CN115553286B - 一种粪便保存液、保存粪便的方法及乙腈在制备粪便保存液中的应用 - Google Patents
一种粪便保存液、保存粪便的方法及乙腈在制备粪便保存液中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种粪便保存液、保存粪便的方法及乙腈在制备粪便保存液中的应用，涉及粪便保存技术领域。粪便保存液中的有效成分为乙腈。本发明的提出，表明了使用乙腈作为保存液在环境温度下收集和储存样本的潜力，极大程度上方便了通过邮寄发送样品或储存样本，进而降低了短链脂肪酸准确定量的难度，为短链脂肪酸检测成为代谢疾病筛查、早期诊断、治疗监测和预后评估等临床应用提供了科学依据，可促进短链脂肪酸谱在临床的应用。可以用于开发相应的短链脂肪酸检测试剂或试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及粪便保存技术领域，具体而言，涉及一种粪便保存液、保存粪便的方法及乙腈在制备粪便保存液中的应用。
背景技术
短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFA)，也称挥发性脂肪酸(Volatilefatty acids，VFA)，根据碳链中碳原子的多少，把碳原子数小于6的有机脂肪酸称为短链脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸。SCFA产生于肠道，在临床上可以作为治疗手段(包括益生菌药物治疗、菌群移植、其他治疗类药物等)治疗后效果的相应指标。
然而由于某些细菌的代谢和增殖可能会继续，从而对微生物结构和SCFA谱产生影响。文献指出在4℃和室温条件下，SCFA几乎随时间成比例增加[Cunningham J,BramstngL,Singh A,et al.Impact of time and temperature on gut microbiota and SCFAcomposition in stool samples.2020.]，因此通常不建议在室温下或在4℃下储存粪便样品超过12小时。这对短链脂肪酸的分析提出了重要的挑战，因为从样本收集到冷冻储存，冷链并不总是能够得到维护或保证。在现场收集的标本通常在室温下花费不同的时间，然后用冷冻凝胶包装(4℃)或干冰运送到实验室进行处理或储存，即样本在到达实验室之前可能已经暴露在室温下数小时，导致SCFA含量产生较大的变化。
一般地，立即将样本冻存在-80℃中被视为参考方法，但这种参考方法受限于保存条件苛刻在许多情况下不可行。相对的，大多数家庭都拥有-20℃的冷冻柜，也可以在-20℃下对样本进行冷冻，但这需要人们愿意将样品放在冷冻柜中，并有资源在冷冻状态下运输样品。目前收集粪便样本的方法主要由参与者在家中自行收集，以便在收集当天安排预约并将样本存放在自己的冰箱或冰柜中，而由上可知，这可能会给参与者带来不适，并可能带来健康风险。因此，标准收集方法中需要立即冷冻的方法可行性低。
综上，样本保存及运输困难是国内医疗机构尚未将短链脂肪酸检测技术作为常规检测项目开展的重要原因，其限制了短链脂肪酸在临床上的应用。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种粪便样本保存液，解决检测短链脂肪酸时粪便样本保存的难题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种粪便保存液，粪便保存液中的有效成分为乙腈。
本发明提供的粪便保存液可允许在室温下收集和储存粪便样本。使用此类保存液使参与者能够通过常规邮寄方式发送样品，而无需预约，冷藏或冷链运输。本发明的保存液可以很好地保持粪便样本中短链脂肪酸的含量稳定，使得短链脂肪酸的定量检测时采样变得更加简单，可常温保存及运输，易于普及推广。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述粪便保存液包含乙腈水溶液。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述粪便保存液含体积浓度为50％～70％的乙腈水溶液，例如含体积浓度为50％-60％的乙腈水溶液，例如含体积浓度为55％-70％的乙腈水溶液，例如含体积浓度为50％-58％的乙腈水溶液。在本发明应用较佳的实施方式中，上述粪便保存液含体积浓度为50％的乙腈水溶液。
本发明提供了一种试剂或试剂盒，试剂或试剂盒含有粪便保存液，粪便保存液的有效成分为乙腈。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述粪便保存液包含乙腈水溶液。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述粪便保存液含体积浓度为50％～70％的乙腈水溶液，例如含体积浓度为50％-60％的乙腈水溶液，例如含体积浓度为55％-70％的乙腈水溶液，例如含体积浓度为50％-58％的乙腈水溶液。在本发明应用较佳的实施方式中，上述粪便保存液含体积浓度为50％的乙腈水溶液。
本发明提供了乙腈在制备粪便保存液中的应用，粪便保存液中的有效成分为乙腈。
针对目前存在的检测短链脂肪酸时粪便样本保存的难题，发明人提供了一种新的粪便保存液。发明人发现，在粪便保存液中设置50％的乙腈能够有效、低负担的满足短链脂肪酸检测的粪便样本保存需求。
具体地，本发明提供的粪便保存液可允许在室温(RT)下收集和储存粪便样本。使用此类保存液使参与者能够通过常规邮寄方式发送样品，而无需预约、冷藏或冷链运输。本发明提供的保存液可以很好地保持粪便样本中短链脂肪酸的含量稳定，使得短链脂肪酸的定量检测时采样变得更加简单，可常温保存及运输，易于普及推广。
