JP7018605B2

JP7018605B2 - 大腸がん検査方法

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Publication number: JP7018605B2
Application number: JP2017069354A
Authority: JP
Inventors: 典行尾島; 修一川名; 結実海野; 健朗坂井; 賢一大林; 恭彦工藤; 優吉田; 信西海; 隆小林; 健東; 康司岡本; 康秀山田; 南都子沖田; 一起須藤
Original assignee: Shimadzu Corp; Kobe University NUC; National Cancer Center Japan
Current assignee: Shimadzu Corp; Kobe University NUC; National Cancer Center Japan
Priority date: 2017-03-30
Filing date: 2017-03-30
Publication date: 2022-02-14
Anticipated expiration: 2037-03-30
Also published as: US20180299448A1; JP2018169376A

Description

特許法第３０条第２項適用ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｐａｃｔｊｏｕｒｎａｌｓ．ｃｏｍ／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｊｏｕｒｎａｌ＝ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ＆ｐａｇｅ＝ａｒｔｉｃｌｅ＆ｏｐ＝ｖｉｅｗ＆ｐａｔｈ％５Ｂ％５Ｄ＝１５０８１＆ｐａｔｈ％５Ｂ％５Ｄ＝４８２２１、平成２９年２月４日［刊行物等］ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｈｉｍａｄｚｕ．ｃｏ．ｊｐ／ｎｅｗｓ／ｐｒｅｓｓ／ｎ００ｋｂｃ００００００ａｔ７１．ｈｔｍｌ、平成２９年２月１５日［刊行物等］ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｏｂｅ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ＮＥＷＳ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／２０１７＿０２＿１５＿０１．ｈｔｍｌ、平成２９年２月１５日［刊行物等］ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｃｒｉ．ｎｃｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｓ００７／０２０／２０１７０２１６１０５７２０．ｈｔｍｌ、平成２９年２月１５日［刊行物等］ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｅｄ．ｇｏ．ｊｐ／ｎｅｗｓ／ｏｔｈｅｒ／２０１７０２１５．ｈｔｍｌ、平成２９年２月１５日［刊行物等］ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｋｏｂｅ－ｎｐ．ｃｏ．ｊｐ／ｎｅｗｓ／ｉｒｙｏｕ／２０１７０３／０００９９６０９７１．ｓｈｔｍｌ、平成２９年３月２日

本発明は、被検者から採取した生体試料中の生体内代謝産物を定量分析した結果を用いた大腸がんの検査方法に関する。

早期の大腸がんは高い確率で治癒できることが知られているものの、早期の段階では自覚症状がなく、自覚症状が現れたときには既に病状が進行していることが多い。そのため、早期の大腸がん罹患者の発見を目的としたスクリーニングが、例えば病院などの医療機関で行われる、健常者を対象にした一般的な定期検診で実施されている。

スクリーニングは、便潜血検査法と呼ばれる大腸がん検査により行われるのが一般的である。便潜血検査法では、消化管の出血により糞便の中にごく微量に含まれる血液（潜血）を、抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的方法により検出する。便潜血検査法で陽性（つまり、大腸がんの疑いがある）と判定された被検者に対しては、さらに、直腸指診、内視鏡検査、或いは造影Ｘ線検査といった精密検査が実施され、その結果を医師などの専門家が総合的に判断して大腸がんを判定する。

当然ながら、スクリーニングには高い判定感度が求められるところ、消化管に出血がみられるのは主に中期以降の段階の大腸がんであるため、早期の段階の大腸がんの罹患者が便潜血検査法で陽性と判定される確率は５０％程度である。

一方、近年の質量分析技術の進展に伴い、被検者から採取した生体試料（血液、尿、糞便、唾液、或いは生体組織の一部など）を質量分析することで得られたデータに対してデータ解析を行うことで、特定の疾病の診断を行う試みがなされている。例えば特許文献１には、生体試料に対して質量分析を行うことで得られたマススペクトルデータに基づき、該生体試料に含まれる生体内代謝産物であるキヌレニン、シスタミン、２－ヒドロキシ酪酸及びアスパラギン酸の量を測定し、これらの生体内代謝産物の測定値の結果によりステージ０からステージ２までの早期の大腸がんを判定することが記載されている。

特開2013-246080号公報

大腸がんは、がん組織の存在部位の違いによって０～４のステージに分類されており、大腸以外の組織への転移がみられるステージ３、４の大腸がんに対して、ステージ０～２の大腸がんは大腸の組織内にがん組織が存在する。具体的には、ステージ０の大腸がんは大腸の最内層である粘膜にがん組織が存在し、ステージ１の大腸がんは粘膜から固有筋層にわたってがん組織が存在する。また、ステージ２の大腸がんは粘膜から固有筋層を越えて大腸の最外層近くまでがん組織が広がる。このようながん組織の存在部位の違いにより、ステージ０～２の各ステージで生体試料に含まれる生体内代謝産物の種類が異なることが予想されるが、特許文献１に記載の検査方法では、ステージ０～２の全てのステージの大腸がんを同じ４種類の生体内代謝産物の測定値に基づいて判定しており、ステージによっては、判定の精度に差がでてくる。また、生体内代謝産物の測定値がガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ－ＭＳ）の分析データから求められたものであり、ＧＣ－ＭＳによる分析のための前処理操作も手動で行われているため、定量性や再現性が低い。従って、高い再現性で定量的に分析できる生体内代謝物の種類が限られてしまい、早期の大腸がんを精度よく判定することができる生体内代謝産物及びその組み合わせが正しく選択されていない可能性がある。

