等体积蒸馏水，搅拌均匀，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱吸附；用2-4倍量树脂床体积蒸馏水洗去水溶性杂质，吸附人参皂苷的树脂柱备用；将上述吸附树脂柱用20-50％乙醇洗脱，20-50％乙醇用量为1-5倍量树脂床体积，主要分离去除原人参三醇组皂苷，根据需要另行处理；用薄层色谱法跟踪检测，其中的薄层色谱法是：展开剂为30-100∶10-50∶2-20的氯仿∶甲醇∶水下层；显色剂：5-20％硫酸乙醇溶液；当薄层色谱上出现原人参二醇组皂苷斑点后，停止用20-50％乙醇洗脱，改用30-100％乙醇洗脱，并收集洗脱液；用0.5-2％活性炭加热回流0.5-2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用30-100％乙醇洗脱树脂吸附的原人参二醇组皂苷，回收乙醇，真空浓缩，真空干燥，粉碎，收集原人参二醇组皂苷为提取物投料量的3-4％；取上述纯化的原人参二醇组皂苷粉溶解于30-70％醋酸、20-50％枸橼酸、20-50％草酸、20-50％丙二酸、0.5-2％盐酸或0.5-2％硫酸的水或乙醇溶液中，控制反应条件：酸浓度为1％-55％，水解温度为20℃-100℃，水解时间为0.5小时-10小时，进行酸水解，反应完成后加入与水解转化液等体积的蒸馏水，用6％氢氧化钠溶液中和至中性，收集水解产物的沉淀，用10倍量蒸馏水，分2-3次洗沉淀，真空干燥，粉碎，备用，收率为投料原人参二醇组皂苷的30-40％；将水解产物溶解于5-10倍量50-140％乙醇中，以60℃-70℃加热，回流加快溶解，过滤，滤液用1％活性炭加热回流0.5-2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用30-100％乙醇洗脱树脂，回收乙醇至总体积的1/4-1，冷却，放置结晶，真空抽滤，收集结晶，真空干燥，粉碎；用高效液相色谱法测定人参皂苷Rh2和Rg3的含量；人参皂苷Rh2含量为24.84％，人参皂苷Rg3含量为44.44％；收率为原人参二醇组皂苷投料量的4-5％；将采集的冬虫夏草带回实验室，采用单孢子分离法和组织块分离法分离；冬虫夏草菌用PDA培养，10-20℃培养，根据冬虫夏草菌的菌落特征，经过多次挑取接种后，在培养基上未见其他菌落生长，说明菌种已经纯化过程，得到冬虫夏草真菌；冬虫夏草真菌按每袋培养基0.3kg接入1g菌种的比例，使其在PDA培养基上生长，即分离得到冬虫夏草菌菌种菌落；菌落在PDA培养基上生长缓慢，菌落紫褐色，紧实，背面褐色；菌丝无色，分隔，光滑，分生孢子梗无色，单生或簇生与无色球形细胞组成的小子座；菌落圆形，边缘整齐，致密；用接种环将菌种接入PDA培养基，在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌；将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却；待环冷却后沾取少量菌或袍子，然后将接种环移出接种管，在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管；从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线；取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上；10-20天后，再把试管培养基上的真菌接入固体或液体发酵培养基，保持10～15℃培养；固体培养基为大米与水的比例为0.8-1.2∶0.9～1.2，每升培养基中还要加入蛋白胨10-20克，蔗糖180-220克，牛肉膏20-30克，磷酸二氢钾3-7克，PH5-8；当菌丝充满整个培养基时，将菌丝分离、烘干即为菌丝体成品，菌丝体粉碎即冬虫夏草菌丝体菌。
2、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于其中的原料药为：
三七提取物40重量份 冬虫夏草菌丝体菌粉60重量份。
3、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于其中的原料药为：
三七提取物20重量份 冬虫夏草菌丝体菌粉80重量份。
4、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于其中的原料药为：
三七提取物50重量份 冬虫夏草菌丝体菌粉100重量份。
5、如权利要求1-4任一所述的药物组合物，其特征在于其中的工艺步骤为：
