JP7280582B2 - 心房細動指標値の測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、血液や尿等の生体試料に含まれる物質のうち心房細動の発症に関連する物質の測定方法に関する。
心房細動は比較的よく認められる心臓不整脈である。心房細動の有病率は加齢に伴い増加し、また、各年齢層では一般に男性の方が女性よりも有病率が高い。心房細動では、速く不規則で無秩序な心房興奮が起こり、有効な心房収縮が消失するため、心房内の血流が停滞して心房内に血栓が形成される。心房内の血栓形成が原因となって発症する脳塞栓（心原性脳梗塞）は心房細動の重篤な合併症の一つであり、その予防として抗凝固薬による治療が永続的に必要となる場合が多い。
また、心房細動では有効な心房収縮が得られないため心拍出量が減少する。そのため、心疾患を有する患者で心房細動が発生すると、血行動態が保てず心不全が増悪する。さらに、心房細動による頻脈が持続すると心筋障害が起こり、長期的には心機能の低下をもたらす。従って、心房細動が発生した場合には、抗不整脈薬による薬物療法や、電気的除細動及びカテーテルアブレーション等の非薬物療法を用いた早期の洞調律化や再発予防、心拍数調節治療が重要となる（非特許文献１）。
心房細動の診断手法としては１２誘導心電図検査が標準的である。しかしながら、発作性のように時々しか起こらない心房細動は短時間の検査では見つけ出すことが容易でないことから、２４時間継続して心電図がとれるホルター心電計が用いられる。さらに、心臓の弁の異常ではないことを除外するためには、心エコー検査が行われる。心房細動が初めて発生してから持続性心房細動に移行する危険因子としては、心不全、高齢（７５歳以上）、一過性脳虚血発作や脳梗塞の既往、慢性閉塞性肺疾患、高血圧などが挙げられる（非特許文献２）。
心房細動を発症した比較的早い段階において心房細動の診断ができれば、脳梗塞などの重篤な合併症の予防が可能となるばかりでなく、洞調律維持のための迅速な対応をとることができる。さらに、持続性心房細動への移行を促進する背景因子の管理に役立てることができる（非特許文献３）。従って、心房細動の発症前状態や早期の状態を特異的に捉えた疾患マーカーは、心房細動の治療や予防のために非常に有用である。
心房細動治療（薬物）ガイドライン（2013年改訂版）.
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Schnabel, R. B. et al. Relation of multiple inflammatory biomarkers to incident atrial fibrillation. Am J Cardiol. 104, 92-6 (2009)
Mayr, M. et al. Combined metabolomic and proteomic analysis of human atrial fibrillation. J Am Coll Cardiol. 51, 585-94 (2008)
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これまで、心房細動の発症と関連する疾患マーカーとして、オステオプロテゲリン（Osteoprotegerin）などの炎症性マーカーが報告されている（非特許文献４）。この疾患マーカーの検出には、汎用性の高いＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) という免疫学的検出法が用いられている。免疫学的検出法は、目的の対象物を個々に測定する方法であり、複数種類の対象物を一度に測定することはできないため、心房細動の発症に対する特異性の高い新規の疾患マーカーを網羅的に探索するには限界があった。
近年、代謝物を解析するメタボローム解析（メタボロミクス）を用いて、様々な疾患マーカーを探索する試みが行われている。心房細動におけるメタボローム解析としては、これまでのところ２つの報告がなされている。一つは、２００８年のMayrらによる、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）を用いたメタボローム解析とプロテオーム解析を組み合わせた前向き研究（追跡調査による研究）の報告であり、この研究では、心臓外科手術後に心房細動を発症した群と洞調律を維持したコントロール群を比較検討し、心房細動発症群における心房筋組織の代謝物の変化を観察している（非特許文献５）。心臓外科手術後に心房細動に進展した群では、心房筋組織において統率されていない代謝物の変化が認められ、心房細動の発症に関連する代謝物としてケトン体の存在が示唆された。