本発明が解決しようとする課題は、ステージ０からステージ２までの早期の大腸がんを正確に判定することができる大腸がん検査方法を提供することである。

上記課題を解決するために成された本発明に係る大腸がん検査方法は、
被検者から採取された生体試料に対してクロマトグラフ－ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで得られたデータに基づき、前記生体試料に含まれる複数種の生体内代謝産物のうち少なくとも乳酸、ピルビン酸、及びグリコール酸の量を測定し、
乳酸、ピルビン酸、及びグリコール酸のうち少なくとも１種の測定値に基づき、ステージ０からステージ２までのいずれかのステージの大腸がんを判定する。

ここで、クロマトグラフＭＳ／ＭＳ分析とは、ガスクロマトグラフ、又は液体クロマトグラフと、これらクロマトグラフで分離された試料の検出装置としてのトリプル四重極型質量分析装置、Ｑ－ＴＯＦ型質量分析装置、ＴＯＦ－ＴＯＦ型質量分析装置、イオントラップ質量分析装置、又はイオントラップ飛行時間型質量分析装置等の質量分析装置とから成る装置を用いた分析をいい、それにより得られるデータとは、ＭＳ／ＭＳスペクトルデータをいう。クロマトグラフで分離された試料の検出装置として、トリプル四重極型質量分析装置、Ｑ－ＴＯＦ型質量分析装置、ＴＯＦ－ＴＯＦ型質量分析装置、イオントラップ質量分析装置、イオントラップ飛行時間型質量分析装置などを用いると、分析対象物（生体内代謝産物）以外の夾雑物を多く含む試料であっても高感度な分析が可能であり、分析安定性が向上するため、高い再現性で且つ定量的に、生体試料に含まれる生体内代謝産物の量を測定することができ、この結果、早期の大腸がんを正確に判定することができる。

上記大腸がん検査方法においては、さらに、前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、オルニチン、及びトリプトファンの量を測定し、
乳酸、ピルビン酸、及びグリコール酸から選択された少なくとも１種の生体内代謝産物と、乳酸、ピルビン酸、グリコール酸、オルニチン、及びトリプトファンから選択された、前記少なくとも１種の生体内代謝産物とは異なる少なくとも１種の生体内代謝産物の、計２種以上の生体内代謝産物の測定値に基づき、ステージ０からステージ２までのいずれかのステージにある大腸がんを判定すると良い。

この場合、ピルビン酸、グリコール酸、オルニチン、及びトリプトファンの測定値に基づき、ステージ０からステージ２のいずれかのステージにある大腸がんを判定するようにしても良い。

また、本発明に係る大腸がん検査方法においては、さらに、前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、フマル酸、及び２－ケト－イソ吉草酸の量を測定し、
ピルビン酸、グリコール酸、フマル酸、及び２－ケト－イソ吉草酸の測定値に基づき、ステージ０からステージ２のいずれかのステージにある大腸がんを判定することができる。

本発明に係る大腸がん検査方法では、さらに、前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、フマル酸、及びリンゴ酸の量を測定し、
乳酸、オルニチン、トリプトファン、フマル酸、及びリンゴ酸の測定値に基づき、ステージ０からステージ２のいずれかのステージにある大腸がんを判定するようにしても良い。

本発明に係る大腸がん検査方法では、さらに、前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、フマル酸、パルミトレイン酸、リジン、及び３-ヒドロキシイソ吉草酸の量を測定し、
オルニチン、グリコール酸、トリプトファン、ピルビン酸、フマル酸、パルミトレイン酸、リジン、及び３-ヒドロキシイソ吉草酸の測定値に基づき、ステージ０からステージ２のいずれかのステージにある大腸がんを判定することも可能である。

また、本発明に係る大腸がん検査方法は、乳酸、及びオルニチンの測定値に基づき、ステージ０にある大腸がんを判定する。

また、本発明に係る大腸がん検査方法は、前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、乳酸、ピルビン酸、グリコール酸、オルニチン、及びトリプトファンに加えて、さらに、尿酸、及びグリセリン酸の量を測定し、
乳酸、グリコール酸、尿酸、及びグリセリン酸の測定値に基づき、ステージ０にある大腸がんを判定する。

また、本発明に係る大腸がん検査方法では、さらに、前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、２－ヒドロキシブチル酸の量を測定し、
乳酸、２－ヒドロキシブチル酸、オルニチン、及びトリプトファンの測定値に基づき、ステージ０にある大腸がんを判定するようにしても良い。

また、本発明に係る大腸がん検査方法では、さらに、前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、グリセリン酸の量を測定し、
グリコール酸、グリセリン酸、及びトリプトファンの測定値に基づき、ステージ１にある大腸がんを判定することも可能である。

また、本発明に係る大腸がん検査方法では、さらに、前記生体試料に含まれる生体内代謝産物であるガラクトース、グリシン、尿酸、及びグリセリン酸の量を測定し、
グリコール酸、ピルビン酸、ガラクトース、グリシン、尿酸、及びグリセリン酸の測定値に基づき、ステージ１にある大腸がんを判定するようにしても良い。

また、本発明に係る大腸がん検査方法では、さらに、前記生体試料に含まれる生体内代謝産物であるクエン酸の量を測定し、
乳酸、オルニチン、トリプトファン、クエン酸の測定値に基づき、ステージ１にある大腸がんを判定する。

また、本発明に係る大腸がん検査方法では、さらに、前記生体試料に含まれる生体内代謝産物であるフマル酸、及びサッカロースの量を測定し、
ピルビン酸、グリコール酸、フマル酸、及びサッカロースの測定値に基づき、ステージ２にある大腸がんを判定する。

また、本発明に係る大腸がん検査方法では、さらに、前記生体試料に含まれる生体内代謝産物であるロイシン、リン酸、サッカロース、及びフマル酸の量を測定し、
ピルビン酸、グリコール酸、ロイシン、リン酸、サッカロース、及びフマル酸の測定値に基づき、ステージ２にある大腸がんを判定する。

