CN113549582B - 一种具有抗氧化、缓解急性酒精性肝损伤及调节肠道菌群作用的甘草发酵液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，提供了一种具有抗氧化、缓解急性酒精性肝损伤及调节肠道菌群作用的甘草发酵液及其应用。甘草发酵液是由植物乳杆菌发酵甘草所得。植物乳杆菌为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum LZU‑S‑ZCJ，于2020年12月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCCNo：61402；植物乳杆菌的核酸序列如SEQ:NO.1所示。本发明所提供的甘草发酵液具有较好的抗氧化及缓解急性酒精性肝损伤的作用，能够清除DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基及还原铁离子，对肠道菌群有较好的调节作用。

Description

一种具有抗氧化、缓解急性酒精性肝损伤及调节肠道菌群作 用的甘草发酵液及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种具有抗氧化、缓解急性酒精性肝损伤及调节肠道菌群作用的甘草发酵液及其应用。

背景技术

由酒精导致的氧化应激指的是在急性或慢性酒精暴露的情况下，机体中活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)占比增加，或者抗氧化剂以及抗氧化酶活力降低。摄入过度酒精后，机体内原有的氧化与还原体系之间的平衡将会被打破，当肝脏中没有足够的抗氧化剂来消耗过量的ROS时，ROS将会大量积累，由于ROS半衰期短、反应性强，将很快与乙醇或铁原子结合，形成羟基自由基、氧化亚铁或者羟乙基自由基，从而导致细胞膜脂质发生过氧化，细胞内物质遭到破坏，甚至会进一步导致肝细胞死亡。

甘草的药理作用与抗炎、抗氧化应激、免疫调节、抗病毒感染和抗癌相关，临床主要用于治疗慢性病毒性肝炎。迄今为止，从甘草属植物中提取分离出的主要生物活性成分及植物次生代谢产物共400多种，包括至少18种三萜皂苷、300多种黄酮类化合物，以及各类查尔酮、香豆素及其糖苷。然而现有的中药加工处理手段往往不能完全发挥中药的优势，中药的发酵可以利用细菌和真菌等微生物分解中药，发酵过程会诱导植物细胞壁的破裂，导致各种抗氧化化合物的释放或合成，可以提高中药的利用率，增进药效。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗氧化、缓解急性酒精性肝损伤及调节肠道菌群作用的甘草发酵液及其应用，所述甘草发酵液具有较好的抗氧化及缓解急性酒精性肝损伤的作用，能够清除DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基及还原铁离子，对肠道菌群有较好的调节作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种植物乳杆菌，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum LZU-S-ZCJ，于2020年12月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：61402；所述植物乳杆菌的核酸序列如SEQ:NO.1所示。

本发明提供了一种甘草发酵液的制备方法，包括以下步骤：

(1)甘草提取液的制备：甘草与水混合浸泡，浸泡后直接煎煮，过滤，得一次滤液和一次滤渣，一次滤渣中加水继续煎煮，过滤，得二次滤液，合并两次滤液，浓缩，离心，灭菌后得到甘草提取液；

(2)发酵：取步骤(1)的甘草提取液与植物乳杆菌菌液混合，发酵，过滤后得到甘草发酵液。

进一步地，步骤(1)中浸泡时间为8～10h。

进一步地，步骤(1)中第一次煎煮甘草与水的体积比为1:5～15，煎煮时间为0.5～2h。

进一步地，步骤(1)中第二次煎煮甘草与水的体积比为1:5～10，煎煮时间为0.5～3h。

进一步地，步骤(1)中浓缩温度80～100℃，离心温度0～5℃，离心转速2000～4000r/min，离心时间2～10min。

进一步地，步骤(2)中所采用的每1mL甘草提取液是由0.1～0.5g甘草制得，菌种接种量为1～5％，发酵温度为35～39℃，发酵时间为24～96h。

进一步地，步骤(2)中植物乳杆菌菌液浓度为1.0×10¹¹～3.0×10¹¹CFU/mL。

本发明还提供了一种上述制备方法得到的甘草发酵液。

本发明还提供了甘草发酵液在制备调节肠道菌群产品，体外抗氧化产品，清除DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基及还原铁离子产品，提高有益菌-厚壁菌门与疣微球菌门丰度的产品中的应用。

