CN105748448B - D手性肌醇在制备抗肝纤维化药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药领域，涉及D手性肌醇在制备抗肝纤维化药物中的应用，通过对胆总管结扎(BDL)模型组大鼠血清肝功能指标AST和ALT活性的影响、对肝脏病理结构的改善、对肝纤维化程度及肝脏组织羟脯氨酸含量的影响、对血清以及肝脏组织氧化应激水平的影响、对炎症反应的影响等系统研究证明，D手性肌醇能够抑制肝纤维化的发生发展，有望开发成为抗肝纤维化药物的潜在有效成分。

Description

D手性肌醇在制备抗肝纤维化药物中的应用
技术领域：
本发明属于医药领域，涉及D手性肌醇在制备抗肝纤维化药物中的应用。
背景技术：
肝纤维化(liver fibrosis)是肝脏内弥漫性细胞外基质过度沉积的病理过程，是机体对多种病因(病毒感染、毒素及胆汁淤积等)引起肝损伤之后的组织修复代偿反应。肝纤维化的进一步发展会导致肝硬化、肝功能衰竭及门脉高压，并最终需要肝移植来延续生命。此外，每年约有3％的肝硬化患者会转变为肝癌，肝癌作为严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，治疗困难、预后差。著名的肝病专家Rogking在对肝纤维化进行深入研究后提出，人典型的肝纤维化是可以逆转的，而一旦发展到中晚期肝硬化则无法逆转。这对有效控制肝脏疾病由肝炎向肝硬化、肝癌恶性发展以及肝癌的防治具有重要意义。随着对肝纤维化产生机制及病理过程研究的深入，多种药物被发现具有抗肝纤维化的活性。但是，目前除针对病因治疗外，全球进入临床研究的抗肝纤维化药物较少，仅中国SFDA批准了两种中成药复方鳖甲软肝片和扶正化瘀片用于其治疗，其中复方鳖甲软肝片正在进行Ⅳ期临床试验，而扶正化瘀胶囊已在国内完成Ⅳ期临床试验，目前已经通过美国FDA的临床II期实验。我国是一个肝病高发国家，除了因我国HBV、HCV高感染率外，酒精肝、脂肪肝和药物性肝炎等的发病率也逐年上升。因此，亟需开发出能用于临床的高效且无明显毒副作用的抗肝纤维化药物。
肌醇(Inositol)，又名环己六醇，是一种水溶性维生素，属维生素B族中的一种。肌醇通常以磷脂酰肌醇的形式广泛分布于动物和微生物细胞内，而在天然植物中，常以肌醇六磷酸盐的形式存在。D手性肌醇(D-chiro-inositol,DCI)是肌醇的一种立体异构体，CAS号为643-12-9，分子式C6H12O6，分子量180.16，分子结构式为：
目前，据文献报道，D手性肌醇常被用于多囊卵巢综合症(PCOS)、糖尿病、高脂血症和血脂障碍、动脉粥样硬化、心血管疾病的治疗，疗效显著且无明显副作用。研究发现，D手性肌醇的治疗效果除了与其胰岛素増敏调节血糖、促进脂代谢、降低胆固醇直接有关外，其抗氧化和抗炎活性也发挥着重要的作用。而氧化应激和炎症反应的产生和持续作用，是诱发和加剧肝纤维化的重要因素。近年来，本实验室利用胆总管结扎(BDL)肝纤维化大鼠模型，对D手性肌醇抑制肝纤维化发生发展的作用进行探索发现，D手性肌醇能够降低肝纤维化的程度，延缓肝纤维化的发展，继而进行了后续的研究工作，发现D手性肌醇抗氧化抗炎活性是抑制肝纤维化的发展，改善肝纤维化程度的重要因素。所述D手性肌醇在抗肝纤维化中的应用，迄今为止尚未见有国内外的相关报道。
发明内容：
本发明提供了D手性肌醇在制备抗肝纤维化药物中的应用。
本发明利用胆总管结扎(BDL)方法建立Sprague-Dawley大鼠肝纤维化模型，并对模型组大鼠肝功能、肝组织病理结构、纤维化程度、胶原纤维含量、氧化应激水平及炎症反应程度进行检测，结果显示，D手性肌醇能够改善模型组大鼠肝纤维化程度，抑制肝纤维化的进一步发展。
本发明还提供了以了D手性肌醇为有效成分与药学上可接受的一种或多种载体组成的药物组合物及其在制备抗肝纤维化药物中的应用。
因此，本发明用于制备抗肝纤维化药物时，其辅料及制备方法可选用药学上可接受的任何形式。
本发明用于抗肝纤维化治疗时，D手性肌醇口服就可以发挥生理活性，而且无毒副作用。口服用药可以制成任何常规剂型，如片剂、胶囊、散剂、颗粒等。
本发明所D手性肌醇给药剂量可根据患病程度、有无既往病史等因素综合考虑进行调整。
附图说明：
图1-D手性肌醇(DCI)对BDL模型组大鼠血清肝功能指标AST、ALT的影响
其中：**p<0.01与假手术组相比；##p<0.01与BDL模型组相比。
