TWI721462B - 非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法、非酒精性脂肪肝疾病檢測用試劑盒和非酒精性脂肪肝疾病檢測用生物標記 - Google Patents

Abstract

非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法包括：取得源自哺乳動物的體液的試樣；以及對試樣中的選自由2-胺基己二酸、2-氧代己酸、2-氧代戊二酸、丙胺酸、麩胺酸、酪胺酸、乳酸、尿酸、纈胺酸、丙酮酸、苯丙胺酸、及脯胺酸所組成的群組中的至少一種分子進行檢測。

Description

非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法、非酒精性脂肪肝疾病檢測用試劑盒和非酒精性脂肪肝疾病檢測用生物標記

本發明是有關於一種非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法、非酒精性脂肪肝疾病檢測用試劑盒和非酒精性脂肪肝疾病檢測用生物標記。

非酒精性脂肪肝疾病(nonalcoholic fatty liver disease；NAFLD)為包括僅確認到脂肪沈積且預後良好的肝疾病即單純性脂肪肝(simple steatosis；SS)、與引發高度纖維化或肝癌的進行性非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis；NASH)的疾病概念(參照非專利文獻1)。SS存在引起NASH的情況等，若進行則引起嚴重的疾病，因此重要的是於更早的階段、或有可能的話於疾病發病之前進行包含SS的NAFLD的發病預測。

然而，目前並未確立預測NAFLD的發病的診斷方法。作為掌握SS的篩選或程度的方法，使用腹部超音波檢查或電腦斷層掃描(computed tomography，CT)、核磁共振造影(Magnetic Resonance Imaging，MRI)等圖像檢查。NASH的診斷是以生檢為標準的方法。該肝臟生檢為侵入性的，就安全性與經濟性的方面而言，並不適合於篩選。

可利用簡便且非侵入性的方法來診斷NAFLD及NASH的生物標記的開發是目前最引人注目的領域之一，但並未確立可於臨床現場有效地活用的生物標記。近年來，藉由可網羅性地分析大量蛋白質的蛋白體學(proteomics)或代謝體學(metabolomics)的技術的進步，正進行使用該些技術的NAFLD患者的血清等中的生物標記的探索(參照非專利文獻2)。

於非專利文獻3及專利文獻1中，報告有以NASH等的患者、與健全者為對象並對血漿中的脂質代謝物進行定量的結果。於非專利文獻4中，報告有以各種肝臟疾病患者、與健全者等為對象並對雙肽(dipeptide)等進行定量的結果。於專利文獻2中，報告有以投予了乙醯胺酚(acetaminophen)的NASH等的患者及健全者為對象並對血漿中的乙醯胺酚-葡萄糖醛酸苷(glucuronide)進行定量的結果。於專利文獻3中，報告有以NAFLD患者、與健全者為對象並對血清中的源自激肽原(kininogen)的肽(peptide)進行定量的結果。於專利文獻4中，報告有以各種肝臟疾病患者、與健全者為對象並對血清中的可溶性LR11進行定量的結果。

[現有技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本專利特表2010-500566號公報

[專利文獻2]日本專利特表2012-504629號公報

[專利文獻3]國際公開第2009/051259號

[專利文獻4]日本專利特開2014-167446號公報

[非專利文獻]

[非專利文獻1]納加卡拉薩尼(Naga Chalasani)，左巴爾尤諾西(Zobair Younossi)，喬爾E.拉文(Joel E.Lavine)，安娜梅迪爾(Anna Mae Diehl)，伊麗莎白M.布倫特(Elizabeth M.Brunt)，肯尼斯庫西(Kenneth Cusi)，邁克爾查爾頓(Michael Charlton)，阿倫J.桑亞爾(Arun J.Sanyal)「非酒精性脂肪肝疾病的診斷及管理：美國胃腸病協會、美國肝疾病研究協會及美國胃腸病學院實踐指南(The diagnosis and management of non-alcoholic fatty liver disease：practice guideline by the American Gastroenterological Association,American Association for the Study of Liver Diseases,and American College of Gastroenterology)」胃腸病學(Gastroenterology)，(美國)，美國胃腸病協會(American Gastroenterological Association)，2012年6月，第142卷，第7期，p.1592-1609