取10目三七粗粉，用70％乙醇回流提取3次，每次2小时，收集提取液，过滤，滤液回收乙醇，至无乙醇味后，真空浓缩2小时，浓缩液加入等体积蒸馏水，搅拌均匀，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱吸附；用3倍量树脂床体积蒸馏水洗去水溶性杂质，吸附人参皂苷的树脂柱备用；将上述吸附树脂柱用35％乙醇洗脱，35％乙醇用量为2.5倍量树脂床体积，主要分离去除原人参三醇组皂苷，根据需要另行处理；用薄层色谱法跟踪检测，其中的薄层色谱法是：展开剂为65∶35∶10的氯仿∶甲醇∶水下层；显色剂：10％硫酸乙醇溶液；当薄层色谱上出现原人参二醇组皂苷斑点后，停止用35％乙醇洗脱，改用65％乙醇洗脱，并收集洗脱液；用1％活性炭加热回流0.5小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用65％乙醇洗脱树脂吸附的原人参二醇组皂苷，回收乙醇，真空浓缩，真空干燥，粉碎，收集原人参二醇组皂苷为提取物投料量的4％；取上述纯化的原人参二醇组皂苷粉溶解于50％醋酸或1％盐酸中，水解温度为75℃，盐酸水解1小时，醋酸水解6小时，进行酸水解，反应完成后加入与水解转化液等体积的蒸馏水，用6％氢氧化钠溶液中和至中性，收集水解产物的沉淀，用10倍量蒸馏水，分3次洗沉淀，真空干燥，粉碎，备用，收率为投料原人参二醇组皂苷的40％；将水解产物溶解于10倍量95％乙醇中，以70℃加热，回流加快溶解，过滤，滤液用1％活性炭加热回流2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用95％乙醇洗脱树脂，回收乙醇至总体积的1/2，冷却，放置结晶，真空抽滤，收集结晶，真空干燥，粉碎；用高效液相色谱法测定人参皂苷Rh2和Rg3的含量；人参皂苷Rh2含量为24.84％，人参皂苷Rg3含量为44.44％；收率为原人参二醇组皂苷投料量的5％；
将采集的冬虫夏草带回实验室，采用单孢子分离法和组织块分离法分离；冬虫夏草菌用PDA培养，16℃培养，根据冬虫夏草菌的菌落特征，经过多次挑取接种后，在培养基上未见其他菌落生长，说明菌种已经纯化过程，得到冬虫夏草真菌；冬虫夏草真菌按每袋培养基0.3kg接入1g菌种的比例，使其在PDA培养基上生长，即分离得到冬虫夏草菌菌种菌落；菌落在PDA培养基上生长缓慢，菌落紫褐色，紧实，背面褐色；菌丝无色，分隔，光滑，分生孢子梗无色，单生或簇生与无色球形细胞组成的小子座；菌落圆形，边缘整齐，致密；用接种环将菌种接入PDA培养基，在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌；将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却；待环冷却后沾取少量菌或袍子，然后将接种环移出接种管，在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管；从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线；取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上；15天后，再把试管培养基上的真菌接入固体或液体发酵培养基，保持10～15℃培养；固体培养基为米饭培养基，大米与水的比例为1∶0.9～1.2，每升培养基中还要加入蛋白胨15克，蔗糖200克，牛肉膏25克，磷酸二氢钾5克，PH6.5；当菌丝充满整个培养基时，将菌丝分离、烘干即为菌丝体成品；将菌丝体粉碎即得冬虫夏草菌丝体菌。
6、如权利要求1-4任一所述的药物组合物，其特征在于其中的工艺步骤为：
取15目三七粗粉，用80％乙醇回流提取4次，每次3小时，收集提取液，过滤，滤液回收乙醇，至无乙醇味后，真空浓缩1.5小时，浓缩液加入等体积蒸馏水，搅拌均匀，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱吸附；用4倍量树脂床体积蒸馏水洗去水溶性杂质，吸附人参皂苷的树脂柱备用；将上述吸附树脂柱用45％乙醇洗脱，45％乙醇用量为5倍量树脂床体积，主要分离去除原人参三醇组皂苷，根据需要另行处理；用薄层色谱法跟踪检测，其中的薄层色谱法是：展开剂为80∶50∶10的氯仿∶甲醇∶水下层；显色剂20％硫酸乙醇溶液；当薄层色谱上出现原人参二醇组皂苷斑点后，停止用45％乙醇洗脱，改用80％乙醇洗脱，并收集洗脱液；用2％活性炭加热回流2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用80％乙醇洗脱