JP5863784B2 - 原発性アルドステロン症の腺腫鑑別法及び１８−オキソコルチゾール（１８−ｏｘｏＦ）、１８−ヒドロキシコルチゾール（１８−ＯＨＦ）の測定法 - Google Patents
原発性アルドステロン症の腺腫鑑別法及び１８−オキソコルチゾール（１８−ｏｘｏＦ）、１８−ヒドロキシコルチゾール（１８−ＯＨＦ）の測定法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、原発性アルドステロン症の腺腫鑑別法に関する、及び試料中に含まれる18-oxoF、18-OHFの量を液体クロマトグラフィー質量分析法（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry：LC-MS）により測定する方法及びその測定に用いる化合物に関する。
日本人の高血圧患者の推定数は、4000万人以上とされ、薬物療法で治療されるのが主であるが、二次性高血圧が10％強含まれる。原発性アルドステロン症（PA）については、近年、高血圧症全体の中のPAの比率が5〜10％程度との報告が相次いでなされ、PA推定患者数は少なくとも200万人とされる。PAは、同等の血圧の本態性高血圧に比較して、脳卒中、心筋梗塞、心不全、心房細動や腎障害等を有意に高頻度に引き起こす。PAの病型分類では、手術によって治癒も可能なアルドステロン産生腺腫（APA）や薬物療法が原則の特発性アルドステロン症（両側副腎過形成：IHA）、糖質コルチコイド反応性アルドステロン症（GRA）等に大別される。そのため、APAを末梢血等の臨床検査で簡便に鑑別することは治療上重要である。
原発性アルドステロン症の診断は、日本内分泌学会が定めた「原発性アルドステロン症診断の手引き」に基づいて実施される。最終的には、手術適応となるAPA（主に片側病変）とIHA（両側病変）との鑑別が重要となる。本ガイドラインではまず血漿アルドステロン／レニン活性（PAC/PRA）比からスクリーニングされた患者にカプトプリル負荷試験等の機能性負荷試験を実施し、原発性アルドステロン症と確定する。この後、副腎部CT撮影により手術療法を検討し、副腎静脈採血（AVS）のアルドステロン、コルチゾール値からアルドステロン過剰分泌の局在診断を行い、片側病変の場合には手術となり、両側病変の場合には薬物療法の適応となる。
確定診断に関しては、施設によって異なる数種の機能性負荷試験が実地医家には煩雑であり敬遠されることも多い。また、IHAに合併する非機能性副腎腺腫の存在やCT陰性の微小の腺腫の存在でCT等の画像診断の正診率が60％程度であるため、手術治療する場合、正診率が高いAVSが必要だが、AVSは患者の負担や医師の高度な技術が必要になることから、実施施設が限定され、より簡便な腺腫鑑別法が従来より期待されていた。
これまでに生体内でコルチゾールから生成される18水酸化ステロイド化合物、主に18-oxoFや18-OHFが、GRAのバイオマーカーとして報告され（非特許文献1）、またAPA患者の尿中（非特許文献2）及び血漿（非特許文献3）でも高値を示すとの報告がなされている。また、18-oxoFの生成にはアルドステロン生成酵素（AS：CYP11B2）が必要とされ、ASは副腎腺腫で過剰発現しているとの報告（非特許文献4）もあることから、生成した18-oxoFはこのような腺腫鑑別に用いられる可能性がある。また、最近、副腎静脈血中の18-oxoFがAPAとIHAの鑑別に有用であるとの報告（非特許文献5）がなされたが、副腎静脈採血には医師の熟練を要する等の問題もあり、実施施設が限定される。
18-oxoFや18-OHFの測定には、これまで、LC-MS、ガスクロマトグラフィー質量分析法（Gas Chromatography -Mass Spectrometry：GC-MS）、ラジオイムノアッセイ法（Radioimmunoassay：RIA）、酵素免疫測定法（Enzyme Immunoassay：EIA）、化学発光免疫測定法（Chemiluminescent Immunoassay：CLIA）、時間分解蛍光免疫測定法（Time-Resolved Fluoroimmunoassay：TR-FIA）等が用いられている。このうち、RIAやEIA等といった免疫反応を利用した測定は、試料中に測定対象化合物と構造が類似した代謝物が多量に存在しているため、交差反応により定量値が大きく変動する。非特許文献2には、グルココルチコイド反応性アルドステロン症（GRA）の尿中18-oxoFをRIAによる直接法で測定しているが、アルドステロンとの交差性が26％と報告されている。非特許文献6では、ELISA法で18-oxoFを測定しているが、RIA法よりは優れるものの、アルドステロンやコルチゾールとの交差性は若干残っている。また、抗体の特異性に加えて、キット間差による測定値の乖離も考えられる。非特許文献7では、TR-FIA法とELISA法の比較が試みられており、相関を認めるものの18-oxoFの測定では、アルドステロンとの交差性が8％あると報告されている。
GC-MS法による測定もこれまでに試みられている。非特許文献8では、尿中18-OHFは測定しているが、18-oxoFは測定していない。非特許文献9では、両側副腎切除患者の尿中18-OHF、18-oxoFを測定しているが、クッシング症を対象としたもので腺腫鑑別には言及していない。非特許文献10では、18-OHFを用いた原発性アルドステロン症のAPAとIHAの鑑別について報告したが、両者の重なりが多く、鑑別が十分とはいえない。
これまでのところ、18-oxoFを用いたLC-MSによる測定法及び鑑別法は、報告されていない。本発明者らは、これまで、ステロイドの水酸基をピリジルカルボニル化してピリジンカルボン酸エステル体とすることにより、複数のステロイドをLC-MSにより数pgのレベルで同時測定できることを見出している（特許文献1）。また、18-oxoFと類似の構造を持つアルドステロンについても、本発明者らは、試料中のアルドステロンを試料操作の過程において、酸性条件下、アルコールと反応させ、アルドステロンを18-アルコキシの状態に収束させ、次いで21位水酸基をピリジンカルボン酸エステル体とすることにより、LC-MSを用いて試料中のアルドステロンの量を数pg／アッセイのレベルで測定することに成功している（特許文献2）。
