JP2011136926A - プラズマローゲンの分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の目的は、プラズマローゲン分析における内部標準として用いることのできる新規化合物、及び前記化合物を用いる精確なプラズマローゲン分析方法を提供することである。
【解決手段】前記課題は、一般式（１）
（式中、Ｒ１は、炭素数７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２１のアルキル基であり、Ｒ２は、炭素数８〜２１のアルキル基又はアルケニル基であり、Ｘは、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３、又はＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である）で表される化合物を、内部標準化合物として用いるプラズマローゲン分析方法によって解決することができる。
【選択図】なし
【解決手段】前記課題は、一般式（１）
（式中、Ｒ１は、炭素数７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２１のアルキル基であり、Ｒ２は、炭素数８〜２１のアルキル基又はアルケニル基であり、Ｘは、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３、又はＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である）で表される化合物を、内部標準化合物として用いるプラズマローゲン分析方法によって解決することができる。
【選択図】なし
Description
本発明は、プラズマローゲン分析における内部標準物質として用いることのできる新規化合物、及び前記化合物を用いるプラズマローゲン分析方法に関する。本発明によれば、コリン型プラズマローゲン及びエタノールアミン型プラズマローゲンの多様な分子種を、精確に定量することができる。
プラズマローゲンは、グリセロリン脂質の一種であり、グリセロール骨格のｓｎ−１位にビニルエーテル結合を有する側鎖を有し、グリセロール骨格のｓｎ−２位にアシル鎖を持つリン脂質である。天然に存在するプラズマローゲンのｓｎ−１位の主たる側鎖の炭素数は１６又は１８であり、ｓｎ−２位の主たるアシル鎖の炭素数は１６、１８、２０又は２２である。また、リン酸に結合する主たる塩基は、コリン又はエタノールアミンであり、それぞれ、コリンプラズマローゲン（以下、ＣＰと称することがある）、及びエタノールアミンプラズマローゲン（以下、ＥＰと称することがある）と呼ばれ、その他の塩基をもつプラズマローゲンはほとんど存在しない。また、哺乳類の心臓や骨格筋ではＣＰの比が高く、その脳ではＥＰの比が高いことが知られている。
ヒト血漿中のプラズマローゲン濃度は０．１〜０．３ｍＭで、その約４０％がＣＰ、約６０％がＥＰである。血漿中においては、ＣＰがコリングリセロリン脂質の約５％、ＥＰがエタノールアミングリセロリン脂質の約６０％を占めている。
ヒト血漿中のプラズマローゲン濃度は０．１〜０．３ｍＭで、その約４０％がＣＰ、約６０％がＥＰである。血漿中においては、ＣＰがコリングリセロリン脂質の約５％、ＥＰがエタノールアミングリセロリン脂質の約６０％を占めている。
プラズマローゲンの生理的な役割として、内因性抗酸化物質としての役割、多価不飽和脂肪酸の貯蔵体としての役割、細胞融合や分泌作用に関わる膜融合作用、情報伝達や生体高分子輸送への関与などが報告されている。また、ヒトの遺伝的なプラズマローゲン欠損が、重篤な精神遅滞、又は副腎機能障害などの病状を呈することが報告されている。
プラズマローゲンのｓｎ−１位のビニルエーテル結合を有する側鎖及びｓｎ−２位のアシル鎖は、前記のように炭素数が異なる脂肪酸残基を含んでおり、更に脂肪酸残基中の不飽和結合の数も多様性があるため、プラズマローゲンはそれらの組み合わせの多様な分子種を有している。例えば、後述の実施例で示すように、生体内の主要なプラズマローゲンとしては、コリン型プラズマローゲン及びエタノールアミン型プラズマローゲンのそれぞれにおいて、ｓｎ−１位には１６：０、１８：０、及び１８：１の３種の炭化水素基があり、ｓｎ−２位には１６：０、１８：０、１８：１、１８：２、１８：３、２０：４、２０：５、２２：４、２２：５、及び２２：６の１０種のアシル基があり、従って、生体内には少なくとも６０種のプラズマローゲンの分子種が存在していると考えられる。
最近、アルツハイマー症患者又は高齢者において、血清プラズマローゲン量が減少することが報告されており、特にアルツハイマーの前段階の状態から、血清中の特定の分子種のプラズマローゲン、すなわち１６：０／２２：６のプラズマローゲンが減少していることが報告されている（非特許文献１）。すなわち、アルツハイマー症と特定の分子種のプラズマローゲンの関係が示されており、特定の分子種のプラズマローゲンが、生体内で重要な役割を担うことが示唆されている。従って、プラズマローゲンの生理作用を評価するためには、分子種の分析が重要であると考える。
従来、血液中プラズマローゲンの測定法としては、試料から脂質を抽出し、ｓｎ−１位由来のジメチルアセタールを、ガスクロマトグラフィーにより分析し、プラズマローゲンの量を換算するものが一般的であった（非特許文献２）。しかしながら、この方法はプラズマローゲンの換算に外部標準物質を用いるものであり、更にコリン型プラズマローゲン及びエタノールアミン型プラズマローゲンをまとめて測定しており、プラズマローゲンの分子種を詳細に解析できなかった。
また、コリン型プラズマローゲンの分子種について、生体中のリン脂質をＴＬＣで分画し、リン脂質クラス分けをした後にガスクロマトグラフィーにて分子種分析を行った報告があったが（非特許文献３）、この方法は、測定の工程が多く、煩雑であり、それに加えて、内部標準物質を用いるものではなく、精確な解析ができていないと考えられた。
一方、エタノールアミン型プラズマローゲンの分子種の測定については、液体クロマトグラフィー質量分析器（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用い、エタノールアミン型プラズマローゲンの分子種に特異的に出現するフラグメントを測定した報告があるが（非特許文献１）、内部標準として用いている化合物はコール酸であり、プラズマローゲンとは全く異なるものであり、内部標準として適当ではないと考えられた。
更に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるコリン型プラズマローゲンの分子種の測定においては、分子種特異的なフラグメントの生成が少ないことが知られており、従って、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、生体内のコリン型プラズマローゲンの分子種を網羅的に分析することは困難であった。
また、コリン型プラズマローゲンの分子種について、生体中のリン脂質をＴＬＣで分画し、リン脂質クラス分けをした後にガスクロマトグラフィーにて分子種分析を行った報告があったが（非特許文献３）、この方法は、測定の工程が多く、煩雑であり、それに加えて、内部標準物質を用いるものではなく、精確な解析ができていないと考えられた。
一方、エタノールアミン型プラズマローゲンの分子種の測定については、液体クロマトグラフィー質量分析器（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用い、エタノールアミン型プラズマローゲンの分子種に特異的に出現するフラグメントを測定した報告があるが（非特許文献１）、内部標準として用いている化合物はコール酸であり、プラズマローゲンとは全く異なるものであり、内部標準として適当ではないと考えられた。
更に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるコリン型プラズマローゲンの分子種の測定においては、分子種特異的なフラグメントの生成が少ないことが知られており、従って、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、生体内のコリン型プラズマローゲンの分子種を網羅的に分析することは困難であった。
「ジャーナル・オブ・リピッド・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」（米国）２００７年、第４８巻、ｐ２４８５−９８
「ブラッド・セルズ・モリキュールズ・アンド・ディジーズ（Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）」（米国）２００８年 第４１巻、ｐ１９６−１９９
「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ニュートリション（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）」（英国）２００２年、第８８巻、ｐ１９−２８
本発明の目的は、プラズマローゲン分析における内部標準として用いることのできる新規化合物、及び前記化合物を用いる精確なプラズマローゲン分析方法を提供することである。
前記非特許文献１における質量分析では、内部標準物質としてコール酸を用いている。コール酸は、実際に測定するプラズマローゲンとは、化学構造も極性も大きく異なる。本発明者らは、コール酸を内部標準物質として用いた場合は、生体試料からの抽出効率、及び質量分析器でのイオン化効率がプラズマローゲンと異なり、適切な補正ができておらず、結果としてプラズマローゲンが精確に測定されていないと考えた。
本発明者は、プラズマローゲン、すなわちコリン型プラズマローゲン及びエタノールアミン型プラズマローゲンの多様な分子種の精確な測定方法について、鋭意研究した結果、ｓｎ−１位のビニルエーテル結合を有する側鎖の炭素数が奇数であり、そしてｓｎ−２位のアシル基の炭素数が９〜２２である新規なプラズマローゲン様化合物を内部標準化合物として用い、質量分析を行うことにより、コリン型プラズマローゲン及びエタノールアミン型プラズマローゲンの多様な分子種を、簡便、高感度、そして精確に測定することができることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
前記非特許文献１における質量分析では、内部標準物質としてコール酸を用いている。コール酸は、実際に測定するプラズマローゲンとは、化学構造も極性も大きく異なる。本発明者らは、コール酸を内部標準物質として用いた場合は、生体試料からの抽出効率、及び質量分析器でのイオン化効率がプラズマローゲンと異なり、適切な補正ができておらず、結果としてプラズマローゲンが精確に測定されていないと考えた。
