CN104845903B

CN104845903B - 嗜甘草的植物乳杆菌及其制备的甘草益生菌制剂

Info

Publication number: CN104845903B
Application number: CN201510079811.XA
Authority: CN
Inventors: 单宝龙; 吴力克; 王静; 任宝涛; 李凤娟; 李晓颖; 刘中青; 杨婷婷; 孙海馨
Original assignee: Shandong Phoenix Bio Tech Co ltd
Current assignee: Shandong Fenghuang Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2015-02-13
Filing date: 2015-02-13
Publication date: 2018-06-22
Anticipated expiration: 2035-02-13
Also published as: CN104845903A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种嗜甘草的植物乳杆菌及其制备的甘草益生菌制剂及制备方法。所述嗜甘草的植物乳杆菌是在乳杆菌发酵甘草过程中获得的，其在以甘草为唯一营养成分的培养基环境中能够旺盛繁殖，该菌株命名为Lactobacillus plantarum BL‑WHSYM9，已于2013年09月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCCM2013449。所述甘草益生菌制剂是利用该植物乳杆菌的嗜甘草特性，发酵甘草，从而得到一种包括嗜甘草的植物乳杆菌和甘草发酵物的益生菌制剂，该益生菌制剂对化学性肝损伤(如酒精性肝炎和中毒性肝炎)、慢性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎有预防及辅助治疗的作用，具有广阔的市场前景。

Description

嗜甘草的植物乳杆菌及其制备的甘草益生菌制剂

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种嗜甘草的植物乳杆菌及其制备的甘草益生菌制剂及制备方法。

背景技术

甘草，学名Glycyrrhiza uralensis Fisch，别名国老、甜草、乌拉尔甘草、甜根子，是豆科甘草属多年生草本植物，根与根状茎粗壮，是一种补益中草药，在中国、印度和希腊的古代医药典籍中多有记载，至今已有几千年的使用历史。在中药中，甘草常用于治疗心气虚，心悸怔忡，脾胃气虚，倦怠乏力，咽喉肿痛，气喘咳嗽，清热解毒等。

现代药物化学分析表明，甘草的化学组成极为复杂，目前为止从甘草中分离出的化合物有甘草甜素、甘草次酸、甘草甙、异甘草甙、新甘草甙、新异甘草甙、甘草素、异甘草素以及甘草西定、甘草醇、异甘草醇、7-甲基香豆精、伞形花内酯等数十种化合物，目前，国内外药理界研究表明，甘草及其提取物具有保肝、抗炎、抗病毒、抗菌、抗癌、抗氧化、镇咳、免疫调解、降糖和抗血小板凝集等多种活性，证实甘草在肝病治疗、糖尿病治疗、缺血再灌注损伤、阿尔茨海默症、帕金森氏症、癫痫、抑郁、癌症治疗方面有更好的开发和应用前景，目前临床用于治疗呼吸系统、消化系统、免疫系统等多种疾病。

甘草是一类植物药类益生元，可促进多种益生菌生长。早在1998年，日本学者新纳靖规就发现甘草经乳酸菌发酵后的发酵液提取物(GL)具有多种肝脏保护作用，并将其开发成为一种护肝类保健食品。

微生态制剂(Probioties)，也叫活菌制剂(Bigone)或生菌剂，是指运用微生态学原理，利用对宿主有益无害的益生菌或益生菌的促生长物质，经特殊工艺制成的制剂。目前，在食品领域，以乳酸菌发酵为代表的微生态制剂是近年来健康食品和保健食品开发中的一支新生力量。鉴于甘草具有多种药理活性作用，因此，开发一种甘草微生态制剂具有广阔的应用前景。

