IT201800005689A1

IT201800005689A1 - Profilo peptidomico maldi-tof delle feci per la diagnosi di malattie infiammatorie croniche dell’intestino

Info

Publication number: IT201800005689A1
Application number: IT102018000005689A
Authority: IT
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2018-05-24
Publication date: 2019-11-24
Also published as: EP3803408A1; WO2019224663A1

Description

PROFILO PEPTIDOMICO MALDI-TOF DELLE FECI PER LA DIAGNOSI DI MALATTIE INFIAMMATORIE CRONICHE DELL’INTESTINO

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce al settore medico, in particolare diagnostico. Più in particolare, si riferisce al settore della diagnosi delle malattie infiammatorie croniche dell’intestino.

SFONDO DELL’INVENZIONE

Le malattie infiammatorie croniche dell’intestino (MICI), come la malattia di Crohn (CD) e la retto-colite ulcerosa (UC), colpiscono tipicamente i giovani adulti, anche se nel 20-25% dei casi l’esordio può verificarsi in età pediatrica. Hanno una prevalenza di circa l’1% e un decorso cronico caratterizzato da frequenti complicanze stenosanti e/o fistolizzanti nella CD (16% dei pazienti), e aumentato rischio di carcinoma del colon-retto soprattutto nella UC. All’esordio, le manifestazioni cliniche per molto tempo possono essere aspecifiche (dolore addominale, diarrea, anemia, etc.) e comuni a patologie funzionali molto diffuse nella popolazione, quali la sindrome dell’intestino irritabile (IBS). Il trattamento delle MICI e delle loro complicanze è complesso, richiedendo un monitoraggio clinico-strumentale stretto dei pazienti, terapie mediche e spesso ripetuti interventi chirurgici.

La diagnosi di MICI è basata essenzialmente sul risultato di esami strumentali ed istologici.

I test di laboratorio che vengono impiegati per l’inquadramento diagnostico e il monitoraggio della malattia sono indici aspecifici di infiammazione e comprendono la proteina C reattiva (PCR) e la determinazione con metodi immunometrici della proteina infiammatoria Calprotectina nelle feci. Quest’ultima, considerata il migliore test ora disponibile per tali malattie, a fronte di una specificità pari a circa l’80%, ha

una sensibilità che non supera il 65%.

E’ quindi auspicabile la disponibilità di biomarcatori più sensibili e specifici al fine di supportare la diagnosi non invasiva di MICI e indirizzare il paziente verso l’esecuzione delle indagini strumentali necessarie per la conferma diagnostica.

Il processo infiammatorio intestinale delle MICI è caratterizzato da un’aumentata presenza nella mucosa non solo di cellule e proteine infiammatorie, ma anche di numerose proteasi, quali le metalloproteinasi, che possono catalizzare la frammentazione delle componenti proteiche in peptidi; questi ultimi possono essere veicolati direttamente e ad elevate concentrazioni nelle feci, che rappresentano pertanto una matrice idonea per la loro identificazione.

Pertanto, sono stati ricercati biomarcatori peptidici nel campione fecale.

Tuttavia, l’applicazione di tecniche di proteomica alla matrice fecale per l’identificazione di biomarcatori è stata limitata dalla natura complessa ed eterogenea della matrice, che consta della componente microbica commensale (20% circa, batteri, funghi, virus), di residui alimentari (30% circa, fibre vegetali, grassi, amidi), di proteine (10% circa), di composti inorganici (10-20%) e di variabili quantità di acqua (50-75%).

Le applicazioni descritte finora sono relative a metodi di tipo elettroforetico (SDS-PAGE e digestione triptica delle proteine) e tecniche di spettrometria di massa con l’utilizzo di strumentazioni quali Orbitrap, qTOF, QQQ.

In particolare, l’analisi mediante spettrometria di massa consente la ricerca di componenti ignote in un campione biologico ed è stata pertanto utilizzata per l’analisi delle feci.

Ad esempio, in alcuni studi l’analisi MALDI-TOF del campione fecale è stata utilizzata allo scopo di analizzare il microbioma o di rilevare la presenza di sangue

occulto.

Ad esempio, i lavori di Lin et al. (Lin SY, Shih SH, Wu DC, Lee YC, Wu CI, Lo LH, Shiea J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry for the detection of hemoglobins as the protein biomarkers for fecal occult blood. Rapid Commun Mass Spectrom.2007;21(20):3311-6) e di Wu Cl et al. (Wu CI, Tsai CC, Lu CC, Wu PC, Wu DC, Lin SY, Shiea J. Diagnosis of occult blood in human feces using matrix-assisted laser desorption ionization/time-of-flight mass spectrometry. Clin Chim Acta. 2007;384(1-2):86-92) riguardano l’utilizzo dell’analisi MALDI-TOF sul campione fecale allo scopo di ricercare le catene alfa e beta dell’emoglobina (range di massa 6-20 kDa), con l’obiettivo di diagnosticare la presenza di sangue occulto nelle feci. Lo stesso tipo di analisi allo stesso scopo viene descritta nel documento US20030232446. In questo tipo di analisi il campione fecale viene sottoposto a sonicazione e poi miscelato direttamente con la matrice MALDI.

Altri studi utilizzano la spettrometria di massa sul campione fecale allo scopo di studiare il microbioma intestinale. Ad esempio, i seguenti lavori: Melnik AV, da Silva RR, Hyde ER, Aksenov AA, Vargas F, Bouslimani A, Protsyuk I, Jarmusch AK, Tripathi A, Alexandrov T, Knight R, Dorrestein PC. Coupling Targeted and Untargeted Mass Spectrometry for Metabolome-Microbiome-Wide Association Studies of Human Fecal Samples. Anal Chem. 2017;89(14):7549-7559; He Y, Li H, Lu X, Stratton CW, Tang YW. Mass spectrometry biotyper system identifies enteric bacterial pathogens directly from colonies grown on selective stool culture media. J Clin Microbiol. 2010 Nov;48(11):3888-92; Perry MJ, Centurioni DA, Davis SW, Hannett GE, Musser KA, Egan CT. Implementing the Bruker MALDI Biotyper in the Public Health Laboratory for C. botulinum Neurotoxin Detection. Toxins (Basel).

2017 Mar 9;9(3). pii: E94. doi:10.3390/toxins9030094; Singhal N, Kumar M, Kanaujia PK, Virdi JS. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Front Microbiol.2015 Aug 5;6:791.

Lo stato dell’arte che utilizza questo tipo di tecniche per l’analisi delle feci è incentrato sull’ambito clinico del carcinoma del colon-retto e non su quello delle malattie infiammatorie croniche intestinali.

Ad esempio, il lavoro Ang CS, Baker MS, Nice EC. Mass Spectrometry-Based Analysis for the Discovery and Validation of Potential Colorectal Cancer Stool Biomarkers. Methods Enzymol. 2017;586:247-274 descrive metodi per l’analisi del proteoma fecale, allo scopo di identificare biomarcatori per il cancro al colon-retto. Rimane quindi nello stato dell’arte la necessità di una metodologia che consenta di diagnosticare in maniera non invasiva ma sufficientemente sensibile e specifica la presenza di una malattia infiammatoria cronica intestinale, in particolare tramite l’analisi del campione fecale.

E’ anche desiderato un metodo diagnostico in grado non solo di rivelare la presenza di una malattia infiammatoria cronica intestinale ma anche di distinguere le due forme principali di malattia infiammatoria cronica dell’intestino, cioè la malattia di Crohn e la rettocolite ulcerosa.

L’utilizzo della spettrometria di massa per l'analisi peptidomica presenta tuttavia ancora delle notevoli difficoltà.

Infatti, è particolarmente rilevante, anche a garanzia di una efficace traslazione clinica dei risultati, il protocollo di estrazione delle proteine/peptidi dalla matrice fecale, che deve essere semplice ed efficiente. Tale protocollo dovrebbe essere il più rapido possibile, dovrebbe limitare i processi di degradazione proteica ex vivo e seguire delle modalità che ne consentano la successiva automazione per

l'applicazione su larga scala. I protocolli di estrazione presenti in commercio o descritti in letteratura sono basati sull'impiego di tamponi di estrazione per proteine di peso molecolare generalmente superiore a 10 kDa e garantiscono la stabilità analitica per successive analisi immunometriche. La ricchezza di sali e detergenti normalmente presenti in questi tamponi li rende tuttavia non idonei per analisi di spettrometria di massa, per la possibile interferenza sui processi di ionizzazione. Gli studi di proteomica fecale, riportano diversi approcci preparativi del campione, ma nessuno è stato verificato per il possibile impiego per analisi peptidomica. Nessuno studio inoltre verifica la stabilità del campione, estremamente rilevante per questa tipologia di analisi dove i frammenti peptidici potrebbero essere il risultato della frammentazione ex vivo pre-analitica, dovuta all'azione di proteasi anche di origine batterica.

Vi è quindi anche la necessità di un procedimento di preparazione del campione che consenta un’analisi peptidomica efficace ed affidabile.

RIASSUNTO DELL’INVENZIONE

E’ stato ora trovato un metodo diagnostico basato sulla spettrometria di massa MALDI-TOF/MS che, effettuato su un campione fecale di un soggetto, consente la diagnosi di una malattia infiammatoria cronica intestinale.

In particolare, è stato scoperto un metodo che consente di ottenere un profilo peptidomico che permette di diagnosticare la presenza di una malattia infiammatoria cronica intestinale con elevata sensibilità e specificità.