本発明者は、プラズマローゲン、すなわちコリン型プラズマローゲン及びエタノールアミン型プラズマローゲンの多様な分子種の精確な測定方法について、鋭意研究した結果、ｓｎ−１位のビニルエーテル結合を有する側鎖の炭素数が奇数であり、そしてｓｎ−２位のアシル基の炭素数が９〜２２である新規なプラズマローゲン様化合物を内部標準化合物として用い、質量分析を行うことにより、コリン型プラズマローゲン及びエタノールアミン型プラズマローゲンの多様な分子種を、簡便、高感度、そして精確に測定することができることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、一般式（１）
（式中、Ｒ１は、炭素数７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２１のアルキル基であり、Ｒ２は、炭素数８〜２１のアルキル基又はアルケニル基であり、Ｘは、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３、又はＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である）で表される化合物に関する。
本発明の化合物の好ましい態様においては、式（４）
で表される化合物である。
本発明の化合物の好ましい態様においては、式（４）
また、本発明は前記化合物を含むプラズマローゲン分析用内部標準組成物に関する。
更に、本発明は前記化合物を内部標準化合物として用い、プラズマローゲンを分析することを特徴とする、プラズマローゲン分析方法に関する。
本発明のプラズマローゲン分析方法の好ましい態様においては、（ａ１）生体試料中に、前記請求項１又は２に記載の化合物を、内部標準化合物として添加する工程、（ｂ１）前記内部標準組成物が添加された試料からプラズマローゲン及び内部標準化合物を抽出する工程、及び（ｃ１）前記抽出したプラズマローゲン及び内部標準化合物の質量を分析する工程、を含む。
本発明のプラズマローゲン分析方法の別の好ましい態様においては、（ａ２）生体試料から、プラズマローゲンを抽出する工程、（ｂ２）抽出試料に、前記請求項１又は２に記載の化合物を、内部標準化合物として、添加する工程、及び（ｃ２）プラズマローゲン及び内部標準化合物の質量を分析する工程、を含む。
本発明のプラズマローゲン分析方法の別の好ましい態様においては、分析が、液体クロマトグラフィータンデム質量分析である。
更に、本発明は前記化合物を内部標準化合物として用い、プラズマローゲンを分析することを特徴とする、プラズマローゲン分析方法に関する。
本発明のプラズマローゲン分析方法の好ましい態様においては、（ａ１）生体試料中に、前記請求項１又は２に記載の化合物を、内部標準化合物として添加する工程、（ｂ１）前記内部標準組成物が添加された試料からプラズマローゲン及び内部標準化合物を抽出する工程、及び（ｃ１）前記抽出したプラズマローゲン及び内部標準化合物の質量を分析する工程、を含む。
本発明のプラズマローゲン分析方法の別の好ましい態様においては、（ａ２）生体試料から、プラズマローゲンを抽出する工程、（ｂ２）抽出試料に、前記請求項１又は２に記載の化合物を、内部標準化合物として、添加する工程、及び（ｃ２）プラズマローゲン及び内部標準化合物の質量を分析する工程、を含む。
本発明のプラズマローゲン分析方法の別の好ましい態様においては、分析が、液体クロマトグラフィータンデム質量分析である。
本発明の新規化合物を、プラズマローゲン分析における内部標準物質として用いることによって、試料からプラズマローゲンを抽出する際の試料間の抽出効率の差の補正、及び質量分析器におけるインジェクション毎のイオン化効率の差の補正を行うことができる。本発明者らの知る限りにおいて、内部標準物質を用いたプラズマローゲンの分析において、新規なプラズマローゲン様化合物が使用された例はなく、例えば非特許文献１においても、内部標準物質としてコール酸が用いられている。後述の実施例で示すように、コール酸を内部標準物質として用いた場合と比較すると、本発明の新規化合物は、内部標準物質の極性、抽出効率、及び質量分析器でのイオン化効率のすべての面において、測定されるプラズマローゲンに類似していると考えられ、内部標準化合物として優れていた。すなわち、測定値のバラツキが少なく、精確な測定値を得ることが可能であった。
更に、コリン型プラズマローゲンの分子種分析の報告のうち、非特許文献３のガスクロマトグラフィーを用いた分析は、処理の工程が多く、煩雑なものであり、更に内部標準を用いたものでなく、精確な値が得られていないと考えられた。本発明の測定方法は、脂質抽出後の分析操作を軽減し、より精度の高い同定方法を提供できるものであり、コリン型プラズマローゲンの分子種を、簡便、且つ精確に測定することができるものである。
そして本発明の方法により、高精度、且つ高感度に血液中のプラズマローゲンを測定することができ、更に分子種解析が可能になることにより、プラズマローゲンの特定の分子種と、疾病（例えば、メタボリックシンドローム、肥満、又は動脈硬化及びその関連疾患等）との関係を明らかにすることができる。
更に、コリン型プラズマローゲンの分子種分析の報告のうち、非特許文献３のガスクロマトグラフィーを用いた分析は、処理の工程が多く、煩雑なものであり、更に内部標準を用いたものでなく、精確な値が得られていないと考えられた。本発明の測定方法は、脂質抽出後の分析操作を軽減し、より精度の高い同定方法を提供できるものであり、コリン型プラズマローゲンの分子種を、簡便、且つ精確に測定することができるものである。
そして本発明の方法により、高精度、且つ高感度に血液中のプラズマローゲンを測定することができ、更に分子種解析が可能になることにより、プラズマローゲンの特定の分子種と、疾病（例えば、メタボリックシンドローム、肥満、又は動脈硬化及びその関連疾患等）との関係を明らかにすることができる。
［１］化合物
本発明の化合物は、
一般式（１）
で表される化合物である。本発明の化合物は、生体内のプラズマローゲンを分析する際の内部標準物質として、有用に用いることができる。
本発明の化合物は、
一般式（１）
本発明の化合物において、前記式中ＸはＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３又はＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である。ＸがＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３の場合は、コリン型プラズマローゲン様化合物であり、下記一般式（２）
で表される。コリン型プラズマローゲン様化合物は、生体内のプラズマローゲン分析において、すべてのプラズマローゲンの内部標準物質として用いることができるが、コリン型プラズマローゲンと構造が類似しているため、特にコリン型プラズマローゲンの分析に有用に用いることができる。
また、ＸがＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である場合は、エタノールアミン型プラズマローゲン様化合物であり、下記一般式（３）
で表される。エタノールアミン型プラズマローゲン様化合物も、生体内のプラズマローゲン分析において、すべてのプラズマローゲンの内部標準物質として用いることができるが、エタノールアミン型プラズマローゲンと構造が類似しているため、特にエタノールアミン型プラズマローゲンの分析に有用に用いることができる。
本発明の化合物において、Ｒ１は、炭素数７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２１の奇数のアルキル基であり、好ましくは炭素数７、９、１１、１９、又は２１のアルキル基であり、より好ましくは炭素数７、９、１９、又は２１のアルキル基であり、最も好ましくは炭素数１９、又は２１のアルキル基である。プラズマローゲンのｓｎ−１位の側鎖は、そのほとんどが１６：０、１８：０、及び１８：１のビニルエーテル結合を有する炭化水素基であり、炭素数が奇数の炭化水素基は生体内にほとんど存在しない。従って、Ｒ１が奇数のアルキル基である本発明の前記化合物を、内部標準化合物としてプラズマローゲンの分析に用いることによって、各種分析において溶出位置が異なり、生体内のプラズマローゲンと明確に区別することが可能である。
また、Ｒ１が、炭素数が７〜２１の奇数のアルキル基であることによって、本発明のコリン型プラズマローゲン様化合物は、特にＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析におけるイオン化において、体内中のプラズマローゲンのｓｎ−１位の脂肪酸と区別することができる。更に、Ｒ１が、炭素数が炭素数１９、又は２１のアルキル基であることによって、本発明のコリン型プラズマローゲン様化合物は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの液体クロマトグラフィーにおいて、血清中のプラズマローゲンよりも保持時間が長いため、血液中の不純物と区別することができる。
なお、本明細書において、「ｓｎ−１位の側鎖」は、「−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ１」を意味し、側鎖に含まれる炭素数と二重結合の表記については、例えば「１６：１」と記載した場合は、側鎖に含まれる炭素数が１６であり、ビニルエーテル結合を除いた二重結合が１であることを示す。
また、Ｒ１が、炭素数が７〜２１の奇数のアルキル基であることによって、本発明のコリン型プラズマローゲン様化合物は、特にＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析におけるイオン化において、体内中のプラズマローゲンのｓｎ−１位の脂肪酸と区別することができる。更に、Ｒ１が、炭素数が炭素数１９、又は２１のアルキル基であることによって、本発明のコリン型プラズマローゲン様化合物は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの液体クロマトグラフィーにおいて、血清中のプラズマローゲンよりも保持時間が長いため、血液中の不純物と区別することができる。
なお、本明細書において、「ｓｎ−１位の側鎖」は、「−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ１」を意味し、側鎖に含まれる炭素数と二重結合の表記については、例えば「１６：１」と記載した場合は、側鎖に含まれる炭素数が１６であり、ビニルエーテル結合を除いた二重結合が１であることを示す。
Ｒ２は、炭素数８〜２１のアルキル基又はアルケニル基であり、好ましくは炭素数８〜２０のアルキル基又はアルケニル基であり、より好ましくは炭素数１３〜１７のアルキル基又はアルケニル基であり、最も好ましくは炭素数１７のアルキル基又はアルケニル基である。炭素数１３〜１７のアルキル基又はアルケニル基は合成効率が高く、本発明の新規化合物の合成効率を上げることができる点から好ましい。