树脂吸附的原人参二醇组皂苷，回收乙醇，真空浓缩，真空干燥，粉碎，收集原人参二醇组皂苷为提取物投料量的3％；取上述纯化的原人参二醇组皂苷粉溶解于70％醋酸或50％枸橼酸的水或乙醇溶液中，水解温度为90℃，水解时间为8小时，进行酸水解，反应完成后加入与水解转化液等体积的蒸馏水，用6％氢氧化钠溶液中和至中性，收集水解产物的沉淀，用10倍量蒸馏水，分3次洗沉淀，真空干燥，粉碎，备用，收率为投料原人参二醇组皂苷的40％；将水解产物溶解于7量100％乙醇中，以70℃加热，回流加快溶解，过滤，滤液用1％活性炭加热回流2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用90％乙醇洗脱树脂，回收乙醇至总体积的1/3，冷却，放置结晶，真空抽滤，收集结晶，真空干燥，粉碎；用高效液相色谱法测定人参皂苷Rh2和Rg3的含量；人参皂苷Rh2含量为24.84％，人参皂苷Rg3含量为44.44％；收率为原人参二醇组皂苷投料量的4％；
将采集的冬虫夏草带回实验室，采用单孢子分离法和组织块分离法分离；冬虫夏草菌用PDA培养，20℃培养，根据冬虫夏草菌的菌落特征，经过多次挑取接种后，在培养基上未见其他菌落生长，说明菌种已经纯化过程，得到冬虫夏草真菌；冬虫夏草真菌按每袋培养基0.3kg接入1g菌种的比例，使其在PDA培养基上生长，即分离得到冬虫夏草菌菌种菌落；菌落在PDA培养基上生长缓慢，菌落紫褐色，紧实，背面褐色；菌丝无色，分隔，光滑，分生孢子梗无色，单生或簇生与无色球形细胞组成的小子座；菌落圆形，边缘整齐，致密；用接种环将菌种接入PDA培养基，在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌；将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却；待环冷却后沾取少量菌或袍子，然后将接种环移出接种管，在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管；从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线；取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上；10-20天后，再把试管培养基上的真菌接入固体或液体发酵培养基，保持10～15℃培养；固体培养基为大米与水的比例为1.1∶1.2，每升培养基中还要加入蛋白胨15克，蔗糖200克，牛肉膏25克，磷酸二氢钾6克，PH8；当菌丝充满整个培养基时，将菌丝分离、烘干即为菌丝体成品，菌丝体粉碎即冬虫夏草菌丝体菌。
7、如权利要求1-4任一所述的药物组合物，其特征在于其中的工艺步骤为：
取12目三七粗粉，用65％乙醇回流提取3次，每次2小时，收集提取液，过滤，滤液回收乙醇，至无乙醇味后，真空浓缩2小时，浓缩液加入等体积蒸馏水，搅拌均匀，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱吸附；用4倍量树脂床体积蒸馏水洗去水溶性杂质，吸附人参皂苷的树脂柱备用；将上述吸附树脂柱用40％乙醇洗脱，40％乙醇用量为3倍量树脂床体积，主要分离去除原人参三醇组皂苷，根据需要另行处理；用薄层色谱法跟踪检测，其中的薄层色谱法是：展开剂为40∶50∶10的氯仿∶甲醇∶水下层；显色剂：10％硫酸乙醇溶液；当薄层色谱上出现原人参二醇组皂苷斑点后，停止用40％乙醇洗脱，改用85％乙醇洗脱，并收集洗脱液；用1.5％活性炭加热回流2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用80％乙醇洗脱树脂吸附的原人参二醇组皂苷，回收乙醇，真空浓缩，真空干燥，粉碎，收集原人参二醇组皂苷为提取物投料量的3-4％；取上述纯化的原人参二醇组皂苷粉溶解于2％盐酸或1％硫酸的水或乙醇溶液中，水解温度为90℃，水解时间为9小时，进行酸水解，反应完成后加入与水解转化液等体积的蒸馏水，用6％氢氧化钠溶液中和至中性，收集水解产物的沉淀，用10倍量蒸馏水，分3次洗沉淀，真空干燥，粉碎，备用，收率为投料原人参二醇组皂苷的30％；将水解产物溶解于7倍量50％乙醇中，以60℃加热，回流加快溶解，过滤，滤液用1％活性炭加热回流2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用30-100％乙醇洗脱树脂，回收乙醇至总体积的1/4，冷却，放置结晶，真空抽滤，收集结晶，真空干燥，粉碎；用高效液相色谱法测定人参皂苷Rh2和Rg3的含量；人参皂苷Rh2含量为24.84％，人参皂苷Rg3含量为44.44％；收率为原人参二醇组皂苷投料量的4.5％；