本发明的有益效果为：

①本发明提供的甘草发酵液具有较好的清除自由基的作用，对DPPH自由基、ABTS自由基、羟自由基有很好的清除作用；

②本发明提供的甘草发酵液能够降低急性酒精性肝损伤小鼠血脂浓度，提高肝组织的抗氧化酶的含量；

③本发明提供的甘草发酵液能够提高急性酒精性肝损伤小鼠肠道内有益菌的丰度，对肠道菌群有较好的调节作用。

附图说明

图1为甘草提取液与甘草发酵液DPPH自由基清除率；图中，S：甘草提取液组，F：甘草发酵液组，J：植物乳杆菌，C：正常组，P：阳性对照组。

图2为甘草提取液与甘草发酵液的总抗氧化能力。

图3为甘草提取液与甘草发酵液的铁离子还原能力。

图4为甘草提取液与甘草发酵液的羟基自由基清除率。

图5为各组小鼠肝脏系数图；图中，C：正常组，M：酒精造模组，P：阳性对照组，S：甘草提取液组，F：甘草发酵液组，JS：植物乳杆菌+甘草提取液，J：植物乳杆菌。

图6为各组小鼠肝组织病理切片图。

图7为各组小鼠血清ALT(左)含量与AST(右)含量。

图8为各组小鼠血清TC(左)含量与TG(右)含量。

图9为各给药组对酒精性肝损伤小鼠肝脏SOD活性(左)、GSH含量(右)的影响。

图10为各给药组对酒精性肝损伤小鼠肝脏MDA含量的影响。

图11为门水平的群落分类学组成和丰度分布图；图中，BC：正常组给药前，BM：酒精造模组给药前，BP：阳性对照组给药前，BF：甘草发酵液组给药前，BS：甘草提取液组给药前，AC：正常组给药后，AM：酒精造模组给药后，AP：阳性对照组给药后，AF：甘草发酵液组给药后，AS：甘草提取液组给药后。

图12为属水平的群落分类学组成和丰度分布图。

图13为甘草提取液组(S)与甘草发酵液组(F)造模后差异代谢物的层次聚类分析；A、B分别表示正、负离子模式。

图14为造模后甘草提取液组与甘草发酵液组样品代谢通路气泡图。

图15为造模后甘草提取液组与甘草发酵液组样品代谢通路矩形树图；图A为整体图，图B为图A右下角的局部图。

保藏说明

植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-S-ZCJ，拉丁文为Lactobacillusplantarum，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2020年12月31日，保藏编号为：GDMCC No：61402。

具体实施方式

本发明提供了一种植物乳杆菌，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum LZU-S-ZCJ，于2020年12月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：61402；所述植物乳杆菌的核酸序列如SEQ:NO.1所示。

本发明提供了一种甘草发酵液的制备方法，包括以下步骤：

(1)甘草提取液的制备：甘草与水混合浸泡，浸泡后直接煎煮，过滤，得一次滤液和一次滤渣，一次滤渣中加水继续煎煮，过滤，得二次滤液，合并两次滤液，浓缩，离心，灭菌后得到甘草提取液；

(2)发酵：取步骤(1)的甘草提取液与植物乳杆菌菌液混合，发酵，过滤后得到甘草发酵液。

在本发明中，步骤(1)中浸泡时间优选为8～10h，更优选为8.5～9.5h。

在本发明中，步骤(1)中第一次煎煮甘草与水的体积比优选为1:5～15，更优选为1:8～12；煎煮时间优选为0.5～2h，更优选为1～1.5h。

在本发明中，步骤(1)中第二次煎煮甘草与水的体积比优选为1:5～10，更优选为1:7～9；煎煮时间优选为为0.5～3h，更优选为1.5～2h。

在本发明中，步骤(1)中浓缩温度优选为80～100℃，更优选为85～95℃；离心温度优选为0～5℃，更优选为2～4℃；离心转速优选为2000～4000r/min，更优选为2500～3500r/min；离心时间优选为2～10min，更优选为4～8min。

在本发明中，步骤(2)中所采用的每1mL甘草提取液是由0.1～0.5g甘草制得，优选为每1mL甘草提取液是由0.2～0.4g甘草制得；菌种接种量优选为1～5％，更优选为2～4％；发酵温度优选为35～39℃，更优选为36～38℃；发酵时间优选为24～96h，更优选为36～72h。

