JP5662060B2 - 検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法、及びメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出キットに関する。

近年、動脈硬化症、高脂血症、糖尿病、高血圧、及び中心性肥満などの生活習慣病が、共通の代謝異常を基盤として発症することが明らかとなり、これらの疾病の基盤となる代謝異常がメタボリックシンドロームと表現されるようになった。厚生労働省令第百五十七号「特定健康診査及び特定保健指導の実施に関する基準（２００７年１２月２８日）」において、４０〜７４歳の保険者に特定健康診査が義務付けられ、メタボリックシンドロームの診断基準である腹囲、血圧、血清トリグリセライド（中性脂肪）、高比重リポ蛋白コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）量、血糖が検査されることとなり、２００８年４月より実施されている。メタボリックシンドローム診断者には保健指導もなされるため、国民の健康に対する意識が高まり、生活習慣病予防への動きも積極的になっている。

従来、動脈硬化症の発症リスクマーカーとしては、高密度リポ蛋白コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、低密度リポ蛋白コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）量、小粒子ＬＤＬ（ｓｄＬＤＬ）、アポリポ蛋白質Ａ、アディポネクチン、ＣＲＰ（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｃ反応性蛋白質）、及びＡＩＰ（Ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ Ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ：血清動脈硬化指標）などが知られている。
ｓｄＬＤＬは、中性脂肪を高含有するＬＤＬであり、通常のＬＤＬよりも粒子サイズが小さい。ＬＤＬよりも酸化されやすく、動脈硬化惹起性が高いとされている。アポリポ蛋白質Ａは、ＨＤＬを構成する蛋白質であり、細胞内からコレステロールの排出を促進する。アディポネクチンは、脂肪細胞から分泌されるホルモンであり、インスリン感受性の亢進、動脈硬化抑制、及び抗炎症の作用があるとされる。また、血中濃度は内臓脂肪量に負の相関がある。ＣＲＰは、体内の炎症反応が生じる際に生成される蛋白質であり、慢性の血管炎症という側面を持つ動脈硬化のマーカーとして注目されている。ＡＩＰは、血清中性脂肪量とＨＤＬ−Ｃ量から計算される〔ｌｏｇ（中性脂肪／ＨＤＬ−Ｃ量）〕血漿（Plasma）動脈硬化指標である。
また、動脈硬化の発症原因に最も寄与するのは、ＬＤＬの酸化であると言われている。コレステロールの代謝や輸送の異常により酸化されたＬＤＬは、マクロファージの泡沫化を招き、また、好中球からのスーパーオキシド産生を誘起させることにより、血管内皮下での更なる脂質過酸化や脂質の蓄積などを引き起こし、疾病の進展を促す。従って、ＬＤＬの酸化の抑制が動脈硬化の発症の抑制に極めて有効である。

一方、プラスマローゲンは、グリセロリン脂質の一種であり、グリセロール骨格のｓｎ−１位にオレフィニル鎖（ビニルエーテル結合）、ｓｎ−２位にアシル鎖、ｓｎ−３位に塩基の結合したリン酸を持つものである。天然に存在するプラスマローゲンの主たるオレフィニル鎖の炭素数は１６〜１８であり、主たるアシル鎖は炭素数１６〜２２の脂肪酸である。また、そのリン酸に結合する主たる塩基は、コリンとエタノールアミンであり、それぞれ、コリン型プラスマローゲン（以下、ＣＰと称することがある）、エタノールアミン型プラスマローゲン（以下、ＥＰと称することがある）と呼ばれ、例えば、哺乳類の心臓や骨格筋ではＣＰの比が高く、その脳や腎臓ではＥＰの比が高いことが知られている。

ヒト血漿中には２〜３ｍＭのリン脂質が存在し、それらはリポタンパク質の構成成分である。その全リン脂質の６０〜７５％はコリングリセロリン脂質で、２〜５％はエタノールアミングリセロリン脂質であり、１０〜２０％はスフィンゴミエリンリン脂質である。
血漿中のプラスマローゲン濃度は０．１〜０．３ｍＭで、その約４０％がＣＰ、約６０％がＥＰである。つまり、コリングリセロリン脂質の約５％、エタノールアミングリセロリン脂質の約６０％がプラスマローゲンである。その他の塩基を持つプラスマローゲンは血中にはほとんど存在しない。