此外，本发明还评估了保存液作为参与者粪便友好型收集方法(常温条件收集存储)的可靠性和效率，与新鲜粪便及新鲜粪便立即于-80℃冷冻相比，采用含50％的乙腈的粪便保存液保存粪便样本后，样本中的短链脂肪酸(SCFA)含量相当，无显著差异。本发明的提出，表明了使用保存液在环境温度下收集和储存的潜力，这对于旨在通过使参与者可以通过邮寄发送样品的可能性来收集大样本的研究来说很方便，进而降低了短链脂肪酸准确定量的难度，为短链脂肪酸检测成为代谢疾病筛查、早期诊断、治疗监测和预后评估等临床应用提供了科学依据，可促进短链脂肪酸谱在临床的应用。
粪便样本中短链脂肪酸含量变化是由于粪便中有较多的微生物且微生物代谢速度非常快，进而影响短链脂肪酸含量，因此可使样本中的微生物代谢速度降低(如立即冷冻)或者灭活微生物。经过长期大量摸索和筛选，发明人意外地发现乙腈作为粪便样品的保存液，可以在常温下有效地保持粪便样品中各种短链脂肪酸的含量变化很小。实验结果表明乙腈溶液作为粪便保存液，对于检测粪便样品中短链脂肪酸的含量非常有利，在-80℃～50℃下，样本放置7天依然可保持样品中短链脂肪酸的含量稳定。发明人验证了在-80℃、4℃、30℃以及50℃下，样品中各SCFA的稳定性均优于无保存液立即冷冻至-80℃(金标准)的情况，因此本发明的乙腈溶液的保存效果均优于“金标准”，稳定性好，可将其作为一般参与者使用的保存液。
而且发明人发现，将粪便样本立即冷冻虽然可以使得样本中的微生物代谢速度降低，但仍有能产生短链脂肪酸的微生物能在低温代谢，而本发明提供的粪便保存液保存样本效果更佳。
在一种可选的实施方式中，粪便保存液还可含有其他的物质，例如防腐剂、稳定剂等其他物质，以起到延长保存期限等的作用。
在本发明应用较佳的实施方式中，粪便保存液包含乙腈水溶液；
在本发明应用较佳的实施方式中，粪便保存液含体积浓度为50～70％的乙腈水溶液。即粪便保存液中含50～70％的乙腈水溶液。
在本发明应用较佳的实施方式中，粪便保存液含体积浓度为50％的乙腈水溶液。
本发明还提供了一种保存粪便的方法，其包括如下步骤：将待保存的粪便样本与粪便保存液混合，粪便保存液中的有效成分为乙腈。
在本发明应用较佳的实施方式中，粪便保存液包含乙腈水溶液。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述粪便保存液含体积浓度为50％～70％的乙腈水溶液，例如含体积浓度为50％-60％的乙腈水溶液，例如含体积浓度为55％-70％的乙腈水溶液，例如含体积浓度为50％-58％的乙腈水溶液。在本发明应用较佳的实施方式中，上述粪便保存液含体积浓度为50％的乙腈水溶液。
在本发明应用较佳的实施方式中，每0.01-0.6g粪便样本保存于1.8ml粪便保存液中。在上述混合比例下，粪便样本中的短链脂肪酸含量保持较为稳定，保存效果较好。例如每0.01-0.5g粪便样本保存于1.8ml粪便保存液中；每0.02-0.08g粪便样本保存于1.8ml粪便保存液中；每0.04g-0.09g粪便样本保存于1.8ml粪便保存液中。
本发明还提供了一种乙腈在制备短链脂肪酸检测试剂或试剂盒中的应用，试剂或试剂盒中含有粪便保存液，粪便保存液中的有效成分为乙腈。
本发明提供的粪便保存液可以用于开发相应的短链脂肪酸检测试剂或试剂盒，用于对粪便样本进行保存。发明人评估了采用粪便保存液在常温条件收集存储粪便的可靠性和效率，采用本发明的粪便保存液保存粪便样品数天后，与新鲜粪便或新鲜粪便立即于-80℃冷冻保存数天相比，样品中短链脂肪酸(SCFA)含量没有显着差异。具体地，采用乙腈作为保存液的有效成分时，无论是在-80℃，还是4℃或30℃或50℃的保存温度下，保存时间7天之内，样品中各SCFA的稳定性均优于无保存液立即冷冻至-80℃的情况。本发明的提出，表明使用保存液在环境温度下收集和储存的潜力，可以用于制备相应的短链脂肪酸检测试剂或试剂盒。
在本发明应用较佳的实施方式中，粪便保存液包含乙腈水溶液。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述粪便保存液含体积浓度为50％～70％的乙腈水溶液，例如含体积浓度为50％-60％的乙腈水溶液，例如含体积浓度为55％-70％的乙腈水溶液，例如含体积浓度为50％-58％的乙腈水溶液。在本发明应用较佳的实施方式中，上述粪便保存液含体积浓度为50％的乙腈水溶液。
当粪便保存液中乙腈的体积浓度为50％时，样本中各SCFA的稳定性更高。无论是在-80℃，还是4℃或30℃或50℃的保存温度下，保存时间7天之内，样品中各SCFA的稳定性均优于无保存液立即冷冻至-80℃的情况。
在本发明应用较佳的实施方式中，短链脂肪酸包括不限于乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、2-甲基丁酸、戊酸、异戊酸、3-甲基戊酸、己酸和异己酸中的至少一种。
本发明还提供了一种用于短链脂肪酸检测的样本前处理的方法，其包括如下步骤：
(a)将待处理的含粪便保存液的粪便样本进行均质；
(b)离心后吸取上清液，用乙腈溶液进行稀释，混匀后(如旋涡振荡)离心；
(c)取上清液进行衍生化，离心；
(d)用含甲酸的乙腈溶液对步骤(c)离心获得的反应液进行稀释。
本发明提供的样本前处理方法可以极大程度上提高样本的耐稳定性。具体地，均质的目的是降低分散物的尺寸，提高分散物的均匀性。例如将粪便样本置于组织研磨仪中60Hz研磨1min。发明人发现通过衍生化之后的低温离心步骤以减缓衍生化反应步骤，采用含甲酸的乙腈溶液来终止衍生化反应，可以使得制备的样品溶液可在≤4℃条件下稳定放置15天，提高了样本的耐稳定性，有助于提高检测效率。
