CN104997812B - 抗脑缺血再灌注损伤的药物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生命科学领域，涉及益生菌制剂在制备治疗与预防脑缺血再灌注损伤中的应用，具体涉及益生菌丁酸梭菌防治脑缺血再灌注损伤的药物新用途。脑缺血再灌注损伤是指各种原因造成的局部脑组织的缺氧缺血，脑神经细胞功能代谢障碍及结构破坏的现象，本发明公开了一种具有防治脑缺血再灌注损伤，且未发现任何毒副作用的益生菌制剂。本发明创造性地以肠道菌群为治疗靶点，开创防治脑缺血再灌注损伤的新模式，既减轻疾病症状又减缓神经细胞损伤，具有很好的社会经济效益，值得推广应用。该制剂以丁酸梭菌为活性成份，加入常规的赋形剂，可以制成适合于临床上使用的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液、灌肠剂等剂型。

Description

抗脑缺血再灌注损伤的药物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及丁酸梭菌的新用途，具体涉及丁酸梭菌在制备预防与治疗脑缺血再灌注损伤组合物中的应用，属于生物制药领域。

背景技术

中风是全球范围内导致死亡的主要疾病，目前已经成为仅次于心脏病和癌症的第三大致死原因。脑卒中具有高发病率、高致残率、高复发率、恢复缓慢的特点，每年新增200万以上病例，严重影响患者的生活质量，给患者家庭和社会带来沉重的负担，且近年来逐渐有年轻化的趋势。脑卒中而缺血性中风的发病率约占中风的60-80％，是脑卒中的主要类型缺血性脑中风为最常见中风类型。

脑缺血再灌注损伤是指各种原因造成的局部脑组织的缺氧缺血，使脑组织细胞发生缺血性损伤，在一定条件下恢复血液再灌注后，脑神经细胞功能代谢障碍及结构破坏不但未减轻反而加重的现象。缺血性脑血管疾病是产生脑缺血再灌注损伤的主要病理因素之一。病理机制十分复杂。脑缺血损伤的病理生理机制尚未完全明确，大量研究认为其发病机制可能主要包括氧化应激、自由基损伤、炎症反应、兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙超载、细胞凋亡等，这几种因素相互作用、相互影响，构成了一个复杂的调控网络，造成一系列病理级联反应，直接或者间接导致神经细胞凋亡/死亡，加剧了脑损伤。由于脑缺血后级联反应的复杂性，单一使用阻断某一病理环节的药物可能难以奏效。目前，临床上对缺血性脑血管疾病治疗主要有溶栓治疗和神经保护治疗两大类。早期溶栓、抗凝治疗为循证医学确认的有效治疗方法，但也存在严格的时间窗限制，在长期恢复过程中效果不显著。

“益生菌，，是活性的微生物，可以有效改善肠道菌群结构，抑制病原菌，产生良好的健康效应，目前已制备成药品、保健品或饮品等益生菌制剂。通过改善肠道菌群调节和治疗全身疾病现在越来越成为科学界的共识，临床实践中发现很多的神经系统疾病，如自闭症、抑郁症，都与肠道菌群紊乱有密切的联系，与人体的脑-肠轴有密切的关系，甚至有通过饮用酸奶减轻疾病症状的成功例子。脑-肠轴是一个存在于中枢神经系统和肠道菌群之间的复杂的双向交互系统，越来越被人所熟知。但是，通过益生菌调节肠道菌群防治脑缺血再灌注损伤国内外未见相关报道。