发明内容

有鉴于此，本申请发明人在乳杆菌发酵甘草的研发过程中，获得了一株以甘草为唯一营养成分的嗜甘草的植物乳杆菌，且该菌在此培养环境中能够旺盛繁殖。然后，利用该植物乳杆菌的嗜甘草特性，用该菌株发酵甘草，制备出一种包含植物乳杆菌和甘草发酵物的益生菌制剂，经初步研究结果显示，该益生菌制剂对化学性肝损伤(如酒精性肝炎和中毒性肝炎)、慢性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎有预防及辅助治疗的作用。

因此，本发明的目的之一在于提供一种嗜甘草的植物乳杆菌，该嗜甘草的植物乳杆菌在以甘草为唯一营养成分的培养基环境中能够旺盛繁殖；本发明的目的之二在于提供含有该嗜甘草的植物乳杆菌的制剂，所述制剂含有药学上一切可接受的载体；本发明的目的之三在于提供一种具有护肝功能的甘草益生菌制剂，该甘草益生菌制剂包括上述的嗜甘草的植物乳杆菌和甘草发酵物，对化学性肝损伤(如酒精性肝炎和中毒性肝炎)、慢性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎有预防及辅助治疗的作用；本发明的目的之四在于提供具有护肝功能的甘草益生菌制剂的制备方法，所述制备方法操作简单，易于工业化生产；本发明的目的之五在于提供所述的具有护肝功能的甘草益生菌制剂在制备预防或治疗肝脏疾病药物中的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

嗜甘草的植物乳杆菌，生物保藏编号为CCTCC M 2013449，所述嗜甘草的植物乳杆菌在添加甘草和/或甘草浸液的培养环境中繁殖旺盛。本发明所得的嗜甘草的植物乳杆菌在以甘草为唯一营养成分的培养基环境中能够旺盛繁殖，其在制备保健食品尤其是微生态制剂中具有广泛的应用。

生物保藏信息说明：

嗜甘草的植物乳杆菌是在以甘草为唯一营养成分的培养基环境中能够旺盛繁殖，命名为Lactobacillus plantarum BL-WHSYM9，已于2013年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2013449。

嗜甘草的植物乳杆菌BL-WHSYM9生物学特征如下：属于乳杆菌科中的乳杆菌属，革兰氏阳性，45℃不生长，兼性厌氧菌，在pH4.5-9.5生长，最适pH6.5左右。菌种呈短杆状，有时呈链状或者呈对状，不产生芽孢；在LBS琼脂培养基中呈灰白色、不透明、圆形、光滑、微小细密的菌落；属于通行发酵乳酸菌，能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、L-山梨糖、乳糖等。

本发明所述的甘草浸液为甘草的浸提液，通过任何常规操作方法浸提均可，在本发明的一个具体实施例中，所述甘草浸液的制备，以10％甘草浸液配制为例：100g甘草超微粉体，加水2L，浸泡40分钟，煎煮40min，4层纱布过滤；药渣再加水2L，煎煮40min，4层纱布过滤；合并两次滤液，经60-300目(如依次经过60、100、200目)分级过滤，浓缩滤液至1L。

嗜甘草的植物乳杆菌是本申请的发明人在乳杆菌发酵甘草过程中获得的，其具体的制备方法包括如下进行的步骤：

(1)LBS培养基培养：取人新鲜粪便，在LBS培养基上划线，37±2℃厌氧培养20-48h；

(2)MRS培养基培养：挑选步骤(1)LBS培养基上得到的不同形态的菌落分别接种到MRS固体培养基上，37±2℃厌氧培养20-48h；

(3)耐甘草乳杆菌筛选：挑选步骤(2)MRS固体培养基上得到的不同培养特征的乳杆菌菌落分别接种到以甘草为唯一碳源的筛选培养基上，37±2℃厌氧培养20-48h，筛选得到耐甘草乳杆菌；所述筛选培养基配方为：5％甘草浸液200mL/L，酵母膏0.5g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，琼脂15g/L。