步骤(b)和(d)中的乙腈溶液为乙腈水溶液，且乙腈水溶液的体积浓度为50％～70％。
在本发明应用较佳的实施方式中，乙腈水溶液的体积浓度为50％。
步骤(b)中用乙腈溶液进行稀释至每1.8mL的乙腈溶液中含0.005～0.05g粪便样本；在上述稀释比例下，更便于对样本中的短链脂肪酸进行检测。
在本发明应用较佳的实施方式中，步骤(c)中的衍生化采用的衍生化试剂为3-硝基苯肼盐酸盐。
在本发明应用较佳的实施方式中，步骤(c)中离心是在0～10℃下离心，更在本发明应用较佳的实施方式中，在4℃下离心30-60s。通过降低样品温度以减缓衍生化反应步骤，为进一步的终止反应提供有利条件。
步骤(d)中甲酸的体积浓度为0.1％～0.5％。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述粪便保存液含体积浓度为50％～70％的乙腈水溶液，例如含体积浓度为50％-60％的乙腈水溶液，例如含体积浓度为55％-70％的乙腈水溶液，例如含体积浓度为50％-58％的乙腈水溶液。在本发明应用较佳的实施方式中，上述粪便保存液含体积浓度为50％的乙腈水溶液。
在本发明应用较佳的实施方式中，衍生化后的反应液的稀释倍数为15倍。通过稀释以满足上机的检测需求。
在本发明应用较佳的实施方式中，衍生化的反应条件是在40℃衍生30min。在该反应条件下，具有较好的衍生化效果。
本发明还提供了一种短链脂肪酸的检测方法，包括将待测样本采用上述的方法进行前处理，然后将前处理后的样本液进行短链脂肪酸的检测。
本发明还提供了一种样本液，其包括粪便和粪便保存液，粪便保存液包含乙醇水溶液。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述粪便保存液含体积浓度为50％～70％的乙腈水溶液，例如含体积浓度为50％-60％的乙腈水溶液，例如含体积浓度为55％-70％的乙腈水溶液，例如含体积浓度为50％-58％的乙腈水溶液。在本发明应用较佳的实施方式中，上述粪便保存液含体积浓度为50％的乙腈水溶液。一种实施方式中，每0.01-0.6g粪便样本保存于1.8ml粪便保存液中。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的含50％乙腈水溶液的粪便保存液可满足在室温下收集和储存粪便样本的需求。使用此类保存液的参与者能够通过常规邮寄方式发送样品，而无需预约、冷藏或冷链运输。本发明的保存液可以很好地保持粪便样本中短链脂肪酸的含量稳定，使得短链脂肪酸的定量检测时采样变得更加简单，可常温保存及运输，易于普及推广。
此外，本发明还评估了保存液作为参与者粪便友好型收集方法(常温条件收集存储)的可靠性和效率，发明人验证了50％的乙腈溶液作为粪便保存液、在-80℃、4℃、30℃以及50℃的保存温度下、样本放置7天的时间内，样品中各SCFA的稳定性均优于无保存液立即冷冻至-80℃(金标准)的情况。本发明的提出，表明了使用保存液在环境温度下收集和储存的潜力，这对于旨在通过使参与者可以通过邮寄发送样品的可能性来收集大样本的研究来说很方便，进而降低了短链脂肪酸准确定量的难度，为短链脂肪酸检测成为代谢疾病筛查、早期诊断、治疗监测和预后评估等临床应用提供了科学依据，可促进短链脂肪酸谱在临床的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为保存液效果考察的实验思路图；
图2为空白溶剂、空白样品、新鲜粪便样本和短链脂肪酸混合标准品的色谱峰叠图；
图3为空白溶剂和高浓度短链脂肪酸混合标准品叠图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
如下为本发明实施例所采用的试剂和设备。
表1试剂耗材表
续上表
表2设备参数表
| 仪器名称 | 型号 | 厂家 |
| 单道移液器 | 2.5μL | Eppendorf |
| 单道移液器 | 20μL | Eppendorf |
| 单道移液器 | 100μL | Eppendorf |
| 单道移液器 | 200μL | Eppendorf |
| 单道移液器 | 1000μL | Eppendorf |
| 涡旋震荡器QL-901 | VORTEX-QL-901 | Kylin-Bell |
| Thermomixer C | 5382FJ513719 | Eppendorf |
| Tissuelyser-48 | 19518003 | 上海净信 |
| 离心机 | 5424R | Eppendorf |
| 天平 | ME204E | 瑞士梅特勒 |
| 高效液相色谱仪 | LC-30 | Shimadzu |
| 质谱仪 | QTRAP 5500 | Sciex |
粪便样本立即于-80℃冷冻保存和新鲜粪便样本立即加保存液于不同时间不同温度保存的样本中的短链脂肪酸含量。评估了三个时间点(第0天，第3天和第6天)分别在-80℃、4℃、30℃、50℃的温度条件下保存样本对SCFA含量的影响。具体地，第0天即为现场收集的粪便样本，立刻制备用于短链脂肪酸检测分析的样本。
综合分析数据表明，50％的乙腈作为粪便保存液保存的粪便样本及立即冷冻的粪便样本与新鲜粪便样本中的SCFA含量结果相当，无显着差异，具体技术路线参照图1所示。
实施例1
本实施例对保存液的保存效果进行稳定性评价。
1.实验设计：
以一份新鲜粪便样本为供试品，分别称取14份约0.01g样品，具体信息见表3。
表3样品储存条件