丁酸梭菌属(Clostridium butyricum)作为重要的益生菌，先前已广泛地应用来预防和治疗肠炎、便秘等疾病。丁酸梭菌属一般存在于土壤、动物和人体的肠道中，是革兰氏阳性厌氧杆菌，能耐受胃酸进入肠道，分泌肠粘膜再生和修复的重要营养物质酪酸(丁酸)，修复受损伤的肠粘膜，消除炎症，营养肠道，对各种原因包括肠道细菌感染、肿瘤化疗、外科手术等所致的肠道疾病具有良好的疗效，人们对脑缺血再灌注损伤和肠道微生态结构认识不足，科学工作者对这方面的研究也不多，到目前为止，尚未见丁酸梭菌防治脑缺血再灌注损伤的研究应用报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷和不足，创造性应用丁酸梭菌到脑缺血再灌注损伤的防治上，进而开发出预防或治疗脑缺血再灌注损伤的益生菌制剂。本发明的目的是提供一种安全的、有效的防治脑缺血再灌注损伤的丁酸梭菌菌株及益生菌制剂和制备方法。

本发明提供一株具有防治脑缺血再灌注损伤的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)WZMC1018菌株。

本发明丁酸梭菌为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1018菌株，已于2014年10月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，保藏编号为CGMCC No.9830。

本发明丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1018具有下述生物学特征：

(1)菌落形态：呈乳白色，圆形稍凸，边缘不规则，直径1～3mm，表面略有光泽，液体培养基中有气泡产生；

(2)个体形态：为G⁺芽孢杆菌，菌体呈直或弯杆状，0.6～1.2×3.0～7.0μm，端圆，单个、成对、短链、偶见长丝状菌体；

(3)生理生化特征：麦芽糖(+)；甘露醇(+)；棉子糖(+)；乳糖(+)；核糖(+)；淀粉(+)。

培养最适条件：厌氧下生长良好，有氧环境中不生长。最适生长温度35～40℃；最低生长温度25～28℃；最高43～45℃；生长最适pH 6.5～7.0；pH 4.5～5.0或8.0～8.5不生长。

本发明的另外一个目的是提供丁酸梭菌的一种新的制药用途，即丁酸梭菌在制备防治脑缺血再灌注损伤益生菌制剂组合物中的应用，该组合物可以为药品、保健品和饮品等。

本发明是以有效剂量的丁酸梭菌WZMC1018菌株作为药物活性成份，按照一定的制剂工艺，加入常规的赋形剂、营养剂等辅料，制成任何一种适合于治疗与预防脑缺血再灌注损伤益生菌制剂，临床上使用的剂型可以为颗粒剂、散剂、口服液、灌肠剂等。

本发明所指有效剂量是指以丁酸梭菌根据上面所述单独或组合作为活性成份制成的固体活菌制剂包含的总活菌数不能低于1×10⁷CFU/g。

本发明所述丁酸梭菌是指活细胞的形式，益生菌制剂组合物包含的总活菌数不能低于1×10⁷CFU/g，一般在1×10⁸CFU/g以上，最高可达到1×10¹²CFU/g或1×10¹²CFU/g以上。

本发明优选的制剂工艺为，丁酸梭菌制剂的制备：将丁酸梭菌WZMC1018菌株种子液按重量1％接种量接入已灭菌后的含有重量蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，葡萄糖2％，K₂HPO₄ 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，MnSO₄·4H₂O 0.02％，低聚果糖0.3％，柠檬酸二铵0.2％液体培养基中，经36℃～38℃厌氧发酵后，离心分离菌体，将菌体加入含有重量5％的谷氨酸钠和5％多脂奶粉冻干保护液中，混合冷冻干燥后即可得到丁酸梭菌活菌菌粉，所得干燥菌粉，与药用载体混合，即得到所述最终剂型益生菌组合物。制剂工艺并不局限于本发明所述，其它公知的制剂工艺均可以。药用载体可以为低聚果糖，葡萄糖，海藻糖等。

由于本发明首次公开了以丁酸梭菌WZMC1018菌株为药物活性成份在制备治疗与预防脑缺血再灌注损伤药物中的应用，因此，以丁酸梭菌WZMC1018菌株为活性成份与辅料组合制成药剂，只要是该药剂用于治疗与预防脑缺血再灌注损伤，均属于本发明的保护范围。