[非專利文獻2]馬克-伊曼紐爾杜馬(Marc-Emmanuel Dumas)，詹姆斯金羅斯(James Kinross)，傑瑞米K.尼克爾森(Jeremy K.Nicholson)「瞭解代謝症候群及脂肪肝疾病的代謝表型與系統生物學方法(Metabolic Phenotyping and Systems Biology Approaches to Understanding Metabolic Syndrome and Fatty Liver Disease.)」胃腸病學(Gastroenterology)，(美國)，美國胃腸病協會(American Gastroenterological Association)，2014年1月，第 146卷，第1期，p.46-62

[非專利文獻3]普尼特普里(Puneet Puri)，米歇爾M.維斯特(Michelle M.Wiest)，張溫潘(Onpan Cheung)，法里德林米沙西(Faridoddin Mirshahi)，卡羅爾薩金特(Carol Sargeant)，閔海基(Hae-Ki Min)，梅麗莎J.孔托(Melissa J.Contos)，理查德K.斯特林(Richard K.Sterling)，邁克爾福克斯(Michael Fuchs)，周慧萍(Huiping Zhou)，史蒂文M.沃特金斯(Steven M.Watkins)，及阿倫J.桑亞爾(Arun J.Sanyal)1.「非酒精性脂肪性肝炎的血脂特性(The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis.)」肝臟病學(Hepatology)，(美國)，美國肝疾病研究協會(American Association for the Study of Liver Diseases)，2009年12月，第50卷，第6期，p.1827-1838

[非專利文獻4]曾我朋義(Tomoyoshi Soga)，杉本昌宏(Masahiro Sugimoto)，本間雅(Masashi Honma)，森理代(Masayo Mori)，五十嵐香織(Kaori Igarashi)，柏倉香住(Kasumi Kashikura)，池田五月(Satsuki Ikeda)，平山明由(Akiyoshi Hirayama)，山本武人(Takehito Yamamoto)，吉田晴彥(Haruhiko Yoshida)，大塚基之(Motoyuki Otsuka)，辻省次(Shoji Tsuji)，矢富裕(Yutaka Yatomi)，櫻川忠之(Tadayuki Sakuragawa)，渡邊久芳(Hisayoshi Watanabe)，二瓶幸榮(Kouei Nihei)，齋藤貴史(Takafumi Saito)，河田純男(Sumio Kawata)，鈴木洋史(Hiroshi Suzuki)，富田勝(Masaru Tomita)，末松誠(Makoto Suematsu.) 「血清代謝組學揭示γ-麩胺醯二肽作為區分不同形式的肝疾病的生物標誌(Serum metabolomics reveals γ-glutamyl dipeptides as biomarkers for discrimination among different forms of liver disease.)」肝臟病學期刊(Journal of Hepatology)，(荷蘭王國)，歐洲肝臟研究協會(European Association of Study of the Liver)，2011年10月，第55卷，第4期，p.896-905

該些報告中，針對NAFLD的被試驗者的數量為數十人以下，並不多。期望使用基於以更多的病例為對象的各種分子的定量而獲得的可靠性更高的生物標記，從而自源自被試驗者的試樣獲得與NAFLD相關的資訊。

根據本發明的第1態樣，非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法包括：取得源自哺乳動物的體液的試樣；以及對所述試樣中的選自由2-胺基己二酸、2-氧代己酸、2-氧代戊二酸、丙胺酸、麩胺酸、酪胺酸、乳酸、尿酸、纈胺酸、丙酮酸、苯丙胺酸、及脯胺酸所組成的群組中的至少一種分子進行檢測。

根據本發明的第2態樣，如第1態樣的非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法，其中，較佳為輸出所述檢測中的基於與所述分子對應的檢測信號的大小而獲得的、與所述哺乳動物是否患有非酒精性脂肪肝疾病相關的資訊。

根據本發明的第3態樣，如第2態樣的非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法，其中，較佳為基於所述檢測信號的大小算出所述試樣中的所述分子的濃度，並且輸出基於所算出的所述濃度是否滿足基於規定臨限值的條件而獲得的、與所述哺乳動物是否患有非酒精性脂肪肝疾病相關的資訊。