プラスマローゲンの生理的な役割として、細胞融合や分泌作用に関わる膜融合作用、情報伝達や生体高分子輸送への関与、酸化され易い多価不飽和脂肪酸の貯蔵体としての役割、及び内因性抗酸化物質としての役割などが報告されている。また、ヒトの遺伝的なプラスマローゲン欠損が、重篤な精神遅滞、副腎機能障害、白内障、聴覚障害、又は発育不全などの病状を呈すること、あるいはアルツハイマー症患者、及び高齢者では血清プラスマローゲン量が減少することが報告されており、プラスマローゲンが生体内できわめて重要な役割を担うことが示唆されている（非特許文献１）。また、プラスマローゲンは、血中リポタンパク質の生成時に優先的に導入されることが知られ、かつ、その内因性の抗酸化能から、ＬＤＬの酸化防御因子として作用することが考えられる。

特許文献１では、高脂血症者を含む中高年者群（１４８名、平均年齢６５．２歳）の血液のコリン型プラスマローゲン及びエタノールアミン型プラスマローゲン量を測定し、ＣＰ／ＥＰ比が、空腹時トリグリセライド（「中性脂肪」を意味する）及びＬＤＬサイズ（「ｓｄＬＤＬ」を意味する）と、それぞれ有意な相関性（相関係数−０．３５９及び０．４０２）を示し、ＣＰ／ＥＰ比を生活習慣病予防の検査法として用いることが開示されている。また、非特許文献１は、更に全ＣＰ量又は全ＥＰ量が、ＨＤＬ−Ｃ、アポリポ蛋白質Ａ−Ｉ、及びアポリポ蛋白質Ａ−ＩＩと、それぞれ相関（相関係数＞０．２８）することを開示している。

しかしながら、特許文献１に記載のＣＰ／ＥＰ比と、空腹時トリグリセライド（中性脂肪）及びＬＤＬサイズ（ｓｄＬＤＬ）との相関、並びに非特許文献１に記載の全ＣＰ量又は全ＥＰ量と、ＨＤＬ−Ｃ、アポリポ蛋白質Ａ−Ｉ、及びアポリポ蛋白質Ａ−ＩＩとの相関は高いものではなく、生活習慣病の検出のマーカーとしては、十分なものではなかった。

特開２００７−３３４１０号公報

「ジャーナル・オブ・アセロスクレロージス・アンド・トロンボシス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）」２００７年、（日本）第１４巻、ｐ．１２−１８

特許文献１において、冠動脈狭窄の有無、耐糖能異常、年齢、性、ＣＡＧ、ＯＧＴＴ、高脂血症、身長、体重、ＢＭＩ、喫煙（本数／日、期間）、家族歴、高血圧症、痛風などの検査項目と、血漿プラスマローゲン濃度、尿酸値、ＴＣ、ＴＧ空腹時、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＦＢＳ、ＨｂＡ１ｃ、ＴＣ＿２、ＴＧ＿２、ＨＤＬ＿２、ＬＤＬ＿２、アポ蛋白Ａ−Ｉ、アポ蛋白Ａ−ＩＩ、アポ蛋白Ｂ、アポ蛋白Ｃ−ＩＩ、アポ蛋白Ｃ−ＩＩＩ、アポ蛋白Ｅ、ＬＰ（Ａ）、ＬＰ−Ｆ＿ＰＧＲ、リポ蛋白α（ＨＤＬ）、リポ蛋白β（ＬＤＬ）、リポ蛋白ｐｒｅβ（ＶＬＤＬ）、ＲＬＰ−Ｃ、Ｓ＿０’、Ｓ＿１２０’、ＩＲＩ＿０’、ＩＲＩ＿１２０’、ＩＲＩ＿０’、ＩＲＩ＿１２０’、ＨＯＭＡ＿ＩＲ、ＬＰＬ、アディポネクチン、ＭＤＡ＿ＬＤＬ、ＬＰＬ後、ＡｐｏＢ４８前、ＡｐｏＢ４８後、ＬＤＬ＿ｓｉｚｅ、リン脂質濃度、コリン型プラスマローゲン（ＣＰ）、エタノールアミン型プラスマローゲン（ＥＰ）、ＣＰ／ＥＰなどの検査項目を測定し、各項目間の相関性を調べたことが記載されている。そして、空腹時トリグリセリド（ＴＧ）、ＨＤＬ_２、ＣＰ／ＥＰの各値と、ＬＤＬサイズとの間で有意な相関性があること、及び前記のようにＣＰ／ＥＰと空腹時トリグリセリド（ＴＧ）との間で、有意な相関があることが記載されているが、その他の検査項目間において相関性があることは、記載されていない。