もう一つは、２０１５年のAlonsoらによるＡＲＩＣ（Atherosclerosis Risk in Communities）研究の報告であり、この研究では、１９１９名のアフリカ系アメリカ人を２２年間追跡調査し、心房細動を新規発症した１８３名の対象者の血清を分析している（非特許文献６）。そして、分析の結果から心房細動の発症と関連する代謝物を解析し、その結果、胆汁酸の代謝と関連のあるGlycolithocholate sulfate及びGlycocholenate sulfateが心房細動の発症と関連する代謝物として報告された。
このように、心房細動の発症に関連するマーカー候補の報告があるものの、いずれのマーカー候補も実際に臨床応用がされていない。
このように、心房細動の発症に関連するマーカー候補の報告があるものの、いずれのマーカー候補も実際に臨床応用がされていない。
心房細動はその発症要因として、遺伝因子（遺伝的素因）と環境因子（生活習慣）の二つが考えられている（非特許文献７）。遺伝的素因は、疾患の発症し易さという点で重要であり、遺伝子情報を疾患マーカーの一つとして将来における疾患発症のリスクを推定できると考えられるが、遺伝子素因だけでは早期の段階で疾患を診断することは困難である。また、生活習慣は、遺伝的素因に影響を及ぼすような習慣の場合は遺伝因子と同様に重要な環境因子となるが、生活習慣は年齢とともに変化することが多く、また、多種多様な要因が重なり合って発症する疾患を早期の段階で診断することは困難である。
本発明が解決しようとする課題は、心房細動の発症に関連すると考えられる代謝物の量を測定することであり、ひいては、その測定結果を心房細動の診断に役立てることである。
上記課題を解決するために成された本発明は、心房細動の発症に関連する指標である心房細動指標値を測定する方法であって、
被検者から採取された生体試料を分析し、１６種の代謝物であるβ‐アラニン、トレオニン、リンゴ酸、フマル酸、2-ヒドロキシピリジン、2-オキソグルタル酸、セリン、アラビノース、マルガリン酸、リボース、イソクエン酸、フェニルアラニン、コハク酸、フコース、クエン酸、エリスリトールから選ばれる少なくとも１種の代謝物の量を前記心房細動指標値として測定することを特徴とする。
被検者から採取された生体試料を分析し、１６種の代謝物であるβ‐アラニン、トレオニン、リンゴ酸、フマル酸、2-ヒドロキシピリジン、2-オキソグルタル酸、セリン、アラビノース、マルガリン酸、リボース、イソクエン酸、フェニルアラニン、コハク酸、フコース、クエン酸、エリスリトールから選ばれる少なくとも１種の代謝物の量を前記心房細動指標値として測定することを特徴とする。
本発明者は、心房細動に関連する複合的な病態の変化を包括的にとらえるため、メタボロミクスといわれる手法を用いて、心房細動に関連する指標となる代謝物を探索した。具体的には、多数の被検者から採取した血液試料（血清）をクロマトグラフ質量分析装置を用いて分析し、該血液試料に含まれる多数の代謝物の量を網羅的に測定した結果を包括的に解析することにより、上述した１６種の代謝物が心房細動に大きく関連することを見出した。従って、これら１６種の代謝物の量の少なくとも一つを心房細動指標値として、心房細動の診断に利用することができる。
上述した１６種の代謝物は、血清に含まれる多数の代謝物のうち堅牢な１３５種の代謝物の測定値について、心房細動の有無の２群について統計解析を行った結果、心房細動の有無との間に高い相関関係が見られた代謝物である。表１に１３５種の代謝物のリストを示す。表１に示す代謝物名に含まれる「-nTMS」、「-nTMS(m)」、「-メチルオキシム-nTMS」、又は「-メチルオキシム-nTMS(m)」（n及びmは自然数）は、ガスクロマトグラフ質量分析装置による分析時に添加された試薬に起因するものである。したがって、例えば表１中の「アスパラギン-2TMS」と「アスパラギン-3TMS」は同一の代謝物（アスパラギン）に由来する。なお、２群比較の際の心房細動の有無は、心電図に基づき判定した。
