CN103278579A - 人类肠管无神经节细胞症相关的血浆代谢小分子标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学及临床医学领域，公开了人类肠管无神经节细胞症相关的血浆代谢小分子标志物及其应用。该标志物为苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸中的一种或多种。该标志物对肠管无神经节细胞症具有特异性和敏感性。本发明提供的试剂盒采用UPLC-MS可准确检测血浆苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸，为诊断肠管无神经节细胞症提供较好的辅助信息，可避免侵入性诊断，并可在早期进行筛查和诊断，可反复检测并易于动态监测。

Description

人类肠管无神经节细胞症相关的血浆代谢小分子标志物及其应用

发明领域

本发明属于分析化学及临床医学领域，涉及人类肠管无神经节细胞症相关的血浆代谢小分子标志物及其应用。

背景技术

先天性肠管无神经节细胞症（Colonic Aganglionosis，CA），是一种以消化道发育过程中远端肠道缺乏神经节细胞为主要病理特征的消化道发育畸形。主要致病机制为肠神经系统发育过程中肠道神经系统向尾端迁移功能障碍，从而导致远端肠管粘膜肌及粘膜下层神经节细胞缺如，远端肠管功能受限，近端肠管代偿性扩张。其临床表现为排便困难而引起的胎便排除延迟，腹胀及肠梗阻为主要临床症状。CA在先天性消化道畸形中的发病率仅次于先天性肛门直肠畸形。目前我国统计活产儿发病率约为1:3000，男女比大约为4:1，即每年有近一万的新生儿会出现该种出生缺陷。CA的发病原因目前尚不完全明了，主要认为：在胚胎发育过程中，胚胎第5周神经母细胞开始沿迷走神经干由头侧向尾侧迁移，于胚胎第12周到达消化道远端，在此过程中任何原因导致神经母细胞迁移发生停顿即可造成远端肠管肠壁神经节细胞缺如，即CA。病理解剖提示直肠及远端结肠狭窄，近端肠管扩张，狭窄段肠壁黏膜下层及黏膜肌层神经节细胞缺如。狭窄段肠壁胆碱能受体及肾上腺能β受体含量较正常肠段减少，导致肠管及内括约肌痉挛，并且缺乏正常的肠蠕动，因此会形成功能性肠梗阻。长期慢性肠梗阻导致患儿食欲下降、营养吸收障碍、生长发育迟缓、贫血等，严重者引起小肠结肠炎、肠穿孔及多器官功能衰竭，危及患儿生命，给患儿及其家庭带来严重后果。

肠管无神经节细胞症患儿治疗多需手术，并且就目前来说手术是解决患儿临床症状的根治办法。但在临床工作中仍然会面临很多困难，特别是手术时机如何选择等。而新生儿CA的诊断相当困难，结合其临床表现：不排胎便及胎便排出延迟合并腹胀、梗阻、呕吐，直肠指检伴有气便排出，需考虑该疾病诊断，同时需对患儿进行一系列辅助检查如：X线，钡剂灌肠检查，肛门直肠测压，酶组织化学检查及活检等。以上辅助检查可以帮助诊断该疾病，但尚存在一些缺陷，如检查价格昂贵、射线辐射危险，操作繁琐且有一定的创伤性及风险。这都给患儿带来极大的痛苦并且给家庭带来严重的经济负担。更为重要的是，这类检查均基于不排胎便及胎便排出延迟等临床症状，而出现此类症状往往已在患病后数日常错过了最佳的早期手术时机，并给患儿带来了相当长时间的痛苦，寻找一种简单、准确、微创的早期CA诊断方法意义重大。

代谢组学（Metabolomics/Metabonomics）是20世纪90年代末期发展起来的一门新兴学科，它是通过考察生物体系在遗传改变或受刺激或扰动后，其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学(Nicholson et al.2002)。所谓代谢组(Metabolome)是基因组的下游产物也是最终产物，是一些参与生物体新陈代谢、维持生物体正常功能和生长发育的小分子化合物的集合，主要是相对分子质量小于1000的内源性小分子，这些内源性代谢小分子涉及糖代谢、能量代谢、脂代谢、氨基酸代谢、核酸代谢、辅酶代谢等。