2.检测不同保存条件下样品中各SCFA的含量。
(1)将S1～S6及S9～S12按样本制备方法处理制备样品进行分析，记录为第0天的数据；取样之后将10份样品及4份未添加保存液的新鲜粪便样本(S7、S8、S13、S14)按照表3所示的温度分别放置于冰箱(-80℃和4℃)或烘箱(30℃和50℃)中；
(2)第3天时取出S1～S7及S9～S13按样本制备方法制备样品进行分析，取样之后将12份样品放回原处；
(3)第6天时取出S1～S6、S8及S9～S12、S14按样本制备方法制备样品进行分析，取样之后将12份样品放回原处；
第0天、3天和6天检测的数据结果见表4，由表4可知，该样本主要检测到AA、PA、IBA、BA、IVA、VA六种短链脂肪酸。
表4样品短链脂肪酸含量结果
“-”表示本项目未检测到该物质，原因可能为样本中该物质含量低于仪器检出限或者样本中不含该物质；需要说明的是，第0天其实无保存温度，对于有保存液的实验组，第0天的实验组为取新鲜样品于保存液中，片刻之后即进行样本制备和分析，其标记的保存温度为取样后样品放置后的温度。
3.考察采用保存液的条件和不用保存液的条件下各样本中SCFA含量的变化和差异。
基于第0天的75％乙醇保存液组的6份样品(表4中编号1-6)和50％乙腈保存液组的4份样品(表4中编号7-10)的含量数据，计算了各SCFA含量的变异系数，如AA的变异系数CV(0d)是以表4中AA列下的编号1-10的含量数据计算的变异系数，所检测到的各SCFA的含量的CV值均小于15％，表明使用50％乙腈和使用75％乙醇溶解新鲜粪便测得的各SCFA含量无显著差别，两者数据可用同一标准比较。各样本中SCFA含量的稳定性差异结果参照表5所示。
表5考察50％乙腈保存液的稳定性差异
4.考察各温度条件下SCFA含量随保存时间的变化和差异分析。
(1)样本保存在75％(V/V)乙醇中，储存温度分别为-80℃、4℃、30℃和50℃时(如表6所示)：
7天内AA、PA、BA含量变异系数均＜7％；对照组AA、PA、BA含量变异系数分别为9.92％、12.38％、12.90％。
IBA、IVA、VA含量变异系数均＜19％；对照组IBA、IVA、VA含量变异系数分别为17.85％、24.26％、18.74％。
(2)样本保存在50％(V/V)乙腈中，储存温度分别为-80℃、4℃、30℃和50℃时(如表6所示)：
7天内AA、PA、BA含量变异系数均＜5％；对照组AA、PA、BA含量变异系数分别为6.81％、7.89％、6.84％。
IBA、IVA、VA含量变异系数均≤13.00％；对照组IBA、IVA、VA含量变异系数分别为11.66％、17.88％、16.11％。
样本保存在75％乙醇和50％乙腈中均符合样本稳定性要求，即(含量较高的短链脂肪酸)AA、PA、BA变异系数不得超过15％；(接近定量下限的短链脂肪酸)IBA、IVA、VA变异系数不得超过20％；(含量远低于定量下限的)2-MBA、3-MVA、ICA和CA变异系数不得超过30％，即当温度在-80℃～50℃范围内时，保存在75％乙醇或50％乙腈中放置7天的时间内样本中短链脂肪酸的含量稳定。且表6中“作为75％乙醇对照”的那组样品，无保存液立即冷冻至-80℃的情况下，样品中各SCFA的变异系数普遍高于采用75％乙醇保存液保存的样品；同样地，在50％乙腈保存液组和其对照组中也是采用50％乙腈保存液时，无论是在-80℃，还是4℃或30℃或50℃的保存温度下，样品中各SCFA的稳定性均优于无保存液立即冷冻至-80℃的情况，因此本发明的保存液75％乙醇、50％乙腈的保存效果均优于“金标准”。
表6不同温度保存的样本稳定性数据分析(CV)
说明：表6中的变异系数是基于在某一保存液中或无保存液时、在某一固定温度下、在第0、3、6天分别取样检测的含量数据，从而计算这3个时间点的变异系数，如75％乙醇保存液、-80℃保存温度下AA的变异系数是基于表4中编号1、12、24(分别对应第0、3、6天)的含量数据计算的。
变异系数(CV)的计算公式如下：
其中，分子是标准差，分母是平均值。
5.分析保存时间相同时不同的保存条件下样品中各SCFA含量的变异系数。
上述第4点的内容说明粪便样本7天内在-80℃～50℃温度范围内保存后，样本中的短链脂肪酸含量是稳定的。所以用同一天检测的各保存液的短链脂肪酸平均值与对照组含量数据比较，可以判断保存液保存的SCFA变化量与对照组的变化量相比，孰高孰低。
首先，表7中AVERAGE是指第0或3或6天该保存液的组别中各保存温度下所有样本的含量的平均值，如0d、75％乙醇组的AVERAGE值是表4中编号1-6的实验组的所测得的某一SCFA含量的平均值。
其次，CV(0d、3d、6d)是基于表7中各时间点(包括0天、3天、6天)各组别中SCFA的含量平均值和对照组含量结果计算的变异系数，比如AA的CV(0d、3d、6d)值是基于表格中“AA列”下的所有数值计算的变异系数。本实验中所检测的短链脂肪酸的CV(0d、3d、6d)值除了IVA之外，均小于15％，整体上来说本实验中的保存液75％乙醇、保存液50％乙腈、无保存液三者间的短链脂肪酸含量差别不大。且在第3天和第6天检测的各对照样品(新鲜粪便立即于-80℃冷冻)中各SCFA的含量，均比相同时间点的含75％乙醇保存液或50％乙腈保存液的样品中的各SCFA平均含量高，说明立即冷冻虽可使样本中的微生物代谢速度降低，但仍有能产生短链脂肪酸的微生物能在低温代谢，本发明提供的粪便保存液保存样本效果更佳。
表7保存不同时间样本稳定性数据分析(CV)
说明：IVA(异戊酸)的定量下限是0.1ug/ml(表13所示)，即约为0.02mg/g。表7中IVA(异戊酸)的平均含量或含量0.01或0.02mg/g，已经小于或等于定量下限了，所以其CV接近20％是可接受的。