具体的には、例えば、被検者から採取した血液中の心房細動指標値を測定し、その測定値を所定の閾値と比較することにより、心房細動の有無を判別することができる。この場合、あらかじめ、心房細動と診断された者（心房細動発症者）、および心房細動発症者ではないと診断された者（正常者）の血液中の心房細動指標値の範囲を求めておき、被検者の心房細動指標値が正常者の範囲に入るか、心房細動発症者の範囲に入るか、のいずれであるかによって、被検者が心房細動であるかどうかを判別すると良い。また、被検者の健常時における心房細動指標値の範囲を予め測定しておき、その後の被検者の心房細動指標値を前記範囲と比較し、該心房細動指標値が前記範囲から外れている場合に被検者が心房細動かどうかを判別しても良い。
上記１６種の代謝物の測定値である心房細動指標値は単独で心房細動の診断に用いることも可能であるが、複数の心房細動指標値を組み合わせて用いることにより、心房細動の診断精度を上げることができる。例えば、２種類の心房細動指標値のいずれか一方だけが心房細動を発症していることを示す範囲にある場合よりも、２種類の心房細動指標値の両方が心房細動を発症していることを示す範囲にある場合の方が、心房細動である可能性が高いと判断することができる。
本発明における「被検者から採取された生体試料」とは、該生体試料に含まれる代謝物の量を測定することができるものであれば血液、生体組織、糞便、尿等、どのようなものでも良い。ただし、試料の採取のし易さ、代謝物の含有量の多さを考慮すると血液（全血、血清、又は血漿）が好ましい。血清としては、全血に対して抗凝固剤を添加せずに血球成分を凝固させてから得られる液性成分を使用することができる。また、血漿としては、全血に対して抗凝固剤を添加して血球成分を凝固させずに得られる液性成分を使用することができる。
また、心房細動の発症に関連する代謝物の探索にはクロマトグラフ質量分析（クロマトグラフＭＳ分析）を用いたが、本発明における生体試料の分析手法としては、クロマトグラフＭＳ分析に限らず、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等の免疫学的分析法などを用いることができる。ただし、定量的に生体試料に含まれる代謝物の量を測定することができる点でクロマトグラフＭＳ分析が優れている。クロマトグラフＭＳ分析とは、ガスクロマトグラフ、又は液体クロマトグラフと、これらクロマトグラフで分離された試料の検出装置としての質量分析装置を用いた分析をいう。質量分析装置としては、トリプル四重極型質量分析装置、Ｑ－ＴＯＦ型質量分析装置、ＴＯＦ－ＴＯＦ型質量分析装置、イオントラップ質量分析装置、又はイオントラップ飛行時間型質量分析装置が挙げられる。これらの質量分析装置を用いると、分析対象物（代謝物）以外の夾雑物を多く含む試料であっても高感度な分析が可能であり、分析安定性が向上するため、高い再現性で生体試料に含まれる代謝物の量を定量的に測定することができる。
上記心房細動指標値の測定方法において、
前記心房細動指標値は、前記１６種の代謝物のうちの特にイソクエン酸、アラビノース、リボース、2-オキソグルタル酸、リンゴ酸、フェニルアラニン、フマル酸、コハク酸、フコース、クエン酸のいずれかの代謝物の量であることが好ましい。
前記心房細動指標値は、前記１６種の代謝物のうちの特にイソクエン酸、アラビノース、リボース、2-オキソグルタル酸、リンゴ酸、フェニルアラニン、フマル酸、コハク酸、フコース、クエン酸のいずれかの代謝物の量であることが好ましい。
上記１０種の代謝物は、１３５種の代謝物の測定値について、ＡＦあり（心房細動）群と正常群（ＡＦなし）の２群間でｔ検定を行ったところ、両群の間に有意な差が認められたものである。また、これらは別途Mann-WhitneyのＵ検定でＰ値が0.001未満であった。従って、上記１０種の代謝物の量を心房細動指標値として測定し、該指標値と所定の閾値との比較により、心房細動の有無を診断することができる。所定の閾値は、多数の被検者について、前記１０種の代謝物それぞれの生体試料中に含まれる量を測定したときの平均値や中央値等とすることができる。
また、上記心房細動指標値は、前記１６種の代謝物のうちの特にβ-アラニン、フマル酸、トレオニン、コハク酸、2-オキソグルタル酸のいずれかの代謝物の量であることが好ましい。
上記５種の代謝物は、従属変数として心房細動の有無に加えて、調整因子として年齢、性別、喫煙歴、高血圧・糖尿病の現病歴あり、心疾患の既往歴あり、及びｅＧＦＲ値を投入したモデルについて１３５種の代謝物の測定値のロジスティック回帰分析を行ったところ、Ｐ値が０．０５よりも小さく、心房細動の有無との間に高い相関関係が見られた代謝物である。従って、これら５種の代謝物の測定値を心房細動指標値として測定し、これと所定の閾値と比較することにより、心房細動を早期の段階で診断することができる。