将采集的冬虫夏草带回实验室，采用单孢子分离法和组织块分离法分离；冬虫夏草菌用PDA培养，15℃培养，根据冬虫夏草菌的菌落特征，经过多次挑取接种后，在培养基上未见其他菌落生长，说明菌种已经纯化过程，得到冬虫夏草真菌；冬虫夏草真菌按每袋培养基0.3kg接入1g菌种的比例，使其在PDA培养基上生长，即分离得到冬虫夏草菌菌种菌落；菌落在PDA培养基上生长缓慢，菌落紫褐色，紧实，背面褐色；菌丝无色，分隔，光滑，分生孢子梗无色，单生或簇生与无色球形细胞组成的小子座；菌落圆形，边缘整齐，致密；用接种环将菌种接入PDA培养基，在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌；将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却；待环冷却后沾取少量菌或袍子，然后将接种环移出接种管，在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管；从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线；取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上；18天后，再把试管培养基上的真菌接入固体或液体发酵培养基，保持12℃培养；固体培养基为大米与水的比例为1.2∶1.1，每升培养基中还要加入蛋白胨18克，蔗糖210克，牛肉膏25克，磷酸二氢钾5克，PH7；当菌丝充满整个培养基时，将菌丝分离、烘干即为菌丝体成品，菌丝体粉碎即冬虫夏草菌丝体菌。
8、一种治疗肿瘤的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法为：
原料药：三七提取物10-50重量份 冬虫夏草菌丝体菌粉30-100重量份；
工艺步骤：取5-15目三七粗粉，用40-100％乙醇回流提取1-4次，每次1-3小时，收集提取液，过滤，滤液回收乙醇，至无乙醇味后，真空浓缩1.5-2小时，浓缩液加入等体积蒸馏水，搅拌均匀，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱吸附；用2-4倍量树脂床体积蒸馏水洗去水溶性杂质，吸附人参皂苷的树脂柱备用；将上述吸附树脂柱用20-50％乙醇洗脱，20-50％乙醇用量为1-5倍量树脂床体积，主要分离去除原人参三醇组皂苷，根据需要另行处理；用薄层色谱法跟踪检测，其中的薄层色谱法是：展开剂为30-100∶10-50∶2-20的氯仿∶甲醇∶水下层；显色剂：5-20％硫酸乙醇溶液；当薄层色谱上出现原人参二醇组皂苷斑点后，停止用20-50％乙醇洗脱，改用30-100％乙醇洗脱，并收集洗脱液；用0.5-2％活性炭加热回流0.5-2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用30-100％乙醇洗脱树脂吸附的原人参二醇组皂苷，回收乙醇，真空浓缩，真空干燥，粉碎，收集原人参二醇组皂苷为提取物投料量的3-4％；取上述纯化的原人参二醇组皂苷粉溶解于30-70％醋酸、20-50％枸橼酸、20-50％草酸、20-50％丙二酸、0.5-2％盐酸或0.5-2％硫酸的水或乙醇溶液中，控制反应条件：酸浓度为1％-55％，水解温度为20℃-100℃，水解时间为0.5小时-10小时，进行酸水解，反应完成后加入与水解转化液等体积的蒸馏水，用6％氢氧化钠溶液中和至中性，收集水解产物的沉淀，用10倍量蒸馏水，分2-3次洗沉淀，真空干燥，粉碎，备用，收率为投料原人参二醇组皂苷的30-40％；将水解产物溶解于5-10倍量50-140％乙醇中，以60℃-70℃加热，回流加快溶解，过滤，滤液用1％活性炭加热回流0.5-2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用30-100％乙醇洗脱树脂，回收乙醇至总体积的1/4-1，冷却，放置结晶，真空抽滤，收集结晶，真空干燥，粉碎；用高效液相色谱法测定人参皂苷Rh2和Rg3的含量；人参皂苷Rh2含量为24.84％，人参皂苷Rg3含量为44.44％；收率为原人参二醇组皂苷投料量的4-5％；