正常状态下的生物体是一个完整的系统，生物体液、细胞和组织中的代谢物处于一个稳定的平衡状态。机体由于遗传或者后天原因发生了病理变化，这一平衡就被打破，代谢产物和代谢过程也产生了相应的变化。通过代谢组学分析了解代谢小分子在疾病过程中的变化，可以帮助人们寻找有关的生物标志物(biomarker)可以辅助疾病的诊断，也可以帮助人们通过小分子物质本身涉及的代谢通路了解疾病的发病机制并为药物研发提供特异性的靶标。近年来，代谢组学在人类各类疾病的研究中在疾病的早期诊断中取得了诸多具有重大意义的研究成果，如心血管疾病、糖尿病和癌症，相关论文发表在学术期刊《Nature》、《Nature medicine》、《Journal of hepatology》和《Cancer research》上，展现了代谢小分子在人类疾病诊断中巨大的潜力与价值。然而代谢组学分析血浆中代谢小分子在CA早期诊断监测中的应用还未得到相应的关注。

目前代谢组学研究常用技术包括液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气象色谱-质谱联用(GC-MS)及核磁共振技术（NMR）。核磁共振技术特点是对待测组分无破坏，样本前处理简单，但灵敏度较低；气相色谱-质谱联用具有较好的灵敏度和重现性，但一般要采用衍生化方法对样本进行前处理，使得实验步骤变得复杂。而LC-MS具有样本处理简单，灵敏度高，临床实用性强的特点，故而采用LC-MS进行代谢小分子的代谢组学分析，若能发现稳定的与CA发病相关的特异血浆代谢小分子作为生物标志物，并研发相应疾病的代谢小分子标志的LC-MS检测方法，不仅在该领域处于国际领先地位，可创造令人瞩目的经济效益，对我国出生缺陷的防治也将是一次强有力的推动。

发明内容

本发明的目的是提供一种人类肠管无神经节细胞症相关的血浆代谢小分子标志物。

本发明另一个目的是提供血浆代谢小分子标志物及其同位素内标在制备人类肠管无神经节细胞症诊断或监测试剂盒中的应用。

本发明再有一个目的是提供人类肠管无神经节细胞症诊断或监测的UPLC-MS（超高效液相色谱串联质谱）的检测试剂盒。该试剂盒用于检测上述血浆代谢小分子标志物。

本发明的目的是通过下列技术措施实现的：

人类肠管无神经节细胞症相关的血浆代谢小分子标志物，该标志物为苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸中的一种或多种。

所述的血浆代谢小分子标志物，该标志物由苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸构成。

所述的血浆代谢小分子标志物的同位素内标，该同位素内标为下列物质中的一种或多种：苯丙色氨酸对应的碳13稳定同位素内标，琥珀酰肉碱对应的碳13稳定同位素内标，γ-谷氨酰谷氨酸对应的碳13稳定同位素内标。

所述的血浆代谢小分子标志物在制备人类肠管无神经节细胞症诊断或监测试剂盒中的应用。

所述的同位素内标在制备人类肠管无神经节细胞症诊断或监测试剂盒中的应用。

一种人类肠管无神经节细胞症诊断或监测的UPLC-MS的检测试剂盒，该试剂盒用于检测上述的血浆代谢小分子标志物。

所述的检测试剂盒，该试剂盒中含有上述的血浆代谢小分子苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸的碳13稳定同位素内标。