上記５種の代謝物は、従属変数として心房細動の有無に加えて、調整因子として年齢、性別、喫煙歴、高血圧・糖尿病の現病歴あり、心疾患の既往歴あり、及びｅＧＦＲ値を投入したモデルについて１３５種の代謝物の測定値のロジスティック回帰分析を行ったところ、Ｐ値が０．０５よりも小さく、心房細動の有無との間に高い相関関係が見られた代謝物である。従って、これら５種の代謝物の測定値を心房細動指標値として測定し、これと所定の閾値と比較することにより、心房細動を早期の段階で診断することができる。
また、上記心房細動指標値としては、前記１６種の代謝物のうちの特に２－オキソグルタル酸、イソクエン酸、フコース、アラビノース、フマル酸、エリスリトール、コハク酸、フェニルアラニン、リンゴ酸、クエン酸のいずれかの代謝物の量であると良い。
上記１０種の代謝物は、従属変数として心房細動の有無において、１３５種の代謝物の測定値についてＲＯＣ解析し、そのＡＵＣ値を求めたところ、その値が大きかった代謝物である。従って、これら１０種の代謝物の測定値をそれぞれ心房細動指標値として測定し、これと所定の閾値との比較により、心房細動の有無を診断することができ、しかも、誤診断を少なくすることができる。
上記１０種の代謝物は、従属変数として心房細動の有無において、１３５種の代謝物の測定値についてＲＯＣ解析し、そのＡＵＣ値を求めたところ、その値が大きかった代謝物である。従って、これら１０種の代謝物の測定値をそれぞれ心房細動指標値として測定し、これと所定の閾値との比較により、心房細動の有無を診断することができ、しかも、誤診断を少なくすることができる。
さらには、上記心房細動指標値は、前記１６種の代謝物のうちの特にβ-アラニン、トレオニン、リンゴ酸、フマル酸、2-ヒドロキシピリジン、2-オキソグルタル酸、セリン、アラビノース、マルガリン酸、リボースのいずれか代謝物の量であると良い。
上記１０種の代謝物は、従属変数として心房細動の有無、調整因子として年齢、性別、喫煙歴、高血圧・糖尿病の現病歴あり、心疾患の既往歴あり、及びｅＧＦＲ値を投入したモデルについて１３５種の代謝物の測定値についてＣ統計量を求めたところ、その値が大きかった代謝物である。従って、これら１０種の代謝物の測定値をそれぞれ心房細動指標値として測定し、これと所定の閾値とを比較することにより、心房細動の有無を高い精度で診断することができる。
上記１０種の代謝物は、従属変数として心房細動の有無、調整因子として年齢、性別、喫煙歴、高血圧・糖尿病の現病歴あり、心疾患の既往歴あり、及びｅＧＦＲ値を投入したモデルについて１３５種の代謝物の測定値についてＣ統計量を求めたところ、その値が大きかった代謝物である。従って、これら１０種の代謝物の測定値をそれぞれ心房細動指標値として測定し、これと所定の閾値とを比較することにより、心房細動の有無を高い精度で診断することができる。
本発明では、メタボロミクスの解析手法を用いて心房細動との関連性が大きい代謝物を探索することによって見出した代謝物の生体試料中の量を心房細動指標値として測定するため、該心房細動指標値を、心房細動の診断に役立てることができる。
本発明者は、被検者から採取した生体試料（血清）をガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣＭＳ）を用いて分析し、該生体試料に含まれる多数の代謝物の量を網羅的に測定した。そして、それらの測定値を様々な手法を用いて解析することにより、心房細動の有無に大きく関連すると思われる代謝物を探索した。表２に心房細動の発症に関連する代謝物を探索するための生体試料を採取した被検者のベースライン特性を示す。表２のベースライン特性を示す被検者の抽出方法、生体試料の調製及び分析方法、代謝物の測定方法、測定結果の解析等について以下に説明する。
＜被検者の抽出＞
研究倫理委員会の承認のもと、２０１５年１０月から２０１６年９月までの１年間に聖路加国際病院附属クリニック予防医療センターを訪れた人間ドック受診者（約４万５０００人）の中から７６０１人の受診者をランダムにサンプリングし、そのうち本実験への不参加を表明した者を除外した残りの７５９２人の対象者を被検者とした。なお、全ての被検者には、病歴や生活習慣（喫煙等）について、自己記入式の質問票での回答結果が付随している。また、人間ドック受診時に身長、体重、体格指数（BMI）、血圧、及び血液検査（ヘモグロビンA1c、空腹時血糖、クレアチニン（GFR推定値））の結果等も被検者には付随している。