Inoltre, è stato anche scoperto un metodo di preparazione del campione fecale da utilizzare per detta analisi MALDI-TOF/MS che consente di identificare tramite una singola analisi profili peptidomici in grado di distinguere i soggetti sani dai malati e nell’ambito dei malati di distinguere i soggetti con malattia di Crohn o rettocolite

ulcerosa.

E’ dunque un oggetto della presente invenzione un metodo per la diagnosi di una malattia infiammatoria cronica intestinale da un campione fecale precedentemente prelevato da un soggetto che comprende i seguenti passaggi:

a. preparazione dell’estratto fecale mediante i seguenti passaggi:

a1. risospendere un campione fecale in acqua, o in soluzione acquosa di solventi polari;

a2. agitare e successivamente centrifugare utilizzando una forza centrifuga uguale o superiore a 15000 RCF (Relative Centrifugal Field), quindi raccogliere il surnatante;

a3. aggiungere un solvente organico apolare in un rapporto fra estratto fecale e solvente in grado di precipitare il contenuto peptidico, rapporto ad esempio compreso fra 1:10 e 10:1 (v/v);

a4. agitare e lasciare a riposo;

a5. centrifugare utilizzando una forza centrifuga uguale o superiore a 20000 RCF e raccogliere il surnatante;

a6. far evaporare il solvente organico evitando il completo essiccamento; a7. aggiungere acqua o una soluzione acquosa di solventi polari, come ad esempio acido trifuoracetico o acido formico;

a8. diluire ulteriormente la soluzione così ottenuta in un intervallo compreso fra 1:2 e 1:10 con acqua o una soluzione acquosa di solventi polari;

b. desalificare l’estratto fecale;

c. miscelare il campione desalificato con una matrice MALDI;

d. eseguire una analisi di spettrometria di massa del tipo scelto fra: MALDI-TOF/MS, MALDI, TOF, MALDI-TOF, MALDI-TOF/MS-MS e MALDI-Q-TOF

in modalità positiva nell’intervallo di massa/carica (m/z) 1000-4000;

e. analizzare lo spettro di massa così ottenuto mediante identificazione di tutti i picchi compresi nel range m/z indicato nel passaggio precedente che presentino un rapporto segnale/rumore (S/N) superiore a 3;

f. diagnosi della presenza di una malattia infiammatoria cronica intestinale nel soggetto da cui è stato precedentemente prelevato il campione se lo spettro così ottenuto e analizzato contiene almeno un picco in corrispondenza di un valore di m/z ± 0,6 scelto fra i seguenti:

1002,3 ; 1006,4; 1019,5; 1029,5; 1030,5; 1035,4; 1048,5; 1049,4; 1051,8 ; 1055,4; 1056,6 ; 1059,5; 1062,4; 1068,6; 1070,5; 1071,4; 1073,5; 1085,4; 1087,5; 1093,5;

1096,4 ; 1098,5; 1099,4; 1108,5; 1113,4; 1117,5; 1121,5; 1127,5; 1132,5; 1134,5;

1137,5; 1139,5; 1148,6; 1160,4; 1161,5; 1166,5; 1169,6; 1172,4; 1177,4; 1179,5; 1186,7 ; 1189,4; 1192,5; 1195,5; 1198,6; 1200,6; 1202,7; 1203,5; 1208,5 ; 1210,5; 1216,8; 1224,5; 1230,8; 1234,8; 1239,6; 1247,5; 1248,7; 1249,5; 1250,7 ; 1255,6; 1256,8 ; 1257,7; 1263,6; 1267,6; 1270,7; 1272,8; 1274,6; 1286,6; 1288,7; 1293,6;

1294,5; 1296,8; 1298,5; 1303,5; 1311,7; 1312,5; 1313,4; 1316,5; 1317,7 ; 1322,8;

1323,5 ; 1329,5; 1336,7; 1339,8; 1342,5; 1345,5; 1355,8; 1358,6; 1360,6 ; 1362,5;

1366,7; 1367,8; 1368,6; 1370,6; 1376,7; 1377,7; 1378,6; 1381,6; 1385,6 ; 1389,8;

1393,8; 1405,6; 1407,5; 1409,6; 1419,6; 1421,5; 1424,7; 1425,6; 1428,6; 1429,6;

1431,6; 1432,6; 1444,7; 1447,6; 1450,1; 1463,7; 1465,7; 1466,7; 1472,7 ; 1478,5;

1479,6; 1485,5; 1486,5; 1487,7; 1492,8; 1493,6; 1494,7; 1507,7; 1511,7; 1520,7;

1522,6; 1523,6; 1524,5; 1529,7; 1536,6; 1537,5; 1540,7; 1563,7; 1566,7; 1567,5; 1572,6; 1576,7; 1587,7; 1596,7; 1599,8; 1605,8; 1612,6; 1617,8; 1619,7 ; 1620,7;

1623,7; 1634,6; 1639,8; 1640,6; 1646,7; 1647,7; 1652,0; 1659,7; 1665,7; 1669,7;

1676,6; 1680,8; 1682,8; 1685,8; 1687,8; 1691,7; 1693,7; 1697,8; 1698,8; 1699,7;

1702,8; 1704,8; 1705,6; 1711,6; 1715,8; 1721,8; 1724,7; 1735,7; 1740,7; 1742,6; 1746,7; 1757,8; 1759,7; 1773,9; 1777,9; 1785,8; 1790,8; 1795,8; 1800,7; 1802,8;

1805,7; 1806,8; 1807,7; 1810,8; 1811,8; 1817,8; 1821,7; 1823,7; 1824,7; 1830,6;

1833,8; 1863,8; 1872,7; 1873,8; 1877,9; 1898,9; 1904,8; 1912,9; 1920,6; 1925,9; 1931,8; 1934,6; 1938,8; 1947,9; 1957,8; 1958,6; 1967,9; 1972,8; 1973,8;

1981,8; 1985,8; 1986,9; 1992,8; 1997,9; 2005,8; 2010,6; 2014,8; 2020,0; 2020,8; 2028,7; 2030,7; 2031,9; 2040,0; 2044,9; 2048,9; 2054,8; 2058,8; 2071,8; 2084,8; 2085,9; 2089,9; 2096,8; 2099,9; 2100,9; 2121,8; 2125,8; 2128,9; 2135,8; 2141,8; 2147,8; 2171,9; 2172,9; 2181,8; 2184,8; 2185,9; 2189,8; 2195,9; 2200,9; 2212,8; 2224,1; 2225,0; 2228,1; 2230,1; 2233,8; 2240,8; 2244,0; 2270,8; 2282,1; 2290,1; 2300,6; 2312,9; 2315,9; 2317,0; 2322,9; 2324,4; 2329,8; 2334,1; 2342,9; 2350,1;

2372,8; 2377,9; 2383,9; 2385,9; 2411,0; 2426,0; 2427,1; 2428,1; 2443,1; 2451,1; 2462,0; 2463,1; 2479,1; 2488,1; 2501,1; 2506,2; 2511,9; 2526,1; 2529,0; 2535,1; 2544,0; 2595,0; 2607,2; 2617,0; 2618,2; 2633,0; 2638,1; 2645,3; 2650,2; 2666,1; 2714,4; 2729,2; 2766,3; 2787,2; 2802,4; 2805,8; 2847,2; 2848,9; 2853,0; 2867,2; 2906,1; 2934,4; 2938,4; 2970,5; 2981,2; 3008,3; 3085,4; 3097,3; 3103,3; 3123,2;

3136,3; 3140,4; 3147,3; 3195,2; 3210,5; 3232,1; 3299,5; 3313,3; 3317,5; 3326,5; 3379,3; 3394,7; 3428,3; 3430,3; 3464,2; 3465,2; 3473,6; 3482,4; 3526,1; 3556,3;

3618,3; 3638,3; 3693,4; 3733,8; 3821,8; 3827,6; 3930,9; 3942,7; 3959,1; 3975,1.

In particolare, quando lo spettro di massa viene ottenuto in maniera tale da rilevare le forme isotopiche di ciascun peptide, il valore di m/z indicato è quello del primo isotopo della serie, cioè il picco con m/z più basso della serie.

In una realizzazione preferita dell’invenzione, nel passaggio f) lo spettro contiene almeno un picco in corrispondenza di un valore di m/z ± 0,6 scelto fra i seguenti: 1035,4; 1099,4; 1121,5; 1245,6; 1263,6; 1286,0; 1293,6; 1294,5; 1323,5; 1329,5;

1366,7; 1367,8; 1376,7; 1405,6; 1419,6; 1428,6; 1466,7; 1639,8; 1693,7; 1697,8; 1724,7; 1773,9; 1805,7; 1810,8; 1863,8; 1957,8; 2020,0; 2096,8; 2171,9; 2185,9; 2212,8; 2228,1; 2282,1; 2315,9; 2342,9; 2529,0; 2934,4; 3821,8.