实施例2
本实施例提供了样本中短链脂肪酸的含量检测方法。
1.样本制备方法。
(1)样本收集(收集管中含1粒金属研磨珠)：
①有保存液的样本：取约0.01g新鲜粪便或肠道内容物于1.8ml保存液中保存，上下颠倒数十下，保存液1为50％(V/V)乙腈水溶液，保存液2为75％(V/V)乙醇水溶液。
②无保存液的对照样本：直接收集粪便，立即于-80℃下冷冻保存。
③无保存液的新鲜粪便样本：直接收集粪便，即刻使用。
(2)样本前处理：
a)称取样品：对于无保存液的对照样本和无保存液的新鲜粪便样本，取约0.01g新鲜粪便或肠道内容物至2mL离心管中，加1.8mL 50％ACN，加入1粒金属研磨珠，含保存液样品可直接进行样品均质。
b)样本均质：①、②、③的样本均进行一样操作：将其置于组织研磨仪中60Hz研磨1min，而后置于4℃离心机中，13000rpm离心10min(4℃)。
c)样本衍生化：吸取上层清液20μL，分别加入10μL 200mM 3-NPH·HCl(3-硝基苯肼盐酸盐)、10μL 200mM EDC·HCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)、80μL50％(V/V)乙腈、50μL 7％Pyridine(吡啶)、1μL内标溶液(Acetic acid-13C2浓度为50μg/ml，Isobutyric acid-d6浓度为12μg/ml，Propionic acid-d5、Butanonic acid-d7、Isovaleric acid-d9、Valeric acid-d3、Caproic acid-d5浓度均为15μg/ml)，涡旋振荡1min，离心1min，于40℃衍生30min。
(3)样本稀释上机
于280μL 50％(V/V)乙腈水溶液加入20μL衍生化后的反应液，涡旋振荡30s，13000rpm离心10min(4℃)后吸取上层清液到进样瓶中，待LC-MS/MS分析。
2.对上述检测方法中的参数进行确定。
发明人比较了不同色谱柱如waters-ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm,2.1mmX 100mm)，Phenomenex(Kinetex 2.6μC18,100x3.00mm)，Phenomenex LC Column(1.7μmC1850x2.1mm)，最终综合色谱峰分离效果，分析时长选择Phenomenex(Kinetex 2.6μC18,100x3.00mm)。
3.系统参数参照表8和表9所示。
表8.LC 30参数
表9.SCIEX QTRAP 5500三重四极杆/线性离子阱串联质谱参数
实施例3
本实施例对实施例2提供的检测方法进行评估。
1.专属性
以新鲜粪便样品为供试品，以短链脂肪酸混合标准品为参比品，以50％(V/V)乙腈制备空白对照样品，50％(V/V)乙腈作为双空白进行检测，结果见图2。空白对照峰数据分析见表10和表11。由表10、表11与图2可知，50％(V/V)乙腈中仅有乙酸处有干扰峰，且其峰面积与定量下限峰面积之比为0.06％，空白对照与各短链脂肪酸定量下限的SA/IA比在1％～20％范围内，符合专属性可接受标准，干扰组分的响应不高于分析物定量下限响应的20％。
表10空白对照-50％(V/V)乙腈数据分析
注：SA为分析物峰面积(Sample Area)，IA为内标物的峰面积比值(InternalStandards Area)；“-”表示本项目未检测到该物质，原因可能为样本中该物质含量低于仪器检出限或者样本中不含该物质。
表11空白对照数据分析
| AA | PA | IBA | BA | 2-MBA | IVA | VA | 3-MVA | ICA | CA | |
| 空白样品SA/IA | 0.33 | 0.14 | 0.02 | 0.05 | 0.30 | 0.01 | 0.04 | 0.02 | 0.00 | 0.14 |
| 定量下限SA/IA | 1.61 | 1.38 | 0.70 | 2.36 | 1.86 | 0.32 | 0.72 | 0.23 | 0.41 | 2.84 |
| 百分比(％) | 20％ | 10％ | 2％ | 2％ | 16％ | 2％ | 5％ | 7％ | 1％ | 5％ |
注：SA/IA＝Sample Area/Internal Standards Area。
2.残留分析。
以空白溶剂50％(V/V)乙腈和高浓度短链脂肪酸混合标准品为供试品进行检测，序列开始前先进一针空白溶剂，检测完高浓度短链脂肪酸混合标准品后再进一针空白溶剂，以此来验证残留情况，结果见图3及表12。由表12与图3可知，第一针50％(V/V)乙腈中乙酸、丁酸处有干扰峰，其峰面积与定量下限峰面积之比分别为0.08％和0.04％，其余目标峰无干扰；第二针50％(V/V)乙腈中仅有乙酸处有干扰峰，其峰面积与定量下限峰面积之比为0.11％，其余目标峰无干扰，均＜2％，符合残留可接受标准，干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的20％。
表12残留数据分析。
3.线性