また、本発明に係る大腸がん検査方法では、さらに、前記生体試料に含まれる生体内代謝産物であるフマル酸の量を測定し、
乳酸、オルニチン、フマル酸、及びトリプトファンの測定値に基づき、ステージ２にある大腸がんを判定する。

本発明者は、ステージ０からステージ２までの各ステージの大腸がん患者の生体試料に特異的に存在する生体内代謝産物を探索するため、健常者、及びステージ０からステージ２までの各ステージの大腸がん患者から血液を採取し、その血漿成分を試料として該試料に含まれる生体内代謝産物の量を網羅的に測定した。その結果、所定の複数種の生体内代謝産物が各ステージの大腸がん患者の試料に特異的に存在することを見出し、本発明に想到した。生体内代謝産物の探索に用いた試料は血液（血漿）であり、該試料中の生体内代謝産物の分析に用いた装置はガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ）であるため、本発明に係る大腸がん検査方法は、分析装置をＧＣ－ＭＳ／ＭＳ、生体試料を血液（血漿）とすることが好ましいが、これらに限定されない。

すなわち、本発明に係る大腸がん検査方法において、「被検者から採取された生体試料」は、該生体試料に含まれる生体内代謝産物の量を測定することができるものであれば血液、生体組織、糞便、尿等、どのようなものでも良いが、試料の採取のし易さ、生体内代謝産物の含有量を考慮すると血液（全血、血清、又は血漿）が好ましく、特に血漿が好適である。血清としては、全血に対して抗凝固剤を添加せずに血球成分を凝固させてから得られる液性成分を使用することができる。また、血漿としては、全血に対して抗凝固剤を添加して血球成分を凝固させずに得られる液性成分を使用することができる。

また、本発明に係る大腸がん検査方法においては、ステージ０～ステージ２の各ステージにある早期の大腸がん患者、或いはステージ０～ステージ２のいずれかにある早期の大腸がん患者と健常者の生体内代謝産物の測定値を多変量解析により比較解析することで、健常者と早期の大腸がん患者を区別できる予測式を作成することができる。この予測式により分析値（Ｐ値）を求め、Ｐ値がカットオフ値よりも高い場合に大腸がんの可能性が高いと判断することができる。
具体的には、或るステージの大腸がんを判定するために用いられる生体内代謝産物をＡ、Ｂ、Ｃの３種類とし、各生体内代謝産物の測定値を[A]、[B]、[C]とすると、分析値（Ｐ値）を算出するための予測式は以下の式（１）で表される。

上記式（１）で求められるＰ値が０に近いほど健常であり、１に近づくほど大腸がんの可能性が高いと判定することができるように、前記式（１）の切片（i）及び解析対象分子（つまり、各生体内代謝産物の測定値[A]、[B]、[C]）に付与される係数ａ～ｃを決定する。このようにして、各ステージについてＰ値を求めることにより、Ｐ値がカットオフ値よりも高い場合にそのステージの大腸がんの可能性が高いと判断することができる。

前記予測式の性能を評価するにはＲＯＣ解析（Receiver Operating Characteristic analysis）を用いる。ＲＯＣ解析によって得られるＲＯＣ曲線（ROC curve）は、縦軸を真陽性率、つまり感度、横軸を偽陽性率、つまり「１－特異度」を尺度としてプロットしたものである。前記Ｐ値に対してカットオフ値を決め、その値よりもＰ値が大きければ大腸がんの可能性が高い、つまり陽性と判断する。そして、大腸がん患者全体に対する、陽性と判断された大腸がん患者の割合より感度を計算し、健常者全体に対する、陽性と判断された健常者（非疾病者）の割合より偽陽性率を計算する。同様にして他のカットオフ値での感度と偽陽性率を計算し、このようにして求めた値をグラフにプロットし、ＲＯＣ曲線を描く。カットオフ値は、大腸がんのステージや検査の位置づけ、その他種々の条件より決定することができる。このＲＯＣ曲線がより左上方に位置するほど検査方法として、優れていると判断することができる。

また、本発明に係る大腸がん検査方法においては、前記生体内代謝産物の測定値を標準値と比較した結果から各ステージの大腸がんを判定することも可能である。この場合、各組の生体内代謝産物の測定値を、それぞれ対応する標準値と比較し、その結果から総合的に判断するようにしても良く、各組の生体内代謝産物の測定値の多重ロジスティック回帰分析の分析結果を標準値と比較することにより大腸がんを判定するようにしても良い。

本発明では、クロマトグラフＭＳ／ＭＳ分析を行うことによって得られたデータに基づき、生体試料に含まれる１種以上の生体内代謝産物の量を測定し、その測定値に基づいてステージ０～２までのいずれかのステージの大腸がんを判定するため、早期の大腸がんを正確に判定することができる。