In una realizzazione dell’invenzione, il passaggio f) può essere sostituito dal passaggio f’) in cui viene diagnosticata l’assenza di una malattia infiammatoria cronica dell’intestino nel soggetto da cui è stato prelevato il campione se lo spettro non contiene nessuno dei picchi di cui al punto f), e contiene solo almeno un picco in corrispondenza di un valore m/z ± 0,6 scelto fra i seguenti: 1010,3; 1076,4; 1103,5; 1105,4; 1143,5; 1153,4; 1174,4; 1181,5; 1213,5; 1232,5; 1291,4; 1338,5; 1354,5; 1404,6; 1416,7; 1427,6; 1464,6; 1470,7; 1477,7; 1489,7; 1506,6; 1538,5; 1564,5; 1568,7; 1592,7; 1595,7; 1615,7; 1635,6; 1661,7; 1696,7; 1744,7; 1747,8; 1763,7; 1781,7; 1835,8; 1846,9; 1858,8; 1862,6; 1870,7; 1881,9; 1883,9; 1894,7; 1895,9; 1917,9; 1921,8; 1945,9; 2021,7; 2051,9; 2053,1; 2068,9; 2079,1; 2102,0; 2118,9; 2134,9; 2176,9; 2190,9; 2249,2; 2271,9; 2302,9; 2320,2; 2398,8; 2435,9; 2541,0; 2585,1; 2659,2; 2677,2; 2856,0; 2902,5; 2924,4; 3040,1; 3058,3; 3073,2; 3214,2; 3218,2; 3262,5; 3360,2; 3446,2; 3620,3; 3766,4.

In una realizzazione preferita dell’invenzione, nel passaggio f’) lo spettro contiene almeno un picco in corrispondenza di un valore di m/z ± 0,6 scelto fra i seguenti: 1010,3; 1076,4; 1103,5; 1105,4; 1143,5; 1153,4; 1213,5; 1232,5; 1416,7; 1464,6; 1846,9; 2053,1; 2541,0; 3218,2.

L’analisi degli spettri di massa ottenuti con il metodo sopra indicato ha permesso di osservare la totale assenza di peptidi nell’intervallo indagato nel 40% dei campioni dei soggetti sani. Nel rimanente 60% dei campioni dei soggetti sani lo spettro non contiene nessuno dei picchi elencati nel punto f), ma può contenere almeno un picco in corrispondenza di un valore m/z ± 0,6 scelto fra quelli sopra indicati nel

passaggio f’). In particolare, sono stati identificati alcuni picchi, fra quelli elencati nel passaggio f’), la cui presenza, in assenza di picchi elencati al punto f), è sufficiente a diagnosticare l’assenza di malattia infiammatoria cronica intestinale. Tali picchi sono i seguenti: 1010,3; 1076,4; 1103,5; 1105,4; 1143,5; 1153,4; 1213,5; 1232,5; 1416,7; 1464,6; 1846,9; 2053,1; 2541,0; 3218,2.

Nei campioni dei soggetti affetti da malattie infiammatorie croniche intestinali lo spettro contiene numerosi peptidi.

In particolare, sono stati identificati 359 picchi, corrispondenti ad altrettanti peptidi, associati esclusivamente alla presenza di malattia infiammatoria cronica dell’intestino ed assenti nei soggetti sani. L’analisi complessiva degli spettri di massa considerando tutti i 359 peptidi consente pertanto di raggiungere una sensibilità pari a 83% ed una specificità pari al 100%. Più in particolare, sono stati selezionati 38/359 peptidi diagnostici, rilevati nei soli pazienti con MICI. Il loro riscontro singolo o variamente combinato consente la diagnosi di MICI con una sensibilità dell’82% ed una specificità del 100%. La ricerca e l’identificazione di questo numero ristretto di picchi consente di semplificare l’analisi del risultato senza alterare la sensibilità e la specificità diagnostica.

Tale metodo presenta quindi una maggiore sensibilità e una maggiore specificità diagnostica rispetto ad altri biomarcatori fecali, in particolare la calprotectina fecale. Inoltre, un metodo di questo tipo ha un basso costo analitico, inferiore a quello della calprotectina fecale.

E’ stato inoltre verificato sperimentalmente che il metodo consente di ottenere lo stesso risultato a prescindere dalla strumentazione MALDI-TOF/MS utilizzata, garantendone quindi la riproducibilità. La riproducibilità analitica è stata verificata mediante l’analisi ripetuta dello stesso campione nella stessa seduta analitica

(riproducibilità intra-assay) o in sedute analitiche effettuate in giorni diversi (riproducibilità inter-assay), ottenendo in entrambi i casi lo stesso profilo peptidomico.

Infine, è stato trovato che gli spettri di massa ottenuti dai campioni fecali preparati secondo il passaggio a) del metodo di cui sopra e conservati a circa 4°C sono riproducibili nel tempo, confermando che tale preparazione consente di ottenere campioni che possono essere conservati prima dell’analisi. Ciò è sicuramente un vantaggio nel contesto dell’analisi clinica di laboratorio.

Detta malattia infiammatoria cronica intestinale è preferibilmente scelta fra rettocolite ulcerosa e malattia di Crohn. In alcuni pazienti con malattia infiammatoria cronica dell’intestino, le caratteristiche cliniche, radiologiche, endoscopiche, istologiche e gli indici biochimici non consentono di distinguere fra malattia di Crohn e rettocolite ulcerosa. Queste malattie infiammatorie croniche dell’intestino vengono pertanto definite come coliti non classificate.

In una realizzazione preferita dell’invenzione, nel passaggio f) se lo spettro contiene almeno un picco in corrispondenza di un valore di m/z ± 0,6 scelto fra i seguenti: 1002,3; 1006,4; 1029,5; 1030,5; 1035,4; 1055,4;1099,4; 1137,5; 1139,5; 1179,5; 1200,6; 1303,5; 1317,7; 1322,8; 1323,5; 1362,5; 1366,7; 1465,7; 1477,7; 1485,5; 1492,8; 1522,6; 1538,5; 1693,7; 1740,7; 1746,7; 2021,7; 2100,9; 2121,8; 2172,9; 2244; 2372,8; 2411,0; 3465,2, viene diagnosticata la malattia di Crohn.

In un’altra realizzazione preferita dell’invenzione, se lo spettro contiene almeno un picco in corrispondenza di un valore di m/z ± 0,6 scelto fra i seguenti: 1019,5; 1049,4; 1070,5; 1085,4; 1093,5; 1127,5; 1177,4; 1186,7; 1224,5; 1296,8; 1342,5; 1425,6; 1431,6; 1479,6; 1536,6; 1537,5; 1676,6; 1759,7; 1807,7; 1895,9; 2044,9; 2084,8; 2089,9; 2315,9; 2938,4, viene diagnosticata la rettocolite ulcerosa.

La diagnosi specifica di malattia di Crohn o rettocolite ulcerosa realizzata tramite l’identificazione dei suddetti picchi consente di ottenere una corretta classificazione dei pazienti nel 72% dei casi.

Il metodo dell’invenzione consente quindi vantaggiosamente non solo di distinguere i soggetti sani dai malati di MICI ma anche di identificare, all’interno di questi ultimi, i soggetti affetti da malattia di Crohn e i soggetti affetti da rettocolite ulcerosa.

E’ anche un oggetto della presente invenzione un apparato per eseguire il suddetto metodo.

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

Figure

Figura 1. Particolare dello spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto in modalità positiva reflectron illustrante nel range m/z 1210-1280 le forme isotopiche dei quattro peptidi rilevati. Per ciascun peptide l’unico valore di m/z considerato è quello corrispondente alla freccia.

Figura 2. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale quasi completamente privo di peptidi rilevabili.

Figura 3. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale caratterizzato da un numero limitato di peptidi rilevabili.

Figura 4. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale caratterizzato da un numero elevato di peptidi rilevabili.

Figura 5. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale caratterizzato da un numero elevato di peptidi rilevabili.

Figura 6. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un soggetto sano di controllo (n 100). Lo spettro non comprende nessuno dei 38 peptidi diagnostici. L’unico peptide segnalato (m/z 1464.6) è stato rilevato sia nei soggetti

sani (6/34) che nei pazienti con MICI (50/133).

Figura 7. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un soggetto sano di controllo (n 34). Lo spettro non comprende nessuno dei 38 peptidi diagnostici. L’unico peptide segnalato (m/z 1076.4) è stato rilevato sia nei soggetti sani (2/34) che nei pazienti con MICI (2/133).

Figura 8. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un paziente affetto da MICI (n 61). Viene evidenziato il peptide diagnostico rilevato (m/z 1294.6). Figura 9. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un paziente affetto da MICI (n 184). Viene evidenziato il peptide diagnostico rilevato (m/z 1724.7).

Figura 10. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un paziente affetto da MICI (n 35). Sono evidenziati i 2 peptidi diagnostici rilevati (m/z 1810.7 e 2212.7).

Figura 11. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un paziente affetto da MICI (n 52). Sono evidenziati i 3 peptidi diagnostici rilevati (m/z 1773.7, 2171.9 e 2281.8).

Figura 12. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un paziente affetto da MICI (n 131). Sono evidenziati i 3 peptidi diagnostici rilevati (m/z 1810.7, 1957.7 e 2185.9).

Figura 13. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un paziente affetto da MICI (n 2). Sono evidenziati i 4 peptidi diagnostici rilevati (m/z 1121.5, 1286.6, 1639.8 e 1863.8).

Figura 14. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un paziente affetto da MICI (n 78). Sono evidenziati i 4 peptidi diagnostici rilevati (m/z 1323.6, 1724.7, 1810.8 e 2185.9).

Figura 15. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un paziente affetto da MICI (n 147). Sono evidenziati i 4 peptidi diagnostici rilevati (m/z 1035.4, 1810.7, 1957.7 e 2185.9).

Figura 16. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un paziente affetto da malattia di Crohn (n 19). Sono evidenziati i peptidi che consentono di definire la presenza di malattia infiammatoria cronica dell’intestino (diagnosi di MICI: m/z 1121.5, 1428.6, 1810.7 e 2019.8) e il peptide che consente di classificare la malattia infiammatoria cronica dell’intestino rilevata come malattia di Crohn (m/z 2410.9).