前記のように、特許文献１では、ＣＰ／ＥＰ比及び空腹時トリグリセライド（中性脂肪）、並びにＣＰ／ＥＰ比及びｓｄＬＤＬに有意な相関が得られているが、相関係数はそれぞれ−０．３５９及び０．４０２とやや低かった。また、非特許文献１における、全ＣＰ量と、ＨＤＬ−Ｃ、アポリポ蛋白質Ａ−Ｉ、及びアポリポ蛋白質Ａ−ＩＩとの相関も、それぞれ０．３０８、０．４３５、及び０．２４１であり、高いものではない。
この理由は、特許文献１及び非特許文献１では、血清（Serum）中プラスマローゲン濃度を測定する検査法として、抽出脂質に三ヨウ化物イオンを反応させて脂質成分中のプラスマローゲンに放射性ヨウ素を特異的に結合させ、それをクロマトグラフィーの手法によりＣＰとＥＰとに分別して定量する方法によっているため、放射性ヨウ素を用いた場合の減衰率の影響などの点で充分な精度ではなかったことが、１つの原因であると思われる。
更に、特許文献１及び非特許文献１のプラスマローゲン測定方法では、内部標準物質を用いていないために、測定間、測定日間、又は測定者間のバラツキがあり、十分な相関が得られなかった可能性が考えられる。

従って、本発明の目的は、４０〜７４歳の特定検診対象者を含む広範囲の被験者において、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の従来のマーカーとの高い相関を有するマーカーを提供すること、及びメタボリックシンドローム又は生活習慣病の有効な検出方法を提供することである。更に、メタボリックシンドローム又は生活習慣病のリスク又は重篤度を示すことのできるマーカーを提供し、更にメタボリックシンドローム又は生活習慣病のリスク又は重篤度の分析方法を提供することである。

本発明者らは、前記課題を解決するため、まず、プラスマローゲンの分析方法について、より精度の高い血液中プラスマローゲンを定量する方法を鋭意検討した結果、上記特許文献１に記載の検査法において、内部標準物質として、１−アルケニル環状ホスファチジン酸（１−ａｌｋ−１’−ｅｎｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ−２，３−ｃｙｃｌｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（以下、ｃＡＰと称することがある））を用いることで、より精度を高めた分析法とすることができることを知見した。そして、更に、内部標準物質として、合成コリン型プラスマローゲンを使用し、プラスマローゲンを液体クロマトグラフィータンデム質量分析器（以下、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳと称する）によって分析することで、ＣＰのｓｎ−２位に結合した脂肪酸の分析（ＣＰの分子種の分析）が精度の高いレベルで可能となることを知見した。

前記の内部標準物質を用いた２つの分析方法により、重疾病患者を除く２０〜６０代の被験者４５１人を対象にした調査を行ったところ、全血清プラスマローゲン量と比較して、ＣＰ量、特にはｓｎ−２位に結合した脂肪酸がオレイン酸であるＣＰ（以下、Ｃ１８：１ＣＰと称する）含量、又はｓｎ−２位に結合した脂肪酸がリノール酸であるＣＰ（以下、Ｃ１８：２ＣＰと称する）含量が、ＨＤＬ−Ｃ、中性脂肪、ｓｄＬＤＬの他、腹囲、アディポネクチン、ＡＩＰなどの動脈硬化症関連因子と強く相関することを確認した。