本発明に係る大腸がん検査方法において、ステージ０からステージ２までの各ステージにある大腸がん、及びステージ０－２のいずれかにある大腸がんの判定に用いられる生体内代謝産物の候補を示す図。大腸がんの判定のための予測式に用いられる生体内代謝産物の組み合わせを示す図。モデル１におけるステージ０のＲＯＣ曲線を示す図。モデル２におけるステージ０のＲＯＣ曲線を示す図。モデル３におけるステージ０のＲＯＣ曲線を示す図。モデル１におけるステージ１のＲＯＣ曲線を示す図。モデル２におけるステージ１のＲＯＣ曲線を示す図。モデル３におけるステージ１のＲＯＣ曲線を示す図。モデル１におけるステージ２のＲＯＣ曲線を示す図。モデル２におけるステージ２のＲＯＣ曲線を示す図。モデル３におけるステージ２のＲＯＣ曲線を示す図。モデル１におけるステージ０－２のＲＯＣ曲線を示す図。モデル２におけるステージ０－２のＲＯＣ曲線を示す図。モデル３におけるステージ０－２のＲＯＣ曲線を示す図。モデル４におけるステージ０－２のＲＯＣ曲線を示す図。乳酸及びオルニチンを用いたステージ０のＲＯＣ曲線を示す図。乳酸及びオルニチンを用いたステージ１のＲＯＣ曲線を示す図。乳酸及びオルニチンを用いたステージ２のＲＯＣ曲線を示す図。乳酸及びオルニチンを用いたステージ０－２のＲＯＣ曲線を示す図。ピルビン酸及びトリプトファンを用いたステージ０のＲＯＣ曲線を示す図。ピルビン酸及びトリプトファンを用いたステージ１のＲＯＣ曲線を示す図。ピルビン酸及びトリプトファンを用いたステージ２のＲＯＣ曲線を示す図。ピルビン酸及びトリプトファンを用いたステージ０－２のＲＯＣ曲線を示す図。乳酸を用いたステージ０のＲＯＣ曲線を示す図。乳酸を用いたステージ１のＲＯＣ曲線を示す図。乳酸を用いたステージ２のＲＯＣ曲線を示す図。乳酸を用いたステージ０－２のＲＯＣ曲線を示す図。グリコール酸を用いたステージ０のＲＯＣ曲線を示す図。グリコール酸を用いたステージ１のＲＯＣ曲線を示す図。グリコール酸を用いたステージ２のＲＯＣ曲線を示す図。グリコール酸を用いたステージ０－２のＲＯＣ曲線を示す図。ピルビン酸を用いたステージ０のＲＯＣ曲線を示す図。ピルビン酸を用いたステージ１のＲＯＣ曲線を示す図。ピルビン酸を用いたステージ２のＲＯＣ曲線を示す図。ピルビン酸を用いたステージ０－２のＲＯＣ曲線を示す図。

以下、本発明の一実施形態に係る大腸がん検査方法について具体例を挙げて説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

被検者から採取した生体試料をＧＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて分析し、該検体に含まれる所定の複数種の生体内代謝産物を候補物質としてその量を測定し、その測定値（ＭＳ／ＭＳ測定値）を解析対象分子として多重ロジスティック回帰分析による解析を行った。ここでは、神戸大大学及び国立研究開発法人国立がん研究センター医学倫理委員会の承認を得て、大腸がん患者及び健常者から取得した検体を生体試料とした。そして、その結果から、ステージ０～２までの各ステージ、及びステージ０～２までのいずれかのステージの早期の大腸がんの判定に用いる１種もしくは複数種の生体内代謝産物を導き出した。

本実施形態においては、早期の大腸がんの判定に用いる生体内代謝産物の候補として、２１種類の生体内代謝産物（乳酸、オルニチン、グリコール酸、尿酸、グリセリン酸、２－ヒドロキシブチル、トリプトファン、ピルビン酸、ガラクトース、グリシン、クエン酸、フマル酸、サッカロース、ロイシン、リン酸、２－ケト－イソ吉草酸、リンゴ酸、パルミトレイン酸、リジン、３－ヒドロキシイソ吉草酸、アスパラギン酸）を選定した。そして、これら２１種類の生体内代謝産物を、図１に示すように、（１）ステージ０、（２）ステージ１、（３）ステージ２、（４）ステージ０～２、の大腸がんの判定に用いられる4つの候補群に分類し、各候補群に含まれる生体内代謝産物の測定結果から対応するステージの大腸がんの判定に用いられる生体内代謝産物の組み合わせを導き出した。なお、２１種類の生体内代謝産物の選定及び４種類の候補群への分類は、大腸がんのマーカとして知られている物質、該マーカとなる可能性が高い物質等、これまで知られている大腸がんのマーカに関する情報を参考に行った。

＜試料の調製＞
空腹状態にある、上記の大腸がん患者及び健常者からＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含んだ採血管に採取した血液を混和後、4℃に保存し、遠心分離（3000rpm、10分間、4℃）して血漿を得た。
次に、血漿50μLをチューブに分注し、これに内部標準として2－イソプロピルリンゴ酸と前記生体内代謝物の安定同位体試薬を含んだメタノールを270μL添加して混合した。
続いて、凍結乾燥機により混合溶液から水分を除去した後、ピリジンに溶解したメチルヒドロキシアミン塩酸塩を添加し、30℃で90分間振盪してオキシム誘導体化を行い、MSTFAを添加し37℃で30分振盪してトリメチルシリル化し、これを試料とした。

＜マススペクトルデータ（ＭＳ／ＭＳデータ）の収集＞
上記試料に対して、トリプル四重極型ガスクロマトグラフ質量分析計（GCMS-TQ8040、株式会社島津製作所製）で質量分析することにより、ＭＳ／ＭＳデータを収集した。質量分析は、以下の条件で行った。
試料のインジェクション容量は1μLとし、GCキャピラリーカラムとして、「BPX-5（SGE Analytical Science Pty. Ltd社）」を用いた。カラム温度は、測定開始から２分間は60℃に保持し、その後、１分あたり15℃ずつ330℃まで上昇させた後、３分間、330℃に保持した。イオン源の温度は250℃に設定した。

＜生体内代謝産物の測定＞
試料のＭＳ／ＭＳデータからマススペクトルのピークを網羅的に検出し、そのピーク情報（質量電荷比及び信号強度）、及びＭＳライブラリに格納されている多数の生体内代謝産物に特異的な物質の質量電荷比、内部標準のピーク情報等に基づき、それらの生体内代謝産物の測定値（以下、ＭＳ／ＭＳ測定値という。）を求めた。