所述的检测试剂盒，该试剂盒还含有UPLC-MS检测用的色谱分离用色谱柱及提取用和色谱流动相用试剂。

所述的检测试剂盒，该试剂盒含有：

碳13标记的苯丙色氨酸、碳13标记的琥珀酰肉碱、碳13标记的γ-谷氨酰谷氨酸中的一种或多种；（稳定同位素内标物）

色谱柱：Waters BEH C181.7μm100mm；（配套色谱柱）

试剂A：甲醇；

试剂B：含0.1%的甲酸的水；（提取和流动相用）

试剂C：6.5mM的重碳酸铵pH=8的水；（提取和流动相用）

试剂D：含0.1%甲酸的甲醇；（流动相用）

试剂E：含6.5mM重碳酸铵的甲醇。（流动相用）

本发明详细描述如下：

本发明人以标准操作程序（SOP）采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了基于UPLC/MS的代谢组学方法进行分析。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

一、研究对象选择和分组依据

A组：健康对照组（n=100，85人筛选，15人独立人群验证）：

1.年龄在0至6月间；

2.无消化系统疾病；

3.无其它先天畸形；

4.无其他全身性重大疾病。

B组：肠管无神经节细胞症组（n=100，85人筛选，15人独立人群验证）：

1.年龄在0至6月间；

2.经钡剂灌肠、结肠测压、术后病理证实为肠管无神经节细胞症；

3.无其他伴随先天畸形；

4.无其它消化系统疾病；

5.无其他全身性重大疾病。

二、UPLC-MS代谢组学分析和CA诊断用代谢小分子筛选和验证

1.样本前处理

1.1新鲜血液于离心机3000rpm离心5min，取上清100μl分装至洁净1.5ml EP管中。

1.2100μl血浆用300μl甲醇沉淀蛋白。

1.3吸取上清，平均分成2份，用氮气吹干再用真空干燥。

1.4用50μL水（含0.1%的甲酸）溶解一份干燥物(酸性提取物)，另一份干燥物用50μL含6.5mM的重碳酸铵pH=8的水溶解（碱性提取物）。

2.仪器检测

2.1分析仪器：采用Waters Acquity公司的UPLC串联ThermoFisher LTQ-FT线性离子阱回旋共振质谱仪。

2.2液相条件：

2.2.1液相色谱柱为Waters BEH C181.7μm100mm色谱柱，柱温为40度。

2.2.2酸性提取物：采用的流动相为（A）含0.1%甲酸的水和（B）含0.1%甲酸的甲醇，流速为350μL/min。1.2仪器梯度为：0-4min0%B到70%B，4-4.5min70%-98%B，4.5-5.4min98%B。

2.2.3碱性提取物：流动相为（A）含6.5mM的重碳酸铵pH=8的水，（B）含6.5mM重碳酸铵的甲醇（甲醇与重碳酸铵溶液体积比95/5）。

2.2.4仪器梯度为：0-4min0%B到70%B，4-4.5min70%-98%B，4.5-5.4min98%B。

2.3进样模式：体积5μl，采用2×overfill的模式进样。

2.4质谱条件

2.4.1用ESI电离源进行分析。

2.4.2酸性的提取物采用正离子模式，碱性提取物采用负离子模式检测。

2.4.3质谱的接口毛细管温度为350度，shealth gas流速为40（arbitrary units），auxgas flow为5（arbitrary units），Spray电压正离子模式为4.5kv，负离子模式为3.75kv。仪器扫描的分子量范围为99-1000m/z。扫描速率为6次每秒（3次MS和3次MS/MS扫描）。

3.生物标志物筛选

差异物在两组间比较采用Welch’s t-tests和Wilcoxon’s rank sum tests，并采用FDR进行多重统计比较p值控制，参考代谢组学临床研究标准，以控制后p值小于0.002，变化倍数上调或下调大于2.5倍为筛选标准进行血浆诊断用差异小分子的筛选，共发现正离子模式下质荷比为352.2、262.1、277.1三个潜在标志物符合上述条件（见表1）。

4.物质定性

通过质谱信息搜索chemspider数据库（http://www.chemspider.com/），初步判断上述化学物为苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸。化学物最终定性采用苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸的标准品及碳13标记的苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸稳定同位素内标物，比对采用色谱信息（保留时间）和质谱信息（精确分子量、同位素分布和MS/MS碎片信息）。