在本发明中，步骤(2)中植物乳杆菌菌液浓度优选为1.0×10¹¹～3.0×10¹¹CFU/mL，更优选为1.5×10¹¹～2.5×10¹¹CFU/mL。

本发明还提供了一种上述制备方法得到的甘草发酵液。

本发明还提供了甘草发酵液在制备调节肠道菌群产品，体外抗氧化产品，清除DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基及还原铁离子产品，提高有益菌-厚壁菌门与疣微球菌门丰度的产品中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本实施例提供了一种甘草发酵液的制备方法，包括以下步骤：

(1)甘草提取液的制备：称取甘草样品，加入10倍体积纯化水混合，浸泡9h，浸泡后直接煎煮2h，重复过滤3次，得到一次滤液和一次滤渣，一次滤渣中加入8倍体积纯化水继续煎煮1h，过滤，得到二次滤液，合并两次滤液，100℃水浴浓缩，4℃、3000rmp/min离心5min后取上清液，上清液121℃灭菌20min后得到甘草提取液；

(2)菌种活化：按照说明书配置MRS液体培养基，121℃，灭菌20min，无菌离心管内加入1mL MRS液体培养基，挑取植物乳杆菌单菌落打入，混匀，37℃培养20h，得到一代菌液，吸取100μL一代菌液接入4.9mL MRS液体培养基，混匀，继续培养20h，得二代菌液，二代菌液涂平板计数，根据结果将各菌液稀释到2.0×10¹¹CFU·mL^-1，即得植物乳杆菌菌液。

(3)发酵：取步骤(1)的甘草提取液，调节甘草提取液使得每1mL甘草提取液由0.23g甘草制得，取步骤(2)的植物乳杆菌菌液，调节菌液浓度为2.0×10¹¹CFU/mL，将植物乳杆菌以4.19％的接种量接种到甘草提取液中，两者混合均匀，37.7℃发酵93h，过滤后得到甘草发酵液。

实施例2

本实施例提供了一种甘草发酵液的制备方法，包括以下步骤：

(1)甘草提取液的制备：称取甘草样品，加入5倍体积纯化水混合，浸泡10h，浸泡后直接煎煮1h，重复过滤3次，得到一次滤液和一次滤渣，一次滤渣中加入5倍体积纯化水继续煎煮0.5h，过滤，得到二次滤液，合并两次滤液，90℃水浴浓缩，0℃、2000rmp/min离心10min后取上清液，上清液121℃灭菌20min后得到甘草提取液；

(2)菌种活化：按照说明书配置MRS液体培养基，121℃，灭菌20min，无菌离心管内加入1mL MRS液体培养基，挑取植物乳杆菌单菌落打入，混匀，37℃培养20h，得到一代菌液，吸取100μL一代菌液接入4.9mL MRS液体培养基，混匀，继续培养20h，得二代菌液，二代菌液涂平板计数，根据结果将各菌液稀释到2.0×10¹¹CFU·mL^-1，即得植物乳杆菌菌液。

(3)发酵：取步骤(1)的甘草提取液，调节甘草提取液使得每1mL甘草提取液由0.1g甘草制得，取步骤(2)的植物乳杆菌菌液，调节菌液浓度为1.0×10¹¹CFU/mL，将植物乳杆菌以1％的接种量接种到甘草提取液中，两者混合均匀，39℃发酵24h，过滤后得到甘草发酵液。

实施例3

本实施例提供了一种甘草发酵液的制备方法，包括以下步骤：

(1)甘草提取液的制备：称取甘草样品，加入15倍体积纯化水混合，浸泡8h，浸泡后直接煎煮0.5h，重复过滤3次，得到一次滤液和一次滤渣，一次滤渣中加入10倍体积纯化水继续煎煮3h，过滤，得到二次滤液，合并两次滤液，80℃水浴浓缩，5℃、4000rmp/min离心2min后取上清液，上清液121℃灭菌20min后得到甘草提取液；

(2)菌种活化：按照说明书配置MRS液体培养基，121℃，灭菌20min，无菌离心管内加入1mL MRS液体培养基，挑取植物乳杆菌单菌落打入，混匀，37℃培养20h，得到一代菌液，吸取100μL一代菌液接入4.9mL MRS液体培养基，混匀，继续培养20h，得二代菌液，二代菌液涂平板计数，根据结果将各菌液稀释到2.0×10¹¹CFU·mL^-1，即得植物乳杆菌菌液。