Kidney Int.、46、1550（1994）
J. Clin. Endocrinol. Metab.、59、1022（1984）
Clin. Endocrinol.、40、583（1994）
J.Clin.Endocrinol. Metab.、86、4326（2001）
第18回日本ステロイドホルモン学会、37（2010）
J.Steroid Biochem. Biochem. Mol.、43、523（1992）
J.Steroid Biochem. Biochem. Mol.、82、83（2002）
J.Clin.Endocrinol. Metab.、76、873（1993）
Clin. Endocrinol.、66、659（2007）
第84回日本内分泌学会、286（2011）
本発明の目的は、原発性アルドステロン症患者の末梢血に存在する18-oxoFを用いた腺腫鑑別法を提供することである。
本発明の別の目的は、試料中に含まれる18-oxoF、18-OHFの同時測定も含めたLC-MSによる測定法を提供することである。
また、本発明の別の目的は、18-oxoF、18-OHFのLC-MSによる測定で有用な化合物及びその化合物を含有することを特徴とする18-oxoF、18-OHF測定用試薬を提供することである。
本発明の別の目的は、試料中に含まれる18-oxoF、18-OHFの同時測定も含めたLC-MSによる測定法を提供することである。
また、本発明の別の目的は、18-oxoF、18-OHFのLC-MSによる測定で有用な化合物及びその化合物を含有することを特徴とする18-oxoF、18-OHF測定用試薬を提供することである。
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、LC-MSを用いて、試料中の18-oxoF、18-OHFの量をそれぞれ0.5pg、5pg／アッセイのレベルで測定することに成功し、本発明の18-oxoF、18-OHFの測定方法を完成させた。
すなわち、本発明は、試料中に含まれる18-oxoFを酸性条件下、アルコールを反応させて18-アルコキシ化し、更にフザリン酸エステル体としてLC-MSで測定する方法を提供するものである。なお、18-OHFは直接フザリン酸エステル化する。
すなわち、本発明は、試料中に含まれる18-oxoFを酸性条件下、アルコールを反応させて18-アルコキシ化し、更にフザリン酸エステル体としてLC-MSで測定する方法を提供するものである。なお、18-OHFは直接フザリン酸エステル化する。
また、本発明は、18-oxoF、18-OHFのLC-MSによる測定において有用な化合物及びその化合物を含有することを特徴とする測定用試薬を提供することである。
本発明者らは、原発性アルドステロン症の腺腫鑑別法のマーカーとして、18-oxoF、18-OHFに着目し、本発明の測定方法で得られたそれらの値を比較検討した結果、APAとIHAの鑑別に有効であることを発見し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、末梢血中の18-oxoFの量に基づき、原発性アルドステロン症のAPAとIHAを鑑別する方法および鑑別のためのデータを提供する方法を提供するものである。
すなわち、本発明は、末梢血中の18-oxoFの量に基づき、原発性アルドステロン症のAPAとIHAを鑑別する方法および鑑別のためのデータを提供する方法を提供するものである。
本発明を具体的に示すと以下の通りである。
［１］ 試料中の18-oxoF、18-OHFのLC-MSによる測定法であって、試料の処理において、
１） 酸性条件下、試料にアルコールを反応させる工程、
２） 下記式（I）
（式中、R1は水素原子、ハロゲン原子、C1-4アルキル基、C1-4アルコキシ基、アリルC1-4アルコキシ基、C1-4アルキルアミノ基、ジ（C1-4アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Xはヒドロキシ基又は脱離基を表す。）
で示される化合物を試料に反応させる工程、
を含むことを特徴とする、測定法。
［２］ R1が水素原子又はC1-4アルキル基を表す、［１］に記載の測定法。
［３］ COXの置換位置がピリジン環の2位である、［１］又は［２］に記載の測定法。
［４］ アルコールがエタノール又はメタノールである、［１］〜［３］のいずれか1つに記載の測定法。
［５］ 試料が、血液、唾液、尿、糞、胆汁、組織及び細胞培養液からなる群より選択される、［１］〜［４］のいずれか1つに記載の測定法。
［６］ 下記式（II）及び（III）
（式中、R1は水素原子、ハロゲン原子、C1-4アルキル基、C1-4アルコキシ基、アリルC1-4アルコキシ基、C1-4アルキルアミノ基、ジ（C1-4アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、R2はC1-4アルキル基を表す。）
で示される化合物。
［７］ R1が水素原子又はC1-4アルキル基を表し、R2がエチル基又はメチル基を表す、［６］に記載の化合物。
［８］ ピリジン環が2位でカルボン酸エステルを介して結合している、［６］又は［７］に記載の化合物。
［９］ 式（ＩＩ）及び（III）で示される化合物を含むことを特徴とする、18-oxoF、18-OHFのLC-MSによる測定用キット。
［１０］ 試料中の18-oxoFの量に基づき、原発性アルドステロン症の副腎腺腫を鑑別する方法。
［１１］ 試料中の18-oxoFの量をLC-MS、GC-MS、RIA、EIA、CLIA、TR-FIAにより測定する、［１０］に記載の鑑別法。
［１２］ ［１］に記載の測定法を用いて、試料中の18-oxoFの量を測定することを含む、［１０］に記載の鑑別法。
［１］ 試料中の18-oxoF、18-OHFのLC-MSによる測定法であって、試料の処理において、
１） 酸性条件下、試料にアルコールを反応させる工程、