＜実施例１＞
７０例以上の健常者及び大腸がん患者から採取した、生体内代謝産物のＭＳ／ＭＳ測定値について適宜のデータ解析を行い、ステージ０～２の各ステージにある大腸がんの判定、及びステージ０～２のいずれかにある大腸がんの判定を行った。この実施例では、判定に用いる１ないし複数の生体内代謝産物を決定し、該生体内代謝産物のＭＳ／ＭＳ測定値を用いて予測式を作成し、この予測式を用いた大腸がんの判定を行った。本実施例では、生体内代謝産物のＭＳ／ＭＳ測定値の多重ロジスティック回帰分析での分析値（Ｐ値）を算出するための式を予測式とした。この予測式で求められるＰ値が０に近いほど健常であり、１に近づくほど大腸がんの可能性が高いと判定することができる。図２に、予測式の算出に用いた４種類の生体内代謝産物の組み合わせを示す。

図２に示すモデル１では、多重ロジスティック回帰分析法により、乳酸とオルニチンのＭＳ／ＭＳ測定値を用いてステージ０の大腸がんの予測式を作成し、グリコール酸、グリセリン酸、及びトリプトファンのＭＳ／ＭＳ測定値を用いてステージ１の大腸がんの予測式を作成し、ピルビン酸、グリコール酸、フマル酸、及びサッカロースのＭＳ／ＭＳ測定値を用いてステージ２の大腸がんの予測式を作成した。また、オルニチン、グリコール酸、トリプトファン、及びピルビン酸のＭＳ／ＭＳ測定値を用いて、ステージ０からステージ２のいずれかのステージにある大腸がんの予測式を作成した。

図２に示すモデル２では、ステップワイズ法により、乳酸、グリコール酸、尿酸、及びグリセリン酸の測定値を用いてステージ０の大腸がんの予測式を作成し、グリコール酸、尿酸、グリセリン酸、ピルビン酸、ガラクトース、及びグリシンの測定値を用いてステージ１の大腸がんの予測式を作成し、グリコール酸、ピルビン酸、ロイシン、リン酸、サッカロース、及びフマル酸の測定値を用いてステージ２の大腸がんの予測式を作成した。また、グリコール酸、ピルビン酸、フマル酸、及び２－ケト－イソ吉草酸のＭＳ／ＭＳ測定値を用いてステージ０からステージ２のいずれかのステージにある大腸がんの予測式を作成した。

図２に示すモデル３では、図１の各候補群の中から安定同位体で測定値を補正可能な生体内代謝産物を優先的に選択するようにし、ステップワイズ法により、乳酸、２－ヒドロキシブチル酸、オルニチン、及びトリプトファンのＭＳ／ＭＳ測定値を用いてステージ０の大腸がんの予測式を作成し、多重ロジスティック回帰分析法により、乳酸、オルニチン、トリプトファン、及びクエン酸のＭＳ／ＭＳ測定値を用いてステージ１の大腸がんの予測式を作成し、同じく多重ロジスティック回帰分析法により、乳酸、オルニチン、トリプトファン、及びフマル酸のＭＳ／ＭＳ測定値を用いてステージ２の大腸がんの予測式を作成した。また、同じく多重ロジスティック回帰分析法により、乳酸、オルニチン、トリプトファン、フマル酸、及びリンゴ酸のＭＳ／ＭＳ測定値を用いてステージ０からステージ２のいずれかのステージにある大腸がんの予測式を作成した。

図２に示すモデル４では、より高度な予測式を作成するため、図１の候補群から多くの生体内代謝産物の組み合わせを選定し、多重ロジスティック回帰分析法により、オルニチン、グリコール酸、トリプトファン、ピルビン酸、フマル酸、パルミトレイン酸、リジン、及び３-ヒドロキシイソ吉草酸のＭＳ／ＭＳ測定値を用いてステージ０からステージ２のいずれかのステージにある大腸がんの予測式を作成した。

次に、モデル１～４の生体内代謝産物のＭＳ／ＭＳ測定値を用いて作成された予測式に基づく判定結果について説明する。

＜１．ステージ０の大腸がんの判定＞
年齢、性別、ＢＭＩを揃えた健常者及びステージ０の大腸がん患者それぞれ７９名について、上述した手法に基づいて、図２のモデル１～３に示す生体内代謝産物のＭＳ／ＭＳ測定値を求め、それらＭＳ／ＭＳ測定値を使って以下の式（２）～（４）を確立した。式（２）はモデル１、式（３）はモデル２、式（４）はモデル３の生体内代謝産物を用いた予測式を示す。また、式中、[乳酸]、[オルニチン]等は、それぞれ括弧内に示す生体内代謝産物のＭＳ／ＭＳ測定値を示す。

P =1/[1+exp{-(-13.506931+49.9697673*[乳酸]+4.26878539*[オルニチン])}]
・・・式（２）
P =1/[1+exp{-(-27.2172815+97.973150029*[乳酸]+ 219.03142781*[グリコール酸]-5.222210335*[尿酸]-68.8976813*[グリセリン酸])}]
・・・式（３）
P =1/[1+exp{-(-5.945008762+61.715859951*[乳酸]-0.690292331*[2-ヒドロキシブチル酸]+7.782649017*[オルニチン]-9.877482547*[トリプトファン])}]
・・・式（４）