根據本發明的第4態樣，如第1態樣至第3態樣中的任一態樣的非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法，其中較佳為所述檢測是利用氣相層析法、液相層析法、質譜、氣相層析法/質譜、液相層析法/質譜、核磁共振分光法、及免疫學檢測法的至少一種來進行。

根據本發明的第5態樣，如第1態樣至第4態樣中的任一態樣的非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法，其中較佳為所述哺乳動物為人。

根據本發明的第6態樣，如第1態樣至第5態樣中的任一態樣的非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法，其中較佳為所述體液為血液。

根據本發明的第7態樣，非酒精性脂肪肝疾病檢測用試劑盒包括選自由2-胺基己二酸、2-氧代己酸、2-氧代戊二酸、丙胺酸、麩胺酸、酪胺酸、乳酸、尿酸、纈胺酸、丙酮酸、苯丙胺酸、及脯胺酸所組成的群組中的至少一種分子的測定試劑。

根據本發明的第8態樣，非酒精性脂肪肝疾病檢測用生物標記包括選自由2-胺基己二酸、2-氧代己酸、2-氧代戊二酸、丙胺酸、麩胺酸、酪胺酸、乳酸、尿酸、纈胺酸、丙酮酸、苯丙胺酸、及 脯胺酸所組成的群組中的至少一種分子。

根據本發明，根據基於以數千人為對象的大規模的分析而獲得的可靠性更高的生物標記，可更準確地自源自被試驗者的試樣獲得與NAFLD相關的資訊。

S1001、S1003、S1005、S1007、S1009、S1011、S1013:步驟

圖1是表示一實施形態的檢測方法的流程的流程圖。

以下，參照圖對用於實施本發明的形態進行說明。以下的實施形態的非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的檢測方法是進行源自對象的個體的試樣中的規定分子的檢測，並基於該檢測取得與該個體是否患有NAFLD相關的資訊。

所述規定分子於源自患有NAFLD的個體的試樣、與源自健全的個體的試樣中為濃度不同的分子。藉由檢測試樣中的該分子而獲得與個體是否患有NAFLD相關的資訊，因此所述規定分子為NAFLD的生物標記，以下稱為標記。

本實施形態的NAFLD的標記是選自由2-胺基己二酸、2-氧代己酸、2-氧代戊二酸、丙胺酸、麩胺酸、酪胺酸、乳酸、尿酸、纈胺酸、丙酮酸、苯丙胺酸、及脯胺酸所組成的群組中。於本實施形態的非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法中，可進行選自該群組中的至少一種標記的檢測，並基於與所檢測出的標記對應的 檢測信號的大小，取得所述個體是否患有NAFLD的資訊。

再者，於以下的實施形態中，所謂「對標記進行檢測」，是指進行用於將試樣中所含的標記定量的檢測，亦包括直接檢測經離子化的標記、經離解的標記、或標記的衍生物等源自標記的物質但不直接檢測標記自身的情況。

(關於試樣)

若標記的濃度於源自患有NAFLD的個體的試樣、與源自健全的個體的試樣中不同，則成為對象的個體的生物種類並無特別限定，較佳為哺乳動物，更佳為人。

若標記的濃度於源自患有NAFLD的個體的試樣、與源自健全的個體的試樣中不同，則可使用成為對象的個體的任意體液來製備試樣，該體液較佳為血液。以下，使用對源自人血液的試樣中的標記進行檢測的例子進行說明。將成為本實施形態的NAFLD的檢測方法的對象的人稱為被試驗者。

成為被試驗者的對象並無特別限定，例如為未被診斷為NAFLD的人。較佳為以接受短期綜合體檢等定期健康診斷的人為對象，亦可為接受健康診斷的預定加入生命保險的人員等。攝取規定量以上的酒精的人、或者現在或過去患有規定疾病的人可適宜地自對象中排除。所述規定量例如以乙醇換算計為男性30g/天以上，女性20g/天以上。所述規定疾病例如為肝疾病、糖尿病、脂質異常症、高尿酸血症或惡性疾病。