なお、本明細書において、ｓｎ−２位のアシル鎖は「−ＣＯ−Ｒ２」を意味し、アシル鎖に含まれる炭素数と二重結合の表記については、例えば「１８：１」と記載した場合は、アシル鎖に含まれる炭素数が１８であり、二重結合が１であることを示す。
なお、本明細書において、ｓｎ−２位のアシル鎖は「−ＣＯ−Ｒ２」を意味し、アシル鎖に含まれる炭素数と二重結合の表記については、例えば「１８：１」と記載した場合は、アシル鎖に含まれる炭素数が１８であり、二重結合が１であることを示す。
本発明のコリン型プラズマローゲン様化合物として、例えば、下記式（４）
で表される化合物を挙げることができる。式（４）で表されるコリン型プラズマローゲン様化合物は、Ｒ１が炭素数２１のアルキル基（ヘンイコシル基）であり、Ｒ２が炭素数１７のアルケニル基であり、従って、ｓｎ−１位の側鎖の表記は「２３：０」であり、ｓｎ−２位のアシル鎖の表記は「１８：１」である。以下、本明細書において、前記式（４）で表されるコリン型プラズマローゲン様化合物を「ｐ２３：０／１８：１」と称することがある。
本発明における前記一般式（２）で表されるコリン型プラズマローゲン様化合物は、下記反応工程式（５）に従い、製造することができる。
（式中、Ｒ１は炭素数７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２１のアルキル基であり、Ｒ２は炭素数８〜２１のアルキル基又はアルケニル基であり、Ｒ１＝ＣｎＨ２ｎ＋１で表された場合、Ｒ３＝Ｃｎ−１Ｈ２ｎ−１である）
本発明における前記一般式（３）で表されるエタノールアミン型プラズマローゲン様化合物は、定法に従い、製造することができる。
［２］プラズマローゲン分析用内部標準組成物
本発明のプラズマローゲン分析用内部標準組成物は、前記一般式（１）で表される化合物を含む組成物である。前記組成物は、前記化合物を溶媒に溶解して製造することができる。溶媒としては、本発明の化合物のプラズマローゲン分析用の内部標準化合物としての機能を損なわないものであれば、限定されるものではないが、例えば水性溶媒、又は有機溶媒を挙げることができる。有機溶媒としては、ヘキサン又はヘプタン以外の有機溶媒が好ましく、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、又はイソプロパノールなどの低級アルコール、ベンゼン、又はクロロホルムを挙げることができる。
本発明のプラズマローゲン分析用内部標準組成物は、前記一般式（１）で表される化合物を含む組成物である。前記組成物は、前記化合物を溶媒に溶解して製造することができる。溶媒としては、本発明の化合物のプラズマローゲン分析用の内部標準化合物としての機能を損なわないものであれば、限定されるものではないが、例えば水性溶媒、又は有機溶媒を挙げることができる。有機溶媒としては、ヘキサン又はヘプタン以外の有機溶媒が好ましく、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、又はイソプロパノールなどの低級アルコール、ベンゼン、又はクロロホルムを挙げることができる。
また、本発明のプラズマローゲン分析用内部標準組成物は、更に補助成分を含むことができる。補助成分としては、本発明の化合物のプラズマローゲン分析用の内部標準化合物としての機能を損なわないものであれば、限定されるものではないが、例えば前記化合物の安定化剤をあげることができ、具体的にはアニオン性化合物、非イオン性化合物、両性化合物、双性イオン化合物、タンパク質、粘度調整剤、カチオン性ポリマー、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリレートコポリマー、ポリメタクリレートコポリマー、ポリアミン、ポリアミノアミド、ポリエステル、シリコーン樹脂、多糖類、デンプン、ガム、シリコーン液、ポリアクリルアミド、ポリアクリルアミド／ポリアクリレートコポリマー、又はこれらの混合物を挙げることができる。
［３］プラズマローゲン分析方法
本発明のプラズマローゲン分析方法は、前記化合物を内部標準化合物として用い、プラズマローゲンを分析することを特徴とするものである。
本明細書において、「内部標準化合物」とは、プラズマローゲンを分析する際に試料中に添加してプラズマローゲンの測定値を補正するための物質を意味する。内部標準化合物を添加する試料は、プラズマローゲンが含まれる可能性のある試料であれば、特に限定されるものではなく、例えばプラズマローゲンを分析するために生物から分離された生体試料でもよく、前記生体試料からリン脂質を抽出した抽出試料でもよく、更には合成されたプラズマローゲンを含む試料でもよい。
本発明のプラズマローゲン分析方法は、前記化合物を内部標準化合物として用い、プラズマローゲンを分析することを特徴とするものである。
本明細書において、「内部標準化合物」とは、プラズマローゲンを分析する際に試料中に添加してプラズマローゲンの測定値を補正するための物質を意味する。内部標準化合物を添加する試料は、プラズマローゲンが含まれる可能性のある試料であれば、特に限定されるものではなく、例えばプラズマローゲンを分析するために生物から分離された生体試料でもよく、前記生体試料からリン脂質を抽出した抽出試料でもよく、更には合成されたプラズマローゲンを含む試料でもよい。
プラズマローゲンの分析方法は、特に限定されるものではなく、例えばガスクロマトグラフィーを用いる方法、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法、及び質量分析方法を挙げることができるが、特には質量分析方法が好ましい。
プラズマローゲンの質量分析方法は、特に限定されるものではないが、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる質量分析法（以下、ＬＣ／ＭＳ法と称する）、ガスクロマトクラフィー（ＧＣ）を用いる質量分析法（以下、ＧＣ／ＭＳ法と称する）、及びキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を用いる質量分析法（以下、ＣＥ−ＭＳ法と称する）を挙げることができ、特には、ＬＣ／ＭＳの１つである液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（以下、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法と称する）が好ましい。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法によれば、感度が高く、プラズマローゲンの多様な分子種を分析することが可能であるからである。
プラズマローゲンの質量分析方法は、特に限定されるものではないが、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる質量分析法（以下、ＬＣ／ＭＳ法と称する）、ガスクロマトクラフィー（ＧＣ）を用いる質量分析法（以下、ＧＣ／ＭＳ法と称する）、及びキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を用いる質量分析法（以下、ＣＥ−ＭＳ法と称する）を挙げることができ、特には、ＬＣ／ＭＳの１つである液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（以下、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法と称する）が好ましい。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法によれば、感度が高く、プラズマローゲンの多様な分子種を分析することが可能であるからである。
前記ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法における、高速液体クロナトグラフィー（ＬＣ）に用いることのできるカラムとしては、逆相クロマトグラフィーカラムが好ましい。逆相クロマトグラフィーカラムとしては、オクタデシルシリカゲル（ＯＤＳ）系カラムが好ましく、例えばWaters ACQUITY UPLC BEH C8（2.1×100 mm, 1.7μm）、Waters ACQUITY UPLC BEH C18及びHypersil Gold（2.1×100 mm, 5μm, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA, USA）を挙げることができる。
高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ）に用いる移動相は、特に限定されるものではないが、ギ酸緩衝系の移動相を用いることができ、例えば、ギ酸緩衝液としては、ギ酸アンモニウム溶液、又はギ酸溶液を挙げることができる。前記ギ酸アンモニウム溶液中のギ酸の濃度は、１ｍＭ〜２０ｍＭが好ましい。ギ酸緩衝系移動相としては、ギ酸アンモニウム／アセトニトリル混用を用いることができる。アセトニトリルとギ酸アンモニウムの混合割合は、容積比で１：９９〜９９：１であり、好ましくは５：９５〜９８：２であり、より好ましくは１０：９０〜９６：４であり、最も好ましくは２０：８０〜９５：５である。また、アセトニトリルに代えて、メタノールなどの低級アルコールを用いることもできる。
カラムの温度も特に限定されるものではなく、適宜決定することができるが、好ましくは７０℃以下であり、より好ましくは３５〜６０℃であり、最も好ましくは５０〜６０℃である。カラムの流速も特に限定されるものではないが、例えば、０．６ｍＬ／ｍＬで行うことができる。
前記ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法におけるプラズマローゲンのイオン化法としては、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、サーモスプレーイオン化（ＴＳＰ）及び高速原子衝撃（ＦＡＢ）を挙げることができる。この中でもＥＳＩが好ましく、ｈｅａｔｅｄ ＥＳＩがより好ましい。本明細書において、タンデム試料分析（ＭＳ／ＭＳ）とは、最初のＭＳで得られた親イオン（水素イオンが付加されている）を選択し、２番目のＭＳで親イオンを窒素ガスやアルゴンガス等により分解させ、生じるフラグメントイオンを検出する方法であり、この方法は、高選択性によりＳＮ比が向上するため、高感度な検出が可能になる。
また、２番目のＭＳにおける衝突エネルギー（collision energy）は、適宜決定することが可能であるが、例えば、コリン型プラズマローゲンでは３２ｅＶ、そしてエタノールアミン型プラズマローゲンでは２０ｅＶの衝突エネルギーによって、それぞれの親イオンを分解し、測定に有用なフラグメントを得ることができる。