上記式（２）～（４）で求められるＰ値のカットオフ値をそれぞれ0.63、0.6、0.5としたときのＲＯＣ解析（Receiver Operating Characteristic analysis）の結果を図３～図５に示す。図３はモデル１、図４はモデル２、図５はモデル３の解析結果（ＲＯＣ曲線）を示す。また、モデル１の感度は８９．９％、特異度は９４．９％、正診率は９２．４％、モデル２の感度は９６．２％、特異度は９８．７％、正診率は９７．５％、モデル３の感度は９２．４％、特異度は９７．５％、正診率は９５．０％であった。

＜２．ステージ１の大腸がんの判定＞
年齢、性別、ＢＭＩを揃えた健常者とステージ１の大腸がん患者それぞれ８０名について、上述したステージ０と同様の手法で、図２のモデル１～３に示す生体内代謝産物のＭＳ／ＭＳ測定値を求め、それらＭＳ／ＭＳ測定値を使って以下の式（５）～（７）を確立した。式（５）はモデル１、式（６）はモデル２、式（７）はモデル３の生体内代謝産物の組み合わせを用いた予測式を示す。
P =1/(1+exp(-(-5.244098866-39.34118597*[グリセリン酸]+137.16175377*[グリコール酸]-3.169957639*[トリプトファン])))
・・・式（５）
P =1/(1+exp(-(-14.99143949+373.05777093*[グリコール酸]+36.504337562*[ピルビン酸]-1.92165145*[ガラクトース]-198.2189077*[グリシン]-3.311584205*[尿酸]-30.15525187*[グリセリン酸])))
・・・式（６）
P =1/(1+exp(-(3.5655473738+25.015349738*[乳酸]+4.7551912842*[オルニチン]-7.667356818*[トリプトファン]-14.85882644*[クエン酸])))
・・・式（７）

上記式（５）～（７）で求められるＰ値のカットオフ値をそれぞれ0.48、0.495、0.489としたときのＲＯＣ解析（Receiver Operating Characteristic analysis）の結果を図６～図８に示す。図６はモデル１、図７はモデル２、図８はモデル３の解析結果（ＲＯＣ曲線）を示す。また、モデル１の感度は９３．８％、特異度は９２．４％、正診率は９３．１％、モデル２の感度は９８．８％、特異度は９８．９％、正診率は９８．８％、モデル３の感度は８７．５％、特異度は８８．０％、正診率は８７．８％であった。

＜３．ステージ２の大腸がんの判定＞
年齢、性別、ＢＭＩを揃えた健常者とステージ２の大腸がん患者それぞれ１２３名について、上述したステージ０と同様の手法で、図２のモデル１～３に示す生体内代謝産物のＭＳ／ＭＳ測定値を求め、それらＭＳ／ＭＳ測定値を使って以下の式（８）～（１０）を確立した。式（８）はモデル１、式（９）はモデル２、式（１０）はモデル３の生体内代謝産物の組み合わせを用いた予測式を示す。
P =1/(1+exp(-(-19.5140397+22.817689838*[ピルビン酸]+68.301755498*[グリコール酸]+214.36183256*[フマル酸]+25.33111413*[サッカロース])))
・・・式（８）
P =1/(1+exp(-(-13.29001781+41.289331856*[ピルビン酸]+147.27766415*[グリコール酸]-1.508033407*[ロイシン]-3.04399115*[リン酸]+82.577937486*[サッカロース]+361.20773121*[フマル酸])))
・・・式（９）
P =1/(1+exp(-(-4.98049072+25.353666196*[乳酸]+7.0154960778*[オルニチン]+118.40574539*[フマル酸]-6.242588904*[トリプトファン])))
・・・式（１０）

上記式（８）～（１０）で求められるＰ値のカットオフ値をそれぞれ0.75、0.5、0.41としたときのＲＯＣ解析の結果を図９～図１１に示す。図９はモデル１、図１０はモデル２、図１１はモデル３の解析結果（ＲＯＣ曲線）を示す。また、モデル１の感度は９０．２％、特異度は９９．２％、正診率は９４．７％、モデル２の感度は９６．８％、特異度は９８．３％、正診率は９７．６％、モデル３の感度は９１．９％、特異度は８９．２％、正診率は９０．６％であった。

＜４．ステージ０～２の大腸がんの判定＞
次に、年齢、性別、ＢＭＩを揃えた健常者とステージ０～２の大腸がん患者それぞれ２８２名について、上述したステージ０～２と同様の手法で、図２のモデル１～３に示す生体内代謝産物のＭＳ／ＭＳ測定値を求め、それらＭＳ／ＭＳ測定値を使って以下の式（１１）～（１４）を確立した。式（１１）はモデル１、式（１２）はモデル２、式（１３）はモデル３、式（１４）はモデル４の生体内代謝産物の組み合わせを用いた予測式を示す。

P =1/(1+exp(-(-8.910098221+16.291903021*[ピルビン酸]+68.3503626855752*[グリコール酸]-7.011317019*[トリプトファン]+4.9721464301*[オルニチン])))
・・・式（１１）
P =1/(1+exp(-(-11.00126848+23.045661795*[ピルビン酸]+62.493803471*[グリコール酸]-583.6163492*[2-ケト－イソ吉草酸]+235.04693604*[フマル酸])))
・・・式（１２）
P =1/(1+exp(-(-3.340652437+29.789478677*[乳酸]-7.212093514*[トリプトファン]+5.5597551347*[オルニチン]+237.87196106*[フマル酸]-59.94751789*[リンゴ酸])))
・・・式（１３）
P =1/(1+exp(-(-8.992407686+19.375560943*[ピルビン酸]+82.332483986*[グリコール酸]-6.864158669*[トリプトファン]+9.6859550708*[オルニチン]-67.47807685*[パルミトレイン酸]-5.757937815*[リジン]-24.99353052*[3-ヒドロキシイソ吉草酸]+296.32483475*[フマル酸])))
・・・式（１４）