２） 下記式（I）
で示される化合物を試料に反応させる工程、
を含むことを特徴とする、測定法。
［２］ R1が水素原子又はC1-4アルキル基を表す、［１］に記載の測定法。
［３］ COXの置換位置がピリジン環の2位である、［１］又は［２］に記載の測定法。
［４］ アルコールがエタノール又はメタノールである、［１］〜［３］のいずれか1つに記載の測定法。
［５］ 試料が、血液、唾液、尿、糞、胆汁、組織及び細胞培養液からなる群より選択される、［１］〜［４］のいずれか1つに記載の測定法。
［６］ 下記式（II）及び（III）
で示される化合物。
［７］ R1が水素原子又はC1-4アルキル基を表し、R2がエチル基又はメチル基を表す、［６］に記載の化合物。
［８］ ピリジン環が2位でカルボン酸エステルを介して結合している、［６］又は［７］に記載の化合物。
［９］ 式（ＩＩ）及び（III）で示される化合物を含むことを特徴とする、18-oxoF、18-OHFのLC-MSによる測定用キット。
［１０］ 試料中の18-oxoFの量に基づき、原発性アルドステロン症の副腎腺腫を鑑別する方法。
［１１］ 試料中の18-oxoFの量をLC-MS、GC-MS、RIA、EIA、CLIA、TR-FIAにより測定する、［１０］に記載の鑑別法。
［１２］ ［１］に記載の測定法を用いて、試料中の18-oxoFの量を測定することを含む、［１０］に記載の鑑別法。
18-oxoFそれ自身は、溶液中で複数の形状で化学平衡を形成しているため、質量分析に基づく測定を行うことは困難であるが、本発明によれば、18-oxoFをアルキルエーテル化することによって化合物が安定し、さらにフザリン酸エステル体とすることによって、また、18-OHFは直接フザリン酸エステル化することによって、LC-MSにおける測定感度が上昇するため、本発明の方法により、試料中の18-oxoF、18-OHFの定量的な高感度分析が可能になる。
本発明によれば、試料中の18-oxoF、18-OHFをそれぞれ0.5、5 pg／アッセイ（定量下限値）まで測定することができる。これにより、末梢血での測定が可能になり、原発性アルドステロン症の腺腫鑑別が可能になる。
また、本発明の測定方法における操作は、試料を溶媒による抽出、固相抽出、遠心分離等の簡易な精製手段に付した後、酸性条件下にてアルコールと反応を行うか又は直接エステル誘導体化試薬で反応を行うというもので、極めて容易に行うことができる。
本発明において、18-OHFは18-Hydroxycortisol：
を指し、18-oxoFは18-oxocortisol：
を指す。これらの化合物は、アルドステロン生合成時に関与するCYP11B1、CYP11B2によりコルチゾールから生成される代謝産物である。
本発明において18-oxoF、18-OHFの測定は、LC-MS、GC-MS、RIA、EIA、CLIA、TR-FIA等を用いて、測定できるが、微量定量が可能であること、感度、特異度が高いこと、また、同時測定が出来ることから、LC-MSが最も適している。
本発明において、「LC-MS」とは、液体クロマトグラフィーと質量分析計とを組み合わせた装置を用いて行う分析方法を表すが、その中でも、質量分離部が複数結合したタンデム型の質量分析計（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometer：LC-MS/MS）を用いることが好ましい。LC-MSにおけるイオン化は、例えば、APCI、ESI、APPI等が挙げられるが、中でも、ESIを用いることが好ましい。また、質量分離法は、例えば、磁場型、四重極型、飛行時間型等が挙げられるが、本発明では、定量性が良く、ダイナミックレンジも広く直線性も良い四重極型を使用することが好ましい。さらに、定量におけるイオンの検出は、目的とするイオンのみを選択的に検出する、選択イオンモニタリング（Selected Ion Monitoring：SIM）や、１つ目の質量分離部で生成したイオン種のうち１つを前駆イオンとして選択し、２つ目の質量分離部で、その前駆イオンの分解によって生じるプロダクトイオンを検出する、選択反応モニタリング（Selected Reaction Monitoring：SRM）等が挙げられる。本発明では、選択性が増し、ノイズが減ることによってS/N（シグナル／ノイズ）比が向上するSRMによる測定が好ましい。
本発明における「アルコール」とは、直鎖状又は分枝鎖状のアルコールを表し、例えば、メタノール、エタノール、n-プロパノール、n-ブタノール等を挙げることができるが、より適しているのは、エタノール及びメタノールである。
本発明の測定方法においては、使用する下記式（Ｉ）
（式中、R1は水素原子、ハロゲン原子、C1-4アルキル基、C1-4アルコキシ基、アリルC1-4アルコキシ基、C1-4アルキルアミノ基、ジ（C1-4アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Xはヒドロキシ基又は脱離基を表す。）
で示される化合物において、R1が水素原子、ハロゲン原子、C1-4アルキル基、C1-4アルコキシ基、アリルC1-4アルコキシ基又はジ（C1-4アルキル）アミノ基を表す場合が好ましく、中でも、R1がブチル基を表す場合が好適である。
で示される化合物において、R1が水素原子、ハロゲン原子、C1-4アルキル基、C1-4アルコキシ基、アリルC1-4アルコキシ基又はジ（C1-4アルキル）アミノ基を表す場合が好ましく、中でも、R1がブチル基を表す場合が好適である。
また、本発明の測定方法において、上記式（I）で示される化合物におけるXはヒドロキシ基又は脱離基を表す。ここで、脱離基とは、水酸基と反応して該水酸基に取って代わることのできる基を意味し、本発明において特に制限はないが、例えば、ハロゲン基（フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）、低級アルキルカルボニルオキシ基、ジカルボン酸イミド基等を挙げることができる。本発明において、Xは、ヒドロキシ基であることが好ましい。