(3)发酵：取步骤(1)的甘草提取液，调节甘草提取液使得每1mL甘草提取液由0.5g甘草制得，取步骤(2)的植物乳杆菌菌液，调节菌液浓度为3.0×10¹¹CFU/mL，将植物乳杆菌以5％的接种量接种到甘草提取液中，两者混合均匀，35℃发酵96h，过滤后得到甘草发酵液。

以下所有实验例所使用的甘草发酵液均为实施例1制备得到的甘草发酵液。

实验例1甘草提取液发酵前后抗氧化活性测定作用

DPPH自由基清除率：配制0.04mg·mL^-1的DPPH乙醇溶液(现用现配)，在517nm处按表1测定样品吸光度。

DPPH自由基清除率方程为

I＝[1－(A₁－A₂)/A₀]×100％，A₀为对照组的吸光度、A₁为样品组的吸光度、A₂为样品空白组的吸光度。

表1 DPPH自由基清除率

铁离子还原能力：按照上海抚生实业有限公司的总抗氧化能力(FRAP法)试剂盒说明书测定，空白管中加入10μL提取液与190μL混合液，测定管中加入10μL样品与190μL混合液，充分混匀，反应20min，利用酶标仪测定593nm处吸光值。FRAP法总抗氧化能力I＝0.8054*(A₁-A₂-0.0134)，A₁为样品组的吸光度、A₂为样品空白组的吸光度。

羟基自由基清除率：配制6mmol·mL^-1的Fe₂SO₄溶液，6mmol·mL^-1的水杨酸乙醇溶液及6mmol·mL^-1H₂O₂溶液，722型分光光度计在510nm处按表2测定样品吸光度(试液按照表2中的顺序依次加入)。羟基自由基清除率I＝[A₃-(A₁-A₂)]/A₁*100％，A₁为样品组的吸光度、A₂为样品不加H₂O₂时样品本底的吸光度、A₃是空白对照溶液的吸光度。

表2羟基自由基清除率

ABTS法检测总抗氧化能力：按照上海抚生实业有限公司的总抗氧化能力(ABTS法)试剂盒说明书测定，空白管中加入10μL提取液与190μL工作液，测定管中加入10μL样品与190μL作液，充分混匀，10min内酶标仪测定734nm处吸光值。ABTS法总抗氧化能力I＝1.424*(A₁-A₂+0.0012)，A₁为空白样品的吸光度、A₂为样品组的吸光度。

实验结果：甘草提取液与甘草发酵液的DPPH自由基清除率(图1)、ABTS法检测总抗氧化能力(图2)、铁离子还原能力(图3)及羟基自由基清除率(图4)均显示甘草发酵液的抗氧化能力强于甘草提取液。说明通过植物乳杆菌LZU-S-ZCJ发酵得到的甘草发酵液，其抗氧化能力高于未经发酵的甘草提取液。

实验例2发酵甘草缓解急性酒精性肝损伤的动物实验

70只20±2g Balb/c雄性小鼠(SPF级)，兰州生物制品研究所提供。适应性喂养7d后，将70只雄性Balb/c小鼠随机分成如表3所示的7组，每组10只。动物实验室温度20～24℃，湿度：60％～70％。明暗期为12h/12h，食物及饮水小鼠自由摄取。

7组小鼠连续给药21d，末次给药后正常组给予生理盐水，模型组、阳性对照(水飞蓟素)组及其余实验组各灌胃50％乙醇(12mL·kg^-1体重)，禁食不禁水16h。小鼠摘眼球取血后处死。4℃，4000rmp离心分离取血清，用来测定血清中AST、ALT、TC、TG含量，-80℃保存备用；肝脏称重后分为两份，一份放置10％中性福尔马林溶液中固定，用来做病理切片；另一份液氮速冻后转移置-80℃冰箱保存，测定组织匀浆中GSH、MDA、SOD、BCA蛋白含量。