5.健康对照组、CA组血浆样本中代谢小分子的差异和诊断意义

检测到的存在差异的健康对照和CA患者血浆代谢小分子苯丙色氨酸在CA患者中的含量显著低于健康对照组，而琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸在CA患者中的含量显著高于健康对照组，并且这些代谢小分子在血浆中的量具有稳定性。采用独立人群应用上述代谢小分子诊断CA，灵敏度为93.33%,特异度为86.67%，ROC曲线下面积为0.9333，具有较高的诊断价值。

同时我们通过数据库和尿酸标准品定性了在负离子模式下血浆中常见化学物尿酸（见表2），目前已有研究发现其与神经系统疾病有关，但其诊断灵敏度为46.67%,特异度为60.00%，ROC曲线下面积为0.6178，均明显低于筛选出的CA生物标志物组合，说明我们发现的标志物组合相比常见血浆化学物具有更高的诊断价值。

三、诊断试剂盒制备方法

根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于CA动态监测的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含测定受试者血浆中稳定存在且可检测的苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸的稳定同位素内标。诊断试剂盒包括一批血浆代谢小分子提取及色谱分离用试剂及器材。

本发明的有益效果：

本发明人通过采用UPLC-MS比较正常对照和肠管无神经节细胞症患儿血浆中的代谢小分子，发现了血浆中存在可用于评估是否患有CA具有诊断价值的血浆代谢小分子标志物，以及该血浆代谢小分子标志物检测的UPLC-MS应用，研制出可便于临床应用的CA诊断、监测试剂盒。

本发明采用血浆代谢小分子作为CA评价的标志物的优越性在于：

（1）血浆代谢小分子是一种新型生物标志物，相比传统蛋白生物标志物其与疾病结局关联更强，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高CA诊断的敏感性和特异性，该类小分子生物标志物的成功开发是对以蛋白为主的传统生物标志物的颠覆，将为出生缺陷的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

（2）本发明提供的血浆代谢小分子标志物可用于肠管无神经节细胞症诊断标志物，可避免侵入性诊断，并可在早期通过微创方式获得CA的患病风险，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。

（3）本发明采用符合肠管无神经节细胞症和健康对照人群的样本进行验证，证明这几种标志物水平在组间存在显著性差异并具有稳定性，以说明该标志物具有灵敏度和特异度，可作为标志物使用。

（4）本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系，初期通过预实验筛选多种血浆代谢小分子，应用UPLC-MS进行独立人群验证，保证了该血浆代谢生物标志物具有可靠的参考价值，为CA的临床诊断提供好较好的辅助信息。

（5）UPLC-MS技术样本处理简单，仪器分析迅速准确，具有较高的临床检测实用价值。

附图说明

图1肛管直肠测压：该图显示CA病例直肠被动性扩张后内括约肌松弛反射缺如。

图2灌肠造影检查：该图显示CA影像学表现为结肠远端狭窄、痉挛，提示无神经节细胞病变肠段累及结肠远端和直肠。左图为正位，右图为侧位。

图3代谢小分子水平波动性。

图4正常对照组和CA组之间的ROC曲线（苯丙色氨酸）。

图5正常对照组和CA组之间的ROC曲线（琥珀酰肉碱）。

图6正常对照组和CA组之间的ROC曲线（γ-谷氨酰谷氨酸）。

图7正常对照组和CA组之间的ROC曲线（苯丙色氨酸和琥珀酰肉碱）。

图8正常对照组和CA组之间的ROC曲线（苯丙色氨酸和γ-谷氨酰谷氨酸）。

图9正常对照组和CA组之间的ROC曲线（琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸）。

图10正常对照组和CA组之间的ROC曲线（苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸）。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1研究对象选择和分组依据