また、全リン脂質量と全ＣＰ量との比（以下、「ＣＰ／ＰＬ」と称する）は、ＣＰ量のみよりも前記の動脈硬化症関連因子と高い相関を示すことを見出した。
更に、全ＣＰ量と体重（以下、「ＣＰ／体重」と称する）との比、又は全ＣＰ量と中性脂肪との比（以下、「ＣＰ／中性脂肪」と称する）も、全ＣＰ量のみよりも前記の動脈硬化症関連因子と高い相関を示すことを見出した。
前記の測定項目は、特許文献１に示されたマーカーであるＣＰ／ＥＰよりも各項目間の相関係数が高く、より多くの項目と相関すること、特に、肥満症の関連因子である腹囲、アディポネクチンとの相関もあることから、これらが脂質代謝異常全般を反映するマーカーとして有効性が高いことがわかった。

すなわち、本発明は、
［１］被検試料中のコリン型プラスマローゲン濃度を測定する工程を含むことを特徴とする、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法、
［２］前記コリン型プラスマローゲン濃度が、ｓｎ−２位にオレイン酸を有するコリン型プラスマローゲン、又はｓｎ−２位にリノール酸を有するコリン型プラスマローゲンの濃度である、［１］に記載のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法、
［３］被検試料中のリン脂質濃度、中性脂肪濃度、及び被検者の体重からなる群から選択される値を測定する工程、及び前記コリン型プラスマローゲン濃度の測定値と、前記被検試料中のリン脂質濃度の測定値、被検試料中の中性脂肪濃度の測定値、又は被検者の体重の測定値との比を計算する工程、を更に含む、［１］又は［２］に記載のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法、
［４］前記生活習慣病が、脂質異常症、高血圧症及び動脈硬化症からなる群から選択される、［１］〜［３］のいずれかに記載のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法、
［５］メタボリックシンドローム又は生活習慣病の、発症予防用又は治療効果のモニタリング用である、［１］〜［３］のいずれかに記載のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法、
［６］プラスマローゲンの分析用内部標準物質として、
下記一般式（１）

（式中、Ｒ^３は、炭素数４〜２６のアルキル基又はアルケニル基であり、Ｍは水素原子又は対カチオンである）で表される１−アルケニル環状ホスファチジン酸、及び
一般式（２）

（式中、Ｒ^１は、炭素数７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２１のアルキル基であり、Ｒ^２は、炭素数８〜２１のアルキル基又はアルケニル基である）で表される化合物、からなる群から選択される化合物の少なくとも１つを用いる、請求項１〜５のいずれかに記載のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法、
［７］プラスマローゲンの分析用内部標準物質として、前記一般式（１）で表される１−アルケニル環状ホスファチジン酸、を含むことを特徴とする、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出キット、及び
［８］プラスマローゲンの分析用内部標準物質として、前記一般式（２）で表される化合物を含むことを特徴とする、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出キット、
に関する。

本発明のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法又は検出キットによれば、従来の検出方法と比較して、高率にメタボリックシンドローム又は生活習慣病を検出することが可能であり、特にメタボリックシンドロームを高率に検出することが可能である。また、本発明の検出方法又は検出キットにより得られる測定値は、生活習慣病のマーカーであるＨＤＬ−Ｃ、ｓｄＬＤＬ、ＡＩＰ、腹囲、体重、又はアディポネクチンの測定値との高い相関を示す。更に、本発明の検出方法又は検出キットにおいて、内部標準物質として、１−アルケニル環状ホスファチジン酸、又は合成コリン型プラスマローゲンを用いることにより、正確にコリン型プラスマローゲンの量を測定することが可能になり、更にコリン型プラスマローゲンの分子種の正確な分析も可能になった。
従って、本発明の検出方法又は検出キットは、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の、リスク又は重篤度を、従来に比べ、より正確に診断することができ、本発明により見出されたマーカーは、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の、リスク又は重篤度を、従来のマーカーに比べ、より正確に示している。

［１］メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法
本発明のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法は、被検試料中のコリン型プラスマローゲン濃度を測定する工程を含む。