(關於標記的檢測)

試樣中的標記的檢測方法若可以所期望的精度判別所檢測出的標記的濃度是否為與NAFLD對應的濃度，則並無特別限定。

就定量性等觀點而言，試樣中所含的標記較佳為利用氣相層析法、液相層析法、質譜、核磁共振分光法、或該些的組合、或者酵素結合免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)所代表的免疫學檢測法來檢測。就自包含各種物質的試樣適宜地分離並檢測出目標標記的觀點而言，試樣中所含的標記更佳為利用氣相層析法/質譜(以下，稱為GC/MS)或液相層析法/質譜(稱為LC/MS)來檢測。此處，GC/MS及LC/MS是設為亦包含進行串聯質譜或MSⁿ等多次質量分離的情況。

因此，作為對試樣中所含的標記進行檢測的檢測裝置或檢查裝置，使用氣相層析儀、液相層析儀、質譜計、核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)分光計、或將該些組合而成的裝置。如上所述，較佳為利用氣相層析儀-質譜計(以下，稱為GC-MS)進行GC/MS，或利用液相層析儀-質譜計(以下，稱為LC-MS)進行LC/MS。質譜計可為單質譜計，亦可為可進行2階段以上的質量分離的質譜計。關於在質譜計的內部進行該些質量分離的質譜器，其種類亦無特別限定，可適宜包括四極質量過濾器、離子阱(ion trap)以及飛行時間型質譜器等。

另一方面，就檢測的容易性或迅速性等觀點而言，較佳為於試樣中添加檢測試劑，並利用該檢測試劑與標記的化學反應來檢測標記的濃度。例如，檢測試劑可包含藉由與標記的化學反 應而顯色的指示劑，可根據添加了該指示劑的試樣溶液的色調來檢測標記的濃度。

提供包括所述氣相層析法、液相層析法、質譜或核磁共振分光法中使用的消耗品、或所述檢測試劑的非酒精性脂肪肝疾病檢測用試劑盒。藉由使用此種試劑盒進行本實施形態的非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法，可更迅速且/或更簡便地取得與被試驗者是否患有NAFLD相關的資訊。

(關於試樣的前處理)

自被試驗者藉由採血等而獲得的試樣是於經適宜保管後供於前處理。試樣可以血液的狀態直接保管，亦可以對血液進行離心分離而獲得的血漿或血清的狀態保管。試樣的保管方法並無特別限定，可進行冷凍保存、冷藏保存或常溫下的保存。

為了對標記進行檢測而將試樣供給至檢測裝置前的前處理的方法並無特別限定。於進行GC/MS的情況下，可於試樣中添加內部標準，並於溶媒提取後適宜進行離心濃縮、凍結乾燥及衍生物化。內部標準可根據要檢測的標記的m/z或試樣的種類(血清、血漿等)等而適宜選擇。例如於在血清試樣中測定m/z 500以下的區域的情況下，可適宜使用血清中並不包含的作為合成化合物的2-異丙基蘋果酸等。衍生化的方法並無特別限定，例如可於對凍結乾燥後的試樣添加甲氧基胺溶液並進行肟化後，添加N-甲基-N-三甲基矽烷基三氟乙醯胺(MSTFA)並進行矽烷基化。將進行了前處理的試樣導入至檢測裝置中。

(關於藉由檢測而獲得的資料的分析)

對藉由檢測而獲得的資料進行分析的方法並無特別限定，只要可算出試樣中的標記的濃度(以下，稱為標記濃度)即可。該資料的分析較佳為利用個人電腦等資訊處理裝置、或檢測裝置中所含的處理裝置等分析裝置來進行，亦可由人進行。於利用質譜進行標記的檢測的情況下，製成與質譜圖(mass spectrum)或質量層析圖(mass chromatogram)對應的資料。其後，基於該些中的波峰的強度或面積來算出標記的檢測量，並藉由用標記的檢測量除以內部標準的檢測量而得的值與內部標準的已知的濃度的積等來算出標記濃度。