Figura 17. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un paziente affetto da malattia di Crohn (n 73). Sono evidenziati i peptidi che consentono di definire la presenza di malattia infiammatoria cronica dell’intestino (diagnosi di MICI: m/z 1810.8) e di classificare la malattia infiammatoria cronica dell’intestino rilevata come malattia di Crohn (m/z 2100.9).

Figura 18. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un paziente affetto da rettocolite ulcerosa (n 36). Sono evidenziati i peptidi che consentono di definire la presenza di malattia infiammatoria cronica dell’intestino (diagnosi di MICI: m/z 2227.9) e di classificare la malattia infiammatoria cronica dell’intestino rilevata come rettocolite ulcerosa (m/z 1537.4).

Figura 19. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un paziente affetto da rettocolite ulcerosa (n 63). Sono evidenziati i peptidi che consentono di definire la presenza di malattia infiammatoria cronica dell’intestino (diagnosi di MICI: m/z 1810.8, 2185.9 e 2315.9) e di classificare la malattia infiammatoria cronica dell’intestino rilevata come rettocolite ulcerosa (m/z 2084.9).

Figura 20. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un soggetto

sano di controllo. Lo spettro di massa non evidenzia nessun peptide.

Figura 21. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un soggetto sano di controllo. Nello spettro di massa sono evidenti due peptidi (m/s 1213.7 e 1470.9) rilevati sia nei soggetti sani (7/34 e 1/34 rispettivamente) che nei pazienti affetti da MICI (74/133 e 4/133 rispettivamente).

Figura 22. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un soggetto sano di controllo. Nello spettro di massa sono evidenti due peptidi (m/s 1213.7 e 2119.1) rilevati sia nei soggetti sani (7/34 e 3/34 rispettivamente) che nei pazienti affetti da MICI (74/133 e 24/133 rispettivamente).

Figura 23. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un paziente affetto da MICI. Nello spettro di massa si rileva la presenza di un peptide diagnostico (m/z 1323.8).

Figura 24. Spettro MALDI-TOF/MS di un campione fecale ottenuto da un paziente affetto da MICI. Nello spettro di massa sono evidenti due peptidi diagnostici (m/z 1035.6 e 1323.7).

Figura 25. Riproducibilità intra-assay. Singole aliquote dello stesso campione (P2) sono state analizzate in quadruplicato nella stessa seduta analitica. Tutti i peptidi del campione (m/z 1143.5, 1416.8, 1464.7, 1587.8, 1870.8, 2119.0) sono stati rilevati in tutti gli spettri (riproducibilità 100%). Il peptide a m/z 1587.8 era presente nei soli pazienti con MICI (8/133). I rimanenti peptidi erano invece rilevabili con le seguenti rappresentatività, sia nei soggetti sani che nei soggetti patologici: m/z 1143.5 (2/34 e 53/133 rispettivamente), m/z 1416.8 (2/34 e 17/133, rispettivamente), m/z 1464.7 (6/34 e 50/133, rispettivamente), m/z 1870.8 (3/34 e 24/133) e m/z 2119.0 (3/34 e 24/133).

Figura 26. Riproducibilità inter-assay. Singole aliquote dello stesso campione (P4)

sono state analizzate in triplicato in sedute analitiche diverse. Tutti i peptidi del campione (m/z 1143.5, 1213.7, 1464.7, 1747.9, 1836.0, 1946.1 e 2119.0) sono stati rilevati in tutti gli spettri (riproducibilità 100%). Tutti i peptidi erano presenti sia nei soggetti sani che nei pazienti con MICI, con le seguenti rappresentatività: m/z 1143.5 (2/34 e 53/133, rispettivamente), m/z 1213.7 (7/34 e 74/133, rispettivamente), m/z 1464.7 (6/34 e 50/133, rispettivamente), m/z 1747.9 (2/34 e 15/133 rispettivamente), m/z 1836.0 (6/34 e 33/133, rispettivamente), m/z 1946.1 (4/34 e 46/133, rispettivamente), m/z 2119.0 (3/34 e 24/133, rispettivamente).

Figura 27. Algoritmo classificativo delle malattie infiammatorie croniche dell’intestino.

Definizioni

Nel contesto della presente invenzione, per MALDI-TOF o MALDI-TOF/MS o MALDI-TOF/MS-MS o MALDI-Q-TOF si intende una analisi effettuata mediante strumentazioni di spettrometria di massa che accoppiano la ionizzazione dei peptidi presenti nel campione tramite energia laser adsorbita dalla matrice alla rilevazione degli ioni tramite tempo di volo.

Nel contesto della presente invenzione, per spettro di massa si intende la rilevazione tramite tempo di volo di tutti gli ioni nel range di massa/carica (m/z) compreso fra 1000 e 4000 presenti nel campione dopo la ionizzazione dei peptidi tramite energia laser adsorbita dalla matrice.

Nel contesto della presente invenzione, per picco si intende un singolo ione dello spettro di massa con un rapporto segnale/rumore superiore a 3. Il picco comprende anche le forme isotopiche.

Nel contesto della presente invenzione, per malattie infiammatorie croniche dell’intestino si intendono le malattie che condividono un processo infiammatorio

cronico intestinale che può colpire qualsiasi tratto della mucosa del tratto gastroenterico (dalla bocca all’ano), ad esempio nella malattia di Crohn, oppure localizzarsi preferenzialmente alla mucosa del colon-retto, ad esempio nella rettocolite ulcerosa.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Il metodo della presente invenzione prevede i passaggi come definiti sopra e nelle rivendicazioni allegate.

Una descrizione più dettagliata del metodo dell’invenzione e di alcune sue realizzazioni preferite viene fornita nel seguito.

a) Preparazione dell’estratto fecale

In tale passaggio, il campione di feci, precedentemente ottenuto da un soggetto, viene risospeso in acqua in un rapporto peso/volume (p/v) preferibilmente compreso fra 10:1 e 10000:1, più preferibilmente in un rapporto campione fecale/acqua di 1000:1 (p/v) (ad esempio 100 mg di feci in 100 µL di acqua).

In alternativa, è possibile risospendere il campione di feci in soluzioni acquose contenenti solventi polari, come ad esempio acido trifluoroacetico (TFA) o acido formico (FA), ad una concentrazione preferibilmente compresa tra 0,01% e 10%. Per favorire il processo di estrazione, il materiale risospeso viene agitato, anche mediante l’utilizzo di sistemi automatici di agitazione, tipicamente per alcuni minuti. La soluzione fecale viene quindi centrifugata per un tempo generalmente compreso fra 10 e 30 minuti, utilizzando una forza centrifuga uguale o superiore a 15000 RCF. Se desiderato, il surnatante, che rappresenta l’estratto del campione fecale, può essere conservato congelato ad una temperatura preferibilmente compresa tra -15 e -80 ºC.

La fase analitica successiva prevede la precipitazione mediante l’impiego di solventi

organici, come ad esempio l’acetonitrile (ACN), dei peptidi a basso peso molecolare presenti nell’estratto fecale. L’estratto fecale può essere utilizzato a fresco subito dopo la sua preparazione oppure dopo lo scongelamento, nel caso in cui sia stato conservato congelato. I campioni sottoposti a scongelamento sono preferibilmente sottoposti ad ulteriore miscelazione, anche mediante l’utilizzo di sistemi automatici di agitazione, per almeno 5-30 secondi e centrifugati tipicamente per circa 5-25 minuti, utilizzando una forza centrifuga uguale o superiore a 15000 RCF, prima di recuperare il surnatante. Successivamente, all’estratto del campione fecale si aggiunge il solvente organico in un rapporto estratto fecale:solvente preferibilmente compreso fra 1:10 e 10:1, più preferibilmente in un rapporto di 1:1 (v/v). Il solvente organico può essere scelto fra solventi apolari in grado di precipitare il contenuto peptidico, quali ad esempio l’acetonitrile, l’acido tricloroacetico (TCA) e l’acetone. Possono essere usate anche miscele di diversi solventi apolari. In una realizzazione, ad una quantità di estratto del campione fecale tra 20 e 1000 µL si aggiunge acetonitrile puro mantenendo un rapporto fra estratto fecale e acetonitrile pari a 1:1 (v/v).

La soluzione ottenuta viene quindi agitata brevemente, anche mediante l’utilizzo di sistemi automatici di agitazione, e quindi lasciata a riposo preferibilmente per circa 20-60 minuti, durante i quali è consigliabile ripetere la procedura di agitazione per almeno tre volte.

Centrifugare quindi, tipicamente per almeno dieci minuti, utilizzando una forza centrifuga superiore a 20000 RCF. Il surnatante viene quindi preferibilmente trasferito in una provetta idonea per l’evaporazione di soluzioni contenenti solventi organici.

L’evaporazione può essere effettuata tramite qualunque metodica nota nel settore

per l’evaporazione di solventi organici. Ad esempio, si può utilizzare il flusso di azoto o evaporatori idonei. Vanno evitati gli evaporatori che prevedono il congelamento del campione. L’evaporazione va protratta fino ad esempio alla presenza di un volume residuo circa corrispondente ad una goccia, evitando il completo essicamento. Aggiungere in seguito un volume preferibilmente compreso tra 5 e 500 µL di acqua o di una soluzione acquosa contenente solventi polari in un range di concentrazione preferibilmente variabile da 0,01% a 10%, ad esempio una soluzione allo 0,1% di acido trifluoroacetico (TFA) o di acido formico. Prima della purificazione, i campioni vengono ulteriormente diluiti con acqua o soluzioni acquose contenenti solventi polari, ad esempio TFA 0,1%, preferibilmente mantenendo un rapporto v/v da 1:2 a 1:10.

b) Purificazione dell’estratto fecale

Si procede alla fase preparativa dell’analisi MALDI-TOF/MS tramite purificazione dell’estratto fecale.