本发明人于2009年7月到2011年9月间从南京医科大学附属儿童医院等医院搜集符合要求的CA患儿及正常非CA儿童血液和组织样品（肛管直肠测压、影像学检查典型表现如图1，图2），通过对样品资料的整理，从中选择了符合要求的100例健康对照（平均年龄：89.45±9.1天）、100例肠管无神经节细胞症患者（平均年龄：92.3±7.01天）作为CA代谢小分子生物标志物的筛选实验对象。具体的样品归类标准如下：

A组：健康对照组（n=100，85人筛选，15人独立人群验证）：

1.年龄在0至6月间；

2.无消化系统疾病；

3.无其它先天畸形；

4.无其他全身性重大疾病。

B组：肠管无神经节细胞症组（n=100，85人筛选，15人独立人群验证）：

1.年龄在0至6月间；

2.经钡剂灌肠、结肠测压、术后病理证实为肠管无神经节细胞症；

3.无其他伴随先天畸形；

4.无其它消化系统疾病；

5.无其他全身性重大疾病。

实施例2研究对象主要诊断依据

研究针对反复排便困难、腹胀、低位肠梗阻的患儿使用肛管直肠测压、影像学检查、直肠壁组织学检查诊断先天性肠管无神经节细胞症。主要诊断依据为：（1）肛管直肠测压法显示肛门内括约肌松弛反射缺如；肛管节律性收缩明显减少；直肠内和内括约肌部静止压高于正常。（2）灌肠造影表现为：1.结肠远端痉挛、狭窄；2.结肠近端扩张；3.痉挛肠管和扩张肠管之间有一移形段，呈漏斗状；（3）直肠壁组织学检查结果显示黏膜下及肌间神经丛神经节细胞缺如或细胞发育异常。正常的神经节细胞核大、染色深、居正中、核仁明显、周围胞浆嗜碱性，而病变肠段即狭窄、痉挛肠管缺乏神经节细胞，神经丛增生。以上临床检查方法均存在其局限性，其中直肠肛管测压诊断准确性在儿童组高达95%以上，新生儿组则存在假阴性和假阳性结果。患儿接受检查时需口服镇静剂。放射学方法对患儿有辐射损伤，对新生儿也有假阴性和假阳性的情况。直肠壁活检方法较为精确，但属于创伤性诊断方法，需接受麻醉，对患儿有明显创伤性，风险较大，难以普遍开展。临床工作中更多的患儿确诊的方法是术后对手术切除标本进行病理学检查，术后组织标本狭窄段未见神经节细胞者为该可诊断肠管无神经节细胞症。

实施例3UPLC-MS代谢组学CA生物标志物筛选

1.样本前处理

1.新鲜血液于离心机3000rpm离心5min，取上清100μl分装至洁净1.5ml EP管中。

2.100μl血浆用300μl甲醇沉淀蛋白。

3.吸取上清，平均分成2份，用氮气吹干再用真空干燥。

4.用50μL水（含0.1%的甲酸）溶解一份干燥物(酸性提取物)，另一份干燥物用50μL含6.5mM的重碳酸铵pH=8的水溶解（碱性提取物）。

2.仪器检测

2.1分析仪器：采用Waters Acquity公司的UPLC串联ThermoFisher LTQ-FT线性离子阱回旋共振质谱仪。

2.2液相条件：

2.2.1液相色谱柱为Waters BEH C181.7μm100mm色谱柱，柱温为40度。

2.2.2酸性提取物：采用的流动相为（A）含0.1%甲酸的水和（B）含0.1%甲酸的甲醇，流速为350μL/min。1.2仪器梯度为：0-4min0%B到70%B，4-4.5min70%-98%B，4.5-5.4min98%B。

2.2.3碱性提取物：流动相为（A）含6.5mM的重碳酸铵pH=8的水，（B）含6.5mM重碳酸铵的甲醇（甲醇与重碳酸铵溶液体积比95/5）。

2.2.4仪器梯度为：0-4min0%B到70%B，4-4.5min70%-98%B，4.5-5.4min98%B。

2.3进样模式：体积5μl，采用2×overfill的模式进样。

2.4质谱条件

2.4.1用ESI电离源进行分析。

2.4.2酸性的提取物采用正离子模式，碱性提取物采用负离子模式检测。

2.4.3质谱的接口毛细管温度为350度，shealth gas流速为40（arbitrary units），auxgas flow为5（arbitrary units），Spray电压正离子模式为4.5kv，负离子模式为3.75kv。仪器扫描的分子量范围为99-1000m/z。扫描速率为6次每秒（3次MS和3次MS/MS扫描）。

3.生物标志物筛选

差异物在两组间比较采用Welch’s t-tests和Wilcoxon’s rank sum tests，并采用FDR进行多重统计比较p值控制，参考代谢组学临床研究标准，以控制后p值小于0.002，变化倍数上调或下调大于2.5倍为筛选标准进行血浆诊断用差异小分子的筛选，共发现正离子模式下质荷比为352.2、262.1、277.1三个潜在标志物符合上述条件（见表1）。

4.物质定性

通过质谱信息搜索chemspider数据库（http://www.chemspider.com/），初步判断上述化学物为苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸。化学物最终定性采用苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸的标准品及碳13标记的苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸稳定同位素内标物，比对采用色谱信息（保留时间）和质谱信息（精确分子量、同位素分布和MS/MS碎片信息）。

表1CA生物标志物信息

注：苯丙色氨酸倍数(病例/对照)值0.28即0.28/1，相当于下调3.57倍。

实施例4个体血浆代谢小分子的稳定性分析

采用实施例3的方法对八名儿童的血浆代谢小分子水平的稳定性进行评价。和实施例3同样的采集方法采集研究对象连续三次血浆（间隔时间为2周，间隔期内无疾病）。结果显示，血浆中苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸水平较稳定（图3）。这些都提示了个体血浆代谢小分子的水平较为稳定，具备作为诊断/监测标志物的特性。

实施例5代谢小分子组合对CA的评估能力

根据上述UPLC-MS代谢组学方法，本发明人通过对独立人群15病例和15对照的血浆样品检测苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸，以此绘制ROC曲线来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估检测血浆中这3个代谢小分子水平对CA的评估能力。

苯丙色氨酸的灵敏度为86.67%,特异度为80.00%，ROC曲线下面积为0.9244；琥珀酰肉碱灵敏度为80.00%，特异度为86.67%，ROC曲线下面积为0.9067；γ-谷氨酰谷氨酸的灵敏度为80.00%，特异度为80.00%，ROC曲线下面积为0.9067。

组合苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱，灵敏度为93.33%,特异度为80.00%，ROC曲线下面积为0.9244；组合苯丙色氨酸和γ-谷氨酰谷氨酸，灵敏度为93.33%,特异度为86.67%，ROC曲线下面积为0.9244；组合琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸，灵敏度为86.67%,特异度为86.67%，ROC曲线下面积为0.9200。

组合苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸，灵敏度为93.33%,特异度为86.67%，ROC曲线下面积为0.9333。

以上3个代谢小分子单独或二二组合均能将CA组与健康组区分开来，但苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸3个的组合具有更好的效果。

实施例6用于肠管无神经节细胞症血浆代谢小分子检测和诊断试剂盒的制作

该血浆代谢小分子试剂盒的制作工艺和操作流程主要基于UPLC-MS技术。

首先通过UPLC-MS的方法确定正常人和肠管无神经节细胞症患儿血浆中具有较高丰度的代谢小分子。然后通过基于UPLC-MS的代谢组学技术用严格的统计学标准筛选出与肠管无神经节细胞症相关的代谢小分子并进行严格的结构鉴定，作为预测是否患有肠管无神经节细胞症以及诊断病变程度的指标。依据统计学差异显著性标准（FDR校正p值小于0.002）及倍数变化标准（病例组与对照组比变化上调或下调大于2.5倍）最后筛选出对应的血浆代谢小分子的数量为3个（苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸），并且实际验证组合上述三种生物标志物可以有效诊断CA（灵敏度为93.33%,特异度为86.67%，ROC曲线下面积为0.9333）。