算出標記濃度後，根據標記濃度是否滿足基於規定臨限值(以下，稱為標記臨限值)的條件，來判定被試驗者是否患有NAFLD、或者患有NAFLD的風險是否高(以下，稱為罹患判定)。標記臨限值是使用基於過去測定的NAFLD患者及健全者中的標記的濃度例如以靈敏度或特異度成為所期望的值的方式而預先設定者。例如，若NAFLD患者中的標記的濃度於統計方面比健全者中的標記的濃度高，則於被試驗者中的標記濃度比標記臨限值高的情況下，以將被試驗者判定為NAFLD患者的方式設定基於標記臨限值的條件。

可藉由針對一個標記的標記濃度來進行罹患判定。於使用針對多個標記的標記濃度來進行罹患判定的情況下，可基於多個標記濃度的值、與對應的多個標記臨限值並藉由多變量分析等 來進行。或者，亦可藉由多個標記中的、標記濃度滿足基於標記臨限值的條件的標記的個數來進行罹患判定。該情況下，亦可藉由該個數將風險分類為「高」「中」「低」三個階段等。

向醫師或醫療工作人員等顯示藉由分析利用檢測獲得的資料而獲得的質譜圖或質量層析圖、表示標記濃度或罹患判定的結果的資訊等。根據該資訊，醫師可對被試驗者是否患有NAFLD進行診斷，並可於被試驗者為NAFLD的情況下進行治療。另外，醫療工作人員等可掌握被試驗者的狀態等。

圖1是表示本實施形態的非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法的流程的流程圖。本實施形態的檢測方法是為了進行NAFLD的診斷而自源自被試驗者的血液的試樣對標記於體外(In vitro)進行檢測的方法。於圖1的流程圖中，示出利用GC/MS對標記進行檢測的例子，但本發明並不限定於此。

於NAFLD的診斷步驟S1001中，由醫療工作人員等進行採血等，並自被試驗者取得血液。於步驟S1001結束後，開始步驟S1003。於步驟S1003中，檢查者、或檢測裝置的使用者等對血液進行前處理並製備源自血液的試樣。於步驟S1003結束後，開始步驟S1005。

於步驟S1005中，利用氣相層析法分離試樣。於步驟S1005結束後，開始步驟S1007。於步驟S1007中，利用質譜檢測經分離的試樣中所含的標記。於步驟S1007結束後，開始步驟S1009。

於步驟S1009中，根據與標記對應的檢測信號的大小，算出試樣中的標記的濃度。於步驟S1009結束後，開始步驟S1011。於步驟S1011中，判定所算出的標記的濃度是否滿足基於規定臨限值(標記臨限值)的條件，並基於判定結果，製成與被試驗者是否患有NAFLD相關的資料。於步驟S1011結束後，開始步驟S1013。

於步驟S1013中，基於步驟S1011中所製成的資料，向顯示裝置等輸出與被試驗者是否患有NAFLD相關的資訊。於步驟S1013結束後，結束處理。

根據所述實施形態，可獲得如下作用效果。

(1)本實施形態的非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法包括：取得源自人血液的試樣；以及對試樣中的選自由2-胺基己二酸、2-氧代己酸、2-氧代戊二酸、丙胺酸、麩胺酸、酪胺酸、乳酸、尿酸、纈胺酸、丙酮酸、苯丙胺酸、及脯胺酸所組成的群組中的至少一種分子進行檢測。藉此，可迅速地進行非酒精性脂肪肝疾病的篩選。另外，該些分子如後述的實施例中所記載般，為藉由基於大規模的病例的分析而獲得的標記，因此可進行準確的篩選。

(2)於本實施形態的非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法中，輸出標記的檢測中的基於與標記對應的檢測信號的大小而獲得的、與被試驗者是否患有NAFLD相關的資訊。藉此，可基於經定量的標記，更精密地進行篩選。

(3)於本實施形態的非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法 中，基於與標記對應的檢測信號的大小算出試樣中的標記的濃度，並且基於所算出的濃度是否滿足基於標記臨限值的條件而輸出與被試驗者是否患有NAFLD相關的資訊。藉此，可基於經定量的標記的濃度，更精密地進行篩選。