La purificazione viene effettuata con desalificazione, tramite qualunque metodica nota nel settore.

La purificazione viene preferibilmente svolta su puntale da pipetta tipo Zip Tip, o in alternativa su fase solida utilizzando colonna C18 o C8. Entrambe queste metodiche sono note nel settore.

c) Miscelazione del campione purificato con una matrice MALDI

Si procede quindi alla preparazione della soluzione campione-matrice MALDI tramite la miscelazione del campione purificato con la matrice MALDI. Qualunque matrice MALDI idonea a generare dopo il desorbimento di ioni carichi di peptidi e proteine può essere utilizzata allo scopo. Tali matrici sono note e commercialmente disponibili. In una realizzazione preferita, tale matrice è l’acido alfa-ciano-4-

idrossicinnaminico (CHCA).

Una quantità variabile tra 0,2 e 5 µL di tale soluzione può essere depositata in un piatto MALDI con caratteristiche idrofobiche o idonee alla determinazione dei peptidi.

d) Analisi di spettrometria di massa

L’analisi di spettrometria di massa viene effettuata in modalità positiva, con condizioni strumentali idonee a consentire la valutazione delle singole cariche dei peptidi nel range di massa/carica (m/z) 1000-4000.

Preferibilmente, viene utilizzata una modalità che consente di evidenziare le forme isotopiche, più preferibilmente la modalità reflectron.

L’analisi di spettrometria di massa può essere realizzata con una tecnologia MALDI-TOF/MS, MALDI, TOF, MALDI-TOF, MALDI-TOF/MS-MS, o MALDI-Q-TOF. Preferibilmente, è eseguita una analisi MALDI-TOF/MS.

Qualunque strumento che consenta di eseguire una analisi MALDI-TOF/MS, MALDI, TOF, MALDI-TOF, MALDI-TOF/MS-MS o MALDI-Q-TOF nel range di massa/carica (m/z) 1000-4000 può essere utilizzato nella presente invenzione. e) Analisi dello spettro di massa

Lo spettro di massa viene tipicamente analizzato con software opportuno, generalmente un software fornito a corredo dello strumento o altri software noti per l’analisi di tali spettri. A titolo di esempio i software commerciali FlexAnalysis (Bruker Daltonics, Bremen, Germany), Data Explorer (Applied Biosystems) e il software libero mMass di Martin Strohalm (freeware) possono essere utilizzati.

Tramite detta analisi vengono identificati i peptidi compresi nell’intervallo di m/z da 1000 a 4000.

I picchi considerati significativamente diversi dal rumore analitico sono quelli che

presentano un rapporto segnale rumore (S/N) superiore a 3. L’analisi prevede quindi l’identificazione di tutti i picchi con le caratteristiche descritte (S/N>3).

Qualora lo spettro di massa rilevi le forme isotopiche di ciascun peptide, il valore di m/z identificato corrispondente al peptide selezionato è quello del primo isotopo della serie, cioè il picco con m/z più basso della serie. La figura 1 illustra un esempio di spettro di massa dove sono evidenti gli isotopi dei peptidi identificati.

f) Diagnosi

Lo spettro di massa così ottenuto e analizzato consente la diagnosi di malattie infiammatorie croniche intestinali, qualora venga identificato almeno un picco in corrispondenza dei valori m/z sopra elencati.

In particolare, il metodo dell’invenzione permette non solo la diagnosi di una MICI ma anche l’analisi differenziale fra Morbo di Chron e rettocolite ulcerosa, qualora venga identificato un picco fra quelli sopra indicati come diagnostici per tali patologie.

In una sua realizzazione, il metodo dell’invenzione consente anche di diagnosticare l’assenza di una malattia infiammatoria cronica intestinale, qualora non vengano identificati picchi fra quelli sopra indicati come diagnostici di MICI, ma vengano identificati solo picchi che rientrano fra quelli riscontrati anche nei soggetti sani, cioè i picchi sopra elencati al passaggio f’), in particolare i seguenti: 1010,3; 1076,4; 1103,5; 1105,4; 1143,5; 1153,4; 1213,5; 1232,5; 1416,7; 1464,6; 1846,9; 2043,1; 2541,0; 3218,2. Qualora, infatti, dall’analisi con il metodo dell’invenzione emergano solo uno o più picchi fra quelli appena elencati, e nessun picco fra quelli sopra indicati come diagnostici di MICI, può essere diagnosticata l’assenza di MICI.

Il metodo può essere eseguito su campioni fecali provenienti da soggetti che si sospetta abbiano una malattia infiammatoria cronica intestinale, ad esempio in

pazienti con una sintomatologia intestinale caratterizzata da dolore persistente, diarrea, calo ponderale o pazienti con sintomatologia addominale più aspecifica come per esempio in pazienti affetti da sindrome dell’intestino irritabile, oppure in pazienti con manifestazioni extra-intestinali compatibili con malassorbimento, ad esempio pazienti con anemia sideropenica oppure pazienti con ridotta mineralizzazione ossea.

E’ anche un oggetto dell’invenzione un apparato in grado di eseguire il metodo dell’invenzione. Tale apparato è in grado quindi di eseguire tutti i passaggi del metodo, dal campionamento delle feci fino all’analisi degli spettri e la conseguente elaborazione di una diagnosi.

Detto apparato può comprendere ad esempio: un dispositivo per la preparazione del campione, uno strumento per l’analisi di spettrometria di massa e un software per l’interpretazione del profilo peptidomico e conseguente visualizzazione del risultato classificativo scelto fra sano e malato di MICI, ed eventualmente anche di morbo di Chron o rettocolite ulcerosa.

Detto apparato è, in particolare, un apparato in grado di eseguire il campionamento e la diluizione delle feci garantendo un prestabilito rapporto peso/volume idoneo. Inoltre, detto apparato è preferibilmente caratterizzato da precisione quantitativa del materiale campionato, rapidità e semplicità d’uso, che possano garantire anche, ad esempio, il suo utilizzo da parte del paziente.

E’ anche un oggetto della presente invenzione un programma per computer per eseguire i passaggi e) ed f) del metodo dell’invenzione. In particolare, detto programma è in grado di elaborare gli spettri di massa ottenuti con il metodo dell’invenzione e di fornire una classificazione diagnostica. Tale classificazione può essere ad esempio basata sull’algoritmo rappresentato nella figura 27. Tale

programma può essere elaborato dall’esperto nel settore sulla base delle sue conoscenze generali nel settore e del metodo qui descritto. Ad esempio, il programma può comprendere i seguenti passaggi:

1. In caso di assenza di peptidi, diagnosi di assenza di malattia infiammatoria cronica intestinale.

2. In caso di presenza di peptidi: se lo spettro comprende almeno un valore m/z fra quelli sopra elencati al passaggio f’) e nessun valore m/z fra quelli elencati al passaggio f), diagnosi di assenza di malattia infiammatoria cronica intestinale; se lo spettro comprende almeno un valore m/z fra quelli elencati al passaggio f), diagnosi di malattia infiammatoria cronica intestinale.

3. In caso di diagnosi di malattia infiammatoria cronica intestinale, se lo spettro comprende almeno un valore m/z fra quelli sopra indicati come diagnostici della malattia di Crohn, classificazione della malattia infiammatoria cronica intestinale come malattia di Crohn; se lo spettro comprende almeno un valore m/z fra quelli sopra indicati come diagnostici di rettocolite ulcerosa, classificazione della malattia infiammatoria cronica intestinale come rettocolite ulcerosa.

Un supporto dati comprendente detto programma per computer e un processore su cui è caricato detto programma per computer sono anch’essi oggetti della presente invenzione.

Con il metodo dell’invenzione sono stati analizzati in una fase esplorativa preliminare 5 campioni fecali ottenuti da soggetti sani e 5 campioni fecali ottenuti da soggetti affetti da malattie infiammatorie croniche dell’intestino (MICI). L’analisi degli spettri di massa evidenziava la quasi totale assenza di peptidi nei campioni dei

soggetti sani e la presenza di numerosi peptidi nei campioni dei soggetti affetti da MICI.

Con l’obiettivo di verificare l’impatto della conservazione del campione sul profilo peptidomico, prima di estendere la valutazione del metodo in una seconda e più estesa serie di campioni, l’analisi MALDI-TOF/MS con il metodo sopra descritto è stata replicata in una serie di 8 campioni ottenuti da soggetti malati. I campioni fecali sono stati analizzati subito dopo la raccolta e dopo essere stati conservati a diversa temperatura (ambiente e 4°C) per diversi periodi di tempo (da 1 a 7 giorni) prima dell’analisi. Gli spettri di massa ottenuti dai campioni conservati a 4°C risultavano riproducibili nel tempo. Sulla base di questo risultato sono stati raccolti 33 campioni da soggetti sani di controllo e da 133 pazienti affetti da MICI. L’analisi dei risultati ottenuti dall’intera serie di campioni analizzati documentava spettri MALDI-TOF/MS di variabile complessità peptidomica. Venivano rilevati spettri quasi completamente privi di segnali peptidomici, spettri caratterizzati dalla presenza di pochi peptidi e spettri particolarmente arricchiti di peptidi.