(4)驯化：将步骤(3)得到的耐甘草乳杆菌接种到含5％甘草浸液的液体培养基中，37±2℃培养20-48h后转接到含10％甘草浸液的液体培养基中，以此类推，最终转接到含50％甘草浸液的液体培养基中；所述液体培养基的配方为：柠檬酸铵2g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸锰0.2g/L，硫酸镁0.5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，吐温-801mL/L，(5-50)％甘草浸液200mL/L；经多次驯化，得到稳定生长活性的嗜甘草的植物乳杆菌。

所述的嗜甘草的植物乳杆菌的制备方法，所述的LBS培养基，在一个具体实施例中，其配方为：酵母浸粉0.5％，胰酪蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.6％，硫酸亚铁0.0034％，硫酸镁0.0575％，葡萄糖2％，乙酸钠2.5％，柠檬酸铵0.2％，硫酸锰0.012％，琼脂1.5％，吐温-801mL，冰乙酸1.3mL；调节pH值为5.5±0.2。当日使用，无需高压灭菌，次日使用，需118℃高压灭菌15min。

所述的嗜甘草的植物乳杆菌的制备方法，所述的MRS培养基，在一个具体实施例中，其配方为：葡萄糖2.0％，柠檬酸铵0.2％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸锰0.02％，硫酸镁0.05％，蛋白胨1.0％，牛肉膏1.0％，酵母膏0.5％，吐温-800.1％，琼脂1.5％；调节pH 6.0±0.2，121℃高压灭菌15min。

含有本发明所述的嗜甘草的植物乳杆菌的制剂，所述制剂含有药学上一切可接受的载体。

优选的，所述制剂包括冻干粉末、胶囊或片剂。

优选的，所述制剂中嗜甘草的植物乳杆菌的活菌数≥1×10⁸cfu/g。

具有护肝功能的甘草益生菌制剂，所述甘草益生菌制剂包括本发明所研发的嗜甘草的植物乳杆菌和甘草发酵物，所述甘草发酵物是由本发明所研发的嗜甘草的植物乳杆菌发酵甘草和/或甘草浸液制备得到。经初步研究结果显示，该益生菌制剂对化学性肝损伤(如酒精性肝炎和中毒性肝炎)、慢性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎有预防及辅助治疗的作用。

本发明进一步提供了具有护肝功能的甘草益生菌制剂的制备方法，将生物保藏编号为CCTCC M 2013449的嗜甘草的植物乳杆菌接种于发酵培养基中发酵，所得发酵产物即为具有护肝功能的甘草益生菌制剂，上述所得发酵产物应理解为发酵结束后所得的所有产物，包括菌和经过发酵后的发酵培养基。所述发酵培养基中添加有甘草和/或甘草浸液，所述发酵培养基中还包括其他利于乳酸菌发酵的氮源、无机盐和生长因子等。在本发明的一个具体实施例中，所述发酵培养基配方为：酪蛋白胨10.00g/L，柠檬酸三铵2.00g/L，牛肉膏10.00g/L，乙酸钠5.00g/L，酵母浸膏5.00g/L，硫酸镁0.50g/L，葡萄糖20.00g/L，硫酸锰0.2g/L，磷酸氢二钾5.00g/L，吐温1.00g/L，10％甘草浸液200mL/L；10％甘草浸液配制方法：100g甘草超微粉体，加水2L，浸泡40分钟，煎煮40min，4层纱布过滤，药渣加水2L，煎煮40min，4层纱布过滤，合并两次滤液，经60、100、200目分级过滤，浓缩滤液至1L。

进一步，所述的制备方法，所得的发酵产物经过离心，取沉淀部分(沉淀部分包括中层菌体和下层药泥)添加冻干保护剂进行真空冷冻干燥，得干粉状甘草益生菌制剂。所述的离心、真空冷冻干燥采用本领域任何常规操作均可实现。所述的冻干保护剂为冻干领域常用的保护剂，包括戊五醇、蔗糖、脯氨酸、脱脂奶粉等，优选脱脂奶粉。