なお、上記低級アルキル基は、炭素数が1〜6の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル等を挙げることができる。
さらに、本発明の測定方法において使用される、前記式（I）で示される化合物における-COXの置換位置は、特に制限されることはないが、より好ましくはピリジン環の2位である。
特に好ましい式（I）の化合物は、フザリン酸である。
なお、前記式（I）の化合物はそのほとんどが既知であり、たとえ新規であったとしても、既知化合物から既存の方法により容易に合成することができる。
さらに、本明細書において、下記式（II）及び（III）
（式中、R1は水素原子、ハロゲン原子、C1-4アルキル基、C1-4アルコキシ基、アリルC1-4アルコキシ基、C1-4アルキルアミノ基、ジ（C1-4アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、R2はC1-4アルキル基を表す。）
で示される化合物におけるR1が水素原子、ハロゲン原子、C1-4アルキル基、C1-4アルコキシ基、アリルC1-4アルコキシ基又はジ（C1-4アルキル）アミノ基を表す場合の化合物が好ましく、中でも、R1がブチル基を表す場合の化合物が好適である。また、R2はエチル基又はメチル基を表す場合の化合物が好ましい。さらに、特に制限されるものではないが、ピリジン環が2位でカルボン酸エステルを介して結合している場合の化合物が好ましい。
で示される化合物におけるR1が水素原子、ハロゲン原子、C1-4アルキル基、C1-4アルコキシ基、アリルC1-4アルコキシ基又はジ（C1-4アルキル）アミノ基を表す場合の化合物が好ましく、中でも、R1がブチル基を表す場合の化合物が好適である。また、R2はエチル基又はメチル基を表す場合の化合物が好ましい。さらに、特に制限されるものではないが、ピリジン環が2位でカルボン酸エステルを介して結合している場合の化合物が好ましい。
特に好ましい式（II）の化合物は、18-oxoF、メタノール又はエタノール、及びフザリン酸から生成されるコルチゾール-18-メトキシ-21-フザニリルエステル又はコルチゾール-18-エトキシ-21-フザニリルエステルである。
特に好ましい式（III）の化合物は、18-OHF及びフザリン酸から生成されるコルチゾール-18-ヒドロキシ-21-フザニリルエステルである。
特に好ましい式（III）の化合物は、18-OHF及びフザリン酸から生成されるコルチゾール-18-ヒドロキシ-21-フザニリルエステルである。
本明細書において、「試料」とは、生物、環境又は工業製品いずれの由来のものであってもよい。生物由来の試料としては、例えば、ヒトを含む動物の血液、唾液、涙液、尿、糞、胆汁、組織、培養細胞、細胞培養液又は臓器から得られる調製物、あるいは植物からの抽出物等を挙げることができる。また、環境由来の試料としては、例えば、土壌、汚水、廃水、河川水、海水等が挙げられる。さらに、工業製品由来の試料としては、例えば、食料品、医薬品等が挙げられる。この中、好ましくは、生物由来の試料としては、ヒトを含む動物の血液、唾液、尿、糞、胆汁、組織及び細胞培養液等が挙げられ、環境由来の試料としては、汚水、排水及び河川水が挙げられ、工業由来の試料としては、医薬品が挙げられる。
動物の血液は、限定されないが、副腎静脈血由来、末梢血由来、より好ましくは末梢血由来の血液である。末梢血の採血部位は、限定されないが、脚や腕などからが好ましい。
本発明の測定方法について、以下に具体的に説明する。
試料の調製
試料は、必要に応じて有機溶媒による抽出を行った後、固相抽出、例えば、ウォーターズ社製Oasis HLB（登録商標）カートリッジ、バリアン社製Bond Elut C18（登録商標）カートリッジ、ジーエルサイエンス社製InertSep Pharma（登録商標）カートリッジ等による分離精製等の一般的な調製方法を適宜選択して調製し、次のアルコキシ化及びフザリン酸エステル体化反応に供することができる。
試料の調製
試料は、必要に応じて有機溶媒による抽出を行った後、固相抽出、例えば、ウォーターズ社製Oasis HLB（登録商標）カートリッジ、バリアン社製Bond Elut C18（登録商標）カートリッジ、ジーエルサイエンス社製InertSep Pharma（登録商標）カートリッジ等による分離精製等の一般的な調製方法を適宜選択して調製し、次のアルコキシ化及びフザリン酸エステル体化反応に供することができる。
アルコキシ化反応
上記で調製した試料に対し、酸性条件下でアルコールを反応させて、試料中に含まれる18-oxoFの18位をアルコキシ化する。
この反応に用いる酸としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、p-トルエンスルホン酸等が挙げられ、中でも塩酸が望ましい。また、アルコールは、メタノール、エタノール、n-プロパノール、n-ブタノール等が使用できるが、中でもメタノール及びエタノールが好適である。本反応に使用する酸とアルコールの量は特に制限されるものではないが、アルコール中に酸の割合が5％前後になるように調製した酸とアルコールの混合溶液を、試料1 mL又は0.5 gにつき0.01乃至1 mLの範囲内、より好ましくは0.1乃至0.5 mLの範囲内で調製試料中に加えることが適している。反応温度は、通常、-5℃乃至80℃の範囲内とすることができるが、好ましくは10℃乃至30℃の範囲内の温度が適している。また、反応時間は、通常5乃至240分の範囲内とすることができ、好ましくは15分乃至90分の範囲内の時間が適している。
上記で調製した試料に対し、酸性条件下でアルコールを反応させて、試料中に含まれる18-oxoFの18位をアルコキシ化する。