研究倫理委員会の承認のもと、２０１５年１０月から２０１６年９月までの１年間に聖路加国際病院附属クリニック予防医療センターを訪れた人間ドック受診者（約４万５０００人）の中から７６０１人の受診者をランダムにサンプリングし、そのうち本実験への不参加を表明した者を除外した残りの７５９２人の対象者を被検者とした。なお、全ての被検者には、病歴や生活習慣（喫煙等）について、自己記入式の質問票での回答結果が付随している。また、人間ドック受診時に身長、体重、体格指数（BMI）、血圧、及び血液検査（ヘモグロビンA1c、空腹時血糖、クレアチニン（GFR推定値））の結果等も被検者には付随している。
聖路加国際病院附属クリニック予防医療センターは東京都中央区にあり、人間ドック受診者の多くの居住地域は東京近傍にある。また、今回の被検者は全て日本人とした。従って、今回の被検者は、環境要因、民族的要因ともに均一な集団といえる。
７５９２人の被検者の集団の中央値年齢は５２歳（四分位範囲４２歳～６２歳）であり、そのうち３９６７名（５２．３％）は女性であった。また、心電図検査で心房細動（ＡＦ）ありと診断された者（「ＡＦ群」と呼ぶ）は５８人（０．８％）、それ以外の者（ＡＦなしと診断された者（「正常群」と呼ぶ））は７５３４人（９９．２％）であった。上記した表２に示すように、ＡＦ群では女性よりも男性の方が統計的に有意に多く、また、正常群よりもＡＦ群の方が統計的に有意に年齢が高かった。
＜試料の調製＞
（１）前処理
被検者から採取された血液を、所定時間放置した後、遠心分離し、上澄み（血清）を採取した。採取した血清は分析までの間、－８０℃で保管した。なお、被検者から血液を採取してから血清を冷凍するまでの時間は血清中の代謝物の測定値に影響を及ぼす。今回の被検者集団の約半数が、血液を採取してから冷凍するまでの時間が５～８時間であった。
（１）前処理
被検者から採取された血液を、所定時間放置した後、遠心分離し、上澄み（血清）を採取した。採取した血清は分析までの間、－８０℃で保管した。なお、被検者から血液を採取してから血清を冷凍するまでの時間は血清中の代謝物の測定値に影響を及ぼす。今回の被検者集団の約半数が、血液を採取してから冷凍するまでの時間が５～８時間であった。
（２）本処理
－８０℃で保存されていた血清を２５℃、５分で解凍した。解凍後の血清を、10,000×ｇ、４℃、１ｍｉｎで遠心分離した後、氷上静置し、これに、第１混合液（メタノール／水／クロロホルム、２．５：１：１）２５０μＬに、内部標準溶液（2‐イソプロピルリンゴ酸：０．１ｍｇ／ｍＬ）６μＬを添加し、ボルテックスミキサーを用いて混合して第２混合液を得た。
－８０℃で保存されていた血清を２５℃、５分で解凍した。解凍後の血清を、10,000×ｇ、４℃、１ｍｉｎで遠心分離した後、氷上静置し、これに、第１混合液（メタノール／水／クロロホルム、２．５：１：１）２５０μＬに、内部標準溶液（2‐イソプロピルリンゴ酸：０．１ｍｇ／ｍＬ）６μＬを添加し、ボルテックスミキサーを用いて混合して第２混合液を得た。
その後、血清と前記第２混合液を、３７℃、３０分間、1,200ｒｐｍで振盪した後、２５℃、５分間、16,000×ｇで遠心分離し、上清１５０μＬを、水１４０μＬを予め加えたチューブに添加し、ボルテックスミキサーを用いて混合して、第３混合液を得た。
次に、上記第３混合液を、２５℃、５分間、16,000×ｇで遠心し、その上清１８０μＬを新しいチューブに回収した。これを、室温、６０分間、スピードメモリを「７」に設定して遠心エバポレーターで濃縮した。
濃縮した第３混合液の上清（濃縮液）を－８０℃、３０分で凍結した後、これをオーバーナイトで乾燥したものをサンプルとした。得られたサンプルは分析までデシケーターで保存した。
次に、上記第３混合液を、２５℃、５分間、16,000×ｇで遠心し、その上清１８０μＬを新しいチューブに回収した。これを、室温、６０分間、スピードメモリを「７」に設定して遠心エバポレーターで濃縮した。
濃縮した第３混合液の上清（濃縮液）を－８０℃、３０分で凍結した後、これをオーバーナイトで乾燥したものをサンプルとした。得られたサンプルは分析までデシケーターで保存した。
＜試料のＧＣＭＳ分析＞