优选的，所述的制备方法，所述用于接种发酵的嗜甘草的植物乳杆菌菌龄为12-24h，更优选的为24h。合适菌龄的菌种可通过菌种活化和/或扩大培养来实现，在本发明的一个具体实施例中，所述菌种活化是将冻干的嗜甘草的植物乳杆菌菌粉接种于固体斜面活化培养基上，在25-40℃培养22-26h。所述扩大培养是取菌种活化所得的活化菌种，在无菌条件下用接种环取一环接种于50mL-100mL扩大培养基中，在25-40℃条件下，静置培养12-24h，至得到所需菌龄及浓度的菌种；若经一次扩大培养得到的菌种仍然不符合要求，可利用第一次扩大培养所得的菌种按照上述的方法继续进行第二次扩大培养，至得到所需菌龄及浓度的菌种，如取第一次扩大培养所得的菌种，按照1-5％的接种量，接种于500mL-1000mL新鲜的扩大培养基中，在25-40℃条件下，静置培养12-24h，制得第二次扩大培养的菌种。所述的固体斜面活化培养基配方为：酪蛋白胨10.00g/L，柠檬酸三铵2.00g/L，牛肉膏10.00g/L，乙酸钠5.00g/L，酵母浸膏5.00g/L，硫酸镁0.50g/L，葡萄糖20.00g/L，硫酸锰0.2g/L，磷酸氢二钾5.00g/L，吐温1.00g/L，琼脂粉15.00g/L，使用时调节pH至6.0，115℃条件下灭菌20min。所述的扩大培养基为不加琼脂的固体斜面活化培养基。

优选的，所述的制备方法，所述发酵条件为25-40℃，pH5.0-7.0。

优选的，所述的制备方法，所述发酵为间歇搅拌发酵。

优选的，所述的制备方法，所述间歇搅拌为每2h搅拌5min，搅拌速度为100r/min。

优选的，所述的制备方法，所述发酵时间为48-96h。

优选的，所述的制备方法，所述嗜甘草的植物乳杆菌的接种量为培养基总量的1-5％，更优选的为2％。

优选的，所述的制备方法，所得的发酵产物离心为管式离心机2000-5000rpm/min离心1-10min。所述发酵产物经离心分为三层，分别为上清液(70-80％，棕色)、菌体(2mm，白色)、药泥(20-30％，深褐色)，移去上清液，菌体和药泥层即为所取沉淀部分。

优选的，所述的制备方法，真空冷冻干燥参数为：冷冻温度(-50℃)-(-70℃)，升华温度30±5℃，冷冻干燥60-80h，优选72h。

本发明所述的具有护肝功能的甘草益生菌制剂在制备预防或治疗肝脏疾病药物中的应用。

进一步，所述肝脏疾病包括酒精性肝炎、中毒性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎。

本发明的有意效果：

(1)本发明通过微生态工程—液态深层发酵技术筛选驯化得到的嗜甘草的植物乳杆菌，在以甘草为唯一营养成分的培养基环境中能够旺盛繁殖。(2)本发明的具有护肝功能的甘草益生菌制剂由嗜甘草的植物乳杆菌和甘草发酵物组成，经初步研究结果显示，该益生菌制剂对化学性肝损伤(如酒精性肝炎和中毒性肝炎)、慢性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎有预防及辅助治疗的作用，具有广阔的市场前景。(3)本发明的甘草益生菌制剂的制备方法，操作简单，易于工业化生产。

附图说明

图1实施例1中甘草植物乳杆菌BL-WHSYM9显微形态图

图2实施例2中发酵物离心后示意图；

图3实施例6中GLX和GQ保护大鼠急性肝损伤模型病理-肉眼照片；

图4实施例6中GLX和GQ保护大鼠急性肝损伤模型病理-光镜照片；

图5实施例6中GLX和GQ保护大鼠急性肝损伤模型病理-电镜照片。

本发明的嗜甘草的植物乳杆菌命名为Lactobacillus plantarum BL-WHSYM9，已于2013年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2013449，生物学特征如下：属于乳杆菌科中的乳杆菌属，革兰氏阳性，45℃不生长，兼性厌氧菌，在pH4.5-9.5生长，最适pH6.5左右。菌种呈短杆状，有时呈链状或者呈对状，不产生芽孢；在LBS琼脂培养基中呈灰白色、不透明、圆形、光滑、微小细密的菌落；属于通行发酵乳酸菌，能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、L-山梨糖、乳糖等。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。