有效剂量是指以丁酸梭菌根据上面所述单独或组合作为活性成份制成的固体活菌制剂包含的总活菌数不能低于1×10⁷CFU/g。

本发明所述丁酸梭菌制剂组合物包含的丁酸梭菌总活菌数不能低于1×10⁷CFU/g，一般在1×10⁸CFU/g以上，最高可达到1×10¹²CFU/g或1×10¹²CFU/g以上。

本发明选用丁酸梭菌WZMC1018菌株来防治脑缺血再灌注损伤，疗效显著，并随剂量的增加，疗效加强，且未发现任何毒副作用。

本发明的优点及效果：

本发明首次揭示丁酸梭菌WZMC1018菌株在防治脑缺血再灌注损伤的用途，并提供丁酸梭菌制剂组合物的制备方法。本发明选用的丁酸梭菌WZMC1018菌株来源于人体，经筛选、驯化和验证，安全性高，具有良好的生态互助性。本发明能明显改善脑缺血再灌注损伤所致的肠道菌群失调，本发明能提高脑组织抗氧化酶活性、抗神经细胞凋亡，改善学习记忆能力。丁酸梭菌的代谢产物有丁酸等短链脂肪酸，通过血脑屏障，也能在脑内发挥抗脑缺血再灌注损伤的神经损伤作用。因此，本发明的丁酸梭菌制剂组合物可以作为防治脑缺血再灌注损伤的药物，无毒副作用，使用方便，可作为营养制剂和其他营养素一起用于临床患者的辅助治疗，让患者在平时饮食的过程中就能完成辅助治疗，能够大大减轻脑缺血再灌注损伤患者痛苦。

具体实施方式

丁酸梭菌制剂组合物的制备是首先制备丁酸梭菌菌粉，然后按照需要填加相应辅料制成相应的剂型，本发明以口服丁酸梭菌活菌散剂具体制备为例，说明益生菌的制备方法，其它剂型的制备方法省略，不再一一说明，具体制备剂型并不局限于下面所述的方法。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1018菌株的分离与鉴定

以一名健康青年人的粪便作为分离样品，在改良MRS琼脂培养基上，37℃厌氧条件下，48h涂布分离培养，获得本发明所述的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1018，鉴定为丁酸梭菌属。

改良MRS培养基的配方：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，K₂HPO₄2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，MnSO₄·4H₂O 0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，琼脂15g，蒸馏水1L，调pH至7.0，115℃灭菌15分钟。

本发明的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1018具有下述微生物学特征：

(1)菌落形态：呈乳白色，圆形稍凸，边缘不规则，直径1～3mm，表面略有光泽，液体培养基中有气泡产生。

(2)个体形态：为G⁺芽孢杆菌，菌体呈直或弯杆状，0.6～1.2×3.0～7.0μm，端圆，单个、成对、短链、偶见长丝状菌体。

(3)生理生化特征：麦芽糖(+)；甘露醇(+)；棉子糖(+)；乳糖(+)；核糖(+)；淀粉(+)。

培养最适条件：厌氧下生长良好，有氧环境中不生长。最适生长温度35～40℃；最低生长温度25～28℃；最高43～45℃；生长最适pH 6.5～7.0；pH 4.5～5.0或8.0～8.5不生长。

本发明的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1018，已于2014年10月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为丁酸梭菌属，保藏编号为CGMCC No.9830。

实施例2丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1018益生菌制剂组合物的制备

1.种子液制备：挑取丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1018单菌落，接种于50mL改良MRS液体培养基中，pH为7.0±0.5，37℃，厌氧培养24h，即为种子液；

改良MRS培养基的配方：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，MnSO₄·4H₂O 0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，蒸馏水1L，调pH至7.0，115℃灭菌15min。