准确称取各短链脂肪酸对照品，用50％(V/V)乙腈溶解并定容，得到10种标准品的单储备液，浓度分别为AA 11.6mg/mL、PA 11.3mg/mL、IBA 11.3mg/mL、BA 10.1mg/mL、2-MBA10.1mg/mL、IVA 10.5mg/mL、VA 10.9mg/mL、3-MVA 12.1mg/mL、ICA 10.6mg/mL、CA 11.6mg/mL。分别取各标准品储备液适量，以50％乙腈(V/V)定容至10mL，得到混合标准品溶液，浓度分别为：AA 77.33μg/mL、PA 28.25μg/mL、IBA 18.83μg/mL、BA 30.30μg/mL、2-MBA 7.58μg/mL IVA 17.75μg/mL、VA 27.25μg/mL、3-MVA 30.25μg/mL、ICA 15.75μg/Ml、CA 24.17μg/mL，并采用50％(V/V)乙腈溶液逐级稀释，得到系列不同浓度的混合标准品溶液。每个浓度水平分别制备3份样品，各进样1针。以样品浓度为横坐标，以标准品与内标物的峰面积比值y为纵坐标，进行线性回归，得出线性决定系数R2，考察方法的线性。由表13可知，AA、PA、IBA、BA、2-MBA、IVA、VA、3-MVA、ICA和CA在对应的浓度范围内线性关系良好，相关系数均＞0.996，线性的考察符合可接受标准。
表13短链脂肪酸的线性方程、相关系数及定量范围。
| ID | Eqμation | Weighting | R2 | LLOQ | ULOQ |
| AA | y＝0.32790x+0.72644 | 1/x | 0.99733 | 3.02 | 77.33 |
| PA | y＝1.56216x+0.33984 | 1/x | 0.99785 | 0.74 | 28.25 |
| IBA | y＝1.29364x+0.24597 | 1/x | 0.99738 | 0.37 | 18.83 |
| BA | y＝1.24018x+0.51706 | 1/x | 0.99648 | 1.58 | 30.30 |
| 2-MBA | y＝3.55389x+0.45081 | 1/x | 0.99937 | 0.39 | 7.58 |
| IVA | y＝1.41211x+0.17910 | 1/x | 0.99842 | 0.10 | 15.75 |
| VA | y＝0.73881x+0.10776 | 1/x | 0.99913 | 0.85 | 27.25 |
| 3-MVA | y＝0.72697x+0.04758 | 1/x | 0.99943 | 0.24 | 30.25 |
| ICA | y＝1.49530x+0.08759 | 1/x | 0.99887 | 0.21 | 15.90 |
| CA | y＝1.34369x+1.02125 | 1/x | 0.99707 | 1.51 | 24.17 |
注：Eqμation为线性方程，R2为决定系数，Weighting为权重，LLOQ(μg/mL)和ULOQ(μg/mL)分别是定量下限和定量上限，两者范围内可准确定量。
4.稳定性
4.1样品溶液于≤4℃条件下的稳定性。
以混合标准品(混合标准品是含有这10种短链脂肪酸的标准样品，与真实样本的区别是无复杂基质干扰，仅以50％乙腈为溶剂)为供试品，分别制备高中低3个浓度水平的样品，样品在≤4℃条件下放置，分别在0时00分、0时09分、0时19分、0时28分、0时38分、0时48分、3时00分和6时00分各进样一针检测。计录样品中AA、PA、IBA、BA、2-MBA、VA、IVA、-3MVA、ICA及CA在≤4℃条件下放置0时00分、0时09分、0时19分、0时28分、0时38分、0时48分、3时和6时的浓度(ug/ml)，并计算各时间点检测到的浓度与0时00分检测到的浓度的相对差异百分比值(RD)如表14所示。
6小时内高浓度混合标准品中各SCFA的浓度相对差异百分比均≤7.1％；中浓度混合标准品中AA、CA于≤4℃条件下放置6时00分后与0时00分检测到的浓度相对差异百分比分别为16.2％、27.2％，其他SCFA的RD值均≤10.7％；低浓度混合标准品放置3时00分后AA、CA的RD分别为39.9％、38.0％，放置6时00分后AA、VA、CA的RD分别为87.7％、17.2％、72.6％，其余SCFA的RD值均≤11.4％。根据耐稳定性可接受标准：变异系数不得超过15％可知，高浓度样品溶液可在≤4℃条件下放置6h，中浓度样品溶液可在≤4℃条件下放置3h，低浓度样品需尽快检测分析。
RD(相对差异百分比，Relative Percent Difference)的计算公式：
对于本申请，计算公式为：(其他时间点测得的浓度-0时00分测得浓度)/0时00分测得浓度*100％
表14样品溶液于≤4℃条件下的稳定性数据分析
续上表
4.2样品溶液于≤-80℃条件下的稳定性
以混合标准品为供试品，分别制备高中低3个浓度水平的样品，0d进6针检测，样品在≤-80℃条件下放置1d、2d、3d、和6d，在各时间点取出后恢复至室温，放置于4℃进样器中各进3针检测。分别计算样品中AA、PA、IBA、BA、2MBA、VA、IVA、3MVA、ICA及CA在≤-80℃条件下放置0d、1d、2d、3d、和6d检测的SCFA浓度的平均值，并计算3个浓度水平7天的变异系数。
结果见表15，高、中、低3个浓度水平的样品溶液在≤-80℃条件下放置7天检测的浓度变异系数均小于6％。三组数据均满足稳定性可接受标准：变异系数不得超过15％。因此，样品溶液可在≤-80℃条件下稳定放置7天。
表15样品溶液于≤-80℃条件下的稳定性数据分析
5、准确度
取3份10μL20220524收集的新鲜粪便样本溶液分别加入适量短链脂肪酸标准溶液制备3个浓度水平进行加标回收实验。每个浓度水平分别制备3份样品，各进样1针。各自浓度水平的平均值代入线性方程得到的各浓度水平的浓度，以各短链脂肪酸加入量加上本底值作为理论值，结果见表16。