(4)於本實施形態的非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法中，標記的檢測可利用氣相層析法、液相層析法、質譜、氣相層析法/質譜、液相層析法/質譜、核磁共振分光法或免疫學檢測法來進行。藉此，可分離試樣中所含的各成分並且更精密地進行篩選。

(5)本實施形態的非酒精性脂肪肝疾病檢測用生物標記包括試樣中的選自由2-胺基己二酸、2-氧代己酸、2-氧代戊二酸、丙胺酸、麩胺酸、酪胺酸、乳酸、尿酸、纈胺酸、丙酮酸、苯丙胺酸、及脯胺酸所組成的群組中的至少一種分子。藉此，可迅速地進行非酒精性脂肪肝疾病的篩選。另外，該些分子如後述的實施例中所記載般，為藉由基於大規模的病例的分析而獲得的標記，因此可進行準確的篩選。

本發明並不限定於所述實施形態的內容。於本發明的技術思想的範圍內考慮到的其他態樣亦包含於本發明的範圍內。

[實施例]

於以下的實施例中，說明如下分析的結果，所述分析是將自藉由腹部超音波觀察結果而診斷為NAFLD的患者(NAFLD群組)、與健全者(正常群組)獲得的血清供給至GC/MS來探索於NAFLD群組與正常群組中濃度不同的血清中的成分。

再者，本發明並不限定於以下實施例中所示的數值、條件。

(對象人員)

對從自2015年10月至2016年9月為止訪問醫院的日本短期綜合體檢受診人員中隨機抽取的人員中的滿足採用基準的3733人的血清進行分析。採用基準均不適用於以下的(1)~(5)的任一者。

(1)表明不同意參加研究的人員

(2)酒精攝取量為(男性：以乙醇換算計為30g/天以上，女性：以乙醇換算計為20g/天以上)的人員

(3)因肝疾病而具有治療中的現病史的人員

(4)關於糖尿病、脂質異常症、高尿酸血症中的至少一種而具有治療中的現病史的人員

(5)關於惡性疾病而具有治療中的現病例的人員

滿足所述採用基準的人員均藉由短期綜合體檢而獲得了腹部超音波觀察結果，且於醫院內的研究倫理審查委員會的承諾下將臨床資訊與分析血清的結果結合。

於NAFLD群組與正常群組合計3733名中，女性為2252名(60.3%)，中位數年齡為51歲(四分位數範圍：43歲~61歲)。將成為分析對象的研究集團的基線特性示於以下表1中。BMI的平均值是使用算術平均值。

[表1]

(前處理)

採血後，利用離心分離提取血清，於採血後5小時~8小時以內在-80℃下冷凍保存。將經冷凍保存的血清於25℃下放置5分鐘而解凍。對經解凍的血清以10,000×g、4℃的條件進行1分鐘離心分離，並轉移上清液，且靜置於冰上。對以2.5：1：1的比例混合有甲醇/水/氯仿的混合液250μL添加內部標準溶液(0.1mg/mL 2-異丙基蘋果酸)6μL，將該混合液添加至經轉移的血清試樣中，使用旋渦混合器(vortex mixer)進行攪拌。於37℃、30分鐘、1,200rpm的條件下對血清試樣進行振盪。將振盪後的試樣於16,000×g、25℃的條件下進行5分鐘離心分離。將離心分離後的上清液150μL添加至預先加入了水140μL的管中，使用旋渦攪拌器進行攪拌。將攪拌後的溶液於16,000×g、25℃的條件下進行5分鐘離心分離。將離心分離後的上清液180μL回收到新的管中。於室溫下利用離心蒸發器濃縮60分鐘。將濃縮後的試樣於-80℃下放置30分鐘並使其凍結。使凍結的試樣乾燥一夜(overnight)。將乾燥後的試樣保存於乾燥器(desiccator)中。於乾燥後的試樣中添加甲氧基胺溶液(20mg/mL，以吡啶溶解)80μL，並於37℃、30分鐘、200rpm的條件下進行振盪。其後，添加N-甲基-N-三甲基矽烷基三氟 乙醯胺40μL，並於37℃、30分鐘、1200rpm的條件下進行振盪。對振盪後的試樣於16000×g、25℃的條件下進行5分鐘離心分離。將離心分離後的上清液50μL移動至玻璃小瓶(vial)中，且將該小瓶設置於GC-MS的自動取樣器上。