前記フラグメントイオンの検出方法としては、例えば、フルスキャン法、選択リアクションモニタリング（ＳＲＭ）法、又はマルチリアクションモニタリング（ＭＲＭ）法を挙げることができるが、ＭＲＭ法が好適に用いられる。
また、２番目のＭＳにおける衝突エネルギー（collision energy）は、適宜決定することが可能であるが、例えば、コリン型プラズマローゲンでは３２ｅＶ、そしてエタノールアミン型プラズマローゲンでは２０ｅＶの衝突エネルギーによって、それぞれの親イオンを分解し、測定に有用なフラグメントを得ることができる。
前記フラグメントイオンの検出方法としては、例えば、フルスキャン法、選択リアクションモニタリング（ＳＲＭ）法、又はマルチリアクションモニタリング（ＭＲＭ）法を挙げることができるが、ＭＲＭ法が好適に用いられる。
本発明によるプラズマローゲン分析方法は、例えば、第一の態様（以下、態様１と称することがある）においては、
（ａ１）生体試料中に、前記一般式（１）で表される化合物を、内部標準化合物として添加する工程、
（ｂ１）前記内部標準組成物が添加された試料からプラズマローゲン及び内部標準化合物を抽出する工程、及び
（ｃ１）前記抽出したプラズマローゲン及び内部標準化合物の質量を分析する工程、
により行うことができる。
（ａ１）生体試料中に、前記一般式（１）で表される化合物を、内部標準化合物として添加する工程、
（ｂ１）前記内部標準組成物が添加された試料からプラズマローゲン及び内部標準化合物を抽出する工程、及び
（ｃ１）前記抽出したプラズマローゲン及び内部標準化合物の質量を分析する工程、
により行うことができる。
前記生体試料は、生物由来の試料であれば特に限定されるものではなく、動物由来、植物由来、及び微生物由来の試料を挙げることができる。例えば、動物由来の生体試料としては、ヒトを含む動物の血液、血漿、血清、リンパ液、組織液、唾液、尿、涙、汗、臓器、及び組織などを挙げることができるが、特には血漿が好ましい。例えば、ヒトの血漿を生体試料として用いる場合は、血液を血液凝固剤（例えば、ＥＤＴＡ）の入った採血管で採血し、遠心分離により血球成分を除いて、用いることができる。
前記態様１の添加工程（ａ１）においては、例えば血漿を凍結乾燥し、内部標準化合物として、一般式（１）で表される化合物を添加する。前記内部標準化合物は、例えば、クロロホルム：メタノール＝２：１の溶媒に溶解した溶液として添加することができる。添加する内部標準化合物の量は、特に限定されないが、１０〜１０００ｐｍｏｌが好ましく、２０〜２００ｐｍｏｌがより好ましく、４０〜１００ｐｍｏｌが更に好ましい。
前記抽出工程（ｂ１）においては、プラズマローゲン及び内部標準化合物を生体試料から抽出する。プラズマローゲン及び内部標準化合物の抽出方法は、リン脂質を回収できる方法であれば特に限定されるものではなく、クロロホルム及びメタノールの混液を用いる方法、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法（Bligh et al. Can.J.Biochem. Physiol., 1959, 37, 911-917）、及びＦｏｌｃｈ法（Folch et al. J. Biol. Chem., 1957, 226 497-505）を用いることができる。
例えば、クロロホルム及びメタノールを用いる方法は、以下のように行うことができる。得られた血漿を凍結乾燥し、クロロホルム：メタノール＝２：１の混液を０．５ｍＬ添加する。この溶液を遠心分離し、上層（１）を回収する。残った下層に、クロロホルム：メタノール＝２：１の混液を１ｍＬ混合し、更に遠心分離を行い、上層（２）を回収する。前記上層（１）及び上層（２）を混合し、窒素を吹き付けることにより溶媒を除去し、固形物を１ｍＬのメタノールに溶解することによって、プラズマローゲン及び内部標準化合物を含む抽出試料を得ることができる。
例えば、クロロホルム及びメタノールを用いる方法は、以下のように行うことができる。得られた血漿を凍結乾燥し、クロロホルム：メタノール＝２：１の混液を０．５ｍＬ添加する。この溶液を遠心分離し、上層（１）を回収する。残った下層に、クロロホルム：メタノール＝２：１の混液を１ｍＬ混合し、更に遠心分離を行い、上層（２）を回収する。前記上層（１）及び上層（２）を混合し、窒素を吹き付けることにより溶媒を除去し、固形物を１ｍＬのメタノールに溶解することによって、プラズマローゲン及び内部標準化合物を含む抽出試料を得ることができる。
前記分析工程（ｃ１）においては、前記ＬＣ／ＭＳ法、ＧＣ／ＭＳ法、ＣＥ−ＭＳ法を用いて、質量分析をすることができるが、特には、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法により質量分析を行うことが好ましい。
また、本発明によるプラズマローゲン分析方法の第二の態様（以下、態様２と称することがある）においては、
（ａ２）生体試料から、プラズマローゲンを抽出する工程、
（ｂ２）抽出試料に、前記請求項１又は２に記載の化合物を、内部標準化合物として、添加する工程、及び
（ｃ２）プラズマローゲン及び内部標準化合物の質量を分析する工程、
により行うことができる。
前記態様１は、プラズマローゲンの抽出工程（ｂ１）におけるプラズマローゲンの抽出効率、及び分析工程（ｃ１）の質量分析のイオン化効率を補正することが可能である。一方、態様２は、抽出工程（ａ２）におけるプラズマローゲンの抽出効率を補正することができないが、分析工程（ｃ２）の質量分析のイオン化効率を補正することが可能であり、イオン化効率のみの補正が必要な場合に有効である。
（ａ２）生体試料から、プラズマローゲンを抽出する工程、
（ｂ２）抽出試料に、前記請求項１又は２に記載の化合物を、内部標準化合物として、添加する工程、及び
（ｃ２）プラズマローゲン及び内部標準化合物の質量を分析する工程、
により行うことができる。
前記態様１は、プラズマローゲンの抽出工程（ｂ１）におけるプラズマローゲンの抽出効率、及び分析工程（ｃ１）の質量分析のイオン化効率を補正することが可能である。一方、態様２は、抽出工程（ａ２）におけるプラズマローゲンの抽出効率を補正することができないが、分析工程（ｃ２）の質量分析のイオン化効率を補正することが可能であり、イオン化効率のみの補正が必要な場合に有効である。
前記抽出工程（ａ２）における抽出方法は、前記態様１の抽出工程（ｂ１）における抽出方法を用いることができる。また、前記添加工程（ｂ２）における化合物の添加量は、前記態様１の添加工程（ａ１）における添加量と同じ量を用いることができる。更に、前記質量分析（ｃ２）における質量分析法は、前記態様１の添加工程（ｃ１）における質量分析法と同じ方法を用いることができる。
プラズマローゲンの質量分析において、内部標準化合物を用いた定量を行う場合、試料中のプラズマローゲンの量を内部標準化合物により補正する方法であれば、特に限定されるものではないが、既知の段階希釈した濃度のプラズマローゲンと、既知の濃度の内部標準化合物とから、作成した検量線を用いる方法が好ましい。すなわち、検量線はプラズマローゲンの濃度の異なる標準溶液に、内部標準化合物を添加した検体を用いて、作成することができる。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法による質量分析において、検量線を作成する場合には、内部標準化合物のピークフラグメントの面積と、プラズマローゲンのピークフラグメントの面積との比を求め、この比をグラフ上にプロットすることにより信頼性の高い検量線を作成することができる。実際の測定においては、生体試料に既知量の内部標準化合物を添加し、得られた検量線に、内部標準化合物のピークフラグメントと、検体中のプラズマローゲンのピークフラグメントの面積比を当てはめることにより、精確な測定値を得ることができる。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法による質量分析において、検量線を作成する場合には、内部標準化合物のピークフラグメントの面積と、プラズマローゲンのピークフラグメントの面積との比を求め、この比をグラフ上にプロットすることにより信頼性の高い検量線を作成することができる。実際の測定においては、生体試料に既知量の内部標準化合物を添加し、得られた検量線に、内部標準化合物のピークフラグメントと、検体中のプラズマローゲンのピークフラグメントの面積比を当てはめることにより、精確な測定値を得ることができる。
プラズマローゲンを質量分析する場合には、１つのプラズマローゲンからいくつかのフラグメントが生成されることが知られており、検量線を作成するためのフラグメントは特に限定されるものではないが、本発明のコリン型プラズマローゲン様化合物、及び試料中のプラズマローゲンのピークフラグメントとしては、例えば下記一般式（６）
で表されるコリンリン酸由来のフラグメント（以下、「コリンリン酸フラグメント」と称することがある）を用いることが好ましい。本発明のコリン型プラズマローゲン様化合物の前記コリンリン酸フラグメント、及び試料中のプラズマローゲンの前記コリンリン酸フラグメントの面積比をプロットすることにより、検量線を作成することができる。
また、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法による質量分析における、本発明のエタノールアミン型プラズマローゲン様化合物、及び試料中のエタノールアミン型のピークフラグメントとしては、下記一般式（７）
で表されるＲ１由来のフラグメント（以下、「Ｒ１フラグメント」と称することがある）を用いることが好ましい。本発明のエタノールアミン型プラズマローゲン様化合物のＲ１フラグメント、及び試料中のエタノールアミン型のＲ１フラグメントの面積比をプロットすることにより、検量線を作成することができる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《製造例１：コリン型プラズマローゲン様化合物（ｐ２３：０／１８：０）の製造》
本製造例では、コリン型プラズマローゲン様化合物（1-O-1'-(Z)-Tricosenyl-2-oleoyl-rac-glycero-3-phosphocholine：ｐ２３：０／１８：０）を、下記反応工程式（８）に従って、製造した。
本製造例では、コリン型プラズマローゲン様化合物（1-O-1'-(Z)-Tricosenyl-2-oleoyl-rac-glycero-3-phosphocholine：ｐ２３：０／１８：０）を、下記反応工程式（８）に従って、製造した。
（ａ）1-Allyl-3-tert-butyldimethylsilyl-rac-glycerol(1ａ)