表3动物实验分组及给药

1.发酵甘草对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏指数的影响

小鼠肝脏系数(g/100g)＝(肝脏质量/g)/(最终体质量/g)×100

实验结果：酒精模型组的肝脏系数显著高于正常组(p<0.01)，即于空白对照组相比，模型组肝脏很可能肿大，并出现增生、充血、水肿等病变。与M组相比，P组、S组，F组肝脏系数显著降低(p<0.01)，说明甘草提取液、甘草发酵液和水飞蓟素都可以降低小鼠肝脏损伤(图5)。各组肝脏系数：C<F<P<S<J<JS<M，则缓解小鼠肝损伤预防效果为F>P>S>J>JS，且甘草发酵液缓解小鼠酒精性肝损伤作用效果好于甘草提取液。

2.发酵甘草对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织病理学的影响

每组小鼠肝脏组织在10％中性福尔马林溶液中固定48h后，于包埋盒中，用不同浓度梯度的乙醇对肝脏组织脱水处理，脱水处理后的组织使用二甲苯进行透明操作，直到组织形态显示为近透明状态，使用石蜡包埋，切片。将此玻片放入干燥箱中于40℃下烘片，并用苏木精-曙红(H&E)染色，最后用中性树胶封片。于100倍、40倍光学显微镜下，观察小鼠肝脏组织的病理切片结果并拍照。

实验结果：在正常组中，肝小叶细胞核清晰，肝细胞呈放射状排列且排列整齐。与正常组相比，酒精造模组肝细胞无序排列，而且可见点状坏死(箭头处)和炎症细胞。P、F、S、JS组肝细胞排列整齐，炎症细胞和点状坏死细胞明显减少(图6)。甘草发酵液可以有效减缓由酒精引起的小鼠肝细胞损伤。

3.发酵甘草对急性酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响

实验结果：与正常组相比，酒精模型组中AST活力极显著增加(p<0.01)，ALT活力也极显著增加(p<0.01)。各组小鼠ALT含量：M>S>JS>J>F>P>C，AST含量M>S>J>JS>P>C>F(图7)，各实验组均可缓解由酒精引起的小鼠肝细胞损伤，但是甘草发酵液的缓解作用最好。

4.发酵甘草对急性酒精性肝损伤小鼠血清TC、TG的影响

实验结果：与正常组相比，酒精模型组小鼠血清中TC含量显著升高(p<0.01)，TG含量升高。与酒精模型组相比，阳性对照组及各实验组小鼠血清中TC含量有显著性降低。各组小鼠TC含量：M>S>P>JS>F>J>C，TG含量：M>S>P>JS>F>J>C。综合两个指标，各实验组降低血脂浓度的效果为C>J>F>JS>P>S>M(图8)，LZU-S-ZCJ菌溶液降低血脂效果最明显，甘草发酵液降低血脂的效果好于阳性对照水飞蓟素及甘草提取液。

5.发酵甘草对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织SOD、GSH的影响

实验结果：与正常组相比，急性酒精性肝损伤模型组的GSH含量以及SOD活性均显著降低(p<0.05)，GSH与SOD是抗氧化酶，酶活性与其清除自由基的能力成正比，含量降低表明小鼠肝脏中过氧化物含量升高，机体氧化还原稳态失衡。与酒精模型组相比，阳性对照组及甘草发酵液组SOD含量显著增高(p<0.05)，甘草发酵液组GSH含量较模型组显著增加(p<0.05)，甘草发酵液能够有效缓解酒精性肝损伤小鼠的氧化损伤(图9)。

6.发酵甘草对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织MDA的影响

实验结果：MDA是脂质过氧化的产物，通过血清和组织中MDA含量的测定，可以间接反映体内脂质过氧化的程度。与正常组相比，酒精模型组MDA含量显著升高(p<0.05)，各给药组MDA含量与正常组相比无显著性差异(p>0.05)，即各给药组均能很好地预防脂质过氧化，MDA含量：M>J>S>JS>F>P>C，甘草发酵液缓解小鼠酒精性肝损伤作用效果好于甘草提取液(图10)。