由表16可知，除低浓度水平的CA回收率为75％外(结合表14、表15和表16可知，样本中未检测到CA，低浓度水平加入的CA接近定量下限1.51μg/mL)，其他3个浓度水平的回收率均在95％～110％范围内，符合可接受标准。
表16准确度的回收率考察
6、重复性
新鲜粪便样本为供试品，分别制备6份的供试品溶液，各进样3针。重复性数据分析见表17。由表17可知，6份供试品溶液中的AA、PA、BA，IBA、IVA、VA，2-MBA、ICA的CV值分别为5.14％、4.44％、6.00％，14.66％、12.47％、9.28％，19.74％、11.39％；未检测到3-MVA和CA。满足重复性可接受标准，即AA、PA、BA变异系数不得超过15％；IBA、IVA、VA变异系数不得超过20％；2-MBA、3-MVA、ICA和CA变异系数不得超过30％。
表17重复性数据分析
实施例4样品检测方法中对取样量的要求
取一粪便样本为供试品，分别制备9份的供试品溶液(取样量分别约为0.01g、0.03g、0.09g各3份样品)，
取样量为0.01g供试品，样品制备方法如实施例2中“1.样本制备方法”所述，取样量为0.03g和0.09g的样品在均质后增加样本稀释步骤，使其比例不变(0.01g样品：1.8mL乙腈溶液)，其他不变。具体稀释及含量结果表18：
表18不同取样量时所测得的样品中SCFA的含量
注：“-”表示本项目未计算该短链脂肪酸CV值，原因为样本中该物质含量低于线性定量限。
由上表可知，该样本主要含有AA(乙酸)和PA(丙酸)，其他短链脂肪酸含量结果均低于定量限，故仅计算乙酸和丙酸的变异系数。由结果可知，取样量约0.01g～0.09g检测的乙酸和丙酸的含量变异系数均小于15％，表明在此取值范围短链脂肪酸含量无明显变化，即可将取样量范围定为0.01g～0.09g。
实施例5样本检测中对样本制备方法的优化
由实施例3中的4.1可知，为保证样品含量测定的准确性，样品溶液最好尽快检测，高浓度样品溶液可在≤4℃条件下放置6h，中浓度样品溶液可在≤4℃条件下放置3h，低浓度样品需尽快检测分析。该条件限制了检测效率，为解决该问题，发明人对样品制备方法进行优化，增加减缓衍生化反应步骤(衍生化反应后，低温离心1min)和终止衍生化反应步骤(稀释上机稀释液使用含0.1％甲酸的50％ACN)。
1.优化后的样品检测方法如下：
(1)样本收集(收集管中含1粒金属研磨珠)：
①有保存液的样本：取约一定量新鲜粪便或肠道内容物于保存液中保存，上下颠倒数十下，保存液1为50％ACN，保存液2为75％(V/V)乙醇水溶液。
②无保存液的对照样本：直接收集粪便，立即于-80℃下冷冻保存。
③无保存液的新鲜粪便样本：直接收集粪便，即刻使用。
(2)样本前处理：
a)称取样品：对于①无保存液的对照样本和②无保存液的新鲜粪便样本，称取一定重量样本(0.01g～0.09g)至2mL离心管中，加1mL 50％ACN，加入1粒金属研磨珠，含保存液样品可直接进行样品均质。
b)样本均质：①、②、③的样本均进行一样操作：将其置于组织研磨仪中60Hz研磨1min，而后置于4℃离心机中，13000rpm离心10min(4℃)。
c)样本稀释：吸取一定量上层清液，按比例稀释样本，稀释到每1.8mL 50％ACN溶液中含0.01g样本，涡旋振荡30s，离心30s。举例，对于取0.03g粪便的样本的操作为：取0.0298g样本，开始用1ml 50％ACN溶液溶解，均质后取100ul上清液，加入436uL 50％ACN(相当于是0.0298g+5.364mL 50％ACN)，最终为1.8mL 50％ACN溶液含0.01g样本。
d)衍生化：吸取上层清液20μL，分别加入10μL 200mM 3-NPH·HCl、10μL 200mMEDC·HCl、80μL 50％ACN、50μL 7％Pyridine、1μL内标溶液(Acetic acid-13C2浓度为50μg/ml，Isobutyric acid-d6浓度为12μg/ml，Propionic acid-d5、Butanonic acid-d7、Isovaleric acid-d9、Valeric acid-d3、Caproic acid-d5浓度均为15μg/ml)，涡旋振荡1min，离心1min，于40℃衍生30min，于4℃、13000rpm离心1min。
(3)稀释上机
先配置含0.1％甲酸的乙腈溶液：1mL甲酸溶于999mL体积浓度为50％的乙腈水溶液中，取该溶液280μLcan，加入20μL衍生化后的反应液，涡旋振荡30s，13000rpm离心10min(4℃)后吸取上层清液到进样瓶中，待LC-MS/MS分析。
2.比较优化后的样本制备方法和实施例2所示的样本制备方法。
分别按照实施例2中“1.样本制备方法”(下称“原方法”)和优化方法(如下)各制备四份粪便样品，结果见原方法和优化方法数据比较表19。由原方法和优化方法数据比较表19可知，四份粪便样本中IBA、2-MBA、IVA、VA、3-MVA、ICA、CA含量较低，浓度未达到定量下限，数据结果仅供参考，未计算原方法与优化方法差异；而样本中的AA、PA、BA含量较高，且优化方法检测的AA、PA、BA含量与原方法检测的AA、PA、BA的相对偏差范围为0.7％～6.5％(＜15％)，即两方法检测短链脂肪酸结果无显著性差异。由优化方法制备样品于≤4℃条件下的稳定性结果表20可知，优化方法制备的样品于≤4℃条件下放置15天的变异系数范围为0.2％～1.8％，根据耐稳定性可接受标准：变异系数不得超过15％可知，优化方法制备的样品溶液可在≤4℃条件下稳定放置15天。
表19实施例2的方法和优化后方法数据比较