图2-D手性肌醇(DCI)对BDL模型组大鼠肝脏组织病理结构的影响
其中：A为假手术组大鼠肝脏组织切片HE染色结果；B为BDL模型组大鼠肝脏组织切片HE染色结果；C为D手性肌醇(DCI)给药组大鼠肝脏组织切片HE染色结果；D为对所有动物组织胆管增生双盲打分的统计图；E为对所有动物组织坏死双盲打分的统计图
**p<0.01与假手术组相比；#p<0.05，##p<0.01与BDL模型组相比。
图3-D手性肌醇(DCI)对BDL模型组大鼠肝纤维化程度的影响
其中：A为假手术组大鼠肝脏组织切片天狼星红染色结果；B为BDL模型组大鼠肝脏组织切片天狼星红染色结果；C为D手性肌醇(DCI)给药组大鼠肝脏组织切片天狼星红染色结果；D为对所有动物组织天狼星红染色面积的统计图
**p<0.01与假手术组相比；#p<0.05与BDL模型组相比。
图4-D手性肌醇(DCI)对BDL模型组大鼠肝脏组织羟脯氨酸含量的影响
其中：**p<0.01与假手术组相比；#p<0.05与BDL模型组相比。
图5-D手性肌醇(DCI)对BDL模型组大鼠血清氧化应激水平的影响
其中：A为丙二醛(MDA)；B为超氧化物歧化酶(SOD)
**p<0.01与假手术组相比；#p<0.05，##p<0.01与BDL模型组相比。
图6-D手性肌醇(DCI)对BDL模型组大鼠肝脏组织氧化应激水平的影响
其中：A为丙二醛(MDA)；B为超氧化物歧化酶(SOD)；C为一氧化氮(NO)
*p<0.05,**p<0.01与假手术组相比；#p<0.05，##p<0.01与BDL模型组相比。
图7-D手性肌醇(DCI)对BDL模型组大鼠炎症反应CD68、NF-κB的影响
其中：A为假手术组大鼠肝脏组织切片免疫组化结果；B为BDL模型组大鼠肝脏组织切片免疫组化结果；C为D手性肌醇(DCI)给药组大鼠肝脏组织切片免疫组化结果。
具体实施方式：
下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述，但所述内容是对本发明的解释而不是限定。
《实施例1》Sprague-Dawley大鼠胆总管结扎(BDL)肝纤维化模型的制备及D手性肌醇给药
将Sprague-Dawley雄性大鼠(体重180～200g)随机分为假手术组、BDL模型组、D手性肌醇(150mg/kg/day，溶解于日常饮水中)给药组，其中假手术组5只，BDL模型组9只，16-4给药组9只。动物手术前禁食12h，用异氟烷麻醉后，在无菌操作条件下，开腹，抬高肝缘，拉开十二指肠，分离总胆管2-3cm。在近十二指肠处和近肝门处用000号丝线各结扎两道，从两结扎位置中间剪断胆总管，将肝恢复原样后缝合切口。假手术组仅作上腹正中切口并缝合，不做胆总管结扎。动物麻醉清醒后，正常饮食，自由饮水。手术造模后第2天开始给药，假手术组和模型组给予日常饮用水，D手性肌醇给药组给予D手性肌醇150mg/kg/day(D手性肌醇溶解于日常饮用水中)，给药14天。
《实施例2》D手性肌醇对BDL模型大鼠血清肝功能的影响。
取样前禁食12h，用10％水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，室温静置1h，3000rpm离心5min，取血清进行血清生化指标检测。谷草转氨酶(AST)与谷丙转氨酶(ALT)是肝功能两大指标。结果显示，BDL模型组血清中AST(721.5±99.0vs222.4±25.4,p<0.01)与ALT(104.3±16.5 vs 24.4±2.2,p<0.01)活性显著增加，D手性肌醇给药后能显著降低两种酶的活性(AST:462.2±116.9 vs721.5±99.0,p<0.01)；ALT(60.7±23.2 vs 104.3±16.5,p<0.01)(图1),表明D手性肌醇能够明显改善BDL大鼠肝功能。
《实施例3》D手性肌醇对BDL诱导的大鼠肝脏病理结构改变的抑制作用
取样前禁食12h，处死大鼠，取肝脏组织，切下肝大叶组织块放入中性甲醛中固定。经过脱水、石蜡包埋、切片、烤片等制作石蜡切片。苏木素-伊红(HE)染色，观察大鼠肝脏组织病理结构变化情况。结果显示，假手术组大鼠肝脏组织肝细胞规则排列，肝小叶完整，无炎性细胞浸润和胆管增生情况；BDL造模后大鼠肝脏组织病理结构发生明显改变，胆管增生十分明显，组织坏死明显增多；D手性肌醇给药后，大鼠肝组织结构得到明显改善，胆管增生情况得到显著抑制，组织坏死程度明显降低(图2)。表明，D手性肌醇能够明显改善BDL大鼠肝脏组织病理结构的变化。