将采集的冬虫夏草带回实验室，采用单孢子分离法和组织块分离法分离；冬虫夏草菌用PDA培养，10-20℃培养，根据冬虫夏草菌的菌落特征，经过多次挑取接种后，在培养基上未见其他菌落生长，说明菌种已经纯化过程，得到冬虫夏草真菌；冬虫夏草真菌按每袋培养基0.3kg接入1g菌种的比例，使其在PDA培养基上生长，即分离得到冬虫夏草菌菌种菌落；菌落在PDA培养基上生长缓慢，菌落紫褐色，紧实，背面褐色；菌丝无色，分隔，光滑，分生孢子梗无色，单生或簇生与无色球形细胞组成的小子座；菌落圆形，边缘整齐，致密；用接种环将菌种接入PDA培养基，在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌；将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却；待环冷却后沾取少量菌或袍子，然后将接种环移出接种管，在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管；从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线；取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上；10-20天后，再把试管培养基上的真菌接入固体或液体发酵培养基，保持10～15℃培养；固体培养基为大米与水的比例为0.8-1.2∶0.9～1.2，每升培养基中还要加入蛋白胨10-20克，蔗糖180-220克，牛肉膏20-30克，磷酸二氢钾3-7克，PH5-8；当菌丝充满整个培养基时，将菌丝分离、烘干即为菌丝体成品，菌丝体粉碎即冬虫夏草菌丝体菌。
9、如权利要求8所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法中原料药为：三七提取物40重量份 冬虫夏草菌丝体菌粉60重量份。
10、如权利要求8所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法中原料药为：三七提取物20重量份 冬虫夏草菌丝体菌粉80重量份。
11、如权利要求8所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法中原料药为：三七提取物50重量份 冬虫夏草菌丝体菌粉100重量份。
12、如权利要求8所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法中的工艺步骤为：
取10目三七粗粉，用70％7醇回流提取3次，每次2小时，收集提取液，过滤，滤液回收乙醇，至无乙醇味后，真空浓缩2小时，浓缩液加入等体积蒸馏水，搅拌均匀，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱吸附；用3倍量树脂床体积蒸馏水洗去水溶性杂质，吸附人参皂苷的树脂柱备用；将上述吸附树脂柱用35％乙醇洗脱，35％乙醇用量为2.5倍量树脂床体积，主要分离去除原人参三醇组皂苷，根据需要另行处理；用薄层色谱法跟踪检测，其中的薄层色谱法是：展开剂为65∶35∶10的氯仿∶甲醇∶水下层；显色剂：10％硫酸乙醇溶液；当薄层色谱上出现原人参二醇组皂苷斑点后，停止用35％乙醇洗脱，改用65％乙醇洗脱，并收集洗脱液；用1％活性炭加热回流0.5小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用65％乙醇洗脱树脂吸附的原人参二醇组皂苷，回收乙醇，真空浓缩，真空干燥，粉碎，收集原人参二醇组皂苷为提取物投料量的4％；取上述纯化的原人参二醇组皂苷粉溶解于50％醋酸或1％盐酸中，水解温度为75℃，盐酸水解1小时，醋酸水解6小时，进行酸水解，反应完成后加入与水解转化液等体积的蒸馏水，用6％氢氧化钠溶液中和至中性，收集水解产物的沉淀，用10倍量蒸馏水，分3次洗沉淀，真空干燥，粉碎，备用，收率为投料原人参二醇组皂苷的40％；将水解产物溶解于10倍量95％乙醇中，以70℃加热，回流加快溶解，过滤，滤液用1％活性炭加热回流2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用95％乙醇洗脱树脂，回收乙醇至总体积的1/2，冷却，放置结晶，真空抽滤，收集结晶，真空干燥，粉碎；用高效液相色谱法测定人参皂苷Rh2和Rg3的含量；人参皂苷Rh2含量为24.84％，人参皂苷Rg3含量为44.44％；收率为原人参二醇组皂苷投料量的5％；