7.发酵甘草对急性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群的调节作用

取动物实验适应期结束后、给药后及造模后小鼠粪便进行高通量测序。

实验结果：图11可知，各实验组均含有拟杆菌门、厚壁菌门、疣微球菌门、变形菌门、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、蓝细菌门、放线菌门、Acidobacteria、Desulfobacterota的存在。与正常小鼠相比，预防给药甘草提取液及甘草发酵液均能能够显著增高小鼠肠道中厚壁菌门与疣微球菌门的丰度，同时能够显著降低变形菌门的丰度。但是给药甘草发酵液还能够显著的降低拟杆菌门的丰度，同时F组疣微球菌门的丰度强于S组。造模后，与模型组相比，F组与S组小鼠肠道中厚壁菌门与疣微球菌门的丰度增高，变形菌门的丰度降低。而且相比于M组，F组拟杆菌门的丰度显著降低。甘草发酵液及提取液均能回调由急性酒精性肝损伤引起的肠道稳态失调，但甘草发酵液的回调效果好于甘草提取液。

造模后与M组相比，S组Akkermansia(阿克曼菌属)、Lachnospiraceae_NK4A136_group(毛螺菌属)、Alloprevotella丰度极显著增加，Escherichia-Shigella(大肠杆菌志贺属)、Alistipes(理研菌属)、Bacteroides(拟杆菌属)丰度极显著降低。造模后与M组相比，F组阿克曼菌属、毛螺菌属、Lactobacillus(乳杆菌属)、Lactobacillus(乳杆菌属)、Parabacteroides(副杆状菌属)丰度极显著增加，大肠杆菌志贺属、理研菌属、拟杆菌属、肠杆菌属丰度极显著降低。说明甘草提取液与甘草发酵液均能显著回调因急性酒精灌胃引起的阿克曼菌等有益菌丰度下降，并降低其引起的有害菌丰度上升，但是甘草发酵液调节肠道菌的范围更广，能更好的维持肠道稳态(图12)。

8.发酵甘草对急性酒精性肝损伤小鼠肠道代谢的调节作用

称取50mg粪便样品，加入1000μL提取液(甲醇：乙腈：水＝2：2：1，含同位素标记内标混合物)。35Hz条件下研磨4min，然后冰水浴超声5min，重复研磨及超声处理步骤三次，将样品置于-40℃冰箱静置1h，然后12000r·min^-1离心15min，取上清液过0.22μm滤膜，转移于进样瓶中用于LC-MS/MS分析，另外每个样本取等量体积混合成QC样本。

Vanquish(Thermo Fisher Scientific)超高效液相色谱仪，WatersACQUITY UPLCBEHAmide(2.1mm×100mm，1.7μm)液相色谱柱，液相色谱A相为水相，含25mmol·L^-1乙酸铵和25mmol·L^-1氨水，B相为乙腈，按表4进行梯度洗脱。样品盘温度：4℃，进样体积：2μL。

表4梯度洗脱表

Thermo Q Exactive HFX质谱仪，离子传输管的温度：350℃，鞘气流速：30Arb，辅助气流速：25Arb，Full Ms分辨率：60000，MS/MS分辨率：7500，碰撞能量10/30/60(在NCE模式下)，喷雾电压：3.6kV(正)或-3.2kV(负)。

实验结果：对酒精造模后甘草提取液组与甘草发酵液组小鼠的粪便差异代谢物进行层次聚类分析，如图13所示，在正离子和负离子模式下，共筛选出48种差异代谢物。相比于给药甘草提取液，给药甘草发酵液后能够使酒精性肝损伤小鼠肠道中甘油磷脂类化合物LysoPA(16:0/0:0)、PA(20:1(11Z)/15:0)水平降低，PC(16:0/18:3(6Z,9Z,12Z))、PA(22:2(13Z,16Z)/18:1(9Z))水平升高、糖类化合物(半乳糖醇、棉子糖、N-乙酰氨基葡萄糖1-磷酸等)水平降低，有机酸类化合物(丙二酸、丙酸、琥珀酸等)水平降低，脂肪酸类化合物(9,10-环氧十八碳烯酸、脱硫生物素等)水平降低，二十碳二烯酸、肾上腺酸水平升高，氨基酸类化合物(L-别苏氨酸、L-茶氨酸、L-赖氨酸、谷氨酰谷氨酸、尿囊酸等)水平降低，脂肪酰类化合物13-OxoODE水平降低，芳香类化合物3,4-二甲氧基苯乙酸水平降低以及核苷与有机氧化物改变。