3-Allyloxy-1, 2-propanediol（１００ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解し、イミダゾール（２０ｍｍｏｌ）とｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＳＣｌ、１００ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１時間攪拌した。その後、室温で一時間攪拌し、エーテルで抽出した。最後にカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物１ａ（９７ｍｍｏｌ）を得た。
3-Allyloxy-1, 2-propanediol（１００ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解し、イミダゾール（２０ｍｍｏｌ）とｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＳＣｌ、１００ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１時間攪拌した。その後、室温で一時間攪拌し、エーテルで抽出した。最後にカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物１ａ（９７ｍｍｏｌ）を得た。
（ｂ）1-Allyl-3-tert-butyldimethylsilyl-2-(2-trimethylsilanylethoxymethyl)-rac-glycerol(2ａ)
水素化ナトリウムを脱水テトラヒドロフランに溶解し、化合物１ａ（３０ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で３０分攪拌した。２−（クロロメトキシ）エチルトリメチルシラン（ＳＥＭＣｌ，３６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌して、減圧下溶媒を留去した。ヘキサンで抽出し、カラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物２ａ（２６ｍｍｏｌ）を得た。
水素化ナトリウムを脱水テトラヒドロフランに溶解し、化合物１ａ（３０ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で３０分攪拌した。２−（クロロメトキシ）エチルトリメチルシラン（ＳＥＭＣｌ，３６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌して、減圧下溶媒を留去した。ヘキサンで抽出し、カラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物２ａ（２６ｍｍｏｌ）を得た。
（ｃ）ヨウ化エイコサン
１−エイコサノール（５０ｍｍｏｌ）をベンゼンに溶解し、イミダゾール（１２５ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１２５ｍｍｏｌ）、ヨウ素（５１ｍｍｏｌ）をこの順に加え、１時間加熱還流を行った。カラムクロマトグラフィーにより精製し、ヨウ化エイコサン（４５ｍｍｏｌ）を得た。
１−エイコサノール（５０ｍｍｏｌ）をベンゼンに溶解し、イミダゾール（１２５ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１２５ｍｍｏｌ）、ヨウ素（５１ｍｍｏｌ）をこの順に加え、１時間加熱還流を行った。カラムクロマトグラフィーにより精製し、ヨウ化エイコサン（４５ｍｍｏｌ）を得た。
（ｄ）3-tert-Butyldimethylsilyl-1-O-1'-(Z)-tricosenyl-2-(2-trimethylsilanylethoxymethyl)-rac-glycerol(3ａ)
化合物２ａ（２０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランに溶解して−７０℃に冷却し、攪拌した。ｓｅｃ−ブチルリチウム（２２ｍｍｏｌ）を緩徐に滴下した。６０分後、ヨウ化エイコサンを滴下し、１時間攪拌した。その後、室温に戻しながら１時間攪拌した。ヘキサンで抽出しカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物３ａ（３ｍｍｏｌ）を得た。
化合物２ａ（２０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランに溶解して−７０℃に冷却し、攪拌した。ｓｅｃ−ブチルリチウム（２２ｍｍｏｌ）を緩徐に滴下した。６０分後、ヨウ化エイコサンを滴下し、１時間攪拌した。その後、室温に戻しながら１時間攪拌した。ヘキサンで抽出しカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物３ａ（３ｍｍｏｌ）を得た。
（ｅ）1-O-1'-(Z)-Tricosenyl-2-(2-trimethylsilanylethoxymethyl)-rac-glycerol(4ａ)
化合物３ａ（１．３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランに溶解し、イミダゾール（９ｍｍｏｌ）を加え、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ，３ｍｍｏｌ）を滴下し、０℃で７２時間攪拌した。カラムクロマトグラフィーで精製し、化合物４ａ（０．９７ｍｍｏｌ）を得た。
化合物３ａ（１．３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランに溶解し、イミダゾール（９ｍｍｏｌ）を加え、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ，３ｍｍｏｌ）を滴下し、０℃で７２時間攪拌した。カラムクロマトグラフィーで精製し、化合物４ａ（０．９７ｍｍｏｌ）を得た。
（ｆ）1-O-1'-(Z)-Tricosenyl-2-(2-trimethylsilanylethoxymethyl)-rac-glycero-3-phosphocholine(5ａ)
化合物４ａ（１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランに溶解し、０℃に冷却した。トリエチルアミン（１００ｍｍｏｌ）を加え攪拌しながら、２−クロロ−１，３，２−ジオキサフォスフォラン（４ｍｍｏｌ）を滴下して、１時間攪拌した。その後、室温に戻して７２時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで溶解して圧力試験管へ移した。トリメチルアミン（１０ｍＬ）を加え、高圧下７０℃で２４時間攪拌した。カラムクロマトグラフィーで精製し、化合物５ａ（０．１５ｍｍｏｌ）を得た。
化合物４ａ（１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランに溶解し、０℃に冷却した。トリエチルアミン（１００ｍｍｏｌ）を加え攪拌しながら、２−クロロ−１，３，２−ジオキサフォスフォラン（４ｍｍｏｌ）を滴下して、１時間攪拌した。その後、室温に戻して７２時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで溶解して圧力試験管へ移した。トリメチルアミン（１０ｍＬ）を加え、高圧下７０℃で２４時間攪拌した。カラムクロマトグラフィーで精製し、化合物５ａ（０．１５ｍｍｏｌ）を得た。
（ｇ）1-O-1'-(Z)-Tricosenyl-rac-glycero-3-phosphocholine(6ａ)
化合物５ａ（０．１ｍｍｏｌ）をヘキサメチルリン酸トリアミドに溶解し、ＴＢＡＦ（３ｍｍｏｌ）を加え、９０℃で４８時間攪拌した。カラムクロマトグラフィーで精製し、化合物６ａ（０．０８ｍｍｏｌ）を得た。
化合物５ａ（０．１ｍｍｏｌ）をヘキサメチルリン酸トリアミドに溶解し、ＴＢＡＦ（３ｍｍｏｌ）を加え、９０℃で４８時間攪拌した。カラムクロマトグラフィーで精製し、化合物６ａ（０．０８ｍｍｏｌ）を得た。
（ｈ）1-O-1'-(Z)-Tricosenyl-2-oleoyl-rac-glycero-3-phosphocholine(7ａ)
化合物６ａ（０．２ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解し、ジクロロメタンに溶解したオレイン酸クロリドを加え、室温で１５０分攪拌した。カラムクロマトグラフィーで精製し、ＩＳとしてのプラズマローゲンである化合物７ａ（０．２５ｍｍｏｌ）を得た。
化合物６ａ（０．２ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解し、ジクロロメタンに溶解したオレイン酸クロリドを加え、室温で１５０分攪拌した。カラムクロマトグラフィーで精製し、ＩＳとしてのプラズマローゲンである化合物７ａ（０．２５ｍｍｏｌ）を得た。
これら化合物の構造については１Ｈ ＮＭＲスペクトルより確認したが、内部標準物質としての新規プラズマローゲンである化合物７ａの構造を確認するためにそのマススペクトルを測定した。図１は合成したプラズマローゲンである化合物７ａ（Ｃ４９Ｈ９６ＮＯ７Ｐ：８４１．６９）のＭＳスペクトルである。ｍ／ｚ８４２．６に擬似分子イオンピーク［Ｍ＋Ｈ＋］が観察され、その構造を示唆している。
《製造例２：コリン型プラズマローゲン（ｐ１６：０／２０：４）の製造》
本製造例では、コリン型プラズマローゲン（2-Arachidonoyl-1-O-1'-(Z)-hexadecenyl-rac-glycero-3-phosphocholine monohydroperoxide：ｐ１６：０／２０：４）を、下記反応工程式（９）に従って、製造した。
本製造例では、コリン型プラズマローゲン（2-Arachidonoyl-1-O-1'-(Z)-hexadecenyl-rac-glycero-3-phosphocholine monohydroperoxide：ｐ１６：０／２０：４）を、下記反応工程式（９）に従って、製造した。
（ａ）1-Allyl-3-tert-butyldimethylsilyl-rac-glycerol(1ｂ)
３−Ａｌｌｙｌｏｘｙ−１，２−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ（１００ｍｍｏｌ）を脱水ピリジンに溶解し、イミダゾール（２０ｍｍｏｌ）とｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１００ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１時間攪拌した。その後、室温で一時間攪拌し、エーテルで抽出した。有機層を水と塩酸で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１）により精製し、化合物１ｂ（９７ｍｍｏｌ）を得た。
