CN105181869B - 一种巨大儿辅助诊断标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学及临床医学领域，公开了一种巨大儿辅助诊断标志物及其应用。该标志物为烟酰胺和柠檬酸的组合，可用于制备巨大儿诊断或监测试剂盒。该标志物对巨大儿具有较好的辅助诊断作用，能减少检测成本，降低病人的经济负担，利于临床推广使用。

Description

一种巨大儿辅助诊断标志物的应用

技术领域

本发明属于分析化学及临床医学领域，涉及一种巨大儿辅助诊断标志物及其应用，特点是基于UPLC-QexactiveMS检测与巨大儿发生相关的代谢小分子标志物及其应用。

背景技术

巨大儿(Macrosomia)是指出生后1小时内体重大于等于4kg的新生儿。巨大儿的发生对母婴皆有危害。我国产妇中巨大儿造成的难产死亡率高于顺产死亡率；巨大儿引起的剖宫术后引发的伤口感染、腹腔粘连、子宫内膜异位等疾病，都有可能直接或间接导致产妇的死亡。巨大儿对新生儿的健康也有危害。巨大儿在分娩时通过勉强的牵拉过程易引发骨骼损伤，因为分娩时间的延长，还会发生窒息，甚至死亡；剖宫产术后的巨大儿易发生低血糖、红细胞增多症、高胆红素血症和肺部的并发症。此外，巨大儿中发生心脏畸形的比例高于一般正常体重儿。现在研究发现，巨大儿长大后患肥胖症的几率较大，将成为糖尿病、高血压等多种疾病的易患人群。

目前巨大儿的早期诊断一般基于母亲的一些易感医学特征比如患有糖尿病、肥胖和过期妊娠。然而对于不具备上述特征的人群，巨大儿的早期诊断需要依赖B超检测。然而B超检测时间较长，检查价格较高，且有些孕妇对B超检查的辐射也较为担心。这些都给巨大儿诊断带来了难度并且给家庭带来严重的经济负担，因而亟需找到新的巨大儿的诊断方法。

代谢组学(Metabolomics/Metabonomics)是20世纪90年代末期发展起来的一门新兴学科，它是通过考察生物体系在遗传改变或受刺激或扰动后，其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。所谓代谢组(Metabolome)是基因组的下游产物也是最终产物，是一些参与生物体新陈代谢、维持生物体正常功能和生长发育的小分子化合物的集合，主要是相对分子质量小于1000的内源性小分子，这些内源性代谢小分子涉及糖代谢、能量代谢、脂代谢、氨基酸代谢、核酸代谢、辅酶代谢等。

正常状态下的生物体是一个完整的系统，生物体液、细胞和组织中的代谢物处于一个稳定的平衡状态。机体由于遗传或者后天原因发生了病理变化，这一平衡就被打破，代谢产物和代谢过程也产生了相应的变化。通过代谢组学分析了解代谢小分子在疾病过程中的变化，可以帮助人们寻找有关的生物标志物(biomarker)辅助疾病的诊断，也可以帮助人们通过小分子物质本身涉及的代谢通路了解疾病的发病机制并为药物研发提供特异性的靶标。近年来，代谢组学在人类各类疾病的研究中在疾病的早期诊断中取得了诸多具有重大意义的研究成果，如心血管疾病、糖尿病和癌症，相关论文发表在学术期刊《Nature》、《Naturemedicine》、《Journalofhepatology》和《Cancerresearch》上，展现了代谢小分子在人类疾病诊断中巨大的潜力与价值。然而采用代谢组学分析孕期血浆中代谢小分子在巨大儿早期诊断监测中的应用还未得到相应的关注。

目前代谢组学研究常用技术包括液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气象色谱-质谱联用(GC-MS)及核磁共振技术(NMR)。核磁共振技术特点是对待测组分无破坏，样本前处理简单，但灵敏度较低；气相色谱-质谱联用具有较好的灵敏度和重现性，但一般要采用衍生化方法对样本进行前处理，使得实验步骤变得复杂。而LC-MS具有样本处理简单，灵敏度高，临床实用性强的特点。UPLC-QexactiveMS是新一代高分辨质谱与超高效液相的组合，具有相比传统LC-MS更强的灵敏度、特异度和稳定性。故而采用UPLC-QexactiveMS进行代谢小分子的代谢组学分析，若能发现稳定的与巨大儿发病相关的特异血浆代谢小分子作为生物标志物，并研发相应疾病的代谢小分子标志的UPLC-QexactiveMS检测方法，不仅在该领域处于国际领先地位，还可创造令人瞩目的经济效益，对提高我国母婴健康水平也将是一次强有力的推动。

发明内容

本发明的目的是提供一种巨大儿发生相关的孕期血浆代谢小分子标志物。

本发明另一个目的是提供上述孕期血浆代谢小分子标志物在制备巨大儿诊断和监测试剂盒的应用。

本发明再有一个目的是提供上述血浆代谢小分子标志物的色谱质谱检测用的诊断和监测试剂盒。

本发明的目的是通过下列技术措施实现的：

与人类巨大儿相关的孕期血浆代谢小分子标志物，为烟酰胺和柠檬酸的组合，可采用UPLC-QexactiveMS方法检测上述代谢小分子进行巨大儿的早期诊断。

所述的孕期血浆代谢小分子标志物在制备巨大儿诊断和监测试剂盒中的应用。

一种用于巨大儿诊断和监测试剂盒，该试剂盒含有烟酰胺标准品，柠檬酸标准品，碳13标记的烟酰胺稳定同位素内标物，碳13标记的柠檬酸稳定同位素内标物，试剂A(流动相用，含0.1％的甲酸的水)，试剂B(流动相用，含0.1％的甲酸的乙腈)，试剂C(沉淀蛋白用，含100％甲醇)，试剂D(复溶用，超纯水)。

所述的诊断试剂盒，该试剂盒还含有C18色谱柱(100mm×2.1mm,粒径1.9μm)。

另外，本发明通过UPLC-QexactiveMS的方法确定正常和巨大儿患儿母亲孕期血浆中具有较高丰度的代谢小分子。然后，在其中通过基于UPLC-QexactiveMS的代谢组学技术筛选与巨大儿相关的代谢小分子，作为巨大儿诊断以及诊断程度的指标。最后将筛选出的对应血浆代谢小分子的数量控制在2个，这是在预实验的基础上做出的最优化的精简。选用这2个代谢小分子的组合既能保证诊断的精确(灵敏度为80.00％,特异度为86.67％，ROC曲线下面积为0.8889)又能最大化减少检测成本，降低病人的经济负担，也利于临床推广使用。

本发明详细描述如下：

本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的孕期血液样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了基于UPLC-QexactiveMS的代谢组学方法进行分析。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

一、研究对象选择和分组依据

第一阶段筛选阶段

随机纳入孕产妇共100人。

1.年龄在23到36岁间；

2.无妊娠高血压、妊娠糖尿病等妊娠期疾病；

3.无吸烟、饮酒史；

4.均为初产妇；

5.孕周小于41周；

6.无全身重大疾病；

7.含巨大儿病例(婴儿出生体重≥4kg，15人)。

第二阶段验证阶段

纳入病例和对照孕产妇共30人。

A组：健康对照组(15人，2.5kg≤婴儿出生体重<4kg)：

1.年龄在23到33岁间；

2.无妊娠高血压、妊娠糖尿病等妊娠期疾病；

3.无吸烟、饮酒史；

4.均为初产妇；

5.孕周小于41周；

6.无全身重大疾病。

B组：巨大儿组(15人，婴儿出生体重≥4kg)：

1.年龄在25至34岁间；

2.无妊娠高血压、妊娠糖尿病等妊娠期疾病；

3.无吸烟、饮酒史；

4.均为初产妇；

5.孕周小于41周；

6.无全身重大疾病。

二、UPLC-QexactiveMS代谢组学分析和巨大儿诊断用代谢小分子筛选和验证

1.样本前处理

1.1.新鲜孕期血液于离心机3000rpm离心5min，取上清100μl分装至洁净1.5mlEP管中。

1.2.50μl血浆用150μl甲醇(试剂C)沉淀蛋白。

1.3.吸取上清，用氮气吹干再用真空干燥。

1.4.用100μL水(试剂D)溶解干燥物。

2.仪器检测

2.1.分析仪器：UPLCUltimate3000system(Dionex)高效液相色谱仪；Q-Exactive高分辨质谱仪。

2.2.液相条件：

2.2.1液相色谱柱为C18色谱柱(100mm×2.1mm,粒径1.9μm)，柱温为40℃。

2.2.2采用的流动相为流动相A含0.1％甲酸的水(试剂A)和流动相B含0.1％甲酸的乙腈(试剂B)，流速为400μL/min。

2.2.3仪器梯度为：0-3min1％B(99％C)，3-10min1％到99％B(99％到1％C)，10-13min99％B(1％C)，13-13.1min99％到1％B(1％到99％C)，13.1-17min1％B(99％C)。