Complessivamente sono stati rilevati 438 peptidi. Settantanove peptidi erano rilevabili nei soggetti sani.67/79 peptidi rilevati nei controlli erano rilevabili anche nei malati, mentre 359 peptidi erano associati esclusivamente alla presenza di MICI. Questi 359 peptidi, singolarmente o variamente combinati erano rilevabili in 111/133 pazienti con MICI. L’analisi complessiva degli spettri di massa considerando tutti i 359 peptidi consente pertanto di raggiungere una sensibilità pari a 83% ed una specificità pari al 100%.

Poiché molti peptidi erano fra loro correlati, l’analisi degli spettri è stata nuovamente effettuata scegliendo i peptidi più rappresentativi fra quelli fra loro correlati. Da tale analisi sono stati selezionati complessivamente 38 peptidi la cui presenza singola o

variamente combinata consente l’identificazione dei pazienti con MICI con una sensibilità pari all’82% ed una specificità del 100%.

Il sistema diagnostico è stato ulteriormente verificato mediante l’analisi MALDI-TOF/MS di una serie indipendente di soggetti sani di controllo (n=13) e di pazienti con MICI (n=25) utilizzando lo stesso metodo per la preparazione del campione, ma strumentazione MALDI-TOF/MS ottenuta da diverso fornitore. In nessun soggetto sano analizzato sono stati rilevati i peptidi diagnostici, ma solo i peptidi comuni. La presenza dei peptidi diagnostici è stata confermata nei pazienti.

La riproducibilità analitica è stata verificata mediante l’analisi ripetuta dello stesso campione nella stessa seduta analitica (riproducibilità intra-assay) o in sedute analitiche effettuate in giorni diversi (riproducibilità inter-assay), ottenendo in entrambi i casi lo stesso profilo peptidomico.

La presente invenzione sarà ora ulteriormente illustrata dai seguenti esempi.

ESEMPI

Materiali e metodi

I campioni di feci sono stati risospesi in H2O con un rapporto 1000:1 (p/v). Il materiale risospeso, dopo agitazione al vortex per alcuni minuti, è stato centrifugato per 30 minuti a 15000 RCF (Relative Centrifugal Field). Il surnatante, ripreso mediante pipetta, è stato congelato a -80 ºC per un massimo di un mese. Dopo scongelamento rapido (37°C per 15 minuti), i campioni sono stati passati al vortex per alcuni minuti, e quindi centrifugati per 15 minuti a 15000 RCF. 50 µL del surnatante sono stati miscelati con 50 µL acetonitrile (ACN) (1:1, v/v). La soluzione ottenuta è stata mantenuta a temperatura ambiente per 30 minuti, durante i quali è stata sottoposta ad intervalli regolari, ogni 10 minuti, ad agitazione mediante passaggio al vortex. La soluzione è stata quindi centrifugata per 15 minuti a 20000

RCF. Il surnatante è stato trasferito tramite pipetta in una provetta idonea per l’evaporazione di soluzioni contenenti solventi organici. L’evaporazione è stata effettuata mediante flusso di azoto per una durata tale da evitare il completo essicamento del campione e che mediamente era di circa 8-10 minuti. Al volume residuo, circa una goccia, sono stati aggiunti 30 µL di una soluzione allo 0.1% di acido trifluoroacetico (TFA). I campioni sono stati ulteriormente diluiti 1:5 con TFA 0,1% subito prima della purificazione mediante Zip Tip. L’eluato così ottenuto è stato miscelato 1:1 con la matrice MALDI acido alfa-ciano-4-idrossicinnaminico (CHCA). Una quantità pari ad 1 µL di tale soluzione è stata depositata in un piatto MALDI. L’analisi MALDI-TOF/MS è stata effettuata con due diverse strumentazioni MALDI: Ultraflex II instrument (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) e 4800 Plus MALDI TOF/TOF Analizer (AB Sciex) seguendo le specifiche strumentali di seguito riportate.

4800 Plus MALDI TOF/TOF Analizer: l’analisi MALDI-TOF/MS è stata effettuata in modalità positiva reflectron, con un campo elettrico di 20 kV di accelerazione e una griglia di 16 kV e un ritardo di estrazione di 450 nanosecondi. I singoli campioni sono stati analizzati dopo aver raccolto mediamente 1500 impulsi laser di intensità pari a 3500 unità arbitrarie.

Ultraflex II instrument: l’analisi MALDI-TOF/MS è stata effettuata in modalità positiva reflectron, con un campo elettrico di IS125 kV, IS221.65 kV, potenziale di reflectron 26.3 kV, tempo di estrazione 0 nanosecondi. I singoli campioni sono stati analizzati dopo aver raccolto mediamente 1500 impulsi laser di intensità pari a 50%.

Gli spettri di massa MALDI-TOF/MS sono stati analizzati mediante il software freeware mMASS V5.5.0 per windows, contemplando i peptidi compresi nel range di m/z da 1000 a 4000. Sono stati considerati picchi significativamente diversi dal

rumore analitico quelli che presentavano un rapporto segnale rumore (S/N) superiore a 3. In presenza di forme isotopiche di ciascun peptide, il valore di m/z identificato è stato quello corrispondente al primo isotopo della serie.

Con il metodo descritto è stata analizzata una serie preliminare di 10 campioni di feci (5 da soggetti sani e 5 da soggetti affetti da malattie infiammatorie croniche dell’intestino). L’analisi è stata quindi estesa ad una serie di 33 soggetti sani (21 maschi, 12 femmine, range di età 30-63 anni) e 133 pazienti affetti da malattie infiammatorie croniche dell’intestino (78 maschi, 55 femmine, range di età 17-83). I 133 pazienti affetti da malattia infiammatoria cronica dell’intestino comprendevano 79 soggetti affetti da malattia di Crohn, 47 affetti da rettocolite ulcerosa e 7 da colite non classificata. Le diagnosi sono sempre state definite da un team esperto sulla base del quadro clinico-biochimico e dei risultati delle indagini radiologiche, endoscopiche ed istologiche. L’analisi di spettrometria di massa di un campione fecale ottenuto da un paziente affetto da rettocolite ulcerosa non ha dato risultati interpretabili per la presenza di forme polimeriche interferenti. I campioni di feci ottenuti da un’ulteriore serie di 8 pazienti affetti da malattia infiammatoria cronica dell’intestino (3 maschi, 5 femmine, range di età 18-70 anni) sono stati utilizzati per la verifica dell’impatto della conservazione del campione sul risultato MALDI-TOF/MS. Ciascun campione, subito dopo la raccolta, è stato suddiviso in sette aliquote. Una aliquota è stata analizzata con il metodo descritto entro due ore dalla raccolta (campione di riferimento). Tre aliquote sono state conservate a temperatura ambiente, mentre le rimanenti tre sono state conservate a 4 °C per 1, 4 e 7 giorni prima dell’analisi. I campioni di feci ottenuti da un’ulteriore serie di 13 soggetti sani e 25 pazienti affetti da malattia infiammatoria cronica dell’intestino sono stati raccolti per la verifica della riproducibilità strumentale.

Tutti i soggetti arruolati hanno espresso il loro consenso informato per iscritto.

Risultati

Esempio 1 – Fase esplorativa preliminare

Con il metodo sopra descritto sono stati analizzati in una fase esplorativa preliminare 5 campioni fecali ottenuti da soggetti sani e 5 campioni fecali ottenuti da soggetti affetti da malattie infiammatorie croniche dell’intestino (MICI).

L’analisi degli spettri di massa evidenziava la quasi totale assenza di peptidi nei campioni dei soggetti sani e la presenza di numerosi peptidi nei campioni dei soggetti affetti da MICI.

Esempio 2 – Verifica dell’impatto della conservazione del campione sul profilo peptidomico

Con l’obiettivo di verificare l’impatto della conservazione del campione sul profilo peptidomico, prima di estendere la valutazione del nuovo metodo in una seconda e più estesa serie di campioni, l’analisi MALDI-TOF/MS con il metodo sopra descritto è stata replicata in una serie di 8 campioni ottenuti da soggetti malati.

I campioni fecali sono stati analizzati subito dopo la raccolta e dopo essere stati conservati a diversa temperatura (ambiente e 4°C) per diversi periodi di tempo (da 1 a 7 giorni) prima dell’analisi.

Gli spettri di massa ottenuti dai campioni conservati a 4°C risultavano riproducibili nel tempo.

Esempio 3 – Validazione del metodo su un numero più elevato di soggetti Sulla base del risultato sopra ottenuto sono stati raccolti 33 campioni da soggetti sani di controllo e da 133 pazienti affetti da MICI.

L’analisi dei risultati ottenuti dall’intera serie di campioni analizzati documentava spettri MALDI-TOF/MS di variabile complessità peptidomica.

Venivano rilevati spettri quasi completamente privi di segnali peptidomici (Figura 2), spettri caratterizzati dalla presenza di pochi peptidi (figura 3) e spettri particolarmente arricchiti di peptidi (figure 4 e 5).

Complessivamente sono stati rilevati 438 peptidi (Tabella 1). Settantanove peptidi erano rilevabili nei soggetti sani. 67/79 peptidi rilevati nei controlli erano rilevabili anche nei malati (segnale condiviso tra sani e pazienti nella colonna B della tabella 1), mentre 359 peptidi erano associati esclusivamente alla presenza di MICI. Questi 359 peptidi, singolarmente o variamente combinati erano rilevabili in 111/133 pazienti con MICI. L’analisi complessiva degli spettri di massa considerando tutti i 359 peptidi consente pertanto di raggiungere una sensibilità pari a 83% ed una specificità pari al 100%.