2.发酵培养：取步骤1的种子液，以1％接种量接种至新的改良MRS培养基中，37℃，厌氧培养24h，结束培养；

3.收集菌体：取步骤2发酵液，以12,000rpm，10min条件，去除发酵上清液，离心分离出菌体；

4.菌粉制备：取步骤3收集的菌体加入含有重量5％的谷氨酸钠和5％多脂奶粉冻干保护液中混合冷冻干燥后即可得到丁酸梭菌菌粉。

5.成品制备：取步骤4所得干燥菌粉，依据丁酸梭菌的活菌数，按比例与药用载体(低聚果糖，葡萄糖，海藻糖等)混合，制备丁酸梭菌制剂组合物成品，成品的活菌数不低于1×10⁷CFU/g或1×10⁷CFU/mL。

实施例3脑缺血再灌注损伤的治疗动物实验

目的：观察本发明丁酸梭菌制剂对脑缺血再灌注损伤小鼠的学习记忆、脑内氧化指标和神经细胞形态学改变的影响。

一、材料与方法：

1.药物：丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1018菌粉，含活菌数为1×10⁸CFU/g，具体制备方法，详见上面的实施例2。

2.实验动物：ICR雄性小鼠，体重18-22g。

3.模型制备及动物分组：脑缺血再灌注损伤小鼠模型制备：小鼠被和腹腔注射350mg/kg水合氯醛麻醉，正中切口的颈部腹侧暴露的右侧和左侧颈总动脉。采用双侧颈总动脉闭塞引起的脑缺血/再灌注模型(用血管夹夹闭双侧颈总动脉)20分钟，去除闭塞再灌注。假手术对照组接受同样的手术，但无颈动脉闭塞。每次注射前，均对注射部位和注射器针头进行严格消毒，以防小鼠感染。全部小鼠均给予标准鼠饲料常规喂养。实验结束前一周对全部小鼠进行水迷宫神经行为学测试，神经行为学测试结束后，快速取盲肠内容物和小鼠海马组织。另一部分小鼠进行灌注固定，HE染色、TUNEL染色的病理学检测。

4.脑组织IL-1β、TNF-α定量ELISA测定：称重，取生理盐水按重量体积比1∶9，用玻璃匀浆器研磨，制成10％的脑组织匀浆，离心，分离，取上清液，于-20℃冻存备用，按照试剂盒的说明书操作。

5.病理组织学观察：用4％的多聚甲醛进行心脏灌流固定，取脑，石蜡包埋，切片，用于HE染色和TUNEL染色检测。

5.1 HE染色：将石蜡切片进行常规HE染色，石蜡切片常规脱蜡下行至蒸馏水中待染；切片置苏木素染色5min，自来水洗去多余的染料；切片入盐酸酒精中分化数秒；自来水充分水洗切片；1％伊红水溶液中5min，洗去多余的伊红；梯度酒精脱水、封片。

5.2 TUNEL染色：TUNEL染色操作按说明书进行，TUNEL阳性细胞核染成棕黄色。

6.应用PCR-DGGE技术测定肠道菌群变化，计算物种丰度指数，Shannon-Wiener指数，物种均匀度指数。行为测试后，将小鼠处死，迅速取出盲肠内容物。新鲜标本立即转移到冰盒实验室和存储在-80℃在进一步分析制备，然后，DNA抽提试剂盒的粪便样品中提取细菌的基因组DNA。

7.统计学分析：实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)统计学分析，组间差异采用q检验，p＜0.05表示有统计学差异。

二、实验结果：

1.模型组的脑组织IL-1β显著高于假手术组(P＜0.05)；丁酸梭菌WZMC1018治疗组的IL-1β含量降低，与模型组相比有显著性差异(P＜0.01)。模型组的脑组织TNF-α显著高于假手术组(P＜0.01)；丁酸梭菌WZMC1018治疗组的TNF-α含量降低，与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)。TNF-α是一种细胞因子，属于前炎症因子，数量增多可促进脑缺血再灌注后炎症反应，加重脑损害。TNF-α可以引起白细胞激活聚集并释放炎症介质，诱导缺血神经元坏死和调亡。以上研究结果，提示丁酸梭菌WZMC1018的抗炎作用，丁酸梭菌WZMC1018可能对脑缺血再灌注损伤有保护作用。

2.HE染色

假手术组：可见到正常神经元的形态，胞体、轴突、树突清晰可见，核膜完整，核仁清晰可见，核呈椭圆形。模型组：神经细胞有受损征象，细胞形态、结构不正常，胞体和胞核固缩、深染，核仁不清楚，胞核被推向一侧或溶解，部分胞核碎裂成颗粒状，周围区胞质亦固缩深染，呈深伊红染色，核浆不易区分，核碎裂明显。丁酸梭菌WZMC1018治疗组：可见神经细胞缺血性改变减轻，细胞轻度肿胀，神经细胞间隙增大有所减轻。神经细胞缺血坏死数量明显减少，细胞胞体有固缩，核仁可见，神经细胞结构基本正常，神经细胞的层次改善、损伤较脑缺血再灌注损伤模型组明显减轻。

3.TUNEL染色

假手术组中偶有阳性凋亡细胞表达。脑缺血再灌注损伤模型组小鼠海马神经细胞核内可见大量深棕黄色颗粒(TUNEL阳性)细胞数增加，与假手术组比较，凋亡阳性细胞的表达有显著增高(P＜0.01)。丁酸梭菌WZMC1018治疗组的神经细胞染色较浅，细胞结构较好，阳性细胞数减少，与模型组比较，丁酸梭菌WZMC1018治疗组凋亡阳性细胞的表达显著减少(P＜0.01)。

TUNEL染色结果显示：本发明的丁酸梭菌具有明显的抗凋亡作用。

4.对肠道菌群影响

丁酸梭菌治疗组在肠道菌群丰度指数、Shannon-Wiener指数(H’)和物种均匀度指数上显著性优于脑缺血再灌注损伤模型小鼠。

结论：对于卒中的神经保护治疗日益重视，脑缺血以后给予神经保护剂治疗，有助于减轻缺血损伤，主要通过降低脑缺血后损伤因子、增加保护因子及减少调亡等方式达到保护缺血受损脑组织和促进脑功能恢复的目的。

与现有技术相比，本发明创造性地以肠道菌群为治疗靶点，开创防治脑缺血再灌注损伤的新模式，研制出了一种疗效好、无毒副作用的防治脑缺血再灌注损伤的药物，经动物实验研究证明，明显改善脑缺血后的病理形态学改变，减轻脂质过氧化损伤，还可抑制炎症因子IL-1β、TNF-α作用。

本发明选用丁酸梭菌WZMC1018菌株来防治脑缺血再灌注损伤，疗效显著，疗效加强，且未发现任何毒副作用，使用方便，可作为营养制剂和其他营养素一起用于临床患者的辅助治疗，让患者在平时饮食的过程中就能完成辅助治疗，能够大大减轻脑缺血再灌注损伤患者痛苦。

综上所述，丁酸梭菌WZMC1018菌株对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。脑缺血再灌注损伤是一个多途径、多因素、多环节的复杂病理生理过程，脑缺血再灌注损伤是一个多环节复杂的病理生理过程，其机制互为因果、相互影响。丁酸梭菌WZMC1018菌株具有多靶点、多向调节、防治结合的特点，并且安全性高、不良反应较少、改善临床症状好、可以降低致残率，有望成为一种有效的神经保护药物。

Claims (1)

1.丁酸梭菌在制备防治脑缺血再灌注损伤组合物中的应用，其特征在于丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1018，该菌株已于2014年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.9830；其制备方法，包括如下步骤：将丁酸梭菌WZMC1018菌株种子液按重量1％接种量接入已灭菌后的含有重量蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，葡萄糖2％，K₂HPO₄0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，MnSO₄·4H₂O0.02％，低聚果糖0.3％，柠檬酸二铵0.2％液体培养基中，经36℃～38℃厌氧发酵后，离心分离菌体，将菌体加入含有重量5％的谷氨酸钠和5％多脂奶粉冻干保护液中，混合冷冻干燥后即可得到丁酸梭菌活菌菌粉，所得干燥菌粉，与药用载体混合，即得到防治脑缺血再灌注损伤组合物。