(GC/MS)

氣相層析法的條件

系統：GCMS-TQ8040(島津製作所)

管柱烘箱溫度：80℃、注射溫度：280℃、注射模式：分流導入法、載氣：氦氣、載氣流量：39cm/sec

分離管柱：

DB-5(安捷倫科技(Agilent Technologies))：固定相：(5%-苯基)-甲基聚矽氧烷(無極性)、長度：30.0m、內徑：0.25mm、膜厚：1.00μm

管柱溫度程式：

質譜的條件

系統：GCMS-TQ8040(島津製作所)

離子源溫度：200℃、介面溫度：250℃、檢測器電壓：0.2kV、

測定模式：掃描模式、掃描範圍：m/z 85-500

(資料分析)

根據於各保持時間內掃描m/z而獲得的檢測強度，製成各保持時間中的質譜圖。基於過去獲得的血清試樣中的質譜圖的資料，鑑定與所製成的質譜圖中的各波峰對應的代謝物(136種)。對與各代謝物對應的檢測強度使用與作為內部標準的異丙基蘋果酸對應的檢測強度而進行標準化，算出試樣中的濃度。藉由統計分析而於NAFLD群組與正常群組中比較各代謝物的濃度。於統計分析中，作為單變量分析，使用未配對t檢定(unpaired t-test)及曼惠特尼U檢定(Mann-Whitney U-test)，作為針對多種代謝物的多變量分析，使用邏輯式迴歸分析。關於NAFLD的診斷能力，對於各代謝物，製成接收者操作特性(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲線，並使用ROC曲線更下側的部分的面積(AUC)進行評價。多種代謝物中的研究是使用LASSO法。於投入有代謝物及調整因子的模型中，使用c統計量進行評價。

(結果)

於NAFLD群組及正常群組兩群組間進行未配對t檢定，確認到非偶然的差的代謝物為麩胺酸、2-氧代戊二酸、纈胺酸、酪胺酸、2-胺基己二酸、苯丙胺酸、丙酮酸、尿酸、2-氧代己酸及丙胺酸(以p值最小的代謝物為第1位，而列舉p值以升序上升至第10位的代謝物)。以下的表2中示出了該些代謝物的p值與t統計量。t統計量於任意代謝物中均為負值，因此得知於正常群組中代 謝物的量少於NAFLD群組。表中，「xE-y」的表述表示對x乘以10的-y乘方而得的值，且於以下的各表中亦相同。

投入作為從屬變數的NAFLD群組/正常群組、作為調整因子的年齡、性別及BMI，並利用邏輯式迴歸分析研究NAFLD群組與各代謝物的關聯，結果於2-氧代戊二酸中確認到最強的關聯(迴歸係數0.5658、標準誤差0.0547、相對於每1SD的變化的勝算比(Odds ratio)1.761、95%可靠區間1.582-1.960、p值=4.10E-25)。以下的表3中示出了包含2-氧代戊二酸在內的5種代謝物的邏輯式迴歸分析中的迴歸係數、標準誤差及p值。再者，記載了不進行利用調整因子的調整時(即表2中的)的位次、以及t統計量與p值。

[表3]

對診斷能力進行研究。從屬變數是設為NAFLD群組/正常群組，且對各代謝物進行ROC分析，並研究AUC，結果值大的代謝物為麩胺酸(AUC=0.759)、2-氧代戊二酸(AUC=0.729)、纈胺酸(AUC=0.699)。以下的表中示出各代謝物的AUC。