デシケーターで保存されていたサンプルに、メトキシアミン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、ピリジンで溶解）８０μＬを添加した後、これを３７℃、３０分間、1,200ｒｐｍで振盪した。続いて、N-メチル-N-トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド４０μＬを添加し、３７℃、３０分間、1,200ｒｐｍで振盪した後、２５℃、５分間、16,000×ｇで遠心分離し、その上清５０μＬをガラスバイアルに入れ、このバイアルをＧＣＭＳのオートサンプラーにセットした。
デシケーターで保存されていたサンプルに、メトキシアミン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、ピリジンで溶解）８０μＬを添加した後、これを３７℃、３０分間、1,200ｒｐｍで振盪した。続いて、N-メチル-N-トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド４０μＬを添加し、３７℃、３０分間、1,200ｒｐｍで振盪した後、２５℃、５分間、16,000×ｇで遠心分離し、その上清５０μＬをガラスバイアルに入れ、このバイアルをＧＣＭＳのオートサンプラーにセットした。
ＧＣＭＳには、株式会社島津製作所製のトリプル四重極型ガスクロマトグラフ質量分析計（GCMS-TQ8040）を用いた。ＧＣＭＳの分析条件を以下に示す。
（１）カラム：ＤＢ－５（(５％-フェニル)-メチルポリシロキサン、無極性）、長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚１．００μｍ
（２）カラムオーブン温度：８０℃
（３）インジェクション温度：２８０℃
（４）インジェクションモード：スプリット
（５）ヘリウムガス流量：３９ｃｍ／ｓｅｃ
（６）カラム温度：０－２．５ｍｉｎ；８０℃、２．５－１８．５ｍｉｎ；８０－２８０℃に上昇、１８．５－２３．０ｍｉｎ；２８０℃
（７）ＭＳイオン源温度：２００℃
（８）インターフェイス温度：２５０℃
（９）検出器電圧：０．２ｋＶ
（１０）質量範囲：ｍ／ｚ ８５－５００
（１）カラム：ＤＢ－５（(５％-フェニル)-メチルポリシロキサン、無極性）、長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚１．００μｍ
（２）カラムオーブン温度：８０℃
（３）インジェクション温度：２８０℃
（４）インジェクションモード：スプリット
（５）ヘリウムガス流量：３９ｃｍ／ｓｅｃ
（６）カラム温度：０－２．５ｍｉｎ；８０℃、２．５－１８．５ｍｉｎ；８０－２８０℃に上昇、１８．５－２３．０ｍｉｎ；２８０℃
（７）ＭＳイオン源温度：２００℃
（８）インターフェイス温度：２５０℃
（９）検出器電圧：０．２ｋＶ
（１０）質量範囲：ｍ／ｚ ８５－５００
＜データ解析＞
＜代謝物の測定＞
試料のマススペクトルからピークを網羅的に検出し、それらのピーク情報（質量電荷比及び信号強度）をＭＳライブラリに格納されている多数の代謝物に特異的な物質の質量電荷比と比較することで、代謝物を同定し、１３５種類の代謝物の測定値（以下、ＭＳデータという。）を求めた。
＜代謝物の測定＞
試料のマススペクトルからピークを網羅的に検出し、それらのピーク情報（質量電荷比及び信号強度）をＭＳライブラリに格納されている多数の代謝物に特異的な物質の質量電荷比と比較することで、代謝物を同定し、１３５種類の代謝物の測定値（以下、ＭＳデータという。）を求めた。
＜統計解析＞
ＭＳデータを取得した被検者について、統計解析に必要な臨床情報、検査データを、聖路加国際病院の研究倫理委員会の承諾のもと、聖路加国際大学情報システムセンターから入手し、臨床情報、検査データとＭＳデータの突合わせを行った。被検者の臨床情報及び検査データは全て被検者を表す管理番号で管理されており、データの突き合わせの際に、被検者が特定されないようにした。
ＭＳデータを取得した被検者について、統計解析に必要な臨床情報、検査データを、聖路加国際病院の研究倫理委員会の承諾のもと、聖路加国際大学情報システムセンターから入手し、臨床情報、検査データとＭＳデータの突合わせを行った。被検者の臨床情報及び検査データは全て被検者を表す管理番号で管理されており、データの突き合わせの際に、被検者が特定されないようにした。
統計解析では、単変量解析として対応のないｔ検定、マン－ホイットニーのＵ検定を用いた。多変量解析としてロジスティック回帰分析を用いた。また、診断能力の評価には、各代謝物単独のモデルでは、ＲＯＣ曲線より算出されたＡＵＣ値を用い、調整因子を用いた多変量解析モデルでは、Ｃ統計量を用いた。