同时我们通过数据库和尿酸标准品定性了在负离子模式下血浆中常见化学物尿酸（见表2），目前已有研究发现其与神经系统疾病有关，但其诊断灵敏度为46.67%,特异度为60.00%，ROC曲线下面积为0.6178，均明显低于筛选出的CA生物标志物组合，说明我们发现的标志物组合相比常见血浆化学物具有更高的诊断价值。

表2血浆尿酸信息

此试剂盒包括一批血浆代谢小分子检测用试剂和耗材，其中代谢小分子的定量和定性采用碳13标记的苯丙色氨酸、碳13标记的琥珀酰肉碱和碳13标记的γ-谷氨酰谷氨酸稳定同位素内标物。其它还有用于UPLC色谱分离的配套反向色谱柱（Waters BEHC181.7μm100mm）、用于沉淀血浆蛋白的试剂（甲醇）、用于血浆酸性物质提取及作为流动相的试剂（含0.1%的甲酸的水）、用于血浆碱性物质的提取及作为流动相的试剂(6.5mM的重碳酸铵pH=8的水)、用于血浆酸性提取物分离的流动相试剂（含0.1%甲酸的甲醇）、用于血浆碱性提取物分离的流动相试剂（含6.5mM重碳酸铵的甲醇）。此试剂盒的价值在于只需要100μl血浆，即可检测血浆代谢小分子标志物的变化趋势，再通过该变化趋势预测肠管无神经节细胞症发生可能性或诊断肠管无神经节细胞症病，并易于进行动态监测和观察治疗效果。

具体试剂盒组成如下：

碳13标记的苯丙色氨酸

碳13标记的琥珀酰肉碱

碳13标记的γ-谷氨酰谷氨酸

色谱柱（Waters BEH C181.7μm100mm）

试剂A（甲醇）

试剂B（含0.1%的甲酸的水）

试剂C(6.5mM的重碳酸铵pH=8的水)

试剂D（含0.1%甲酸的甲醇）

试剂E（含6.5mM重碳酸铵的甲醇）。

主要参考文献

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Claims (9)

1.人类肠管无神经节细胞症相关的血浆代谢小分子标志物，其特征在于该标志物为苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的血浆代谢小分子标志物，其特征在于该标志物由苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸构成。

3.权利要求1或2所述的血浆代谢小分子标志物的同位素内标，其特征在于该同位素内标为下列物质中的一种或多种：苯丙色氨酸对应的碳13稳定同位素内标，琥珀酰肉碱对应的碳13稳定同位素内标，γ-谷氨酰谷氨酸对应的碳13稳定同位素内标。

4.权利要求1或2所述的血浆代谢小分子标志物在制备人类肠管无神经节细胞症诊断或监测试剂盒中的应用。

5.权利要求3所述的同位素内标在制备人类肠管无神经节细胞症诊断或监测试剂盒中的应用。

6.一种人类肠管无神经节细胞症诊断或监测的UPLC-MS的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测权利要求1或2所述的血浆代谢小分子标志物。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒中含有权利要求3所述的血浆代谢小分子苯丙色氨酸、琥珀酰肉碱和γ-谷氨酰谷氨酸的碳13稳定同位素内标。

8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒还含有UPLC-MS检测用的色谱分离用色谱柱及提取用和色谱流动相用试剂。

9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有：

碳13标记的苯丙色氨酸、碳13标记的琥珀酰肉碱、碳13标记的γ-谷氨酰谷氨酸中的一种或多种；

色谱柱：Waters BEH C181.7μm100mm；

试剂A：甲醇；

试剂B：含0.1%的甲酸的水；

试剂C：6.5mM的重碳酸铵pH=8的水；

试剂D：含0.1%甲酸的甲醇；

试剂E：含6.5mM重碳酸铵的甲醇。

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