上記式（１１）～（１４）で求められるＰ値のカットオフ値をそれぞれ0.45、0.45、0.4、0.19としたときのＲＯＣ解析の結果を図１２～図１５に示す。図１２はモデル１、図１３はモデル２、図１４はモデル３、図１５はモデル４の解析結果（ＲＯＣ曲線）を示す。また、モデル１の感度は９５．４％、特異度は９２．８％、正診率は９４．１％、モデル２の感度は９６．５％、特異度は９４．９％、正診率は９５．７％、モデル３の感度は９３．３％、特異度は８９．７％、正診率は９１．５％、モデル４の感度は９８．３％、特異度は９３．８％、正診率は９６．１％であった。

以下の表１は、上述のモデル１～４の予測式で求められたＰ値に基づく各ステージの大腸がんの判定結果をまとめて示したものである。表１中、AUCは血中濃度－時間曲線下面積（Area Under the blood concentration-time Curve）を示す。

表１から分かるように、モデル１～４のいずれの予測式においても、ステージ０～２の早期の大腸がんを、ステージ毎に高い感度で正確に診断することができることが示唆された。また、ステージ０～２までのいずれかのステージにある早期の大腸がんを高い感度で正確に診断することができることも示唆された。

＜実施例２＞
年齢、性別、ＢＭＩを揃えた健常者及び大腸がん患者それぞれ２８２名について、実施例１と同様の手順で生体内代謝産物のＭＳ／ＭＳ測定値を求め、該ＭＳ／ＭＳ値について適宜のデータ解析を行い、実施例１とは別の方法で、ステージ０～２の各ステージにある大腸がんの判定、及びステージ０～２のいずれかにある大腸がんの判定を行った実施例２について以下に説明する。
この実施例では、ステージ０～２の各ステージにある大腸がんの判定、及びステージ０～２のいずれかにある大腸がんの判定を、共通の生体内代謝産物のＭＳ／ＭＳ測定値を用いた点が実施例１と異なる。

＜１．乳酸及びオルニチンを用いた判定＞
乳酸及びオルニチンのＭＳ／ＭＳ測定値を使った、各ステージの予測式を以下に示す。また、各予測式から求められるＰ値のカットオフ値とそのときのＲＯＣ解析の結果を図１６～図１９及び以下の表２に示す。
＜ステージ０＞
P =1/[1+exp{-(-13.506931+49.9697673*[乳酸]+4.26878539*[オルニチン])}]
＜ステージ１＞
P =1/[1+exp{-(-3.87236783+15.326042355*[乳酸]+1.2883608996*[オルニチン])}]
＜ステージ２＞
P =1/[1+exp{-(-8.659104135+25.441015108*[乳酸]+5.2519152847*[オルニチン])}]
＜ステージ０－２＞
P =1/[1+exp{-(-7.109178221+24.600621297*[乳酸]+3.2254288676*[オルニチン])}]

＜２．ピルビン酸及びトリプトファンを用いた判定＞
ピルビン酸及びトリプトファンのＭＳ／ＭＳ測定値を使った、各ステージの予測式を以下に示す。また、各予測式から求められるＰ値のカットオフ値とそのときのＲＯＣ解析の結果を図２０～図２３及び上述の表２に示す。
＜ステージ０＞
P =1/[1+exp{-(-3.024371454-4.885245141*[トリプトファン]+29.99823801*[ピルビン酸])}]
＜ステージ１＞
P =1/[1+exp{-(1.4528990406-4.070618917*[トリプトファン]+9.2766738843*[ピルビン酸])}]
＜ステージ２＞
P =1/[1+exp{-(-0.438767321-4.66996093*[トリプトファン]+17.635049962*[ピルビン酸])}]
＜ステージ０－２＞
P =1/[1+exp{-(-0.20906188-3.903240175*[トリプトファン]+ 14.960074677*[ピルビン酸])}]

＜３．乳酸を用いた判定＞
乳酸のＭＳ／ＭＳ値のみを用いてステージ０～２の各ステージにある大腸がん、及びステージ０～２のいずれかにある大腸がんの判定を行った結果を上述の表２に示す。この例のように、１種類の生体内代謝産物のＭＳ／ＭＳ値を用いる場合は、予測式は作成せず、ＭＳ／ＭＳ値がカットオフ値よりも大きければ大腸がんの可能性が高い（陽性）と判断し、その結果に基づき、感度、特異度、正診率を求めた。このようにして求めた感度及び特異度から作成したＲＯＣ曲線を図２４～図２７に示す。

＜４．グリコール酸を用いた判定＞
グリコール酸のＭＳ／ＭＳ値のみを用いてステージ０～２の各ステージにある大腸がん、及びステージ０～２のいずれかにある大腸がんの判定を行った結果を上述の表２に示す。この例でも乳酸を用いた判定と同様、予測式は作成せず、ＭＳ／ＭＳ値がカットオフ値よりも大きければ大腸がんの可能性が高い（陽性）と判断し、その結果に基づき、感度、特異度、正診率を求めた。このようにして求めた感度及び特異度から作成したＲＯＣ曲線を図２８～図３１に示す。

＜５．ピルビン酸を用いた判定＞
ピルビン酸のＭＳ／ＭＳ値のみを用いてステージ０～２の各ステージにある大腸がん、及びステージ０～２のいずれかにある大腸がんの判定を行った結果を上述の表２に示す。この例でも乳酸を用いた判定と同様、予測式は作成せず、ＭＳ／ＭＳ値がカットオフ値よりも大きければ大腸がんの可能性が高い（陽性）と判断し、その結果に基づき、感度、特異度、正診率を求めた。このようにして求めた感度及び特異度から作成したＲＯＣ曲線を図３２～図３５に示す。