この反応に用いる酸としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、p-トルエンスルホン酸等が挙げられ、中でも塩酸が望ましい。また、アルコールは、メタノール、エタノール、n-プロパノール、n-ブタノール等が使用できるが、中でもメタノール及びエタノールが好適である。本反応に使用する酸とアルコールの量は特に制限されるものではないが、アルコール中に酸の割合が5％前後になるように調製した酸とアルコールの混合溶液を、試料1 mL又は0.5 gにつき0.01乃至1 mLの範囲内、より好ましくは0.1乃至0.5 mLの範囲内で調製試料中に加えることが適している。反応温度は、通常、-5℃乃至80℃の範囲内とすることができるが、好ましくは10℃乃至30℃の範囲内の温度が適している。また、反応時間は、通常5乃至240分の範囲内とすることができ、好ましくは15分乃至90分の範囲内の時間が適している。
エステル誘導体化反応
上記でアルコキシ化した後、更に、試料中に含まれる18-OHF及び／又は18位がアルコキシ化された18-oxoFの21位を前記式（I）の化合物とエステル化反応させる。
上記でアルコキシ化した後、更に、試料中に含まれる18-OHF及び／又は18位がアルコキシ化された18-oxoFの21位を前記式（I）の化合物とエステル化反応させる。
この反応は、一般に、上記でアルコキシ化した試料又は直接アルコキシ化していない試料を、適当な塩基、例えば、水素化ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、ピリジン等の存在下にて不活性有機溶媒（例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類；アセトニトリル；ジメチルスルホキシド等の不活性有機溶媒）又はそれと水との混合溶媒に溶解又は懸濁することによって行うことができる。
反応温度は、通常、-5℃乃至80℃の範囲内の温度とすることができ、好ましくは10℃乃至60℃の範囲内の温度が適している。また、反応時間は、通常5乃至240分の範囲内の時間とすることができ、好ましくは15分乃至90分の範囲内の時間が適している。
上記エステル誘導体化反応において、試料の量に対する前記式（I）の化合物の使用割合は、特に制限されるものではないが、一般に、試料1 mLあたり前記式（I）の化合物を少なくとも0.2 mg、好ましくは1乃至5 mgの範囲内で用いることができる。
また、上記エステル誘導体化反応において使用する塩基の量は、特に制限されるものではないが、一般に、試料1 mLあたり塩基を少なくとも0.1 mmol、好ましくは0.1乃至0.5 mmolの範囲内とすることができる。
なお、上記エステル誘導体化反応において、前記式（Ｉ）の化合物におけるXがヒドロキシ基を表す場合は、この式（I）の化合物を予め、例えば、1,1-カルボニルジイミダゾール、1,1-チオニルジイミダゾール等で処理して、ヒドロキシ基を活性アミド等の脱離基に変換しておくことが望ましい。
また、Xがハロゲン基を表す場合、式（I）の化合物は予め、例えばイミダゾール及びDBU（1,8-ジアザビシクロ［5.4.0］ウンデカ-7-エン）等で処理して、ハロゲンをイミダゾリド等の他の脱離基に変換しておくこともできる。
以上のようにエステル誘導体化反応を行った後、常法により後処理を行い、以下のようにしてLC-MSによる測定を行う。
LC-MS測定
上記反応において調製した調製物のLC-MSによる測定は、一般的なLC、例えば、ヒューレット・パッカード社製HP 1100、ウォーターズ社製ACQUITY UPLC（登録商標）等のLC、さらにウォーターズ社製及び一般的なMS、例えば、マイクロマス社製QUATTRO II（登録商標）、QUATTRO MICRO（登録商標）、アプライド・バイオシステムズ社製API 5000（登録商標）等のMSを用いて行うことができる。
上記反応において調製した調製物のLC-MSによる測定は、一般的なLC、例えば、ヒューレット・パッカード社製HP 1100、ウォーターズ社製ACQUITY UPLC（登録商標）等のLC、さらにウォーターズ社製及び一般的なMS、例えば、マイクロマス社製QUATTRO II（登録商標）、QUATTRO MICRO（登録商標）、アプライド・バイオシステムズ社製API 5000（登録商標）等のMSを用いて行うことができる。
原発性アルドステロン症腺腫（ＡＰＡ）鑑別法
患者の血液を用いて、上記の方法により、試料を調整した後、18-oxoF及び／または18-OHFを測定し、設定したカットオフ値、感度、特異度を基に原発性アルドステロン症の腺腫（ＡＰＡ）を鑑別することができる。
患者の血液を用いて、上記の方法により、試料を調整した後、18-oxoF及び／または18-OHFを測定し、設定したカットオフ値、感度、特異度を基に原発性アルドステロン症の腺腫（ＡＰＡ）を鑑別することができる。
カットオフ値とは、この値を超えた場合APAと判断する値を意味する。18-oxoF の末梢血液におけるカットオフ値は、1.0〜10.0ng/dL、3.0〜6.0ng/dL、好ましくは、4.0〜5.5ng/dL、より好ましくは、4.5〜5.0 ng/dLである。
18-OHFの末梢血液におけるカットオフ値は、125.0〜350.0ng/dL、175.0〜300.0ng/dL、好ましくは、200.0〜275.0ng/dL、より好ましくは、225.0〜250.0 ng/dLである。
末梢血液における18-oxoFまたは18-OHF量がカットオフ値を超えた場合、対象はＡＰＡであると鑑別することができる。
18-OHFの末梢血液におけるカットオフ値は、125.0〜350.0ng/dL、175.0〜300.0ng/dL、好ましくは、200.0〜275.0ng/dL、より好ましくは、225.0〜250.0 ng/dLである。
末梢血液における18-oxoFまたは18-OHF量がカットオフ値を超えた場合、対象はＡＰＡであると鑑別することができる。
感度とは、APAをもった対象から得られる陽性結果の百分率を意味する。鑑別に適した感度は、65.0％以上、70.0％以上、好ましくは75.0％以上、より好ましくは80.0％以上である。
特異度とは、IHAをもった対象から得られる陰性結果の百分率を意味する。鑑別に適した特異度は、80.0％以上、85.0％以上、好ましくは90.0％以上、より好ましくは95.0％以上である。