Tabella 1. La tabella riporta l’elenco dei peptidi rilevati (colonna A), la loro condivisione eventuale fra sani e malati (colonna B), il numero di soggetti sani (colonna C), il numero dei soggetti malati considerati complessivamente (colonna D) o singolarmente sulla base della diagnosi di malattia di Crohn (colonna E), di rettocolite ulcerosa (colonna F) o di colite non classificata (colonna G) nei quali sono stati rilevati individualmente i singoli peptidi.

Poiché molti peptidi erano fra loro correlati, l’analisi degli spettri è stata nuovamente effettuata scegliendo i peptidi più rappresentativi fra quelli fra loro correlati. Da tale analisi sono stati selezionati complessivamente 38 peptidi, riportati nella tabella 2, la cui presenza singola o variamente combinata consente l’identificazione dei pazienti con MICI con una sensibilità pari all’82% ed una specificità del 100%.

m/z

1035,4

1099,4

1121,5

1263,6

1245,6

1286,0

1293,6

1294,5 1323,5 1329,5 1366,7 1367,8 1376,7 1405,6 1419,6 1428,6 1466,7 1639,8 1693,7 1697,8 1724,7 1773,9 1805,7 1810,8 1863,8 1957,8 2020,0 2096,8 2171,9 2185,9 2212,8

2228,1

2282,1

2315,9

2342,9

2529,0

2934,4

3821,8

Tabella 2. La tabella riporta l’elenco dei principali 38 peptidi diagnostici, rilevati nei soli pazienti con MICI. Il loro riscontro singolo o variamente combinato consente la diagnosi di MICI con una sensibilità dell’82% ed una specificità del 100%.

Le figure 6-15 riportano spettri MALDI-TOF/MS ottenuti da due soggetti sani di controllo e da otto pazienti affetti da MICI. In ciascuno degli spettri riportati sono indicati solo i peptidi compresi fra i 38 selezionati come diagnostici (vedi tabella 2); questi non sono mai stati rilevati nei soggetti sani di controllo (figure 6 e 7), mentre la loro presenza in varia combinazione è stata rilevata nell’82% dei pazienti con MICI. Gli spettri di massa dei pazienti (Figure 8-15) evidenziano alcuni esempi di possibili combinazioni di peptidi utili per la diagnosi di malattie infiammatorie croniche dell’intestino.

Sono stati identificati anche dei peptidi diagnostici per la malattia di Crohn (tabella 3) e per la rettocolite ulcerosa (tabella 4).

m/z

1002,3

1006,4

1029,5 1030,5 1035,4 1055,4 1099,4 1137,5 1139,5 1179,5 1200,6 1303,5 1317,7 1322,8 1323,5 1362,5 1366,7 1465,7 1477,7 1485,5 1492,8 1522,6 1538,5 1693,7 1740,7 1746,7 2021,7

2100,9

2121,8

2172,9

2244

2372,8

2411

3465,2

Tabella 3. Picchi diagnostici per la malattia di Crohn.

m/z

1019,5

1049,4

1070,5

1085,4

1093,5

1127,5

1177,4

1186,7

1224,5

1296,8

1342,5

1425,6

1431,6

1479,6

1536,6

1537,5

1676,6

1759,7

1807,7

1895,9

2044,9

2084,8

2089,9

2315,9

2938,4

Tabella 4. Picchi diagnostici per la rettocolite ulcerosa.

Le figure 16-19 riportano spettri MALDI-TOF/MS ottenuti da due pazienti affetti da malattia di Crohn e da due pazienti affetti da rettocolite ulcerosa. In ciascuno degli spettri riportati sono indicati i peptidi compresi fra i 38 selezionati come diagnostici per MICI (vedi tabella 2), i peptidi compresi fra i 34 diagnostici per malattia di Crohn (vedi tabella 3) e i peptidi compresi fra i 25 diagnostici per rettocolite ulcerosa (vedi tabella 4).

Lo schema della Figura 27 illustra il flow-chart diagnostico basato sull’analisi MALDI-TOF/MS del campione fecale.

Esempio 4 - riproducibilità strumentale e analitica

Il sistema diagnostico è stato ulteriormente verificato mediante l’analisi MALDI-TOF/MS di una serie indipendente di soggetti sani di controllo (n=13) e di pazienti

con MICI (n=25) utilizzando lo stesso metodo per la preparazione del campione, ma strumentazione MALDI-TOF/MS ottenuta da diverso fornitore.

Le figure 20-24 riportano gli spettri di massa ottenuti da tre soggetti sani (figure 20-22) e da due soggetti affetti da MICI (figure 23-24).

In nessun soggetto sano analizzato sono stati rilevati i peptidi diagnostici (tabella 2), ma solo i peptidi comuni (tabella 1), e questi sono segnalati con il corrispondente m/z nelle figure 20-22.

La presenza dei peptidi diagnostici è stata confermata nei pazienti, come evidenziato nelle figure 23-24.

La riproducibilità analitica è stata verificata mediante l’analisi ripetuta dello stesso campione nella stessa seduta analitica (riproducibilità intra-assay) o in sedute analitiche effettuate in giorni diversi (riproducibilità inter-assay), ottenendo in entrambi i casi lo stesso profilo peptidomico (figure 25 e 26).