表３は、ＡＦ群と正常群について１３５種の代謝物の量を測定した結果について、両群のｔ検定を行った結果を示している。表３には、ＡＦ群と正常群の間で統計的に有意な差が認められた１０種の代謝物（イソクエン酸、アラビノース、リボース、2-オキソグルタル酸、リンゴ酸、フェニルアラニン、フマル酸、コハク酸、フコース、クエン酸）のＰ値及びｔ統計量を、Ｐ値が小さいものから順に列挙している。なお、表３において、「ｍＥｎ（ｍは実数、ｎは整数）」は「ｍ×１０ｎ」を意味する。例えば「３．７４Ｅ－０６」は「３．７４×１０－６」となる。表３に示す１０種の代謝物は、いずれも別途行ったマン－ホイットニーのＵ検定でＰ値が0.001未満であった。
表３に示すように、１０種の代謝物は、いずれもＰ値が小さいほどｔ統計量の絶対値が大きく、リボースを除きいずれも負の値であった。このことから、リボースを除く９種の代謝物の量は、ＡＦ群よりも正常群の被検者の方が統計的に有意に少なく、リボースの量は、ＡＦ群よりも正常群の被検者の方が統計的に有意に多かったことが分かる。
以上の結果から、上記１０種の代謝物の測定値は心房細動指標値として有用であり、いずれも測定値と所定の閾値とを比較し該閾値よりも大きいとき、もしくは小さいときは心房細動であると診断することができる。
以上の結果から、上記１０種の代謝物の測定値は心房細動指標値として有用であり、いずれも測定値と所定の閾値とを比較し該閾値よりも大きいとき、もしくは小さいときは心房細動であると診断することができる。
表４は、従属変数としてＡＦ群／正常群、調整因子として年齢、性別、喫煙歴、高血圧・糖尿病の現病歴あり、心疾患の既往歴あり、及びｅＧＦＲ（Estimate glomerular filtration rate、推定糸球体濾過量）値を投入し、ＡＦ群と１３５種の生体内代謝産物の測定値との関連を、ロジスティック回帰分析で検討した結果を示している。表４には、ロジスティック回帰分析の結果、Ｐ値が小さかった５種の代謝物（β－アラニン、フマル酸、トレオニン、コハク酸、２－オキソグルタル酸）を、回帰係数、標準誤差、Ｐ値とともに列挙している。表４に示すように、５種の代謝物のうちβ－アラニンのＰ値が最も小さく、β－アラニンと心房細動との間に強い相関が認められた。表４には、調整因子での調整を行わなかった時のｔ検定結果であるt統計量、Ｐ値、及びｔ検定Ｐ値順位を併せて示した。上記５種の代謝物は、いずれも調整因子で調整したときの方が、調整因子で調整しなかったときよりもＰ値順位が上位であった。このように調整因子で調整を行うことで順位が上がり、指標としての有用性が増した。
次に、各代謝物の測定値を心房細動指標値としたときの、その診断能力（つまり、心房細動の診断精度の高さ）を検討するため、従属変数をＡＦ群／正常群として、１３５種の代謝物についてＲＯＣ解析（Receiver Operating Characteristic analysis）を行った。その結果、１０種の代謝物（2-オキソグルタル酸、イソクエン酸、フコース、アラビノース、フマル酸、エリスリトール、コハク酸、フェニルアラニン、リンゴ酸、クエン酸）の測定値が心房細動の診断に有用であることが分かった。表５は、心房細動の診断に有用な１０種の代謝物のＲＯＣ曲線（ROC curve）のＡＵＣ値を示している。
ＲＯＣ曲線は、縦軸を真陽性率、つまり感度、横軸を偽陽性率、つまり「１－特異度」を尺度としてプロットしたものである。すなわち、心房細動の被検者全体に対する、陽性と判断された被検者の割合より感度を計算し、正常群の被検者全体に対する、陽性と判断された被検者（非ＡＦ）の割合より偽陽性率を計算する。同様にして他のカットオフ値での感度と偽陽性率を計算し、このようにして求めた値をグラフにプロットすることによりＲＯＣ曲線が得られる。ＡＵＣ値はＲＯＣ曲線と横軸で囲まれた部分の面積の値である。ＡＵＣ値が大きいほどＡＦの有無を診断する精度が高いと判断することができる。ＲＯＣ曲線からＡＵＣ値を求めた結果、ＡＵＣ値の大きかった生体内代謝物は2-オキソグルタル酸（ＡＵＣ＝0.733）、イソクエン酸（ＡＵＣ＝0.723）、フコース（ＡＵＣ＝0.722）であった。