所述為利用單一代謝物的診斷能力的研究，使用多種代謝物同樣地進行了研究。進行利用LASSO法的研究，結果，選擇70種代謝物，且該情況下的AUC為0.870。70種代謝物如下所述。 硼酸、苯酚、2-羥基異丁酸、乙醇酸、丙胺酸、甘胺酸、2-羥基丁酸、對甲酚、3-羥基丁酸、3-羥基異丁酸、2-羥基異戊酸、2-胺基丁酸、3-羥基異戊酸、纈胺酸、尿素、辛酸、甘油、醋尿酸、磷酸、異白胺酸、脯胺酸、琥珀酸、富馬酸、絲胺酸、戊二酸、2-脫氧甲基丙炔酸、癸酸、天冬胺酸、蛋胺酸、焦麩胺酸、羥基脯胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、月桂酸、天冬醯胺酸、2-胺基己二酸、烏頭酸(aconitic acid)、麩醯胺、組胺酸、酪胺酸、棕櫚油酸、尿酸、硬脂酸、色胺酸、2-吡啶酮、丙酮酸、3-胺基丙酸、赤蘚醇、蘇糖酸(threonic acid)、2-氧代戊二酸、肌酸酐、木糖醇、阿拉伯糖醇、岩藻糖(fucose)、乙醇胺磷酸、異檸檬酸、次黃嘌呤、馬尿酸(hippuric acid)、1,5-脫水-D-葡糖醇、3-甲基組胺酸、甘露糖、離胺酸、對黃嘌呤、鯊肌醇(scyllo-inositol)、3-吲哚丙酸、犬尿胺酸(kynurenine)、胱胺酸、乙醯乙酸、葡萄糖酸、核糖。

關於相對於相同的從屬變數而投入作為調整因子的年齡、性別及BMI的模型中的c統計量，麩胺酸為0.873而最大。以下的表5中示出了各代謝物的c統計量。再者，記載了不進行利用調整因子的調整時(即表4中的)的位次、以及AUC。

近年來，BMI不高、即不被認為肥胖的群組中的NAFLD於臨床方面被視為問題。因此，於BMI小於25的並不肥胖的群組中進行所述分析，結果為相同的結果。

進而，於BMI小於23的並不小於標準體重的群組中進行所述分析，結果為相同的結果。

將如下優先權基礎申請的揭示內容作為引用文而組入於此。

日本專利申請2018年第180886號(2018年9月26日申請)

S1001、S1003、S1005、S1007、S1009、S1011、S1013:步驟

Claims (8)

1. 一種非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法，包括：取得源自哺乳動物的體液的試樣；以及對所述試樣中的選自由2-胺基己二酸、2-氧代己酸、2-氧代戊二酸、丙胺酸、麩胺酸、酪胺酸、乳酸、尿酸、丙酮酸、苯丙胺酸、及脯胺酸所組成的群組中的至少一種分子進行檢測。
2. 如申請專利範圍第1項所述的非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法，其中輸出所述檢測中的基於與所述分子對應的檢測信號的大小而獲得的與所述哺乳動物是否患有非酒精性脂肪肝疾病相關的資訊。
3. 如申請專利範圍第2項所述的非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法，其中基於所述檢測信號的大小算出所述試樣中的所述分子的濃度，並且輸出基於所算出的所述濃度是否滿足基於規定臨限值的條件而獲得的與所述哺乳動物是否患有非酒精性脂肪肝疾病相關的資訊。
4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法，其中所述檢測是利用氣相層析法、液相層析法、質譜、氣相層析法/質譜、液相層析法/質譜、核磁共振分光法、及免疫學檢測法的至少一種來進行。
5. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的非酒精性脂肪肝疾病的檢測方法，其中所述哺乳動物為人。
6. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的非酒精 性脂肪肝疾病的檢測方法，其中所述體液為血液。
7. 一種非酒精性脂肪肝疾病檢測用試劑盒，包含選自由2-胺基己二酸、2-氧代己酸、2-氧代戊二酸、丙胺酸、麩胺酸、酪胺酸、乳酸、尿酸、丙酮酸、苯丙胺酸、及脯胺酸所組成的群組中的至少一種分子的測定試劑。
8. 一種非酒精性脂肪肝疾病檢測用生物標記，包含選自由2-胺基己二酸、2-氧代己酸、2-氧代戊二酸、丙胺酸、麩胺酸、酪胺酸、乳酸、尿酸、丙酮酸、苯丙胺酸、及脯胺酸所組成的群組中的至少一種分子。

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