优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。本发明所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1嗜甘草的植物乳杆菌的筛选及驯化

人新鲜粪便取自一名23岁健康男性核潜艇艇员。

筛选及驯化的步骤具体如下：

(1)培养基及甘草浸液的制备

LBS培养基：酵母浸粉0.5％，胰酪蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.6％，硫酸亚铁0.0034％，硫酸镁0.0575％，葡萄糖2％，乙酸钠2.5％，柠檬酸铵0.2％，硫酸锰0.012％，琼脂1.5％，吐温-801mL，冰乙酸1.3mL，调节pH值5.5±0.2。当日使用，无需高压灭菌，次日使用，需118℃高压灭菌15min。

MRS培养基：葡萄糖2.0％，柠檬酸铵0.2％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸锰0.02％，硫酸镁0.05％，蛋白胨1.0％，牛肉膏1.0％，酵母膏0.5％，吐温-800.1％，琼脂1.5％，调节pH 6.0±0.2，121℃高压灭菌15min。

筛选培养基配方为：5％甘草浸液200mL/L，酵母膏0.5g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，琼脂15g/L。

甘草浸液的配制(以10％甘草浸液为例)：100g甘草超微粉体，加水2L，浸泡40分钟，煎煮40min，4层纱布过滤；药渣加水2L，煎煮40min，4层纱布过滤；合并两次滤液，经60、100、200目分级过滤，浓缩滤液至1L，保存备用。

(2)甘草植物乳杆菌的制备

①采集该核潜艇艇员新鲜粪便，在LBS培养基上划线，37℃厌氧培养24h；

②挑选不同形态的菌落接种到MRS固体培养基上，37℃条件下厌氧培养24h；

③挑选不同培养特征的乳杆菌菌落接种到筛选培养基上，筛选培养基是以甘草为唯一碳源的斜面培养基；

④驯化：将筛选到的耐甘草乳杆菌接种到添加有5％甘草浸液的液体培养基中，37℃培养24h后转接到添加有10％甘草浸液的液体培养基中，依次提高甘草浸液的浓度至50％。所述液体培养基的配方为：柠檬酸铵2g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸锰0.2g/L，硫酸镁0.5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，吐温-801mL/L；在本发明的一个实施例中，(5-50)％甘草浸液的添加量为每1L液体培养基中添加200mL；经多次驯化，得到稳定生长活性的嗜甘草的植物乳杆菌。

⑤鉴定及保存：经多次驯化，菌种仍能在浓度为50％甘草浸液的培养基中保持较高生长活性，经鉴定此菌为植物乳杆菌，命名为Lactobacillus plantarum BL-WHSYM9，已于2013年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCCM2013449，该菌在10×100倍显微镜下观察的形态如图1所示。

实施例2具有护肝功能的甘草益生菌制剂的制备

1.实验菌种：嗜甘草的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BL-WHSYM9；

2.培养基：

固体斜面培养基：酪蛋白胨10.00g/L，柠檬酸三铵2.00g/L，牛肉膏10.00g/L，乙酸钠5.00g/L，酵母浸膏5.00g/L，硫酸镁0.50g/L，葡萄糖20.00g/L，硫酸锰0.2g/L，磷酸氢二钾5.00g/L，吐温1.00g/L，琼脂粉15.00g/L，使用时调节pH至6.0，115℃条件下灭菌20min；