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Un metodo per la diagnosi di una malattia infiammatoria cronica intestinale da un campione fecale precedentemente prelevato da un soggetto che comprende i seguenti passaggi: a. preparazione dell’estratto fecale mediante i seguenti passaggi: a1. risospendere il campione fecale in acqua, o in soluzione acquosa di solventi polari; a2. agitare e successivamente centrifugare utilizzando una forza centrifuga uguale o superiore a 15000 RCF (Relative Centrifugal Field), quindi raccogliere il surnatante; a3. aggiungere un solvente organico apolare in un rapporto fra estratto fecale e solvente in grado di precipitare il contenuto peptidico, ad esempio un rapporto estratto fecale:solvente compreso fra 1:10 e 10:1 (v/v); a4. agitare e lasciare a riposo; a5. centrifugare utilizzando una forza centrifuga uguale o superiore a 20000 RCF e raccogliere il surnatante; a6. far evaporare il solvente organico evitando il completo essiccamento; a7. aggiungere acqua o una soluzione acquosa contenente solventi polari; a8. diluire ulteriormente la soluzione così ottenuta in un intervallo compreso fra 1:2 e 1:10 con acqua o una soluzione acquosa di solventi polari; b. desalificare l’estratto fecale; c. miscelare il campione desalificato con una matrice MALDI; d. eseguire una analisi di spettrometria di massa del tipo scelto fra: MALDI-TOF/MS, MALDI, TOF, MALDI-TOF, MALDI-TOF/MS-MS e MALDI-Q-TOF in modalità positiva nell’intervallo di massa/carica (m/z) 1000-4000; e. analizzare lo spettro di massa così ottenuto mediante identificazione di tutti i picchi compresi nel range m/z indicato nel passaggio precedente che presentano un rapporto segnale/rumore (S/N) superiore a 3; f. diagnosi della presenza di una malattia infiammatoria cronica intestinale nel soggetto da cui è stato precedentemente prelevato il campione se lo spettro così ottenuto e analizzato contiene almeno un picco in corrispondenza di un valore di m/z ± 0,6 scelto fra i seguenti: 1002,3 ; 1006,4; 1019,5; 1029,5; 1030,5; 1035,4; 1048,5; 1049,4; 1051,8 ; 1055,4; 1056,6; 1059,5; 1062,4; 1068,6; 1070,5; 1071,4; 1073,5; 1085,4; 1087,5; 1093,5; 1096,4; 1098,5; 1099,4; 1108,5; 1113,4; 1117,5; 1121,5; 1127,5; 1132,5; 1134,5; 1137,5; 1139,5; 1148,6; 1160,4; 1161,5; 1166,5; 1169,6; 1172,4; 1177,4; 1179,5; 1186,7; 1189,4; 1192,5; 1195,5; 1198,6; 1200,6; 1202,7; 1203,5; 1208,5; 1210,5; 1216,8; 1224,5; 1230,8; 1234,8; 1239,6; 1247,5; 1248,7; 1249,5; 1250,7; 1255,6; 1256,8; 1257,7; 1263,6; 1267,6; 1270,7; 1272,8; 1274,6; 1286,6; 1288,7; 1293,6; 1294,5; 1296,8; 1298,5; 1303,5; 1311,7; 1312,5; 1313,4; 1316,5; 1317,7; 1322,8; 1323,5 ; 1329,5; 1336,7; 1339,8; 1342,5; 1345,5; 1355,8; 1358,6; 1360,6 ;1362,5; 1366,7; 1367,8; 1368,6; 1370,6; 1376,7; 1377,7; 1378,6; 1381,6; 1385,6 ; 1389,8; 1393,8; 1405,6; 1407,5; 1409,6; 1419,6; 1421,5; 1424,7; 1425,6; 1428,6; 1429,6; 1431,6; 1432,6; 1444,7; 1447,6; 1450,1; 1463,7; 1465,7; 1466,7; 1472,7; 1478,5; 1479,6; 1485,5; 1486,5; 1487,7; 1492,8; 1493,6; 1494,7; 1507,7; 1511,7; 1520,7; 1522,6; 1523,6; 1524,5; 1529,7; 1536,6; 1537,5; 1540,7; 1563,7; 1566,7; 1567,5; 1572,6; 1576,7; 1587,7; 1596,7; 1599,8; 1605,8; 1612,6; 1617,8; 1619,7; 1620,7; 1623,7; 1634,6; 1639,8; 1640,6; 1646,7; 1647,7; 1652,0; 1659,7; 1665,7; 1669,7; 1676,6; 1680,8; 1682,8; 1685,8; 1687,8; 1691,7; 1693,7; 1697,8; 1698,8; 1699,7; 1702,8; 1704,8; 1705,6; 1711,6; 1715,8; 1721,8; 1724,7; 1735,7; 1740,7; 1742,6; 1746,7; 1757,8; 1759,7; 1773,9; 1777,9; 1785,8; 1790,8; 1795,8; 1800,7; 1802,8; 1805,7; 1806,8; 1807,7; 1810,8; 1811,8; 1817,8; 1821,7; 1823,7; 1824,7; 1830,6; 1833,8; 1863,8; 1872,7; 1873,8; 1877,9; 1898,9; 1904,8; 1912,9; 1920,6; 1925,9; 1931,8; 1934,6; 1938,8; 1947,9; 1957,8; 1958,6; 1967,9; 1972,8; 1973,8; 1981,8; 1985,8; 1986,9; 1992,8; 1997,9; 2005,8; 2010,6; 2014,8; 2020,0; 2020,8; 2028,7; 2030,7; 2031,9; 2040,0; 2044,9; 2048,9; 2054,8; 2058,8; 2071,8; 2084,8; 2085,9; 2089,9; 2096,8; 2099,9; 2100,9; 2121,8; 2125,8; 2128,9; 2135,8; 2141,8; 2147,8; 2171,9; 2172,9; 2181,8; 2184,8; 2185,9; 2189,8; 2195,9; 2200,9; 2212,8; 2224,1; 2225,0; 2228,1; 2230,1; 2233,8; 2240,8; 2244,0; 2270,8; 2282,1; 2290,1; 2300,6; 2312,9; 2315,9; 2317,0; 2322,9; 2324,4; 2329,8; 2334,1; 2342,9; 2350,1; 2372,8; 2377,9; 2383,9; 2385,9; 2411,0; 2426,0; 2427,1; 2428,1; 2443,1; 2451,1; 2462,0; 2463,1; 2479,1; 2488,1; 2501,1; 2506,2; 2511,9; 2526,1; 2529,0; 2535,1; 2544,0; 2595,0; 2607,2; 2617,0; 2618,2; 2633,0; 2638,1; 2645,3; 2650,2; 2666,1; 2714,4; 2729,2; 2766,3; 2787,2; 2802,4; 2805,8; 2847,2; 2848,9; 2853,0; 2867,2; 2906,1; 2934,4; 2938,4; 2970,5; 2981,2; 3008,3; 3085,4; 3097,3; 3103,3; 3123,2; 3136,3; 3140,4; 3147,3; 3195,2; 3210,5; 3232,1; 3299,5; 3313,3; 3317,5; 3326,5; 3379,3; 3394,7; 3428,3; 3430,3; 3464,2; 3465,2; 3473,6; 3482,4; 3526,1; 3556,3; 3618,3; 3638,3; 3693,4; 3733,8; 3821,8; 3827,6; 3930,9; 3942,7; 3959,1 ; 3975,1.
2. Il metodo secondo la rivendicazione 1 in cui nel passaggio f) viene diagnosticata una malattia infiammatoria cronica intestinale se lo spettro contiene almeno un picco in corrispondenza di un valore di m/z ± 0,6 scelto fra i seguenti: 1035,4; 1099,4; 1121,5; 1245,6; 1263,6; 1286,0; 1293,6; 1294,5; 1323,5; 1329,5; 1366,7; 1367,8; 1376,7; 1405,6; 1419,6; 1428,6; 1466,7; 1639,8; 1693,7; 1697,8; 1724,7; 1773,9; 1805,7; 1810,8; 1863,8; 1957,8; 2020,0; 2096,8; 2171,9; 2185,9; 2212,8; 2228,1; 2282,1; 2315,9; 2342,9; 2529,0; 2934,4; 3821,8.
3. Il metodo secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui detta malattia infiammatoria cronica intestinale è scelta fra rettocolite ulcerosa e malattia di Crohn.
4. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui nel passaggio f) se lo spettro contiene almeno un picco in corrispondenza di un valore di m/z ± 0,6 scelto fra i seguenti: 1002,3; 1006,4; 1029,5; 1030,5; 1035,4; 1055,4;1099,4; 1137,5; 1139,5; 1179,5; 1200,6; 1303,5; 1317,7; 1322,8; 1323,5; 1362,5; 1366,7; 1465,7; 1477,7; 1485,5; 1492,8; 1522,6; 1538,5; 1693,7; 1740,7; 1746,7; 2021,7; 2100,9; 2121,8; 2172,9; 2244,0; 2372,8; 2411,0; 3465,2, viene diagnosticata la malattia di Crohn.
5. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui nel passaggio f) se lo spettro contiene almeno un picco in corrispondenza di un valore di m/z ± 0,6 scelto fra i seguenti: 1019,5; 1049,4; 1070,5; 1085,4; 1093,5; 1127,5; 1177,4; 1186,7; 1224,5; 1296,8; 1342,5; 1425,6; 1431,6; 1479,6; 1536,6; 1537,5; 1676,6; 1759,7; 1807,7; 1895,9; 2044,9; 2084,8; 2089,9; 2315,9; 2938,4, viene diagnosticata la rettocolite ulcerosa.
6. Il metodo secondo la rivendicazione 1 in cui il passaggio f) è sostituito dal passaggio f’), in cui se lo spettro non contiene nessuno dei picchi di cui al passaggio f) e contiene solo almeno un picco in corrispondenza di un valore di m/z ± 0,6 scelto fra i seguenti: 1010,3; 1076,4; 1103,5; 1105,4; 1143,5; 1153,4; 1174,4; 1181,5; 1213,5; 1232,5; 1291,4; 1338,5; 1354,5; 1404,6; 1416,7; 1427,6; 1464,6; 1470,7; 1477,7; 1489,7; 1506,6; 1538,5; 1564,5; 1568,7;1592,7; 1595,7; 1615,7; 1635,6; 1661,7; 1696,7; 1744,7; 1747,8; 1763,7; 1781,7; 1835,8; 1846,9; 1858,8; 1862,6; 1870,7; 1881,9; 1883,9; 1894,7; 1895,9; 1917,9; 1921,8; 1945,9; 2021,7; 2051,9; 2053,1; 2068,9; 2079,1; 2102,0; 2118,9; 2134,9; 2176,9; 2190,9; 2249,2; 2271,9; 2302,9; 2320,2; 2398,8; 2435,9; 2541,0; 2585,1; 2659,2; 2677,2; 2856,0; 2902,5; 2924,4; 3040,1; 3058,3; 3073,2; 3214,2; 3218,2; 3360,2; 3262,5; 3446,2; 3620,3; 3766,4 viene diagnosticata l’assenza di una malattia infiammatoria cronica intestinale nel soggetto da cui è stato prelevato il campione.
7. Il metodo secondo la rivendicazione 6 in cui nel passaggio f’) lo spettro contiene almeno un picco in corrispondenza di un valore di m/z ± 0,6 scelto fra i seguenti: 1010,3; 1076,4; 1103,5; 1105,4; 1143,5; 1153,4; 1213,5; 1232,5; 1416,7; 1464,6; 1846,9; 2043,1; 2541,0; 3218,2.
8. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto solvente polare è scelto fra acido trifluoroacetico (TFA) e acido formico (FA).
9. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto solvente organico è acetonitrile (ACN).
10. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, che comprende un ulteriore passaggio a2’ in cui il surnatante viene conservato congelato ad una temperatura preferibilmente compresa tra -15 e -80 ºC e prima del passaggio a3 viene sottoposto a scongelamento, seguito da ulteriore miscelazione e centrifugazione utilizzando una forza centrifuga uguale o superiore a 15000 RCF.
11. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la desalificazione nel passaggio b) viene svolta su puntale da pipetta tipo Zip Tip, o, in alternativa, su fase solida utilizzando colonna C18 o C8.
12. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta matrice MALDI è l’acido alfa-ciano-4-idrossicinnaminico (CHCA).
13. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui nel passaggio d) la spettrometria di massa è del tipo MALDI-TOF/MS.
14. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui nel passaggio d) viene utilizzata una modalità che consente di evidenziare le forme isotopiche, preferibilmente la modalità reflectron.
15. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto soggetto è un soggetto che si sospetta abbia una malattia infiammatoria cronica intestinale, ad esempio un paziente con una sintomatologia intestinale caratterizzata da dolore persistente, diarrea, calo ponderale o un paziente con sintomatologia addominale più aspecifica, come ad esempio un paziente affetto da sindrome dell’intestino irritabile, oppure un paziente con manifestazioni extra-intestinali compatibili con malassorbimento, ad esempio un paziente con anemia sideropenica oppure un paziente con ridotta mineralizzazione ossea.
16. Un apparato in grado di eseguire il metodo di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15.
17. L’apparato secondo la rivendicazione 16, che è in grado di eseguire il campionamento e la diluizione delle feci garantendo un prestabilito rapporto peso/volume idoneo.
18. Un programma per computer in grado di eseguire i passaggi e) ed f) del metodo di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15.
19. Il programma per computer secondo la rivendicazione 18, che è in grado di elaborare gli spettri di massa ottenuti con detto metodo e di fornire una classificazione diagnostica.
20. Un supporto dati comprendente il programma per computer di una qualsiasi delle rivendicazioni 18-19.
21. Un processore su cui è caricato il programma per computer di una qualsiasi delle rivendicazioni 18-19.