将采集的冬虫夏草带回实验室，采用单孢子分离法和组织块分离法分离；冬虫夏草菌用PDA培养，16℃培养，根据冬虫夏草菌的菌落特征，经过多次挑取接种后，在培养基上未见其他菌落生长，说明菌种已经纯化过程，得到冬虫夏草真菌；冬虫夏草真菌按每袋培养基0.3kg接入1g菌种的比例，使其在PDA培养基上生长，即分离得到冬虫夏草菌菌种菌落；菌落在PDA培养基上生长缓慢，菌落紫褐色，紧实，背面褐色；菌丝无色，分隔，光滑，分生孢子梗无色，单生或簇生与无色球形细胞组成的小子座；菌落圆形，边缘整齐，致密；用接种环将菌种接入PDA培养基，在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌；将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却；待环冷却后沾取少量菌或袍子，然后将接种环移出接种管，在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管；从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线；取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上；15天后，再把试管培养基上的真菌接入固体或液体发酵培养基，保持10～15℃培养；固体培养基为米饭培养基，大米与水的比例为1∶0.9～1.2，每升培养基中还要加入蛋白胨15克，蔗糖200克，牛肉膏25克，磷酸二氢钾5克，PH6.5；当菌丝充满整个培养基时，将菌丝分离、烘干即为菌丝体成品；将菌丝体粉碎即得冬虫夏草菌丝体菌。
13、如权利要求8所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法中的工艺步骤为：
取15目三七粗粉，用80％乙醇回流提取4次，每次3小时，收集提取液，过滤，滤液回收乙醇，至无乙醇味后，真空浓缩1.5小时，浓缩液加入等体积蒸馏水，搅拌均匀，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱吸附；用4倍量树脂床体积蒸馏水洗去水溶性杂质，吸附人参皂苷的树脂柱备用；将上述吸附树脂柱用45％乙醇洗脱，45％乙醇用量为5倍量树脂床体积，主要分离去除原人参三醇组皂苷，根据需要另行处理；用薄层色谱法跟踪检测，其中的薄层色谱法是：展开剂为80∶50∶10的氯仿∶甲醇∶水下层；显色剂20％硫酸乙醇溶液；当薄层色谱上出现原人参二醇组皂苷斑点后，停止用45％乙醇洗脱，改用80％乙醇洗脱，并收集洗脱液；用2％活性炭加热回流2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用80％乙醇洗脱树脂吸附的原人参二醇组皂苷，回收乙醇，真空浓缩，真空干燥，粉碎，收集原人参二醇组皂苷为提取物投料量的3％；取上述纯化的原人参二醇组皂苷粉溶解于70％醋酸或50％枸橼酸的水或乙醇溶液中，水解温度为90℃，水解时间为8小时，进行酸水解，反应完成后加入与水解转化液等体积的蒸馏水，用6％氢氧化钠溶液中和至中性，收集水解产物的沉淀，用10倍量蒸馏水，分3次洗沉淀，真空干燥，粉碎，备用，收率为投料原人参二醇组皂苷的40％；将水解产物溶解于7量100％乙醇中，以70℃加热，回流加快溶解，过滤，滤液用1％活性炭加热回流2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用90％乙醇洗脱树脂，回收乙醇至总体积的1/3，冷却，放置结晶，真空抽滤，收集结晶，真空干燥，粉碎；用高效液相色谱法测定人参皂苷Rh2和Rg3的含量；人参皂苷Rh2含量为24.84％，人参皂苷Rg3含量为44.44％；收率为原人参二醇组皂苷投料量的4％；
将采集的冬虫夏草带回实验室，采用单孢子分离法和组织块分离法分离；冬虫夏草菌用PDA培养，20℃培养，根据冬虫夏草菌的菌落特征，经过多次挑取接种后，在培养基上未见其他菌落生长，说明菌种已经纯化过程，得到冬虫夏草真菌；冬虫夏草真菌按每袋培养基0.3kg接入1g菌种的比例，使其在PDA培养基上生长，即分离得到冬虫夏草菌菌种菌落；菌落在PDA培养基上生长缓慢，菌落紫褐色，紧实，背面褐色；菌丝无色，分隔，光滑，分生孢子梗无色，单生或簇生与无色球形细胞组成的小子座；菌落圆形，边缘整齐，致密；用接种环将菌种接入PDA培养基，在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌；将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却；待环冷却后沾取少量菌或袍子，然后将接种环移出接种管，在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管；从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线；取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上；10-20天后，再把试管培养基上的真菌接入固体或液体发酵培养基，保持10～15℃培养；固体培养基为大米与水的比例为1.1∶1.2，每升培养基中还要加入蛋白胨15克，蔗糖200克，牛肉膏25克，磷酸二氢钾6克，PH8；当菌丝充满整个培养基时，将菌丝分离、烘干即为菌丝体成品，菌丝体粉碎即冬虫夏草菌丝体菌。