表２から分かるように、共通の生体内代謝産物のＭＳ／ＭＳ値を用いた場合でも、ステージ０～２の全てのステージの大腸がんを高い感度で、正確に診断することができることが示唆された。特に、ピルビン酸とトリプロファン、グリコール酸のみ、ピルビン酸のみを用いた大腸がんの判定では、全てのステージにおいて、８０％以上の正診率が得られことから、これらの生体内代謝産物のＭＳ／ＭＳ値は大腸がんの有効なマーカとなりうることが推測された。

Claims

被検者から採取された生体試料に対してクロマトグラフ－ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで得られたデータに基づき、
前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、ピルビン酸、グリコール酸、オルニチン、及びトリプトファンの測定値を求め、該測定値を用いてステージ０からステージ２の間の大腸がんである可能性を示す指標値を求める、大腸がんの指標値取得方法。
被検者から採取された生体試料に対してクロマトグラフ－ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで得られたデータに基づき、
前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、ピルビン酸、グリコール酸、フマル酸、及び２－ケト－イソ吉草酸の測定値を求め、該測定値を用いてステージ０からステージ２の間の大腸がんである可能性を示す指標値を求める、大腸がんの指標値取得方法。
被検者から採取された生体試料に対してクロマトグラフ－ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで得られたデータに基づき、
前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、乳酸、オルニチン、トリプトファン、フマル酸、及びリンゴ酸の測定値を求め、該測定値を用いてステージ０からステージ２の間の大腸がんである可能性を示す指標値を求める、大腸がんの指標値取得方法。
被検者から採取された生体試料に対してクロマトグラフ－ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで得られたデータに基づき、
前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、オルニチン、グリコール酸、トリプトファン、ピルビン酸、フマル酸、パルミトレイン酸、リジン、及び３-ヒドロキシイソ吉草酸の測定値を求め、該測定値を用いてステージ０からステージ２の間の大腸がんである可能性を示す指標値を求める、大腸がんの指標値取得方法。
被検者から採取された生体試料に対してクロマトグラフ－ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで得られたデータに基づき、
前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、乳酸、及びオルニチンの測定値を求め、該測定値を用いてステージ０の大腸がんである可能性を示す指標値を求める、大腸がんの指標値取得方法。
被検者から採取された生体試料に対してクロマトグラフ－ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで得られたデータに基づき、
前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、乳酸、グリコール酸、尿酸、及びグリセリン酸の測定値を求め、該測定値を用いてステージ０の大腸がんである可能性を示す指標値を求める、大腸がんの指標値取得方法。
被検者から採取された生体試料に対してクロマトグラフ－ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで得られたデータに基づき、
前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、乳酸、２－ヒドロキシブチル酸、オルニチン、及びトリプトファンの測定値を求め、該測定値を用いてステージ０の大腸がんである可能性を示す指標値を求める、大腸がんの指標値取得方法。
被検者から採取された生体試料に対してクロマトグラフ－ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで得られたデータに基づき、
前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、グリコール酸、グリセリン酸、及びトリプトファンの測定値を求め、該測定値を用いてステージ１の大腸がんである可能性を示す指標値を求める、大腸がんの指標値取得方法。
被検者から採取された生体試料に対してクロマトグラフ－ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで得られたデータに基づき、
前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、グリコール酸、ピルビン酸、ガラクトース、グリシン、尿酸、及びグリセリン酸の測定値を求め、該測定値を用いてステージ１の大腸がんである可能性を示す指標値を求める、大腸がんの指標値取得方法。
被検者から採取された生体試料に対してクロマトグラフ－ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで得られたデータに基づき、
前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、乳酸、オルニチン、トリプトファン、クエン酸の測定値を求め、該測定値を用いてステージ１の大腸がんである可能性を示す指標値を求める、大腸がんの指標値取得方法。
被検者から採取された生体試料に対してクロマトグラフ－ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで得られたデータに基づき、
前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、ピルビン酸、グリコール酸、フマル酸、及びサッカロースの測定値を求め、該測定値を用いてステージ２の大腸がんである可能性を示す指標値を求める、大腸がんの指標値取得方法。
被検者から採取された生体試料に対してクロマトグラフ－ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで得られたデータに基づき、
前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、ピルビン酸、グリコール酸、ロイシン、リン酸、サッカロース、及びフマル酸の測定値を求め、該測定値を用いてステージ２の大腸がんである可能性を示す指標値を求める、大腸がんの指標値取得方法。
被検者から採取された生体試料に対してクロマトグラフ－ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで得られたデータに基づき、
前記生体試料に含まれる生体内代謝産物である、乳酸、オルニチン、フマル酸、及びトリプトファンの測定値を求め、該測定値を用いてステージ２の大腸がんである可能性を示す指標値を求める、大腸がんの指標値取得方法。
請求項１から１３のいずれかに記載の大腸がんの指標値取得方法において、
前記生体試料が、全血、血漿、及び血清から選択されるいずれかである、大腸がんの指標値取得方法。
請求項１４に記載の大腸がんの指標値取得方法において、
前記生体試料が血漿である、大腸がんの指標値取得方法。
請求項１から１５のいずれかに記載の大腸がんの指標値取得方法において、
前記クロマトグラフ－ＭＳ／ＭＳ分析が、ガスクロマトグラフ－ＭＳ／ＭＳ分析である、大腸がんの指標値取得方法。
請求項１から１６のいずれかに記載の大腸がんの指標値取得方法において、
前記各々の生体内代謝産物の測定値の多重ロジスティック回帰分析により前記指標値を求める、大腸がんの指標値取得方法。
前記指標値がカットオフ値よりも高いことに基づいて前記大腸がんの可能性があると判定するためのものである、請求項１７に記載の大腸がんの指標値取得方法。