种子液体培养基配方为不加琼脂的固体培养基；

液体发酵培养基：酪蛋白胨10.00g/L，柠檬酸三铵2.00g/L，牛肉膏10.00g/L，乙酸钠5.00g/L，酵母浸膏5.00g/L，硫酸镁0.50g/L，葡萄糖20.00g/L，硫酸锰0.2g/L，磷酸氢二钾5.00g/L，吐温1.00g/L，10％甘草浸液200mL/L；使用时调节pH5.5---6，115℃条件下灭菌20min。

3.实验过程

(1)斜面培养：将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在37℃培养24h；

(2)一级种子培养：取上述培养好的斜面，在无菌条件下用接种环取一环接种于100mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养12h，制得一级种子液；

(3)扩大培养：以5％的接种量，将一级种子液接于500mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养12h，制得二级种子液；

(4)发酵罐培养：以2％的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于35℃条件下，间歇搅拌100r/min，5min/2h，发酵周期为72h；

(5)发酵结束后，发酵产物经管式离心机4000rpm/min离心10min，离心后上清液与沉淀部分的示意图如图2所示，移去上清液，取沉淀部分添加保护剂脱脂奶粉进行真空冷冻干燥，所得冻干粉，即为所制备的甘草益生菌制剂。

实施例3具有护肝功能的甘草益生菌制剂的制备

2.培养基：

种子液体培养基配方为不加琼脂的固体培养基；

液体发酵培养基：酪蛋白胨10.00g/L，柠檬酸三铵2.00g/L，牛肉膏10.00g/L，乙酸钠5.00g/L，酵母浸膏5.00g/L，硫酸镁0.50g/L，葡萄糖20.00g/L，硫酸锰0.2g/L，磷酸氢二钾5.00g/L，吐温1.00g/L，20％甘草浸液200mL/L；使用时调节pH5.5---6，115℃条件下灭菌20min；所述20％甘草浸液配制：200g甘草超微粉体，加水2L，浸泡40分钟，煎煮40min，4层纱布过滤；药渣加水2L，煎煮40min，4层纱布过滤；合并两次滤液，经60、100、200目分级过滤；浓缩滤液至1L。

3.实验过程

(5)发酵结束后，发酵产物经管式离心机4000rpm/min离心10min，移去上清液，取沉淀部分添加保护剂脱脂奶粉进行真空冷冻干燥，所得冻干粉，即为所制备的甘草益生菌制剂。

实施例4具有护肝功能的甘草益生菌制剂的制备

2.培养基：

种子液体培养基配方为不加琼脂的固体培养基；

液体发酵培养基：酪蛋白胨10.00g/L，柠檬酸三铵2.00g/L，牛肉膏10.00g/L，乙酸钠5.00g/L，酵母浸膏5.00g/L，硫酸镁0.50g/L，葡萄糖20.00g/L，硫酸锰0.2g/L，磷酸氢二钾5.00g/L，吐温1.00g/L，50％甘草浸液200mL/L；使用时调节pH5.5---6，115℃条件下灭菌20min；所述50％甘草浸液配制：500g甘草超微粉体，加水2L，浸泡40分钟，煎煮40min，4层纱布过滤；药渣加水2L，煎煮40min，4层纱布过滤；合并两次滤液，经60、100、200目分级过滤；浓缩滤液至1L。

3.实验过程

实施例5甘草益生菌制剂治疗酒精肝功能验证试验

以下实施例中将本发明制备的具有护肝功能的甘草益生菌制剂命名为“甘清”。

1.材料

以小鼠为实验对象，构建酒精性肝损伤小鼠模型，研究甘清对酒精性肝损伤的生理及病理组织的影响

2.方法

参照保健食品检验与评价技术规范(2003版)。

(1)实验分组

选小鼠，每组10只，雌雄各半，体重150克左右，标准条件饲养，供水。适应性饲养1周后，分组进行保护性处理。实验设3个剂量组、1个空白对照组和1个模型对照组。用无水乙醇(分析纯)造成肝损伤模型，无水乙醇浓度为50％(以蒸馏水稀释)，受试样品给予时间30d。

