CN105106244B - 一种防治糖尿病脑病的益生菌制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生命科学领域，涉及益生菌制剂在制备防治糖尿病脑病中的应用，具体涉及益生菌丁酸杆菌防治糖尿病脑病的药物新用途。糖尿病脑病指糖尿病久病者渐进发生以认知功能障碍为主要临床特征的慢性全面性精神功能紊乱症，本发明公开了一种具有防治糖尿病脑病，且未发现任何毒副作用的益生菌制剂。本发明创造性地以肠道菌群为治疗靶点，开创防治糖尿病脑病的新模式，既减轻疾病症状又减缓神经细胞损伤，具有很好的社会经济效益，值得推广应用。该制剂以丁酸杆菌为活性成份，加入常规的赋形剂，可以制成适合于临床上使用的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液、灌肠剂等剂型。

Description

一种防治糖尿病脑病的益生菌制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及丁酸杆菌的新用途，具体涉及丁酸杆菌在制备预防与治疗糖尿病脑病组合物中的应用，属于生物制药领域。

背景技术

糖尿病发病率高、并发症多、致死率、致残率高。据世界卫生组织(WHO)报告2008全球范围内糖尿病患者高达3.84亿，我国发病率在9.5％左右，保守估计至少在8000万以上。其中大部分为(90-95)％2型糖尿病。糖尿病合并疾病和并发症多，并发冠心病、高血压、心肌梗死、脑卒中、老年性痴呆、帕金森、肾病、视网膜病等，心脑血管并发症的发病率较非糖尿病人群高3倍以上。糖尿病并发症已成为糖尿病病人致死、致残的重要病种，包括糖尿病脑病，这显然对糖尿病脑病病人的生活质量带来严重影响。

糖尿病脑病容易被忽视、研究相对滞后。糖尿病脑病是糖尿病最常见的伴发疾病之一，发症发生隐蔽、慢性渐进性加重，常被忽视，其早期一般无典型临床症状，病理改变多可逆，及时治疗可完全恢复或推迟发生，但一旦出现明显的临床症状时，发展脑中风损伤、老年性痴呆等多种疾病，其病理损害便不可逆转，而且至今尚无有效的措施阻止其发生与发展。近年来，糖尿病对中枢神经系统的影响已引起人们的高度重视。国内调查发现，60％的糖尿病患者合并有脑血管病变。脑血管意外的发病率高出非糖尿病患者2～3倍，2型糖尿病患老年痴呆症的概率高出1倍，约9％的患者发展成痴呆，而老年痴呆患糖尿病的概率也比一般人群高4～5倍，应引起高度重视。糖尿病脑病的防治研究起步低于其他的糖尿病肾病、视网膜疾病，致使对糖尿病的认识不足。如何做到糖尿病脑病的早期发现和干预是防治糖尿病脑病的重要内容，探索其发病机理寻找合适的抗糖尿病脑病药物的重要主要中心环节。

糖尿病对大脑的损害主要表现为脑血管疾病(主要包括血栓性脑梗死、脑栓塞、短暂性脑缺血发作、腔隙性脑梗死以及出血性脑卒中)和糖尿病性脑病(由于糖尿病糖代谢紊乱导致脑血管改变，损害了中枢神经系统，使大脑在结构、神经生理及神经精神等方面发生病理改变，以获得性认知行为缺陷为特征的糖尿病慢性并发症)。糖尿病脑病常存在低灌注状态，与高糖、高脂有关。临床研究及动物实验研究已经表明糖尿病慢性过程中，并发心脑血管病变，包括缺血性、出血性脑中风损伤、老年性痴呆等可引起认知功能障碍。70％以上的心血管病人伴有痴呆的病人有脑血流降低，并伴有脑皮层白质损伤。早期PET研究表明I型糖尿病组病人脑组织的血流灌注量较非糖尿病病人脑血流量显著降低约10％，与收缩压升高、致动脉粥样硬化指数、总胆固醇负相关，而与高密度脂蛋白程正相关，并与糖化血红蛋白含量相关提示脑灌注量下降与高糖、动脉粥样硬化有密切关系。大量的动物实验也证实糖尿病时存在脑组织的低灌注。这些资料说明糖尿病慢性过程存在脑组织低灌注现象。