14、如权利要求8所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法中的工艺步骤为：
取12目三七粗粉，用65％乙醇回流提取3次，每次2小时，收集提取液，过滤，滤液回收乙醇，至无乙醇味后，真空浓缩2小时，浓缩液加入等体积蒸馏水，搅拌均匀，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱吸附；用4倍量树脂床体积蒸馏水洗去水溶性杂质，吸附人参皂苷的树脂柱备用；将上述吸附树脂柱用40％乙醇洗脱，40％乙醇用量为3倍量树脂床体积，主要分离去除原人参三醇组皂苷，根据需要另行处理；用薄层色谱法跟踪检测，其中的薄层色谱法是：展开剂为40∶50∶10的氯仿∶甲醇∶水下层；显色剂：10％硫酸乙醇溶液；当薄层色谱上出现原人参二醇组皂苷斑点后，停止用40％乙醇洗脱，改用85％乙醇洗脱，并收集洗脱液；用1.5％活性炭加热回流2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用80％乙醇洗脱树脂吸附的原人参二醇组皂苷，回收乙醇，真空浓缩，真空干燥，粉碎，收集原人参二醇组皂苷为提取物投料量的3-4％；取上述纯化的原人参二醇组皂苷粉溶解于2％盐酸或1％硫酸的水或乙醇溶液中，水解温度为90℃，水解时间为9小时，进行酸水解，反应完成后加入与水解转化液等体积的蒸馏水，用6％氢氧化钠溶液中和至中性，收集水解产物的沉淀，用10倍量蒸馏水，分3次洗沉淀，真空干燥，粉碎，备用，收率为投料原人参二醇组皂苷的30％；将水解产物溶解于7倍量50％乙醇中，以60℃加热，回流加快溶解，过滤，滤液用1％活性炭加热回流2小时脱色，过滤去除活性炭，滤液过大孔阳、阴离子交换柱，进一步脱色脱盐除杂，并用30-100％乙醇洗脱树脂，回收乙醇至总体积的1/4，冷却，放置结晶，真空抽滤，收集结晶，真空干燥，粉碎；用高效液相色谱法测定人参皂苷Rh2和Rg3的含量；人参皂苷Rh2含量为24.84％，人参皂苷Rg3含量为44.44％；收率为原人参二醇组皂苷投料量的4.5％；
将采集的冬虫夏草带回实验室，采用单孢子分离法和组织块分离法分离；冬虫夏草菌用PDA培养，15℃培养，根据冬虫夏草菌的菌落特征，经过多次挑取接种后，在培养基上未见其他菌落生长，说明菌种已经纯化过程，得到冬虫夏草真菌；冬虫夏草真菌按每袋培养基0.3kg接入1g菌种的比例，使其在PDA培养基上生长，即分离得到冬虫夏草菌菌种菌落；菌落在PDA培养基上生长缓慢，菌落紫褐色，紧实，背面褐色；菌丝无色，分隔，光滑，分生孢子梗无色，单生或簇生与无色球形细胞组成的小子座；菌落圆形，边缘整齐，致密；用接种环将菌种接入PDA培养基，在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌；将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却；待环冷却后沾取少量菌或袍子，然后将接种环移出接种管，在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管；从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线；取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上；18天后，再把试管培养基上的真菌接入固体或液体发酵培养基，保持12℃培养；固体培养基为大米与水的比例为1.2∶1.1，每升培养基中还要加入蛋白胨18克，蔗糖210克，牛肉膏25克，磷酸二氢钾5克，PH7；当菌丝充满整个培养基时，将菌丝分离、烘干即为菌丝体成品，菌丝体粉碎即冬虫夏草菌丝体菌。
15、如权利要求1、2、3或4所述药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
16、如权利要求5所述药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
17、如权利要求6所述药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