将差异代谢物导入到MetaboAnalyst网站进行代谢通路分析。图14为以气泡图展示的代谢通路的分析结果。图15为以矩形树图展示的代谢通路的分析结果。结合图14及图15可知，酒精造模后，甘草提取液组与甘草发酵液组显著富集的通路为Purine metabolism嘌呤代谢、Citrate cycle(TCA cycle)TCA循环、Linoleic acid metabolism亚油酸代谢以及Galactose metabolism半乳糖代谢。

由以上实施例和实验例可知，本发明提供了一种具有抗氧化、缓解急性酒精性肝损伤及调节肠道菌群作用的甘草发酵液及其应用，甘草发酵液具有较好的抗氧化及缓解急性酒精性肝损伤的作用，能够清除DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基及还原铁离子，对肠道菌群有较好的调节作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 兰州大学

<120> 一种具有抗氧化、缓解急性酒精性肝损伤及调节肠道菌群作用的甘草发酵液及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1433

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttaggcgctg gttctaaagg ttaccccacc gactttgggt gttacaaact ctcatggtgt 60

gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta 120

ctagcgattc cgacttcatg taggcgagtt gcagcctaca atccgaactg agaatggctt 180

taagagatta gcttactctc gcgagttcgc aactcgttgt accatccatt gtagcacgtg 240

tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg 300

tcaccggcag tctcaccaga gtgcccaact taatgctggc aactgataat aagggttgcg 360

ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc 420

tgtatccatg tccccgaagg gaacgtctaa tctcttagat ttgcatagta tgtcaagacc 480

tggtaaggtt cttcgcgtag cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540

ccgtcaattc ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggaa tgcttaatgc 600

gttagctgca gcactgaagg gcggaaaccc tccaacactt agcattcatc gtttacggta 660

tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tacccatact ttcgagcctc agcgtcagtt 720

acagaccaga cagccgcctt cgccactggt gttcttccat atatctacgc atttcaccgc 780

tacacatgga gttccactgt cctcttctgc actcaagttt cccagtttcc gatgcacttc 840

ttcggttgag ccgaaggctt tcacatcaga cttaaaaaac cgcctgcgct cgctttacgc 900

ccaataaatc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta 960

gccgtggctt tctggttaaa taccgtcaat acctgaacag ttactctcag atatgttctt 1020

ctttaacaac agagttttac gagccgaaac ccttcttcac tcacgcggcg ttgctccatc 1080

agactttcgt ccattgtgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ttgggccgtg 1140

tctcagtccc aatgtggccg attaccctct caggtcggct acgtatcatt gccatggtga 1200

gccgttacct caccatctag ctaatacgcc gcgggaccat ccaaaagtga tagccgaagc 1260

catctttcaa actcggacca tgcggtccaa gttgttatgc ggtattagca tctgtttcca 1320

ggtgttatcc cccgcttctg ggcaggtttc ccacgtgtta ctcaccagtt cgccactcac 1380

tcaaatgtaa atcatgatgc aagcaccaat caataccaga gttcgtcgac tgc 1433

Claims (2)

1.甘草发酵液在制备提高厚壁菌门与疣微球菌门丰度的产品中的应用，其特征在于，所述甘草发酵液的制备方法，包括以下步骤：

(1)甘草提取液的制备：甘草与水混合浸泡，浸泡后直接煎煮，过滤，得一次滤液和一次滤渣，一次滤渣中加水继续煎煮，过滤，得二次滤液，合并两次滤液，浓缩，离心，灭菌后得到甘草提取液；

(2)发酵：取步骤(1)的甘草提取液与植物乳杆菌菌液混合，发酵，过滤后得到甘草发酵液；步骤(1)中浸泡时间为8～10h；步骤(1)中第一次煎煮甘草与水的体积比为1:5～15，煎煮时间为0.5～2h；步骤(1)中第二次煎煮甘草与水的体积比为1:5～10，煎煮时间为0.5～3h；步骤(1)中浓缩温度80～100℃，离心温度0～5℃，离心转速2000～4000r/min，离心时间2～10min；步骤(2)中所采用的每1mL甘草提取液是由0.1～0.5g甘草制得，菌种接种量为1～5％，发酵温度为35～39℃，发酵时间为24～96h；

所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) LZU-S-ZCJ，于2020年12月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：61402；所述植物乳杆菌的核酸序列如SEQ:NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)中植物乳杆菌菌液浓度为1.0×1011~3.0×1011CFU/mL。

Images