本発明の鑑別方法を用い、患者が片方の副腎腺腫であると鑑別された場合、腺腫を有する副腎を手術により取り除く処置を行うことができる。
本発明の方法のために用いるキットは、式（I）、（II）、（III）の化合物、緩衝液、酸、塩基、アルコール、18-oxoF、18-OHF、注射器、測定手順を記載した文書から選択される少なくとも１つを含むことができる。さらに、鑑別方法の場合、判定基準を記載した文書を含むことができる。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
コルチゾール-18-エトキシ-21-フザリニルエステルの合成
18-oxoF 400 μg（東北薬科大学山下教授より提供、J.Steroid Biochem,、22、141(1985)に基づき合成）をエタノール：塩酸（5：1、v/v）0.25 mLに溶解し、30分間室温で放置した。これに、精製水1 mLを加え、酢酸エチル5 mLで抽出し、抽出物を減圧下で濃縮・乾固した。その残渣にフザリン酸100 mg、2-メチル-6-ニトロ安息香酸無水物200 mg及び4-ジメチルアミノピリジン50 mgのテトラヒドロフラン1 mL溶液を100 μL及びトリエチルアミン40 μL加え、室温で60分静置した。反応後、5% 重曹水1 mLを加え、あらかじめメタノール6 mL、精製水6 mLでコンディショニングしたInertSep Pharmaカートリッジに負荷した。そのカートリッジを精製水3 mL、5% 塩酸溶液1 mL、精製水3 mLで順次洗浄し、アセトニトリル：精製水（80:20、v/v）で目的化合物を溶出し、その溶出液を減圧下で濃縮・乾固し、粗精製物を得た。次いで、プレパラティブ薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：アセトン：アセトニトリル（100:30:10））で分離し、Rf 0.63部位のシリカゲルを剥離し、酢酸エチルで溶出した。溶出液を濃縮・乾固し、コルチゾール-18-エトキシ-21-フザリニルエステルを得た。
18-oxoF 400 μg（東北薬科大学山下教授より提供、J.Steroid Biochem,、22、141(1985)に基づき合成）をエタノール：塩酸（5：1、v/v）0.25 mLに溶解し、30分間室温で放置した。これに、精製水1 mLを加え、酢酸エチル5 mLで抽出し、抽出物を減圧下で濃縮・乾固した。その残渣にフザリン酸100 mg、2-メチル-6-ニトロ安息香酸無水物200 mg及び4-ジメチルアミノピリジン50 mgのテトラヒドロフラン1 mL溶液を100 μL及びトリエチルアミン40 μL加え、室温で60分静置した。反応後、5% 重曹水1 mLを加え、あらかじめメタノール6 mL、精製水6 mLでコンディショニングしたInertSep Pharmaカートリッジに負荷した。そのカートリッジを精製水3 mL、5% 塩酸溶液1 mL、精製水3 mLで順次洗浄し、アセトニトリル：精製水（80:20、v/v）で目的化合物を溶出し、その溶出液を減圧下で濃縮・乾固し、粗精製物を得た。次いで、プレパラティブ薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：アセトン：アセトニトリル（100:30:10））で分離し、Rf 0.63部位のシリカゲルを剥離し、酢酸エチルで溶出した。溶出液を濃縮・乾固し、コルチゾール-18-エトキシ-21-フザリニルエステルを得た。
得られたコルチゾール-18-エトキシ-21-フザリニルエステルの液体クロマトグラフ飛行時間型質量分析計（LC-TOF-MS）データを下記表1に示す。
コルチゾール-18-ヒドロキシ-21-フザリニルエステルの合成
18-OHF 1 mg （STERALOIDS社から購入）をアセトニトリル0.2 mLに溶解し、フザリン酸20 mg、2-メチル-6-ニトロ安息香酸無水物40 mg及び4-ジメチルアミノピリジン10 mgのアセトニトリル1 mL溶液を120 μL及びトリエチルアミン50 μL加え、室温で45分静置した。反応液に精製水1 mLを加え、酢酸エチル5 mLによる抽出を2回行い、抽出液を減圧下で濃縮・乾固した。得られた残渣をプレパラティブ薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル：アセトン：アセトニトリル（4:1:1））で分離し、Rf 0.2部位のシリカゲルを剥離し、酢酸エチルで溶出した。溶出液を濃縮・乾固し、コルチゾール-18-ヒドロキシ-21-フザリニルエステルを得た。
18-OHF 1 mg （STERALOIDS社から購入）をアセトニトリル0.2 mLに溶解し、フザリン酸20 mg、2-メチル-6-ニトロ安息香酸無水物40 mg及び4-ジメチルアミノピリジン10 mgのアセトニトリル1 mL溶液を120 μL及びトリエチルアミン50 μL加え、室温で45分静置した。反応液に精製水1 mLを加え、酢酸エチル5 mLによる抽出を2回行い、抽出液を減圧下で濃縮・乾固した。得られた残渣をプレパラティブ薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル：アセトン：アセトニトリル（4:1:1））で分離し、Rf 0.2部位のシリカゲルを剥離し、酢酸エチルで溶出した。溶出液を濃縮・乾固し、コルチゾール-18-ヒドロキシ-21-フザリニルエステルを得た。
得られたコルチゾール-18-ヒドロキシ-21-フザリニルエステルのLC-TOF-MSデータを下記表2に示す。
LC-MS/MSでの検出感度の比較
18-oxoF、コルチゾール-18-エトキシ-21-ピコリニルエステル及びコルチゾール-18-エトキシ-21-フザリニルエステルについて、LC-MS/MSでの検出感度を比較した。
18-oxoF、コルチゾール-18-エトキシ-21-ピコリニルエステル及びコルチゾール-18-エトキシ-21-フザリニルエステルについて、LC-MS/MSでの検出感度を比較した。
コルチゾール-18-エトキシ-21-ピコリニルエステルは、18-oxoFを用い特許文献１の記載に基づいて合成した。