(2)实验步骤

每日经口灌胃给予受试样品，空白对照组和模型对照组给予蒸馏水。给予受试样品结束时将模型对照组及各样品组一次灌胃给予50％乙醇12mL/kg BW，空白对照组给予蒸馏水，禁食16h处死动物，进行各项指标的检测及病理组织学检查。

3.结果

3.1甘清对酒精性肝损伤小鼠组织中TG，CSH，MDA水平的影响

如表1所示，与正常对照组比较，模型对照组肝组织中TG，MDA水平明显升高，GSH水平明显降低，差异均有统计学意义(p<0.05，p<0.01)，表明模型成功建立；甘清高、中剂量组与模型对照组比较TG水平明显降低，GSH水平明显升高，差异有统计学意义(p<0.05，p<0.01)；甘清三个剂量组MDA水平虽有降低，但与模型对照组比较差异不显著。

表1.对酒精性肝损伤小鼠肝组织中TG，CSH，MDA水平的影响

注：a:与模型对照组比较p<0.05，

b:与模型对照组比较p<0.01。

3.2甘清对酒精性肝损伤小鼠肝脏病理组织学变化的影响

空白对照组肝组织结构基本正常，清晰可见，肝细胞排列整齐，细胞核圆形，核仁清晰，胞质内几乎无脂滴；模型组弥漫性肝细胞脂肪变性，脂滴较大；甘清高、中剂量组肝细胞未见明显肿胀，散在肝细胞脂肪变性，脂滴较小。甘清低剂量组区域弥散性肝细胞脂肪变性，脂滴较大，说明本发明的益生菌制剂甘清对酒精所致小鼠肝脏损伤具有一定的保护作用。酒精性肝损伤小鼠肝组织中TG，GSH两项指标结果阳性，并且病理组织学病理结果阳性，判定受试样品甘清对酒精性肝损伤有辅助保护作用。

实施例6甘草益生菌制剂“甘清”对实验性大鼠急性肝损伤模型的保护作用

1.实验材料与方法

(1)各处理因素的保护性试验

选SD大白鼠，每组10只，雌雄各半，体重150克左右，标准条件饲养，供水。适应性饲养1周后，分组进行保护性处理，即：各组分别以NS(阴性对照)、GLX(阳性对照，甘利欣(甘草酸二铵)胶囊，市售成品)、GQ(甘清)，调配至适当浓度后，每次2ml、3次/日灌胃，连续7天；从第6天开始，对各组大鼠行实验性急性肝损伤造模处理。同时设空白对照组(KB)，仅常规喂养处理。

(2)实验性急性肝损伤动物模型的建立

大鼠保护性因素处理5天后，于第6天，用25％CCl₄溶液以5ml/kg体重的剂量1次性皮下注射造模，至48h时集中处理取标本。造模期间不停止保护性因素处理。

(3)标本采取及处理

采取标本前各组大鼠均停止进食12h，可随时饮水。开始取材时，先用4％戊巴比妥钠0.3ml/只将模型大鼠麻醉后，充分暴露股静脉，穿刺取血，离心后取血清备查各项血清学指标；随后剖腹，取肝脏作组织病理，心脏穿刺取血作内毒素检测用。如实验大鼠在造模后48h内死亡，则仅留取心血、肝组织和粪便标本。

2.急性肝损伤保护作用结果

①死亡率(数字结果分析)

GLX和GQ保护急性重度肝损伤(肝衰竭)大鼠模型(用D-GalN造模)，结果为：GLX保护组8只死亡1只(12.5％)，GQ保护组8只未见死亡(0％)，NS对照组8只死亡4只，说明GLX和GQ对发生肝衰竭均有保护作用，且GQ优于GLX。

②肝功能(统计学处理及分析)