注：A为原方法，B为优化方法；①为Calculated Concentration(ug/ml)，②为两方法的相对偏差，计算公式为：由于IBA、2-MBA、IVA、VA、3-MVA、ICA、CA的浓度结果未达到定量下限，数据结果仅供参考，故未计算两者差异。
表20优化后的方法制备样品于≤4℃条件下的各短链脂肪酸的稳定性。
注：①为Calculated Concentration(ug/ml)，②为优化方法第1天、第2天、第3天、第4天和第15天检测到的短链脂肪酸含量的变异系数值；由于IBA、2-MBA、IVA、VA、3-MVA、ICA、CA的浓度结果未达到定量下限，数据结果仅供参考，未计算其变异系数。
优化后的方法的线性评估。
根据实际样品中短链脂肪酸含量及表13结果，重新配置线性标准液(具体如下表21)，每个浓度水平分别制备3份样品，各进样1针。以样品浓度为横坐标，以标准品与内标物的峰面积比值y为纵坐标，进行线性回归，得出线性决定系数R2，考察优化方法的线性。由表22结果可知，AA、PA、IBA、BA、2-MBA、IVA、VA、3-MVA、ICA和CA在对应的浓度范围内线性关系良好，相关系数均＞0.997，线性的考察符合可接受标准。
表21标准样品浓度(μg/mL)
表22短链脂肪酸的线性方程、相关系数及定量范围(优化方法)
| ID | Eqμation | Weighting | R2 | LLOQ | ULOQ |
| AA | y＝0.36958x+0.20441 | 1/x | 0.99863 | 0.76 | 58.00 |
| PA | y＝1.48377x+0.05883 | 1/x | 0.99828 | 0.08 | 24.86 |
| IBA | y＝0.94915x+0.01194 | 1/x | 0.99914 | 0.04 | 11.30 |
| BA | y＝0.91172x+0.01787 | 1/x | 0.99941 | 0.08 | 24.24 |
| 2-MBA | y＝2.03649x+0.01879 | 1/x | 0.99896 | 0.03 | 10.10 |
| IVA | y＝0.86895x+0.00182 | 1/x | 0.99965 | 0.05 | 14.70 |
| VA | y＝0.69856x+0.01622 | 1/x | 0.99949 | 0.05 | 15.26 |
| 3-MVA | y＝0.70827x+-0.00102 | 1/x | 0.99940 | 0.03 | 9.68 |
| ICA | y＝0.70108x+0.00162 | 1/x | 0.99934 | 0.05 | 14.84 |
| CA | y＝2.87916x+0.38270 | 1/x | 0.99710 | 0.05 | 16.24 |
注：Eqμation为线性方程，R2为决定系数，Weighting为权重，LLOQ(μg/mL)和ULOQ(μg/mL)分别是定量下限和定量上限，两者范围内可准确定量。
综上所述，本发明测试了两种保存液，保存液可允许在室温(RT)下收集和储存粪便样本。使用此类保存液使参与者能够通过常规邮寄方式发送样品，而无需预约，冷藏或冷链运输。本发明还评估了保存液采用常温条件收集存储的可靠性和效率，与新鲜粪便及新鲜粪便立即于-80℃冷冻相比，SCFA含量没有显着差异。本发明的提出，凸显了使用保存液在环境温度下收集和储存的潜力，这对于旨在通过使参与者可以通过邮寄发送样品的可能性来收集大样本的研究来说很方便，进而降低了短链脂肪酸准确定量的难度，为短链脂肪酸检测成为代谢疾病筛查、早期诊断、治疗监测和预后评估等临床应用提供了科学依据，可促进短链脂肪酸谱在临床的应用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.乙腈在制备粪便保存液中的应用，其特征在于，所述粪便保存液为体积浓度为50%~70%的乙腈水溶液，所述粪便保存液被用于维持粪便样本中的短链脂肪酸含量的稳定。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述粪便保存液为体积浓度为50%的乙腈水溶液。
3.乙腈在制备短链脂肪酸检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂或试剂盒中含有粪便保存液；所述粪便保存液为体积浓度为50%~70%的乙腈水溶液，所述粪便保存液被用于维持粪便样本中的短链脂肪酸含量的稳定。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述粪便保存液为体积浓度为50%的乙腈水溶液。
5.一种保存粪便的方法，其特征在于，其包括如下步骤：将待保存的粪便样本与粪便保存液混合，所述粪便保存液为体积浓度为50%~70%的乙腈水溶液，所述粪便保存液被用于维持粪便样本中的短链脂肪酸含量的稳定。
6.根据权利要求5所述的保存粪便的方法，其特征在于，所述粪便保存液为体积浓度为50%的乙腈水溶液。
7.根据权利要求6所述的保存粪便的方法，其特征在于，每0.01-0.6g粪便样本保存于1.8ml粪便保存液中。
8.根据权利要求5所述的保存粪便的方法，其特征在于，在-4℃~50℃下进行粪便样本的保存。
9.根据权利要求8所述的保存粪便的方法，其特征在于，在4℃、25℃、30℃或50℃下进行粪便样本的保存。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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