一方、表６は、表５に示す結果が得られたＲＯＣ解析と同じ従属変数に、調整因子として年齢、性別、喫煙歴、高血圧・糖尿病の現病歴あり、心疾患の既往歴あり、及びｅＧＦＲ値を投入したモデルについて１３５種の代謝物のＲＯＣ解析を行った結果、Ｃ統計量が高かった１０種の代謝物を示している。Ｃ統計量はＡＵＣ値に相当し、Ｃ統計量が１に近づくほど診断能力が高いことを示している。表６には、１３５種の代謝物のうちＣ統計量が多い順に１０種の代謝物（β－アラニン、トレオニン、リンゴ酸、フマル酸、２－ヒドロキシピリジン、２－オキソグルタル酸、セリン、アラビノース、マルガリン酸、リボース）をＣ統計量とともに列挙している。これら１０種の代謝物の測定値はいずれも、心房細動と統計学的に相関しており、心房細動の有無を診断する指標として有用である。特に、Ｃ統計量が最も大きかったβ－アラニン（Ｃ統計量：０．９１７）の測定値は、心房細動との間で強い相関がみられ、心房細動の有無を診断する指標として優れているといえる。
表６には併せて、調整因子での調整を行わなかった時のＲＯＣ解析により求められたＡＵＣ値、及びＡＵＣ順位を記載した。上記１０種の代謝物は、調整因子で調整したときの方が、調整因子で調整しなかったときよりもＡＵＣ順位が上位であった。このように調整因子で調整を行うことで１０種の代謝物の順位が上がり、指標としての有用性が増す。
このように、被検者の生体試料に含まれる１６種の代謝物の量を測定した結果は、被検者における心房細動の有無の診断に利用することができる。
すなわち、心房細動の診断方法は、被検者から採取された生体試料を分析装置で分析すること、前記分析装置で得られたデータから、１６種の代謝物であるβ‐アラニン、トレオニン、リンゴ酸、フマル酸、2-ヒドロキシピリジン、2-オキソグルタル酸、セリン、アラビノース、マルガリン酸、リボース、イソクエン酸、フェニルアラニン、コハク酸、フコース、クエン酸、エリスリトールから選ばれる少なくとも１種の代謝物の量である心房細動指標値を求めること、前記心房細動指標値を所定の閾値と比較した結果に基づき、前記被検者における心房細動の有無を診断すること、を含む。
すなわち、心房細動の診断方法は、被検者から採取された生体試料を分析装置で分析すること、前記分析装置で得られたデータから、１６種の代謝物であるβ‐アラニン、トレオニン、リンゴ酸、フマル酸、2-ヒドロキシピリジン、2-オキソグルタル酸、セリン、アラビノース、マルガリン酸、リボース、イソクエン酸、フェニルアラニン、コハク酸、フコース、クエン酸、エリスリトールから選ばれる少なくとも１種の代謝物の量である心房細動指標値を求めること、前記心房細動指標値を所定の閾値と比較した結果に基づき、前記被検者における心房細動の有無を診断すること、を含む。
また、心房細動を診断する別の方法は、被検者から採取された生体試料をクロマトグラフ質量分析装置で分析すること、前記クロマトグラフ質量分析装置で得られたデータから、１６種の代謝物であるβ‐アラニン、トレオニン、リンゴ酸、フマル酸、2-ヒドロキシピリジン、2-オキソグルタル酸、セリン、アラビノース、マルガリン酸、リボース、イソクエン酸、フェニルアラニン、コハク酸、フコース、クエン酸、エリスリトールから選ばれる少なくとも１種の代謝物の量である心房細動指標値を求めること、前記心房細動指標値を所定の閾値と比較した結果に基づき、前記被検者における心房細動の有無を診断すること、を含む。
Claims (5)
- 心房細動の発症に関連する指標である心房細動指標値を測定する方法であって、
被検者から採取された生体試料を分析し、代謝物であるコハク酸の量を前記心房細動指標値として測定する、心房細動指標値の測定方法。 - 請求項１に記載の心房細動指標値の測定方法において、
前記心房細動指標値が、コハク酸の量と、イソクエン酸、アラビノース、リボース、2-オキソグルタル酸、リンゴ酸、フマル酸、フコース、クエン酸のうちのいずれか１種の代謝物の量の組み合わせからなる、心房細動指標値の測定方法。 - 請求項１に記載の心房細動指標値の測定方法において、
前記心房細動指標値が、コハク酸の量と、β-アラニン、フマル酸、トレオニン、2-オキソグルタル酸のうちのいずれか１種の代謝物の量の組み合わせからなる、心房細動指標値の測定方法。 - 請求項１に記載の心房細動指標値の測定方法において、
前記心房細動指標値が、コハク酸の量と、２-オキソグルタル酸、イソクエン酸、フコース、アラビノース、フマル酸、エリスリトール、フェニルアラニン、リンゴ酸、クエン酸のうちのいずれか１種の代謝物の量の組み合わせからなる、心房細動指標値の測定方法。 - 請求項１～４のいずれかに記載の心房細動指標値の測定方法において、
前記心房細動指標値が、生体試料をクロマトグラフＭＳ分析することによって得られたデータに基づき測定された代謝物の量である、心房細動指標値の測定方法。
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