GLX和GQ保护急性肝损伤大鼠模型(用25％CCl₄造模)，各肝功能指标在造模后48h时检测结果的均数与对应时间点生理盐水对照组相应指标均数比较，用t检验进行统计学处理，结果见表2：

表2. GLX和GQ保护急性肝损伤大鼠模型肝功能指标造模前后比较以及与NS组比较(x±s)

本组间造模前与造模后相比：^※P<0.05，^※※P<0.01；保护组造模后与生理盐水组造模后相比：^▼P<0.05，^▼▼P<0.01。

上表结果表明，GLX和GQ保护组急性肝损伤模型动物，ALT、AST、TBIL、mAST造模后较造模前均有显著增高，表明两者的肝脏保护作用均不够完全；但与生理盐水处理组造模后相比，又有非常显著降低，提示两者确有明显保护作用。此外，结果可见GQ在阻止肝脏蛋白系统降低方面优于GLX。

③内毒素和抗氧化指标(统计学处理及分析)

GLX和GQ保护急性肝损伤大鼠模型内毒素及抗氧化指标与生理盐水对照组比较结果见表3。

表3. GLX和GQ保护急性肝损伤大鼠模型内毒素及抗氧化指标与生理盐水对照组比较(x±s)

上表结果可见，与NS对照组比较，GLX和GQ保护可明显减低LPS、TNF-α和MDA的升高幅度，以及提高抗氧化酶SOD和px-GSH的水平。

④肝组织(照片观察分析)

肉眼观察：与未保护的急性肝损伤大鼠比较，GLX和GQ保护肝脏的大小、色泽、质地均有差异，但两者间比较差异不大(照片比较)，如图3所示。

光镜观察：与未保护的急性肝损伤大鼠比较，GLX和GQ保护肝组织发生肿胀性炎症和局部坏死改变的程度偏轻，但两者间比较差异不大(照片比较)，如图4所示。

电镜观察：与未保护的急性肝损伤大鼠比较，GLX和GQ保护肝细胞及其细胞器发生炎症或破坏的程度偏轻，但两者间比较差异不大(照片比较)，如图5所示。

由图可知，GLX和GQ保护慢性肝损伤大鼠造模给药后的动物表现、死亡及淘汰率、肝功指标、肝脏组织学变化和肠菌群定量分析，初步证明两种保护性处理因素均对慢性肝损伤有保护作用。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.具有护肝功能的甘草益生菌制剂，其特征在于，所述甘草益生菌制剂包括嗜甘草的植物乳杆菌和甘草发酵物；所述嗜甘草的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) 生物保藏编号为CCTCC M 2013449 ，所述嗜甘草的植物乳杆菌在添加甘草和/ 或甘草浸液为唯一碳源的培养环境中繁殖旺盛；所述甘草发酵物是由上述的嗜甘草的植物乳杆菌发酵甘草和/ 或甘草浸液制备得到。

2.根据权利要求1 所述的制剂，其特征在于，所述制剂含有药学上一切可接受的载体。

3.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述制剂包括冻干粉末、胶囊或片剂。

4.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述制剂中嗜甘草的植物乳杆菌的活菌数≥ 1×10⁸cfu/g。

5.具有护肝功能的甘草益生菌制剂的制备方法，其特征在于，将生物保藏编号为CCTCCM 2013449 的嗜甘草的植物乳杆菌接种于发酵培养基中发酵，所得发酵产物即为具有护肝功能的甘草益生菌制剂，所述发酵培养基中添加有甘草和/ 或甘草浸液。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所得的发酵产物离心，取沉淀部分添加冻干保护剂进行真空冷冻干燥，得干粉状甘草益生菌制剂。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵温度为25-40℃，所述发酵为间歇搅拌发酵48-96h，所述间歇搅拌为每2h 搅拌5min，搅拌速度为100r/min。

8.权利要求1所述的具有护肝功能的甘草益生菌制剂在制备预防或治疗肝脏疾病药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肝脏疾病包括酒精性肝炎、中毒性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎。