CN104164377A

CN104164377A - 一种丁酸梭菌及其应用

Info

Publication number: CN104164377A
Application number: CN201410137978.2A
Authority: CN
Inventors: 汪以真; 王腾浩
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-04-08
Filing date: 2014-04-08
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2034-04-08
Also published as: CN104164377B

Abstract

本发明公开了一种丁酸梭菌及其应用。本发明所提供的丁酸梭菌具体为丁酸梭菌ZJU-F1，该丁酸梭菌分离自健康仔猪肠道，该菌株抗逆性强，耐高温，本发明将其发酵产物乳化制得丁酸梭菌制剂，可以作为饲料添加剂应用于制备动物饲料替代抗生素或/并降低氧化锌的使用。该微生态制剂可以调节动物肠道内的微生态平衡，促进有益菌的生长，增强动物非特异性免疫功能，同时分泌营养因子、蛋白酶，促进营养物质的消化吸收，促进动物生产提高饲料报酬。

Description

一种丁酸梭菌及其应用

技术领域

本发明涉及饲料添加剂—微生物制剂领域，具体涉及到一种高效安全丁酸梭菌及其应用。

背景技术

饲用抗生素在促进动物生长、提高饲料转化效率、减少粮食损耗、提高猪肉产量等方面具有显著的效果。但随着抗生素作为动物促生长剂在饲料中的广泛使用，它的弊端正日益凸现，如导致动物胃肠道菌群失调，产生耐药性和药物残留等，引发了一系列公共安全，环境保护和畜禽产品质量方面的问题。寻找无毒、高效、不产生耐药性的绿色安全饲料添加剂已成为动物营养领域热点之一。

饲料微生物制剂是有利于平衡动物肠道菌群、耐酸、耐碱、并定值于动物消化道表面，产生益生代谢产物，促进动物生长，且在加工和储存过程中必须保持其活性；农业部2045公告中公布了安全的34种安全菌株，丁酸梭菌作为监测期内的新饲料添加剂。

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）主要通过以下几个方面发挥作用：①维持动物肠道内的微生态平衡，促进有益菌（乳酸杆菌、双歧杆菌）的增殖和生长，抑制有害菌（大肠杆菌、沙门氏菌）等有害菌的生长繁殖。②产生多种对动物有用的酶、维生素等，提高动物的消化吸收能力。③产丁酸，促进动物小肠上皮细胞组织再生和修复，维持肠道的健康。④增强动物的非特异性免疫，抵御感染。

国内对丁酸梭菌的相关研究报道不多，研究主要集中在发酵工艺和制作产品上，对其在动物生长中的应用研究较少。

发明内容

针对现有技术存在及不足，本发明的目的在于提供一种丁酸梭菌及其应用。

一种丁酸梭菌，丁酸梭菌（Clostridium butyricum）ZJU-F1，该菌株是分离自健康猪肠道，属于芽孢菌科，梭菌属，革兰氏阳性，有芽孢，孢子裸圆，偏心或次生端，耐高温，耐酸，耐碱、并具有调节动物肠道的微生物平衡的菌株特性，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年3月20日，保藏号为CGMCC No.8939，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码100101。

一种所述的丁酸梭菌制备的丁酸梭菌制剂，所述的丁酸梭菌制剂的有效成分为丁酸梭菌（Clostridium butyricum）ZJU-F1，利用麦芽糊精、麸皮、豆粕、石粉中的一种或多种作为载体，作为饲料添加剂。

一种述的丁酸梭菌制备的动物微生物制剂，所述的微生物制剂的活性成分为丁酸梭菌（Clostridium butyricum）ZJU-F1，进一步包括地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、双歧杆菌中的一种或多种活性成分，并配以麦芽糊精、麸皮、豆粕、石粉中的一种或多种作为辅料，取代断奶仔猪料中的抗生素。

本发明的所提供的丁酸梭菌（Clostridium butyricum）ZJU-F1在如下至少一种中的应用也属于本发明的保护内容

①制备丁酸梭菌制剂；

②制备饲料添加剂益生菌制剂；

③制备细菌素；

④制备动物饲料；

⑤替代饲料中的抗生素；

⑥促进猪的生长。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1.丁酸梭菌制剂或微生物组合能有效替代断奶仔猪中的抗生素使用，提高动物生产性能，降低料肉比，有效降低细菌耐药性，减少肉制品中的抗生素残留。

2.丁酸梭菌制剂或微生物组合能降低饲料中药理氧化锌的使用量，减少断奶仔猪的腹泻率。

3.丁酸梭菌制剂或微生物组合能有效改善仔猪肠道菌群结构，使有益菌的数量/有害菌的数量明显升高

4.本发明饲料丁酸梭菌制剂或微生物组合制剂稳定性好，耐酸碱高温，因此在微生态制剂制备过程中和饲料制粒（温度>80℃）中不会失活，确保其能进入肠道起到调节微生态菌群的作用。

5.该丁酸梭菌制剂或微生物组合中丁酸梭菌能和地衣芽孢杆菌等益生菌共同作用，起到协同增效作用。

6.该丁酸梭菌制剂或微生物组合中益生菌活菌属达到1×10¹⁰cfu/g,其中丁酸梭菌的活菌数或芽孢数达到1×10⁸cfu/g。

本发明通过分离、鉴定、筛选，得到丁酸梭菌（Clostridium butyricum）ZJU-F1，其抗逆性强、具有益生功能，本发明将其制成丁酸梭菌制剂，作为饲料添加剂制备动物饲料，其中动物包括但不限于猪等各种动物。该添加剂具有替代饲料抗生素并降低仔猪日粮种的氧化锌使用，调节动物肠道微生态平衡，增强动物非特异性免疫的作用，同时产生维生素、有益的酶等营养因子，促进动物消化吸收，降低腹泻，促进生长。本发明的丁酸梭菌不产生耐药性、不在动物体内残留，不会对人类健康产生威胁，是健康安全的饲料添加剂。

附图说明

下面结合附图和具体实施案例对本发明作进一步详细描述。

图1是丁酸梭菌菌落形态；

图2是丁酸梭菌革兰氏染色示意图。

具体实施方式

下述实施案例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施案例中使用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业渠道获得。

下面结合具体实施案例对本发明作进一步详细描述。

实施案例1菌种的分离和鉴定

1、实验方法

1.1实验材料浙江省某猪场健康仔猪粪便10份

1.2培养基

①梭菌增殖培养基（均为质量浓度g/L）:胰蛋白胨20，牛肉浸膏10，酵母膏6，葡萄糖4，牛胆酸盐5，复合盐1份(K₂HPO₄2、KH₂PO₄1、MgSO₄0.4、CaCl₂0.2、FeSO₄0.1、盐酸半胱氨酸0.5，以下同)；pH7.2,121℃，15min灭菌

②梭菌计数培养基（均为质量浓度g/L）：胰蛋白胨10，牛肉浸膏5，酵母膏3，葡萄糖4，琼脂16；复合盐一份，pH7.2,121℃，15min灭菌

③梭菌培养基（均为质量浓度g/L）：胰蛋白胨20，牛肉浸膏10，酵母膏6，葡萄糖4，复合盐1份；pH7.2,121℃，15min灭菌

1.3具体实验方法

1）取粪便样品健康仔猪的粪便10g加到90mL PBS中，放入80℃水浴

10min;杀死非芽孢菌，然后放入增殖培养基，于37℃培养36h；

2）将样品分别稀释到10^-3，10^-5，10^-7，涂布于梭菌分离培养基，放入厌氧培养箱中，37℃培养48h；

3）采用影印平板法分离菌种，选取厌氧生长良好的菌株，进行镜检；

4）选取培养特征、菌落形态和显微形态和丁酸梭菌相符的菌株进行生理生化鉴定；

5）16SrDNA测序鉴定

基因测序采用菌落PCR方法扩增获得16SrDNA片段。细菌总DNA提取采用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工，SK8229）提取。16SrDNA扩增引物采用细菌扩增通过引物，正向引物为7F：5’–CAGAGTTTGATCCTGGCT3’；反向引物为1540R：5’–AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。反应体系（25μL）：5×Buffer(with Mg²⁺)2.5μL；dNTP(各2.5mM)1μL；7F(10uM/μL)0.5μL；1540R(10uM/μL)μL;基因组DNA（50ng/μl）0.5μL;TaKaRa Extaq酶（5U/μL）0.3μL；加双蒸水至25μL。PCR扩增层序：98℃预变性3min，98℃变性25sec，55℃退火25sec，72℃延伸1min，进行30cycle，最后72℃延伸4min.

PCR产物利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，片段1500bp的阳性产物经纯化后送上海生工序列测定。

2、实验结果

2.1形态学鉴定

对10份样品处理培养后，以影印平板进行好氧和厌氧培养，得到严格厌氧菌株8株，选择性培养基培养后镜鉴得到梭状芽孢杆菌菌株1株，进行纯化后菌落形态鉴定和革兰氏染色镜检后初步鉴定为丁酸梭菌，其直径为0.6-1.2×3.0-7.0μm,端圆，中间部分轻度膨胀，单个或成对，短链，偶见有丝状菌体。孢子卵圆、偏心或次端生（见图1和图2）。

2.2生理生化特征

随后根据《细菌属的鉴定指导》中介绍的方法，测定分离菌对各种碳源的利用情况以及进行其他生理生化试验。结果见表1。

表1分离丁酸梭菌的生理生化特征

注：+表示结果是阳性，—表示结果为阴性

根据试验结果，对照《伯杰氏细菌鉴定手册》检索，菌株初步鉴定结果为丁酸梭菌。

2.316SrDNA序列同源性分析

其序列如SEQ ID NO:1（序列1）所示，将序列1在Genbank数据库进行BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）同源性比对，确定为丁酸梭菌。

实施案例2

丁酸梭菌制剂（Clostridium butyricum）ZJU-F1及其微生物复合制剂替代抗生素降低氧化锌在断奶仔猪中的应用

目的与意义：选择断奶仔猪为试验对象，探讨丁酸梭菌微生态制剂在无抗生素、低剂量氧化锌条件下对断奶仔猪生长性能、腹泻率、肠道微生态区系的影响，旨在研究益生菌在减少抗生素的和高剂量氧化锌的应用中对动物生长性能、缓解断奶应激、和肠道微生态区系的影响。

试验动物：选取23±2天日龄杜×长×大三元杂交健康断奶仔猪120头，体重为7.8±0.2Kg。

丁酸梭菌制剂：丁酸梭菌（Clostridium butyricum）ZJU-F1液体发酵后喷雾干燥所得，玉米粉为载体，制的丁酸梭菌制剂的活菌数在10⁹cfu/g，本实施案例中，该丁酸梭菌制剂作为动物添加剂使用。

复合芽孢杆菌制剂：丁酸梭菌（Clostridium butyricum）ZJU-F1液体发酵后喷雾干燥后与地衣芽孢杆菌制剂（实验室前期成果，有效成分为地衣芽孢杆菌活菌属10¹⁰cfu/g）混合而成，制的复合芽孢杆菌制剂的活菌数在10¹⁰cfu/g（其中丁酸梭菌活菌数在10⁹cfu/g），本实施案例中，该复合菌制剂作为动物添加剂使用。

试验方案和分组：将120头龄健康断奶仔猪，根据体重、窝别、性别分为4个组，每个组设三个重复，每个重复10头，试验期12天。处理1为对照组1（抗生素阳性对照组），基础日粮+氧化锌（1125ppm）和抗生素（喹乙醇100ppm+硫粘200ppm+吉他霉素100ppm）；处理2为对照组2（氧化锌阳性对照组），基础日粮中添加抗生素（喹乙醇100ppm+硫酸粘菌素200ppm+吉他霉素100ppm）和氧化锌（2250ppm）；处理3为实验组1，基础日粮+氧化锌（1125ppm）并添加丁酸梭菌制剂100g/T；处理4为实验组2，基础日粮+氧化锌（1125ppm）并添加复合芽孢杆菌制剂100g/T。基础日粮配方及营养水平见表2。

表2基础日粮配方及营养水平

注：营养水平中的粗蛋白、赖氨酸、总磷、钙为实测值，消化能为计算值；核心料为定制产品，不含抗生素、氧化锌、和微生物制剂，每公斤核心料提供粗蛋白240g,总磷30g，食盐50g，赖氨酸26g，铜1200mg，铁1000mg，锌100mg，维生素A125000IU，维生素D320000IU，维生素E480mg.

3.饲养动物管理

试验断奶仔猪采用高床饲养,自然通风,环境卫生条件良好，自由采食、饮水；驱虫和免疫按照猪场规程处理。随时观察动物采食和健康情况。所有腹泻猪不进行治疗。

4.测定指标

4.1生长性能的测定

试验在开始时以及结束时候对仔猪和饲料称重，计算每个处理组的每头猪的平均日增重和平均采食量，计算料肉比。料肉比为日平均采食量和日平均增重的比值。

4.2腹泻率测定

整个试验过程中，每天上午9点观察猪腹泻情况，每头猪每天只统计一次。腹泻率为腹泻仔猪头数和仔猪总头数的比值。

5.数据统计：试验所有所居采食SPSS17.0（SPSS Inc.，USA）统计软件的单因素方法分析进行显著性分析，差异显著则进行Dunan氏法多重比较分析。数据用平均值±标准误表示。

6.实验结果

表3丁酸梭菌极其组合对仔猪生长性能和腹泻率的影响

各试验组断奶仔猪的初始体重、日增重、料重比和腹泻率见表3

由试验结果可知，日粮中添加丁酸梭菌制剂或丁酸梭菌复合微生物制剂，断奶仔猪生长速度和较处理组1组显著提高，料重比显著下降，说明丁酸梭菌和丁酸梭菌复合微生物制剂能完全取代断奶仔猪料中的抗生素使用。而较处理组2组，处理组3较处理组2组略差，但差异不显著，而处理4组明显高于处理2组，差异不显著，说明丁酸梭菌和丁酸梭菌复合微生物制剂能部分替代饲料中的高剂量氧化锌。

处理3、处理4组腹泻率较处理1组显著改善，说明丁酸梭菌极其复合菌能显著降低断奶仔猪的腹泻情况，相比较于处理组2组，处理3组略差，但差异不显著，而处理4组略少，差异不显著，说明丁酸梭菌及其复合微生物菌组合能显著降低断奶仔猪腹泻情况。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 一种丁酸梭菌及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1373

<212> DNA

<213> Clostridium butyricum

<400> 1

gtgcttacac atgcagtcga gcgatgaagc tccttcggga gtggattagc ggcggacggg 60

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tgccgccgct aacgcattaa gtattccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ttaaaactca 840

aaggaattga cgggggcccg cacaagcagc ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 900

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gagcaaaact ataaaaccga tctcagttcg gattgtaggc tgaaactcgc ctacatgaag 1260

ctggagttgc tagtaatcgc gaatcagaat gtcgcggtga atacgttccc gggccttgta 1320

cacaccgccc gtcacaccat gagagttggc aatacccaaa gttcgtgagc taa 1373

Claims

1.一种丁酸梭菌，其特征是，丁酸梭菌（Clostridium butyricum）ZJU-F1，该菌株是分离自健康猪肠道，属于芽孢菌科，梭菌属，革兰氏阳性，有芽孢，孢子裸圆，偏心或次生端，耐高温，耐酸，耐碱、并具有调节动物肠道的微生物平衡的菌株特性，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8939。

2.一种根据权利要求1所述的丁酸梭菌制备的丁酸梭菌制剂，其特征是，所述的丁酸梭菌制剂的有效成分为丁酸梭菌（Clostridium butyricum）ZJU-F1，利用麦芽糊精、麸皮、豆粕、石粉中的一种或多种作为载体，作为饲料添加剂。

3.一种根据权利要求1所述的丁酸梭菌制备的动物微生物制剂，其特征是，所述的微生物制剂的活性成分为丁酸梭菌（Clostridium butyricum）ZJU-F1，进一步包括地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、双歧杆菌中的一种或多种活性成分，并配以麦芽糊精、麸皮、豆粕、石粉中的一种或多种作为辅料，取代断奶仔猪料中的抗生素。