化合物それぞれ5 pgを含有するアセトニトリル溶液をLC-MS/MSで測定して、得られたクロマトグラムより、S/N比を算出した。その結果を下記表3に示す。
18-oxoF及び18-OHF測定の再現性
以下に述べる方法で、18-oxoF及び18-OHF測定の日内再現性を確認した。また、日を替えて同様の試験を3日間行い、日差再現性の確認をした。
以下に述べる方法で、18-oxoF及び18-OHF測定の日内再現性を確認した。また、日を替えて同様の試験を3日間行い、日差再現性の確認をした。
4-1）検量線の作製
18-oxoF及び18-OHFの濃度を求める際に、次のようにして検量線を作製した。すなわち、18-oxoF（0、0.5、2、10、50、200、1000 pg／50 μL）及び18-OHF（0、5、20、100、500、2000、10000 pg／50 μL）のエタノール溶液に、内標準物質としてアルドステロン−2H7エタノール溶液（100 pg／50 μL）及びコルチゾール−2H4エタノール溶液（200 pg／50 μL）を添加した。そこへ精製水を3 mL加え、あらかじめメタノール3 mL及び精製水3 mLでコンディショニングしたBond Elut C18カートリッジカラムに負荷した。そのカートリッジを30％メタノール3 mLで洗浄後、アセトニトリル：精製水（80：20）1 mLで目的物を溶出し、その溶出液を減圧下で濃縮・乾固した。
18-oxoF及び18-OHFの濃度を求める際に、次のようにして検量線を作製した。すなわち、18-oxoF（0、0.5、2、10、50、200、1000 pg／50 μL）及び18-OHF（0、5、20、100、500、2000、10000 pg／50 μL）のエタノール溶液に、内標準物質としてアルドステロン−2H7エタノール溶液（100 pg／50 μL）及びコルチゾール−2H4エタノール溶液（200 pg／50 μL）を添加した。そこへ精製水を3 mL加え、あらかじめメタノール3 mL及び精製水3 mLでコンディショニングしたBond Elut C18カートリッジカラムに負荷した。そのカートリッジを30％メタノール3 mLで洗浄後、アセトニトリル：精製水（80：20）1 mLで目的物を溶出し、その溶出液を減圧下で濃縮・乾固した。
下記4-3）から4-4）に従い処理をしてLC-MS/MS測定により含有量を求めた。検量線は、18-oxoFについては0.5〜1000 pg/tube（5〜10000 pg/ｍL）及び18-OHFについては5〜20000 pg/tube（50〜200000 pg/ｍL）の範囲において、測定対象物ピーク面積値／内標準物質ピーク面積値比と濃度との関係が、相関係数0.99以上と良好な直線性を示した（図3及び6）。
4-2）試料の調製
標準品として下記表6，7，8及び9に示した濃度の18-oxoF及び18-OHFのエタノール溶液50 μLに内標準としてアルドステロン−2H7（100 pg/ 50 μL）及びコルチゾール−2H4エタノール溶液（200 pg/50 μL）を添加した。以下、4-1）と同様に操作した。
標準品として下記表6，7，8及び9に示した濃度の18-oxoF及び18-OHFのエタノール溶液50 μLに内標準としてアルドステロン−2H7（100 pg/ 50 μL）及びコルチゾール−2H4エタノール溶液（200 pg/50 μL）を添加した。以下、4-1）と同様に操作した。
4-3）エトキシ化
残留物にエタノール：濃塩酸（5：1、v/v）を0.25 mL加え、よく振り混ぜた後、室温で30分間放置した。反応後、5％ 重曹水1 mL、酢酸エチル3 mLを加え、10分間振とうした後、酢酸エチルを凍結分離し、減圧下で留去した。
残留物にエタノール：濃塩酸（5：1、v/v）を0.25 mL加え、よく振り混ぜた後、室温で30分間放置した。反応後、5％ 重曹水1 mL、酢酸エチル3 mLを加え、10分間振とうした後、酢酸エチルを凍結分離し、減圧下で留去した。
4-4）フザリン酸エステル誘導体化
上記で得られた残留物に、フザリン酸20 mg、2-メチル-6-ニトロ安息香酸無水物40 mg、4-ジメチルアミノピリジン10 mg及びトリエチルアミン20 μLを含むアセトニトリル1 mL溶液の50 μLを加え、混合し、50℃で15分放置した。反応後、これにアセトニトリル0.25 mL及び5％塩酸0.75 mLを加え、あらかじめメタノール3 mL及び精製水3 mLでコンディショニングしたInertSep Pharmaカートリッジカラムに負荷した。そのカートリッジをアセトニトリル：精製水（30：70）1 mL、5％重曹水1 mL及びアセトニトリル：精製水（30：70）3 mLで順に洗浄後、アセトニトリル2 mLで目的物を溶出し、その溶出液を減圧下で濃縮・乾固した。その残渣をアセトニトリル：精製水（40：60）0.1 mLで溶解し、そのうち0.01 mLを下記表4及び5に示した条件でLC-MS/MS測定に供した。その結果を下記表6、7、8及び9に示す。
上記で得られた残留物に、フザリン酸20 mg、2-メチル-6-ニトロ安息香酸無水物40 mg、4-ジメチルアミノピリジン10 mg及びトリエチルアミン20 μLを含むアセトニトリル1 mL溶液の50 μLを加え、混合し、50℃で15分放置した。反応後、これにアセトニトリル0.25 mL及び5％塩酸0.75 mLを加え、あらかじめメタノール3 mL及び精製水3 mLでコンディショニングしたInertSep Pharmaカートリッジカラムに負荷した。そのカートリッジをアセトニトリル：精製水（30：70）1 mL、5％重曹水1 mL及びアセトニトリル：精製水（30：70）3 mLで順に洗浄後、アセトニトリル2 mLで目的物を溶出し、その溶出液を減圧下で濃縮・乾固した。その残渣をアセトニトリル：精製水（40：60）0.1 mLで溶解し、そのうち0.01 mLを下記表4及び5に示した条件でLC-MS/MS測定に供した。その結果を下記表6、7、8及び9に示す。
健康成人血清中の18-oxoF、18-OHF測定
5-1）：試料の調製