３−Ａｌｌｙｌｏｘｙ−１，２−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ（１００ｍｍｏｌ）を脱水ピリジンに溶解し、イミダゾール（２０ｍｍｏｌ）とｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１００ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１時間攪拌した。その後、室温で一時間攪拌し、エーテルで抽出した。有機層を水と塩酸で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１）により精製し、化合物１ｂ（９７ｍｍｏｌ）を得た。
（ｂ）1-Allyl-3-tert-butyldimethylsilyl-2-(2-trimethylsilanylethoxymethyl)-rac-glycerol(2ｂ)
常法に則り、オイルを除去した水素化ナトリウムを脱水テトラヒドロフランに溶解し、化合物１ｂ（３０ｍｍｏｌ）を、シリンジを用いて滴下し、室温で３０分攪拌した。２−（クロロメトキシ）エチルトリメチルシラン（３６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌して、減圧下溶媒を留去した。ヘキサンで抽出し、有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去して、残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物２ｂ（２６ｍｍｏｌ）を得た。
常法に則り、オイルを除去した水素化ナトリウムを脱水テトラヒドロフランに溶解し、化合物１ｂ（３０ｍｍｏｌ）を、シリンジを用いて滴下し、室温で３０分攪拌した。２−（クロロメトキシ）エチルトリメチルシラン（３６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌して、減圧下溶媒を留去した。ヘキサンで抽出し、有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去して、残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物２ｂ（２６ｍｍｏｌ）を得た。
（ｃ）ヨウ化トリデシルの合成
１−トリデカノール（５０ｍｍｏｌ）をベンゼンに溶解し、イミダゾール（１２５ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１２５ｍｍｏｌ）、ヨウ素（１００ｍｍｏｌ）をこの順に加え、３０分（常法では２時間）加熱還流を行った。冷却し、ヘキサンで洗浄しながら吸引ろ過を行った。減圧下溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン）により精製し、ヨウ化トリデシル（４５ｍｍｏｌ）を得た。
１−トリデカノール（５０ｍｍｏｌ）をベンゼンに溶解し、イミダゾール（１２５ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１２５ｍｍｏｌ）、ヨウ素（１００ｍｍｏｌ）をこの順に加え、３０分（常法では２時間）加熱還流を行った。冷却し、ヘキサンで洗浄しながら吸引ろ過を行った。減圧下溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン）により精製し、ヨウ化トリデシル（４５ｍｍｏｌ）を得た。
（ｄ）3-tert-Butyldimethylsilyl-1-O-1'-(Z)-hexadecenyl-2-(2-trimethylsilanylethoxymethyl)-rac-glycerol(3ｂ)
空気を窒素で置換し、化合物２ｂ（２０ｍｍｏｌ）を−７０℃に冷却し、脱水テトラヒドロフランに溶解して攪拌した。シリンジを用いてｓｅｃ−ブチルリチウム（２２ｍｍｏｌ）を緩徐に滴下した。１時間後、ヨウ化トリデシルを緩徐に滴下し、３０分攪拌した。その後、室温に戻しながら１時間攪拌した。減圧下溶媒を留去し、ヘキサンで抽出した。有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物３ｂ（４．５ｍｍｏｌ）を得た。
空気を窒素で置換し、化合物２ｂ（２０ｍｍｏｌ）を−７０℃に冷却し、脱水テトラヒドロフランに溶解して攪拌した。シリンジを用いてｓｅｃ−ブチルリチウム（２２ｍｍｏｌ）を緩徐に滴下した。１時間後、ヨウ化トリデシルを緩徐に滴下し、３０分攪拌した。その後、室温に戻しながら１時間攪拌した。減圧下溶媒を留去し、ヘキサンで抽出した。有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物３ｂ（４．５ｍｍｏｌ）を得た。
（ｅ）1-O-1'-(Z)-Hexadecenyl-2-(2-trimethylsilanylethoxymethyl)-rac-glycerol(4ｂ)
化合物３ｂ（３．１ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフランに溶解し、イミダゾール（９ｍｍｏｌ）を加え、シリンジを用いてフッ化テトラブチルアンモニウム（３ｍｍｏｌ）を緩徐に滴下し、０℃で７２時間攪拌した。減圧下溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２００：１）で精製し、化合物４ｂ（２．８ｍｍｏｌ）を得た。
化合物３ｂ（３．１ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフランに溶解し、イミダゾール（９ｍｍｏｌ）を加え、シリンジを用いてフッ化テトラブチルアンモニウム（３ｍｍｏｌ）を緩徐に滴下し、０℃で７２時間攪拌した。減圧下溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２００：１）で精製し、化合物４ｂ（２．８ｍｍｏｌ）を得た。
（ｆ）1-O-1'-(Z)-Hexadecenyl-2-(2-trimethylsilanylethoxymethyl)-rac-glycero-3-phosphocholine(5ｂ)
化合物４ｂ（１ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフランに溶解し、０℃に冷却した。トリエチルアミン（３２ｍｍｏｌ）を加えて攪拌しながら、２−クロロ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサフォスフォラン（４ｍｍｏｌ）を滴下して、１時間攪拌した。その後、室温に戻して３０分攪拌した。減圧下溶媒を留去し、残渣をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）で溶解して圧力試験管へ移した。脱水したトリメチルアミン（１０ｍＬ）を加え、高圧下７０℃で２４時間攪拌した。クロロホルムで吸引ろ過し、減圧下溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝３：１）で精製し、化合物５ｂ（０．５５ｍｍｏｌ）を得た。
化合物４ｂ（１ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフランに溶解し、０℃に冷却した。トリエチルアミン（３２ｍｍｏｌ）を加えて攪拌しながら、２−クロロ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサフォスフォラン（４ｍｍｏｌ）を滴下して、１時間攪拌した。その後、室温に戻して３０分攪拌した。減圧下溶媒を留去し、残渣をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）で溶解して圧力試験管へ移した。脱水したトリメチルアミン（１０ｍＬ）を加え、高圧下７０℃で２４時間攪拌した。クロロホルムで吸引ろ過し、減圧下溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝３：１）で精製し、化合物５ｂ（０．５５ｍｍｏｌ）を得た。
（ｇ）1-O-1'-(Z)-Hexadecenyl-rac-glycero-3-phosphocholine(6ｂ)
化合物５ｂ（０．５ｍｍｏｌ）をヘキサメチルリン酸トリアミドに溶解し、フッ化テトラブチルアンモニウム（３ｍｍｏｌ）を加え、９０℃で４８時間攪拌した。減圧下溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝３：１）で精製し、化合物６ｂ（０．４ｍｍｏｌ）を得た。
化合物５ｂ（０．５ｍｍｏｌ）をヘキサメチルリン酸トリアミドに溶解し、フッ化テトラブチルアンモニウム（３ｍｍｏｌ）を加え、９０℃で４８時間攪拌した。減圧下溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝３：１）で精製し、化合物６ｂ（０．４ｍｍｏｌ）を得た。
（ｈ）2-Arachidonoyl-1-O-1'-(Z)-hexadecenyl-rac-glycero-3-phosphocholine(7ｂ)
化合物６ｂ（１．５ｍｍｏｌ）を脱水したピリジンに溶解し、脱水ジクロロメタンに溶解したアラキドンクロリドを加え室温で１５０分攪拌した。減圧下溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝３：１）で精製しプラズマローゲンである化合物７ｂ（０．２ｍｍｏｌ）を得た。
化合物６ｂ（１．５ｍｍｏｌ）を脱水したピリジンに溶解し、脱水ジクロロメタンに溶解したアラキドンクロリドを加え室温で１５０分攪拌した。減圧下溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝３：１）で精製しプラズマローゲンである化合物７ｂ（０．２ｍｍｏｌ）を得た。
《実施例１》
本実施例では、前記製造例１で製造した化合物７ａ（ｐ２３：０／１８：１、ＭＷ：８４１．６９；以下、「ｐ２３：０／１８：１」と称することがある）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法で測定した。質量分析器は、Accela UHPLC及びTSQ Quantum system（ThermoFisher社）を用いた。
前記ｐ２３：０／１８：１を、メタノールに１．２ｎｍｏｌ／ｍＬ溶解し、下記のＬＣ−ＭＳ／ＭＳの条件で解析した。
本実施例では、前記製造例１で製造した化合物７ａ（ｐ２３：０／１８：１、ＭＷ：８４１．６９；以下、「ｐ２３：０／１８：１」と称することがある）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法で測定した。質量分析器は、Accela UHPLC及びTSQ Quantum system（ThermoFisher社）を用いた。