“益生菌”是活性的微生物，可以有效改善肠道菌群结构，抑制病原菌，产生良好的健康效应，目前已制备成药品、保健品或饮品等益生菌制剂。通过改善肠道菌群调节和治疗全身疾病现在越来越成为科学界的共识，临床实践中发现很多的神经系统疾病，如自闭症、抑郁症，都与肠道菌群紊乱有密切的联系，与人体的脑-肠轴有密切的关系，甚至有通过饮用酸奶减轻疾病症状的成功例子。脑-肠轴是一个存在于中枢神经系统和肠道菌群之间的复杂的双向交互系统，越来越被人所熟知。但是，通过益生菌调节肠道菌群防治糖尿病脑病国内外未见相关报道。

丁酸梭菌属(Clostridium butyricum)作为重要的益生菌，先前已广泛地应用来预防和治疗肠炎、便秘等疾病。丁酸杆菌属一般存在于土壤、动物和人体的肠道中，是革兰氏阳性厌氧杆菌，能耐受胃酸进入肠道，分泌肠粘膜再生和修复的重要营养物质酪酸(丁酸)，修复受损伤的肠粘膜，消除炎症，营养肠道，对各种原因包括肠道细菌感染、肿瘤化疗、外科手术等所致的肠道疾病具有良好的疗效，人们对糖尿病脑病和肠道微生态结构认识不足，科学工作者对这方面的研究也不多，到目前为止，尚未见丁酸杆菌防治糖尿病脑病的研究应用报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷和不足，创造性应用丁酸杆菌到糖尿病脑病的防治上，进而开发出预防或治疗糖尿病脑病的益生菌制剂。本发明的目的是提供一种安全的、有效的防治糖尿病脑病的丁酸杆菌菌株及益生菌制剂和制备方法。

本发明提供一株具有防治糖尿病脑病的丁酸杆菌(Clostridium butyricum)WZ001菌株。

本发明丁酸杆菌为丁酸杆菌(Clostridium butyricum)WZ001菌株，已于2014年01月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，保藏编号为CGMCC No.8808。

本发明丁酸杆菌(Clostridium butyricum)WZ001具有下述生物学特征：

(1)菌落形态：呈乳白色，圆形稍凸，边缘不规则，直径1～3mm，表面略有光泽，液体培养基中有气泡产生；

(2)个体形态：为G⁺芽孢杆菌，菌体呈直或弯杆状，0.6～1.2×3.0～7.0μm，端圆，单个、成对、短链、偶见长丝状菌体；

(3)生理生化特征：麦芽糖(+)；甘露醇(+)；棉子糖(+)；乳糖(+)；核糖(+)；淀粉(+)。

培养最适条件：厌氧下生长良好，有氧环境中不生长。最适生长温度35～40℃；最低生长温度25～28℃；最高43～45℃；生长最适pH 6.5～7.0；pH 4.5～5.0或8.0～8.5不生长。

本发明的另外一个目的是提供丁酸杆菌的一种新的制药用途，即丁酸杆菌在制备防治糖尿病脑病益生菌制剂组合物中的应用，该组合物可以为药品、保健品和饮品等。

本发明是以有效剂量的丁酸杆菌WZ001菌株作为药物活性成份，按照一定的制剂工艺，加入常规的赋形剂、营养剂等辅料，制成任何一种适合于治疗与预防糖尿病脑病益生菌制剂，临床上使用的剂型可以为颗粒剂、散剂、口服液、灌肠剂等。

本发明所指有效剂量是指以丁酸杆菌根据上面所述单独或组合作为活性成份制成的固体活菌制剂包含的总活菌数不能低于1×10⁷CFU/g。

本发明所述丁酸杆菌是指活细胞的形式，益生菌制剂组合物包含的总活菌数不能低于1×10⁷CFU/g，一般在1×10⁸CFU/g以上，最高可达到1×10¹²CFU/g或1×10¹²CFU/g以上。

本发明优选的制剂工艺为，丁酸杆菌制剂的制备：将丁酸杆菌WZ001菌株种子液按重量1％接种量接入已灭菌后的含有重量蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，葡萄糖2％，K₂HPO₄0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，MnSO₄·4H₂O 0.02％，低聚果糖0.3％，柠檬酸二铵0.2％液体培养基中，经36℃～38℃厌氧发酵后，离心分离菌体，将菌体加入含有重量5％的谷氨酸钠和5％多脂奶粉冻干保护液中，混合冷冻干燥后即可得到丁酸杆菌活菌菌粉，所得干燥菌粉，与药用载体混合，即得到所述最终剂型益生菌组合物。制剂工艺并不局限于本发明所述，其它公知的制剂工艺均可以。药用载体可以为低聚果糖，葡萄糖，海藻糖等。

由于本发明首次公开了以丁酸杆菌WZ001菌株为药物活性成份在制备治疗与预防糖尿病脑病药物中的应用，因此，以丁酸杆菌WZ001菌株为活性成份与辅料组合制成药剂，只要是该药剂用于治疗与预防糖尿病脑病，均属于本发明的保护范围。

有效剂量是指以丁酸杆菌根据上面所述单独或组合作为活性成份制成的固体活菌制剂包含的总活菌数不能低于1×10⁷CFU/g。

本发明所述丁酸杆菌制剂组合物包含的丁酸杆菌总活菌数不能低于1×10⁷CFU/g，一般在1×10⁸CFU/g以上，最高可达到1×10¹²CFU/g或1×10¹²CFU/g以上。

本发明选用丁酸杆菌WZ001菌株来防治糖尿病脑病，疗效显著，并随剂量的增加，疗效加强，且未发现任何毒副作用。

本发明的优点及效果：

本发明首次揭示丁酸杆菌WZ001菌株在防治糖尿病脑病的用途，并提供丁酸杆菌制剂组合物的制备方法。本发明选用的丁酸杆菌WZ001菌株来源于人体，经筛选、驯化和验证，安全性高，具有良好的生态互助性。本发明能明显改善糖尿病脑病所致的肠道菌群失调，本发明能提高脑组织抗氧化酶活性、抗神经细胞凋亡，改善学习记忆能力。丁酸杆菌的代谢产物有丁酸等短链脂肪酸，通过血脑屏障，也能在脑内发挥抗糖尿病脑病的神经损伤作用。因此，本发明的丁酸杆菌制剂组合物可以作为防治糖尿病脑病的药物，无毒副作用，使用方便，可作为营养制剂和其他营养素一起用于临床患者的辅助治疗，让患者在平时饮食的过程中就能完成辅助治疗，能够大大减轻糖尿病脑病患者痛苦。

具体实施方式

丁酸杆菌制剂组合物的制备是首先制备丁酸杆菌菌粉，然后按照需要填加相应辅料制成相应的剂型，本发明以口服丁酸杆菌活菌散剂具体制备为例，说明益生菌的制备方法，其它剂型的制备方法省略，不再一一说明，具体制备剂型并不局限于下面所述的方法。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1丁酸杆菌(Clostridium butyricum)WZ001菌株的分离与鉴定

以一名健康青年人的粪便作为分离样品，在改良MRS琼脂培养基上，37℃厌氧条件下，48h涂布分离培养，获得本发明所述的丁酸杆菌(Clostridium butyricum)WZ001，鉴定为丁酸杆菌属。

改良MRS培养基的配方：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，K₂HPO₄2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，MnSO₄.4H₂O 0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，琼脂15g，蒸馏水1L，调pH至7.0，115℃灭菌15分钟。

本发明的丁酸杆菌(Clostridium butyricum)WZ001具有下述微生物学特征：

(1)菌落形态：呈乳白色，圆形稍凸，边缘不规则，直径1～3mm，表面略有光泽，液体培养基中有气泡产生。

(2)个体形态：为G⁺芽孢杆菌，菌体呈直或弯杆状，0.6～1.2×3.0～7.0μm，端圆，单个、成对、短链、偶见长丝状菌体。

(3)生理生化特征：麦芽糖(+)；甘露醇(+)；棉子糖(+)；乳糖(+)；核糖(+)；淀粉(+)。

培养最适条件：厌氧下生长良好，有氧环境中不生长。最适生长温度35～40℃；最低生长温度25～28℃；最高43～45℃；生长最适pH 6.5～7.0；pH 4.5～5.0或8.0～8.5不生长。

本发明的丁酸杆菌(Clostridium butyricum)WZ001，已于2014年01月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为丁酸杆菌属，保藏编号为CGMCC No.8808。

实施例2丁酸杆菌(Clostridium butyricum)WZ001益生菌制剂组合物的制备

1.种子液制备：挑取丁酸杆菌(Clostridium butyricum)WZ001单菌落，接种于50mL改良MRS液体培养基中，pH为7.0±0.5，37℃，厌氧培养24h，即为种子液；

改良MRS培养基的配方：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，MnSO₄·4H₂O 0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，蒸馏水1L，调pH至7.0，115℃灭菌15min。

2.发酵培养：取步骤1的种子液，以1％接种量接种至新的改良MRS培养基中，37℃，厌氧培养24h，结束培养；

3.收集菌体：取步骤2发酵液，以12,000rpm，10min条件，去除发酵上清液，离心分离出菌体；

4.菌粉制备：取步骤3收集的菌体加入含有重量5％的谷氨酸钠和5％多脂奶粉冻干保护液中混合冷冻干燥后即可得到丁酸杆菌菌粉。

5.成品制备：取步骤4所得干燥菌粉，依据丁酸杆菌的活菌数，按比例与药用载体(低聚果糖，葡萄糖，海藻糖等)混合，制备丁酸杆菌制剂组合物成品，成品的活菌数不低于1×10⁷CFU/g或1×10⁷CFU/mL。

实施例3防治糖尿病脑病的动物实验研究

目的：观察本发明丁酸杆菌制剂对糖尿病脑病小鼠的学习记忆、脑内氧化指标和神经细胞形态学改变的影响。

一、材料与方法：

1.药物：丁酸杆菌(Clostridium butyricum)WZ001菌粉，含活菌数为1×10⁸CFU/g，具体制备方法详见实施例2。

2.实验动物：ICR小鼠雄性，体重18-22g，雄性，由学校实验动物中心提供。

2.1糖尿病脑病小鼠模型制备：小鼠禁食12h进行单次腹腔注射链脲佐菌素50mg/kg，每隔一周的动物血糖水平，血糖≥11.1mmol/L。这些糖尿病小鼠进一步手术操作。采用永久性右单侧颈总动脉闭塞(rUCCAO)，小鼠麻醉后，固定于手术台上，分离和缝合用永久性的小丝线进行右侧颈总动脉，小鼠的体温保持在37℃恒温。皮肤缝合后，小鼠回到笼子里喂养恢复正常。模型成功小鼠20只，分为模型组(10只)和丁酸杆菌治疗组(10只)，丁酸杆菌治疗组：糖尿病脑病模型建立成功后的24小时，开始口服灌胃丁酸杆菌WZ001，浓度1×10⁹CFU/天/小鼠，每天一次，连续4周时间。只开皮不接扎列为假手术对照组(10只)。实验结束前一周对全部小鼠进行水迷宫神经行为学测试，神经行为学测试结束后，快速取盲肠内容物和小鼠海马组织，脑组织进行SOD酶活性、MDA含量的测定。另一部分小鼠进行灌注固定，HE染色、TUNEL染色的病理学检测。

4.学习记忆能力测试

采用Morris水迷宫进行学习记忆能力测试，包括定向航行和空间探索实验。实验设备由视频采集系统、数据分析系统和四个象线的环形水池构成，检测实验动物的空间学习能力和空间记忆能力。

A)定向航行实验：将小鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，记录小鼠找到平台所需时间，即逃避潜伏期(escape latency)，连续测试5d。

B)空间探索实验：第6天撤除平台，测量小鼠在目标象线停留时间。

5.脑组织的SOD酶活性及MDA含量测定：Morris水迷宫神经行为学测试结束后，将各组小鼠每组处死，冰上快速取海马，匀浆，2000rpm/min离心10min，取上清。SOD活性和MDA含量测定按试剂盒的说明书进行。

6.对脑组织的AChE活性及Glu含量测定：检测脑组织AChE活性及Glu含量，按试剂盒说明书操作。

7.病理组织学观察：用4％的多聚甲醛进行心脏灌流固定，取脑，石蜡包埋，切片，用于HE染色和TUNEL染色检测。

7.1 HE染色：将石蜡切片进行常规HE染色，石蜡切片常规脱蜡下行至蒸馏水中待染；切片置苏木素染色5min，自来水洗去多余的染料；切片入盐酸酒精中分化数秒；自来水充分水洗切片；1％伊红水溶液中5min，洗去多余的伊红；梯度酒精脱水、封片。

7.2 TUNEL染色：TUNEL染色操作按说明书进行，TUNEL阳性细胞核染成棕黄色。

8.应用PCR-DGGE技术测定肠道菌群变化，计算物种丰度指数，Shannon-Wiener指数，物种均匀度指数。行为测试后，将小鼠处死，迅速取出盲肠内容物。新鲜标本立即转移到冰盒实验室和存储在-80℃在进一步分析制备15分钟。然后，DNA抽提试剂盒的粪便样品中提取细菌的基因组DNA。

9.统计学分析：实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)统计学分析，组间差异采用q检验，p＜0.05表示有统计学差异。

3.试验结果

3.1对糖尿病脑病小鼠记忆障碍的影响

Morris水迷宫实验结果显示，糖尿病脑病模型小鼠出现明显的学习记忆能力及判断能力的下降；丁酸杆菌治疗组明显改善糖尿病脑病模型小鼠的学习记忆障碍，定向航行成绩(逃避潜伏期)明显缩短，与模型组比有显著性差异(p＜0.01)。以上结果表明本发明的丁酸杆菌具有明显改善糖尿病脑病小鼠的学习记忆功能。实验结果见表1。

3.2对糖尿病脑病小鼠脑组织SOD，MDA的影响

糖尿病脑病模型小鼠海马SOD酶活性明显降低，MDA含量明显升高；丁酸杆菌治疗组明显提高小鼠海马内SOD酶活性，并明显的降低MDA含量(p＜0.05)，以上结果表明本发明的丁酸杆菌具有明显的抗氧化作用，实验结果见表2。

表1 对小鼠脑组织SOD活力和MDA含量的影响

3.3对脑循环血量的影响

结果显示，丁酸杆菌治疗组小鼠脑循环血流量明显升高，与糖尿病脑病模型组相比差异具显著性(P＜0.01)，显示本发明的丁酸杆菌具有一定增加脑循环血流量的作用。

4.HE染色糖尿病脑病模型组小鼠神经细胞排列松散，结构模糊、有核固缩等受损征象，丁酸杆菌治疗组小鼠神经细胞层次改善、损伤较糖尿病脑病模型组小鼠明显减轻。

5.TUNEL染色结果：TUNEL染色结果显示：糖尿病脑病模型组小鼠海马神经细胞核内可见大量深棕黄色颗粒(TUNEL阳性)细胞数增加；丁酸杆菌治疗组神经细胞染色较浅，细胞结构较好，阳性细胞数减少，以上结果表明本发明的丁酸杆菌具有明显的抗凋亡作用。

6.应用PCR-DGGE技术测定肠道菌群变化

丁酸杆菌治疗组在肠道菌群丰度指数、Shannon-Wiener指数(H’)和物种均匀度指数上显著性优于糖尿病脑病模型小鼠。

结论：

与现有技术相比，本发明创造性地以肠道菌群为治疗靶点，开创防治糖尿病脑病的新模式，研制出了一种疗效好、无毒副作用的防治糖尿病脑病的药物，经动物实验研究证明，明显改善糖尿病脑病小鼠的学习记忆能力，增加脑循环血流量，有效提升脑组织SOD活力，有效降低MDA含量，减轻细胞凋亡的病理改变。

本发明选用丁酸杆菌WZ001菌株来防治糖尿病脑病，疗效显著，并随剂量的增加，疗效加强，且未发现任何毒副作用，使用方便，可作为营养制剂和其他营养素一起用于临床患者的辅助治疗，让患者在平时饮食的过程中就能完成辅助治疗，能够大大减轻糖尿病脑病患者痛苦。

Claims (1)

1.丁酸杆菌在制备防治糖尿病脑病组合物中的应用，其特征在于丁酸杆菌为丁酸杆菌WZ001菌株，该菌株已于2014年01月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，保藏编号为CGMCC No.8808；其制备方法，包括如下步骤：将丁酸杆菌WZ001菌株种子液按重量1％接种量接入已灭菌后的含有重量蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，葡萄糖2％，K₂HPO₄0.2％，MgSO₄·7H₂O0.05％，MnSO₄·4H₂O 0.02％，低聚果糖0.3％，柠檬酸二铵0.2％液体培养基中，经36℃～38℃厌氧发酵后，离心分离菌体，将菌体加入含有重量5％的谷氨酸钠和5％多脂奶粉冻干保护液中，混合冷冻干燥后即可得到丁酸杆菌活菌菌粉，所得干燥菌粉，与药用载体混合，即得到防治糖尿病脑病组合物。