健常者16例の腕より末梢血液を採取し、血清0.1 mLを得た。これに内標準物質としてアルドステロン-2H7（100 pg/50 μL)及びコルチゾール-2H4（200 pg/50 μL）を添加し、アセトニトリル 0.25 mLを加えて振とうした後、3000rpm 5分間遠心分離した。その上清に精製水を3 mL加え、あらかじめメタノール3 mL及び精製水3 mLでコンディショニングしたBond Elut C18カートリッジカラムに負荷した。そのカートリッジを30％メタノール3 mLで洗浄後、アセトニトリル：精製水（80：20）1 mLで目的物を溶出し、その溶出液を減圧下で濃縮・乾固した。
5-1）：試料の調製
健常者16例の腕より末梢血液を採取し、血清0.1 mLを得た。これに内標準物質としてアルドステロン-2H7（100 pg/50 μL)及びコルチゾール-2H4（200 pg/50 μL）を添加し、アセトニトリル 0.25 mLを加えて振とうした後、3000rpm 5分間遠心分離した。その上清に精製水を3 mL加え、あらかじめメタノール3 mL及び精製水3 mLでコンディショニングしたBond Elut C18カートリッジカラムに負荷した。そのカートリッジを30％メタノール3 mLで洗浄後、アセトニトリル：精製水（80：20）1 mLで目的物を溶出し、その溶出液を減圧下で濃縮・乾固した。
その後、上記実施例4の4-3）及び4-4）記載の方法でエトキシ化及びフザリン酸エステル誘導体化を行った。なお、検量線は上記実施例4-1）と同様の方法で作製した。
5-2）：LC-MS/MS測定
上記5-1）で得たアセトニトリル：精製水（40：60）溶液0.1 mLのうち、その0.01 mLを上記表3及び4で示した条件に則りLC-MS/MS測定し、血清中の18-oxoF、18-OHF濃度を求めた。その結果を下記表10に示す。
上記5-1）で得たアセトニトリル：精製水（40：60）溶液0.1 mLのうち、その0.01 mLを上記表3及び4で示した条件に則りLC-MS/MS測定し、血清中の18-oxoF、18-OHF濃度を求めた。その結果を下記表10に示す。
原発性アルドステロン症腺腫鑑別法
75人のAPA患者及び115人のIHA患者の腕から末梢血液を採取し、実施例５と同様にして、18-oxoF及び18-OHF量を測定した。
75人のAPA患者及び115人のIHA患者の腕から末梢血液を採取し、実施例５と同様にして、18-oxoF及び18-OHF量を測定した。
上記APA患者群の18-oxoF量及び18-OHF量、IHA患者群の18-oxoF量及び18-OHF量に基にして、ROC解析を実施し、カットオフ値、感度、特異度を求めた。
18-oxoFのカットオフ値は4.8ng/dL（48pg/ml）、そのときの感度は82.7％、特異度は95.7％であった。また、18-OHFのカットオフ値は234 ng/dL（2340pg/ml）、そのときの感度は69.3％、特異度は93.0％であった。
これらの結果より、18-oxoF量に基づき、原発性アルドステロン症の腺腫鑑別を実施するのがより適切であることが判明した。そして、末梢血液中の18-oxoF量が4.8ng/dL（48ｐｇ/ｍｌ）を越える場合、患者をAPAであると鑑別できた。
本発明の方法によれば、試料中の18-oxoF、18-OHFの有無を検出したり、18-oxoF、18-OHFの量を測定したりすることができる。
本発明は、例えば、医学、薬学、生化学、公衆衛生などの分野で利用できる。
本発明は、例えば、医学、薬学、生化学、公衆衛生などの分野で利用できる。
Claims (9)
- 試料中の１８−ｏｘｏＦ、または１８−ｏｘｏＦ及び１８−ＯＨＦのＬＣ−ＭＳによる測定法であって、試料の処理において、
１）酸性条件下、試料にアルコールを反応させる工程、及び
２）下記式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１はＣ４アルキル基を表し、Ｘはヒドロキシ基又は脱離基を表し、ＣＯＸの置換位置はピリジン環の２位である。）
で示される化合物を、上記工程１）の試料に反応させて、下記式（ＩＩ）および／又は（ＩＩＩ）：
（式中、Ｒ２はＣ１−４アルキル基を表す。）
で示されるフザリン酸エステル誘導体を生じさせる工程、
を含むことを特徴とする測定法。 - 試料中の１８−ＯＨＦのＬＣ−ＭＳによる測定法であって、試料の処理において、
下記式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１はＣ４アルキル基を表し、Ｘはヒドロキシ基又は脱離基を表し、ＣＯＸの置換位置はピリジン環の２位である。）
で示される化合物を、試料に反応させて、下記式（ＩＩＩ）：
で示されるフザリン酸エステル誘導体を生じさせる工程、
を含むことを特徴とする測定法。 - アルコールがエタノール又はメタノールである、請求項１記載の測定法。
- 試料が、血液、唾液、尿、糞、胆汁、組織及び細胞培養液からなる群より選択される、請求項１、２または３のいずれか１項に記載の測定法。
- 下記式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）：
（式中、Ｒ１はＣ４アルキル基を表し、Ｒ２はＣ１−４アルキル基を表し、ピリジン環は２位でカルボン酸エステルを介して結合している。）
で示される化合物。 - Ｒ２がエチル基又はメチル基を表す、請求項５に記載の化合物。
- 請求項５の式（ＩＩ）で示される化合物を含むことを特徴とする、請求項１、３及び４のいずれか１項に記載の測定法のために用いる１８−ｏｘｏＦの測定用キット。
- 請求項５の式（ＩＩＩ）で示される化合物を含むことを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の測定法のために用いる１８−ＯＨＦの測定用キット。
- 請求項１、３及び４のいずれか１項に記載の測定法を用いて、試料中の１８−ｏｘｏＦの量を測定することを含む、原発性アルドステロン症の副腎腺腫の鑑別法。
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