前記ｐ２３：０／１８：１を、メタノールに１．２ｎｍｏｌ／ｍＬ溶解し、下記のＬＣ−ＭＳ／ＭＳの条件で解析した。
質量分析器：Ａｃｃｅｌａ ＵＨＰＬＣ ａｎｄ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）
＜ＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）の条件＞
ＬＣ システム：Ａｃｃｅｌａ ＵＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ
溶離液Ａ：５ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
溶離液Ｂ：アセトニトリル
カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ８（２．１×１００ｍｍ，１．７μｍ）
カラム温度：６０℃
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＨＰＬＣの溶離液の条件を表１に示す。
＜ＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）の条件＞
ＬＣ システム：Ａｃｃｅｌａ ＵＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ
溶離液Ａ：５ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
溶離液Ｂ：アセトニトリル
カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ８（２．１×１００ｍｍ，１．７μｍ）
カラム温度：６０℃
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＨＰＬＣの溶離液の条件を表１に示す。
＜ＭＳ／ＭＳ（タンデム質量分析）の条件＞
ＭＳシステム：ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ ｓｙｓｔｅｍ
イオン化モード：ＨｅａｔｅｄＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ
キャピラリー電圧：３．２ｋＶ
コーン電圧：３５Ｖ
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ温度：４００℃
Ｓｏｕｒｃｅ温度：８０℃
衝突エネルギー：３２ｅＶ（コリン型プラズマローゲン）
２０ｅＶ（エタノールアミン型プラズマローゲン）
ＭＳシステム：ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ ｓｙｓｔｅｍ
イオン化モード：ＨｅａｔｅｄＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ
キャピラリー電圧：３．２ｋＶ
コーン電圧：３５Ｖ
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ温度：４００℃
Ｓｏｕｒｃｅ温度：８０℃
衝突エネルギー：３２ｅＶ（コリン型プラズマローゲン）
２０ｅＶ（エタノールアミン型プラズマローゲン）
前記の条件で、ｐ２３：０／１８：１を測定した結果を図２に示す。ｐ２３：０／１８：１の親イオン（分子量＋Ｈ）から、生じた主なフラグメントは、（Ａ）コリンリン酸由来フラグメント、（Ｂ）ｓｎ−２位の脂肪酸がはずれたｓｎ−１位由来のフラグメント、（Ｃ）ｓｎ−１位の脂肪酸がはずれたｓｎ−２位由来のフラグメントであった。これらの３種のフラグメントのうち、最もフラグメント量の多い、コリンリン酸由来フラグメント（Ａ）（ｍ／ｚ１８４）の面積を用いて、コリン型プラズマローゲンの各分子種の定量を行うことにした。
なお、生体試料中のコリン型プラズマローゲンの各分子種について、前記の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）のフラグメントが検出されることを確認した。更に、プラズマローゲンは、酸によって分解されるため、塩酸暴露によるプラズマローゲン分解後の分析を行い、前記の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）のフラグメントが消失することにより、プラズマローゲンのフラグメントを測定していることを確認した。
なお、生体試料中のコリン型プラズマローゲンの各分子種について、前記の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）のフラグメントが検出されることを確認した。更に、プラズマローゲンは、酸によって分解されるため、塩酸暴露によるプラズマローゲン分解後の分析を行い、前記の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）のフラグメントが消失することにより、プラズマローゲンのフラグメントを測定していることを確認した。
《実施例２》
本実施例では、試料中のコリン型プラズマローゲンの定量を行うための検量線を作成した。前記製造例２で製造した化合物７ｂ（ｐ１６：０／２０：４；以下「ｐ１６：０／２０：４」と称することがある）を、メタノールに溶解し、標準原液（１．７μｍｏｌ／ｍＬ）を調製した。前記標準原液をメタノールで希釈し、０．０８５ｐｍｏｌ、０．１７ｐｍｏｌ、０．３４ｐｍｏｌ、及び０．５１ｐｍｏｌの４種類の濃度の標準溶液を調製した。次に、それぞれの標準溶液に、製造例１で製造したｐ２３：０／１８：１を１００ｐｍｏｌ添加した。それぞれの標準溶液を、実施例１に記載の条件に従って解析した。得られたそれぞれの標準溶液中のｐ１６：０／２０：４と、ｐ２３：０／１８：１とのコリンリン酸由来フラグメント（Ａ）の面積比（ｐｅａｋ ａｒｅａ ｒａｔｉｏ）を計算し、検量線を作成した。図３に得られた検量線を示す。この検量線を用いて、後述の実施例４において、ヒトの血漿試料中のコリン型プラズマローゲンの定量を行った。
本実施例では、試料中のコリン型プラズマローゲンの定量を行うための検量線を作成した。前記製造例２で製造した化合物７ｂ（ｐ１６：０／２０：４；以下「ｐ１６：０／２０：４」と称することがある）を、メタノールに溶解し、標準原液（１．７μｍｏｌ／ｍＬ）を調製した。前記標準原液をメタノールで希釈し、０．０８５ｐｍｏｌ、０．１７ｐｍｏｌ、０．３４ｐｍｏｌ、及び０．５１ｐｍｏｌの４種類の濃度の標準溶液を調製した。次に、それぞれの標準溶液に、製造例１で製造したｐ２３：０／１８：１を１００ｐｍｏｌ添加した。それぞれの標準溶液を、実施例１に記載の条件に従って解析した。得られたそれぞれの標準溶液中のｐ１６：０／２０：４と、ｐ２３：０／１８：１とのコリンリン酸由来フラグメント（Ａ）の面積比（ｐｅａｋ ａｒｅａ ｒａｔｉｏ）を計算し、検量線を作成した。図３に得られた検量線を示す。この検量線を用いて、後述の実施例４において、ヒトの血漿試料中のコリン型プラズマローゲンの定量を行った。
《実施例３》
本実施例では、試料中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量を行うための検量線を作成した。３種類のエタノールアミン型プラズマローゲン、すなわちｐ１８：０／１８：０、ｐ１８：０／２０：４、及びｐ１８：０／２２：６を、メタノールに溶解し、標準原液（１．５μｍｏｌ／ｍＬ）を調製した。前記標準原液をメタノールで希釈し、３種類のエタノールアミン型プラズマローゲンについて、それぞれ０．０３５ｐｍｏｌ、０．０７ｐｍｏｌ、及び０．１５ｐｍｏｌの３種類の濃度の標準溶液（合計９種）を調製した。次に、作成した標準溶液に、製造例１で製造したｐ２３：０／１８：１を１００ｐｍｏｌ添加した。標準溶液を、実施例１に記載の条件に従って解析した。得られたｐ２３：０／１８：１のコリンリン酸由来フラグメント（Ａ）と、３種類のエタノールアミン型プラズマローゲン、すなわちｐ１８：０／１８：０、ｐ１８：０／２０：４、及びｐ１８：０／２２：６の、下記の一般式（６）に示す分子種特異的なフラグメント（Ｒ１由来フラグメント）との面積比（ｐｅａｋ ａｒｅａ ｒａｔｉｏ）を計算し、検量線を作成した。図４に得られた検量線を示す。この検量線を用いて、ヒトの血漿試料中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量を行った。
本実施例では、試料中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量を行うための検量線を作成した。３種類のエタノールアミン型プラズマローゲン、すなわちｐ１８：０／１８：０、ｐ１８：０／２０：４、及びｐ１８：０／２２：６を、メタノールに溶解し、標準原液（１．５μｍｏｌ／ｍＬ）を調製した。前記標準原液をメタノールで希釈し、３種類のエタノールアミン型プラズマローゲンについて、それぞれ０．０３５ｐｍｏｌ、０．０７ｐｍｏｌ、及び０．１５ｐｍｏｌの３種類の濃度の標準溶液（合計９種）を調製した。次に、作成した標準溶液に、製造例１で製造したｐ２３：０／１８：１を１００ｐｍｏｌ添加した。標準溶液を、実施例１に記載の条件に従って解析した。得られたｐ２３：０／１８：１のコリンリン酸由来フラグメント（Ａ）と、３種類のエタノールアミン型プラズマローゲン、すなわちｐ１８：０／１８：０、ｐ１８：０／２０：４、及びｐ１８：０／２２：６の、下記の一般式（６）に示す分子種特異的なフラグメント（Ｒ１由来フラグメント）との面積比（ｐｅａｋ ａｒｅａ ｒａｔｉｏ）を計算し、検量線を作成した。図４に得られた検量線を示す。この検量線を用いて、ヒトの血漿試料中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量を行った。
《実施例４》
本実施例では、２２〜５３歳の被験者６人（男性４人、女性２人）の血液から分画した血清を用いて、プラズマローゲンを定量した。血清からの総脂質の抽出は、以下のようにして行った。
血液を遠心分離して得た血清０．１５ｍＬを凍結乾燥し、それに内部標準化合物として５０ｐｍｏｌの前記ｐ２３：０／１８：１を含むクロロホルム：メタノール＝２：１の混液０．５ｍＬを加えた。１０分間混合後、３０分間室温で放置した。３００ｒｐｍ、１５分間遠心分離後、上層を回収した。下層に更にクロロホルム：メタノール＝２：１の混液を１ｍＬ加え、混合・放置後、遠心分離を行い、上層を回収し、先の回収液と混合した。得られた溶液に窒素を吹きつけ、溶媒を除去した。得られた固形物を１ｍＬのメタノールに溶解し、フィルターでろ過し、適宜メタノールで希釈したのち、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて解析した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの条件は、実施例１に記載の条件に従った。得られた測定値から、図３の検量線、又は図４の検量線を用いて、コリン型プラズマローゲン及びエタノールアミン型プラズマローゲンのそれぞれの分子種の量を換算した。結果を表２〜４に示す。