2.2.4进样方式：体积10μl。

2.3.质谱条件

2.3.1加热电喷雾电离方式(HESI)进行分析。

2.3.2正离子模式喷雾电压：3.5kV；负离子模式喷雾电压：2.5kV；两种模式下毛细管温度：250℃，加热器温度：425℃，鞘气气流：50AU，辅助气气流：13AU，反吹气气流：0AU；透镜电压：60V。采用全扫模式，扫描范围：70到1050m/z；分辨率：70000；自动增益控制(ACG)：1×10-6charges；最大注射时间：30ms。

3.物质定性和定量

代谢小分子定性采用与烟酰胺和柠檬酸标准品比对色谱信息(保留时间)和质谱信息(精确分子量、同位素分布和MS/MS碎片信息)，并实时比对样本中同位素内标标准品(碳13标记的烟酰胺稳定同位素内标物、碳13标记的柠檬酸稳定同位素内标物)的色谱信息(保留时间)；定量采用烟酰胺和柠檬酸标准品和同位素内标标准品(碳13标记的烟酰胺稳定同位素内标物、碳13标记的柠檬酸稳定同位素内标物)的内标标准曲线法。

4.数据分析

生物标志物筛选采用多元线性回归筛选稳健的与出生体重有关的代谢物，再采用多元Logistic回归确认关键代谢物。

5.健康对照组、巨大儿组血浆样本中代谢小分子的差异和诊断意义

经过校正母亲的年龄、孕末期体质指数、孕周和出生婴儿的性别，多元线性回归分析发现孕期血浆烟酰胺和柠檬酸的含量与子代的出生体重呈正相关。经过校正母亲的年龄、孕末期体质指数、孕周和出生婴儿的性别，多元Logistic回归分析发现孕期血浆烟酰胺和柠檬酸的含量增加显著提高了子代为巨大儿的风险。采用独立人群应用上述代谢小分子组合诊断巨大儿，灵敏度为80.00％，特异度为86.67％，ROC曲线下面积为0.8889，具有较高的诊断价值。

三、诊断试剂盒制备方法

根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于巨大儿动态监测的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含测定受试者孕期血浆中稳定存在且可检测的烟酰胺和柠檬酸的稳定同位素内标及烟酰胺和柠檬酸的标准品。诊断试剂盒还包括一套血浆代谢小分子提取及色谱分离用试剂及器材。

本发明的有益效果：

本发明人通过采用UPLC-QexactiveMS比较正常对照和巨大儿母亲孕期血浆中的代谢小分子，发现了孕期血浆中存在可用于评估母亲是否孕有巨大儿，具有诊断价值的血浆代谢小分子标志物组合，以及该血浆代谢小分子标志物检测的UPLC-QexactiveMS的应用，研制出可便于临床应用的巨大儿诊断、监测试剂盒。

本发明采用孕期血浆代谢小分子作为巨大儿评价的标志物的优越性在于：

(1)血浆代谢小分子是一种新型生物标志物，其与疾病结局关联强，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高巨大儿诊断的敏感性和特异性，该类小分子生物标志物的成功开发将为不良出生结局的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(2)本发明提供的血浆代谢小分子标志物可用于巨大儿的诊断标志物，可在早期通过微创方式进行辅助诊断，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。

(3)本发明采用巨大儿和健康对照人群的母亲孕期血浆样本进行验证，证明了孕期血浆中烟酰胺和柠檬酸水平在预测巨大儿中具有较高灵敏度和特异度，可作为标志物使用。

(4)UPLC-QexactiveMS技术样本处理简单，仪器分析迅速准确，具有较高的临床诊断实用价值。

附图说明

图1第一阶段人群的病例和对照的出生体重。

箱式图的顶部和底部分别代表第七十五和第二十五百分位，箱式图的上端到下端代表最大到最小值，(-)为中位数，(+)为平均数。

图2第二阶段人群的病例和对照的出生体重，图注参考图1。

图3筛选阶段，经过校正母亲的年龄、孕末期体质指数、孕周和出生婴儿的性别，多元线性回归和多元Logistic回归分析均一致发现孕期血浆烟酰胺和柠檬酸的含量增加显著提高了子代为巨大儿的风险。

图4代谢小分子检测水平波动性(均数±标准误)。

图5验证阶段，采用孕期血浆代谢小分子含量信息制作的正常对照组和巨大儿组之间的ROC曲线。其中：图5A为烟酰胺，图5B为柠檬酸，图5C为烟酰胺组合柠檬酸。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1：研究对象选择和分组依据

本发明人从南京医科大学附属南京妇幼保健院搜集符合要求的巨大儿患儿及正常儿童母亲孕期血液样品(巨大儿和对照出生体重差异见图1，图2)。对出生后新生儿称重，如出生后1小时内体重等于或大于4kg者，即诊断为“巨大儿”。第一阶段随机纳入了符合要求的100例孕产妇样本，其中15例为巨大儿；第二阶段纳入30例孕产妇样本，其中15例对照15例巨大儿，作为巨大儿孕期血液代谢小分子生物标志物的筛选实验对象。具体的样品归类标准如下：

第一阶段筛选阶段

随机纳入孕产妇共100人。

1.年龄在23到36岁间；

2.无妊娠高血压、妊娠糖尿病等妊娠期疾病；

3.无吸烟、饮酒史；

4.均为初产妇；

5.孕周小于41周；

6.无全身重大疾病；

7.含巨大儿病例(婴儿出生体重≥4kg，15人)。

第二阶段验证阶段

纳入病例和对照孕产妇共30人。

A组：健康对照组(15人，2.5kg≤婴儿出生体重<4kg)：

1.年龄在23到33岁间；

2.无妊娠高血压、妊娠糖尿病等妊娠期疾病；

3.无吸烟、饮酒史；

4.均为初产妇；

5.孕周小于41周；

6.无全身重大疾病。

B组：巨大儿组(15人，婴儿出生体重≥4kg)：

1.年龄在25至34岁间；

2.无妊娠高血压、妊娠糖尿病等妊娠期疾病；

3.无吸烟、饮酒史；

4.均为初产妇；

5.孕周小于41周；

6.无全身重大疾病。

实施例2：UPLC-MS代谢组学巨大儿生物标志物筛选

1.样本前处理

1.1.新鲜孕期血液(筛选阶段样本100例)于离心机3000rpm离心5min，取上清100μl分装至洁净1.5mlEP管中。

1.2.50μl血浆用150μl甲醇(试剂C)沉淀蛋白。

1.3.吸取上清，用氮气吹干再用真空干燥。

1.4.用100μL水(试剂D)溶解干燥物。

2.仪器检测

2.1.分析仪器：UPLCUltimate3000system(Dionex)高效液相色谱仪；Q-Exactive高分辨质谱仪。

2.2.液相条件：

2.2.1液相色谱柱为C18色谱柱(100mm×2.1mm,粒径1.9μm)，柱温为40℃。优选液相色谱柱为HypersilGOLDC18色谱柱(100mm×2.1mm,粒径1.9μm,ThermoScientific,Germany)。

2.2.2采用的流动相为(A)含0.1％甲酸的水(试剂A)和(B)含0.1％甲酸的乙腈(试剂B)，流速为400μL/min。

2.2.3仪器梯度为：0-3min1％B(99％C)，3-10min1％到99％B(99％到1％C)，10-13min99％B(1％C)，13-13.1min99％到1％B(1％到99％C)，13.1-17min1％B(99％C)。

2.2.4进样方式：体积10μl。

2.3.质谱条件

2.3.1加热电喷雾电离方式(HESI)进行分析。

2.3.2正离子模式喷雾电压：3.5kV；负离子模式喷雾电压：2.5kV；两种模式下毛细管温度：250℃，加热器温度：425℃，鞘气气流：50AU，辅助气气流：13AU，反吹气气流：0AU；透镜电压：60V。采用全扫模式，扫描范围：70到1050m/z；分辨率：70000；自动增益控制(ACG)：1×10-6charges；最大注射时间：30ms。

3.物质定性和定量

代谢小分子定性采用与烟酰胺和柠檬酸标准品比对色谱信息(保留时间)和质谱信息(精确分子量、同位素分布和MS/MS碎片信息)，并实时比对样本中同位素内标标准品(碳13标记的烟酰胺稳定同位素内标物、碳13标记的柠檬酸稳定同位素内标物)的色谱信息(保留时间)；定量采用烟酰胺和柠檬酸标准品和同位素内标标准品(碳13标记的烟酰胺稳定同位素内标物、碳13标记的柠檬酸稳定同位素内标物)的内标标准曲线法。

4.数据分析

生物标志物筛选采用多元线性回归筛选稳健的与出生体重有关的代谢物，再采用多元Logistic回归确认关键代谢物。

5.健康对照组、巨大儿组血浆样本中代谢小分子的差异和诊断意义

经过校正母亲的年龄、孕末期体质指数、孕周和出生婴儿的性别，多元线性回归分析发现孕期血浆烟酰胺和柠檬酸的含量与子代的出生体重呈正相关。经过校正母亲的年龄、孕末期体质指数、孕周和出生婴儿的性别，多元Logistic回归分析发现孕期血浆烟酰胺和柠檬酸的含量增加显著提高了子代为巨大儿的风险(图3)。

实施例3：血浆代谢小分子的稳定性分析

采用实施例1同样的采集方法采集九名母亲孕期的血浆，采用实施例2的方法对血浆烟酰胺和柠檬酸水平的稳定性进行评价(间隔时间为2周)。结果显示，血浆中烟酰胺和柠檬酸测定水平稳定(图4)，具备作为诊断/监测标志物的特性。

实施例4：代谢小分子组合对巨大儿的诊断

根据上述UPLC-QexactiveMS代谢组学方法，本发明人通过对独立人群15病例和15对照(验证阶段样本30例)的孕期血浆样品检测烟酰胺和柠檬酸，以此绘制ROC曲线并评估预测的灵敏性和特异性(见图5)，进而评估检测血浆中这2个代谢小分子水平对巨大儿的评估能力。

烟酰胺的灵敏度为80.00％,特异度为73.33％，ROC曲线下面积为0.8867；柠檬酸灵敏度为73.33％，特异度为80.00％，ROC曲线下面积为0.8489。

烟酰胺和柠檬酸组合的灵敏度为80.00％,特异度为86.67％，ROC曲线下面积为0.8889。

故而烟酰胺和柠檬酸组合具有较好地诊断巨大儿的能力。

实施例5：用于巨大儿血浆代谢小分子检测和诊断试剂盒的制作

此试剂盒包括一批孕期血浆代谢小分子检测用试剂和耗材，其中代谢小分子的定性和定量采用烟酰胺和柠檬酸的标准品，辅助定量和辅助定性采用碳13标记的烟酰胺、碳13标记的柠檬酸的稳定同位素内标物。其它还有用于UPLC色谱分离的配套反向色谱柱(C18色谱柱，100mm×2.1mm,粒径1.9μm)、用于沉淀血浆蛋白的试剂(100％甲醇)，用于提取代谢小分子的试剂(100％超纯水)，用于流动相的试剂(含0.1％的甲酸的水和含0.1％的甲酸的乙腈)。此试剂盒的价值在于只需要100μl孕期血浆，即可检测血浆代谢小分子标志物的含量，再通过含量预测巨大儿发生可能性或诊断巨大儿病，并易于进行动态监测和观察治疗效果。

具体试剂盒组成举例如下：

烟酰胺标准品

柠檬酸标准品

碳13标记的烟酰胺稳定同位素内标物

碳13标记的柠檬酸稳定同位素内标物

试剂A(含0.1％的甲酸的水)

试剂B(含0.1％的甲酸的乙腈)

试剂C(含100％甲醇)

试剂D(100％超纯水)。

该试剂盒还含有C18色谱柱：100mm×2.1mm,粒径1.9μm。

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Claims (1)

1.一种巨大儿相关的孕期血浆代谢小分子标志物在制备巨大儿诊断或监测试剂盒中的应用，该标志物为烟酰胺和柠檬酸的组合。