《实施例4》D手性肌醇对BDL模型大鼠肝纤维化程度的抑制作用
4.1天狼星红染色是胶原纤维特异性染色，将石蜡切片用天狼星红染色，观察大鼠肝脏组织胶原纤维面积及纤维化程度。结果显示，BDL大鼠肝脏组织胶原纤维面积及纤维化程度明显增加，D手性肌醇给药后，胶原纤维面积减少，纤维化程度得到明显抑制(图3)。表明，D手性肌醇能够明显抑制胶原纤维的产生，抑制BDL大鼠肝纤维化。
4.2羟脯氨酸为胶原纤维中特有，羟脯氨酸含量可以反映肝纤维化的程度。取肝脏组织(80-100mg)，按照羟脯氨酸测试盒(购自南京建成生物工程研究所)说明书进行肝脏组织中羟脯氨酸含量测定。结果显示，与假手术组相比，BDL模型大鼠肝脏组织中羟脯氨酸含量明显升高；D手性肌醇给药后，大鼠肝脏组织中羟脯氨酸含量明显降低(图4)。表明，D手性肌醇能够明显抑制BDL大鼠中胶原纤维的产生，抑制肝纤维化的发生。
《实施例5》D手性肌醇对BDL模型组大鼠血清氧化应激水平的影响
丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)是氧化应激的两个重要指标。取收集的血清，按照丙二醛和超氧化物歧化酶测试盒(购自南京建成生物工程研究所)的操作步骤，检测血清中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果显示，BDL模型组的大鼠血清中MDA含量显著升高，SOD活力显著降低；D手性肌醇给药后，血清中MDA含量明显降低，SOD活力升高(图5)。表明，D手性肌醇能够明显抑制模型组大鼠的氧化应激水平。
《实施例6》D手性肌醇对BDL模型组大鼠肝脏组织氧化应激反应的抑制作用
准确称取收集制备的肝脏组织，按照重量(g)：体积(ml)＝1:9的比例加入9倍体积的预冷生理盐水，于冰浴中研磨，制备匀浆，3000～4000rpm，离心10～15min，取10％匀浆上清待测。按照丙二醛、一氧化氮(一步法)、超氧化物歧化酶测试盒(购自南京建成生物工程研究所)的操作步骤，检测肝脏组织中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果显示，与假手术组大鼠相比，BDL模型组大鼠肝脏组织中MDA与NO含量显著升高，SOD活力明显降低；D手性肌醇给药后，大鼠肝脏组织中MDA与NO含量显著降低，SOD活力升高(图6)。表明，D手性肌醇能够明显抑制模型组大鼠氧化应激反应。
《实施例7》D手性肌醇对BDL模型组大鼠炎症反应的抑制作用
将制备好的石蜡切片经过脱蜡、复水、抗原修复(柠檬酸缓冲液微波修复法)、血清封闭后，分别滴加一抗CD68(鼠抗，1:50；Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)和NF-κB(兔抗，1:500；Cell Signaling Technology,Beverley,Massachusetts,USA)，4℃孵育过夜，PBS漂洗三遍，滴加二抗37℃孵育20min，PBS漂洗三遍，滴加DBA显色液并于显微镜下检测反应时间，自来水冲洗后，用苏木素进行复染(30～40s)，自来水冲洗后，脱水，树胶封片，镜检观察CD68和NF-κB染色情况。结果显示，与假手术组大鼠相比，BDL模型组大鼠肝脏组织中CD68和NF-κB染色面积增多，表达增加；D手性肌醇给药后，CD68和NF-κB表达明显降低，染色面积显著减少(图7)。表明，D手性肌醇能够明显抑制模型组大鼠炎症反应。

Claims (4)

1.D手性肌醇作为唯一活性成分在制备抗肝纤维化药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述药物包括：药学上可接受的载体。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述D手性肌醇制成包括片剂、胶囊、散剂、颗粒常规口服剂型。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征是，D手性肌醇给药剂量根据患病程度、有无既往病史因素综合考虑进行调整。
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