試料中の測定したプラズマローゲンの分子種は、コリン型プラズマローゲン及びエタノールアミン型プラズマローゲンのいずれも、ｓｎ−１位が１６：０、１８：０、又は１８：１の３種類、ｓｎ−２位が１６：０、１８：０、１８：１、１８：２、１８：３、２０：４、２０：５、２２：４、２２：５、又は２２：６の１０種類である。従って、測定したコリン型プラズマローゲンの分子種は３０種類であり、エタノールアミン型プラズマローゲンの分子種も３０種類である。
本実施例では、２２〜５３歳の被験者６人（男性４人、女性２人）の血液から分画した血清を用いて、プラズマローゲンを定量した。血清からの総脂質の抽出は、以下のようにして行った。
血液を遠心分離して得た血清０．１５ｍＬを凍結乾燥し、それに内部標準化合物として５０ｐｍｏｌの前記ｐ２３：０／１８：１を含むクロロホルム：メタノール＝２：１の混液０．５ｍＬを加えた。１０分間混合後、３０分間室温で放置した。３００ｒｐｍ、１５分間遠心分離後、上層を回収した。下層に更にクロロホルム：メタノール＝２：１の混液を１ｍＬ加え、混合・放置後、遠心分離を行い、上層を回収し、先の回収液と混合した。得られた溶液に窒素を吹きつけ、溶媒を除去した。得られた固形物を１ｍＬのメタノールに溶解し、フィルターでろ過し、適宜メタノールで希釈したのち、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて解析した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの条件は、実施例１に記載の条件に従った。得られた測定値から、図３の検量線、又は図４の検量線を用いて、コリン型プラズマローゲン及びエタノールアミン型プラズマローゲンのそれぞれの分子種の量を換算した。結果を表２〜４に示す。
試料中の測定したプラズマローゲンの分子種は、コリン型プラズマローゲン及びエタノールアミン型プラズマローゲンのいずれも、ｓｎ−１位が１６：０、１８：０、又は１８：１の３種類、ｓｎ−２位が１６：０、１８：０、１８：１、１８：２、１８：３、２０：４、２０：５、２２：４、２２：５、又は２２：６の１０種類である。従って、測定したコリン型プラズマローゲンの分子種は３０種類であり、エタノールアミン型プラズマローゲンの分子種も３０種類である。
《比較例１》
本比較例では、外部標準法を用いて、実施例４と同じ２２〜５３歳の被験者６人（男性４人、女性２人）の血液から分画した血清中のプラズマローゲンを定量した。
血清に内部標準化合物を添加しないことを除いては、実施例４の操作を繰り返した。
コリン型プラズマローゲンの検量線に関しては、実施例２で得られた、ｐ１６：０／２０：４のコリンリン酸由来フラグメント（Ａ）の面積を用いて、検量線を作成した。本比較例で得られた測定値（コリンリン酸由来フラグメント（Ａ）の面積）を検量線に当てはめ、コリン型プラズマローゲンのそれぞれの分子種の量を計算した。
エタノールアミン型プラズマローゲンの検量線に関しては、実施例３で得られた、３種類のエタノールアミン型プラズマローゲンの分子種特異的なフラグメント（Ｒ１由来フラグメント）の面積から、検量線を作成した。本比較例で得られた測定値を検量線に当てはめ、エタノールアミン型プラズマローゲンのそれぞれの分子種を計算した。結果を表２〜４に示す。
本比較例では、外部標準法を用いて、実施例４と同じ２２〜５３歳の被験者６人（男性４人、女性２人）の血液から分画した血清中のプラズマローゲンを定量した。
血清に内部標準化合物を添加しないことを除いては、実施例４の操作を繰り返した。
コリン型プラズマローゲンの検量線に関しては、実施例２で得られた、ｐ１６：０／２０：４のコリンリン酸由来フラグメント（Ａ）の面積を用いて、検量線を作成した。本比較例で得られた測定値（コリンリン酸由来フラグメント（Ａ）の面積）を検量線に当てはめ、コリン型プラズマローゲンのそれぞれの分子種の量を計算した。
エタノールアミン型プラズマローゲンの検量線に関しては、実施例３で得られた、３種類のエタノールアミン型プラズマローゲンの分子種特異的なフラグメント（Ｒ１由来フラグメント）の面積から、検量線を作成した。本比較例で得られた測定値を検量線に当てはめ、エタノールアミン型プラズマローゲンのそれぞれの分子種を計算した。結果を表２〜４に示す。
《比較例２》
本比較例では、内部標準物質として、コール酸を用いて、実施例４と同じ２２〜５３歳の被験者６人（男性４人、女性２人）の血液から分画した血清中のプラズマローゲンを定量した。
内部標準化合物として、１００ｐｍｏｌの前記ｐ２３：０／１８：１を用いる代わりに、１８０ｐｍｏｌのコール酸を用いることを除いては、実施例４の操作を繰り返した。
コリン型プラズマローゲンの検量線も、ｐ２３：０／１８：１を１００ｐｍｏｌ用いる代わりに、１８０ｐｍｏｌのコール酸を用いることを除いては、実施例２の操作を繰り返すことによって、作成した。
エタノールアミン型プラズマローゲンの検量線は、ｐ２３：０／１８：１を５０ｐｍｏｌ用いる代わりに、１８０ｐｍｏｌのコール酸を用いることを除いては、実施例３の操作を繰り返すことによって、作成した。
本比較例で得られた測定値をそれぞれの検量線に当てはめ、エタノールアミン型プラズマローゲンのそれぞれの分子種を計算した。結果を表２〜４に示す。
本比較例では、内部標準物質として、コール酸を用いて、実施例４と同じ２２〜５３歳の被験者６人（男性４人、女性２人）の血液から分画した血清中のプラズマローゲンを定量した。
内部標準化合物として、１００ｐｍｏｌの前記ｐ２３：０／１８：１を用いる代わりに、１８０ｐｍｏｌのコール酸を用いることを除いては、実施例４の操作を繰り返した。
コリン型プラズマローゲンの検量線も、ｐ２３：０／１８：１を１００ｐｍｏｌ用いる代わりに、１８０ｐｍｏｌのコール酸を用いることを除いては、実施例２の操作を繰り返すことによって、作成した。
エタノールアミン型プラズマローゲンの検量線は、ｐ２３：０／１８：１を５０ｐｍｏｌ用いる代わりに、１８０ｐｍｏｌのコール酸を用いることを除いては、実施例３の操作を繰り返すことによって、作成した。
本比較例で得られた測定値をそれぞれの検量線に当てはめ、エタノールアミン型プラズマローゲンのそれぞれの分子種を計算した。結果を表２〜４に示す。
《解析》
実施例４、及び比較例１及び２では、それぞれの試料について５回測定を行い、平均及び標準偏差を計算した。表２には、検体１及び２について、測定した３０種のコリン型プラズマローゲンの合計の測定値及び標準偏差を示している。
実施例４、及び比較例１及び２では、それぞれの試料について５回測定を行い、平均及び標準偏差を計算した。表２には、検体１及び２について、測定した３０種のコリン型プラズマローゲンの合計の測定値及び標準偏差を示している。
表２から明らかなように、内部標準としてコリン型プラズマローゲン様化合物を用いた実施例４は、外部標準を用いた比較例１及びコール酸を内部標準として用いた比較例２と比較すると、数値が高く、ばらつき（標準偏差）も小さく、内部標準物質としてプラズマローゲンを使用し、補正した数値の精度が高いことがわかった。
表３には、検体１及び２について、測定した３０種のエタノールアミン型プラズマローゲンの合計の測定値及び標準偏差を示している。
驚くべきことに、塩基の異なるコリン型プラズマローゲン様化合物を内部標準として用いて、エタノールアミン型プラスミノーゲンを測定した場合にも、外部標準法である比較例１及びコール酸を内部標準として用いた比較例２よりも、数値が高く、ばらつき（標準偏差）も小さく、内部標準としてプラズマローゲンを使用し、補正した数値の精度が高かった。
更に、表４は、ｐ２３：０／１８：１を内部標準として用い分析をした場合の、６人の被験者のコリン型プラズマローゲン、エタノールアミン型プラズマローゲン、及び総プラズマローゲンの濃度、並びにコリン型プラズマローゲン、及びエタノールアミン型プラズマローゲンのそれぞれの分子種のｓｎ−２位の脂肪酸毎にまとめたものの割合を記載した。被験者によって、プラズマローゲン総量とともに、ｓｎ−２位に結合している脂肪酸組成も異なり、特にコリン型プラズマローゲン、及びエタノールアミン型プラズマローゲンともにｓｎ−２位の分子種が２０：５のプラズマローゲンの割合は各被験者で大きく異なっていた。このように本発明により、従来、分析されていたエタノールアミン型の分子種分析に加え、コリン型プラズマローゲンの詳細な分子種分析が可能となった。
本発明の化合物は、プラズマローゲンの分析方法に、内部標準化合物として用いることができる。前記化合物を用いたプラズマローゲンの分析方法は、簡便に且つ精確にプラズマローゲンの分子種を測定することができ、疾患などの診断に用いることができる。
Claims (7)
- 一般式（１）
Ｒ２は、炭素数８〜２１のアルキル基又はアルケニル基であり、
Ｘは、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３、又はＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である）
で表される化合物。 - 式（４）
- 請求項１又は２に記載の化合物を含むプラズマローゲン分析用内部標準組成物。
- 請求項１又は２に記載の化合物を、内部標準化合物として用い、プラズマローゲンを分析することを特徴とする、プラズマローゲン分析方法。
- （ａ１）生体試料中に、前記請求項１又は２に記載の化合物を、内部標準化合物として添加する工程、
（ｂ１）前記内部標準組成物が添加された試料からプラズマローゲン及び内部標準化合物を抽出する工程、及び
（ｃ１）前記抽出したプラズマローゲン及び内部標準化合物の質量を分析する工程、
を含むプラズマローゲン分析方法。 - （ａ２）生体試料から、プラズマローゲンを抽出する工程、
（ｂ２）抽出試料に、前記請求項１又は２に記載の化合物を、内部標準化合物として、添加する工程、及び
（ｃ２）プラズマローゲン及び内部標準化合物の質量を分析する工程、
を含むプラズマローゲン分析方法。 - 前記分析が、液体クロマトグラフィータンデム質量分析である、請求項４〜６のいずれか一項に記載のプラズマローゲン分析方法。
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|---|---|---|---|---|
| WO2014010667A1 (ja) * | 2012-07-12 | 2014-01-16 | 学校法人帝京大学 | 認知機能検査法、及びそのキット |
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2009
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