18、如权利要求7所述药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20061108 Assignee: Kunming Yipukang Phytochemistry Co., Ltd. Assignor: Tianxiu Plant Sci-Tech Development Co., Ltd., Yunnan Contract record no.: 2012530000074 Denomination of invention: Antitumor medicine composition and its prepn Granted publication date: 20090408 License type: Exclusive License Record date: 20120912 |
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| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: YUNNAN TIANXIU PLANT TECHNOLOGY DEVELOPMENT CO., L Free format text: FORMER NAME: TIANXIU PLANT SCI-TECH DEVELOPMENT CO., LTD., YUNNAN |
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Address after: 650217, incubator management center of Kunming hi tech Zone, Yunnan Province University Science Park, Yunnan overseas student Pioneer Park, No. 139, No. 2, building A2, No. 403, FA Lu, Yunnan Patentee after: Yunnan Tian Xiu plant science and technology development Limited by Share Ltd Address before: 650217, Kunming economic and Technological Development Zone, Yunnan Province, No. 3, science and Technology Innovation Park, B26 Patentee before: Tianxiu Plant Sci-Tech Development Co., Ltd., Yunnan |
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| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 650106 incubator management center of Kunming high tech Zone, Yunnan Province, No. 403, building A2, phase 2 base, No. 139 Kefa Road, Yunnan University Science Park and Yunnan Overseas Students Pioneer Park Patentee after: Yunnan Tianxiu Plant Technology Co.,Ltd. Address before: 650217 incubator management center of Kunming high tech Zone, Yunnan Province, No. 403, building A2, phase 2 base, No. 139 Kefa Road, Yunnan University Science Park and Yunnan overseas students entrepreneurship Park Patentee before: YUNNAN TIANXIU PLANT TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co.,Ltd. |
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