本発明の検出方法においては、被検試料中の総量のコリン型プラスマローゲン濃度、又はコリン型プラスマローゲンの分子種の濃度を測定する。ここで、コリン型プラスマローゲン濃度、又はコリン型プラスマローゲンの分子種の濃度の測定において、内部標準物質を添加せずに分析・測定をした場合、分析において当然発生してくるサンプル間の抽出効率の差、また、例えば質量分析器に供した際のイオン化効率のインジェクション毎の差の補正を行うことができない。そのため、内部標準物質を添加することが行われる。さて、従来は内部標準物質としてコール酸などを用いていたが、その極性やイオン化効率などがプラスマローゲンと大きく異なるため、正確なプラスマローゲン含量の測定値であるとはいえないものであった。
本発明者らは、新規な内部標準物質として、１−アルケニル環状ホスファチジン酸〔１−ａｌｋ−１’−ｅｎｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ−２，３−ｃｙｃｌｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（以下、ｃＡＰと称することがある）〕、又は合成コリン型プラスマローゲンを用いることで、コリン型プラスマローゲンの正確な含有量の測定が可能となることを見出した。以下に、本発明の検出方法において内部標準物質として用いることのできる１−アルケニル環状ホスファチジン酸、及び合成コリン型プラスマローゲンについて説明する。

《内部標準物質》
（１−アルケニル環状ホスファチジン酸）
本発明の検出方法において、内部標準物質として用いることのできる１−アルケニル環状ホスファチジン酸（ｃＡＰ）は、下記一般式（１）

（式中、Ｒ^３は、炭素数４〜２６のアルキル基又はアルケニル基であり、Ｍは水素原子又は対カチオンである）
で表される化合物である。

前記１−アルケニル環状ホスファチジン酸において、Ｒ^３は、炭素数４〜２６のアルキル基又はアルケニル基であり、好ましくは炭素数８〜２２のアルキル基又はアルケニル基であり、より好ましくは炭素数１２〜１８のアルキル基又はアルケニル基であり、最も好ましくは炭素数１４〜１６のアルキル基又はアルケニル基である。なお、アルケニル基に比べアルキル基であることが好ましい。プラスマローゲンのｓｎ−１位の側鎖は、そのほとんどが１６：０、１８：０、及び１８：１のビニルエーテル結合を有する炭化水素基であり、Ｒ^３の炭素数が３以下、又は２７以上のアルキル基を有する１−アルケニル環状ホスファチジン酸の場合、挙動が異なる可能性があるため好ましくない。

前記ｃＡＰの調製は、化学合成あるいは酵素合成によって行うことができる。価格的に有利である酵素合成法については、特開２００１−１７８４８９号公報に記載の方法に準じて行うことができ、１−リゾリプラスマローゲン（例えば１−リゾコリンプラスマローゲン）と、ホスホリパーゼＤ（例えばＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ Ｎｏ．３６２由来のホスホリパーゼＤ）との反応生成物として、１−リゾホスファチジン酸プラスマローゲンとともにｃＡＰが得られる。更に、本発明者らは、エーテル／エタノール混合溶媒を用いる再抽出により、１−リゾホスファチジン酸プラスマローゲンを除去することができ、高純度のｃＡＰが得られることを見出している。
前記ｃＡＰは、内部標準物質として、後述の総ＣＰ量の測定方法において使用することができる。

（合成コリン型プラスマローゲン）
発明の検出方法において、内部標準物質として用いることのできる合成コリン型プラスマローゲンは、下記一般式（２）

（式中、Ｒ^１は、炭素数７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２１のアルキル基であり、Ｒ^２は、炭素数８〜２１のアルキル基又はアルケニル基である）で表される化合物である。

前記合成コリン型プラスマローゲンにおいて、Ｒ^１は、炭素数７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２１の奇数のアルキル基であり、好ましくは炭素数７、９、１１、１９、又は２１のアルキル基であり、より好ましくは炭素数７、９、１９、又は２１のアルキル基であり、最も好ましくは炭素数１９、又は２１のアルキル基である。プラスマローゲンのｓｎ−１位の側鎖は、そのほとんどが１６：０、１８：０、及び１８：１のビニルエーテル結合を有する炭化水素基であり、炭素数が奇数の炭化水素基は生体内にほとんど存在しない。従って、Ｒ^１が奇数のアルキル基である本発明の前記化合物を、内部標準化合物としてプラスマローゲンの分析に用いることによって、各種分析において溶出位置が異なり、生体内のプラスマローゲンと明確に区別することが可能である。

前記一般式（２）で表される化合物は、本発明者が特願２００９−２９６７４４号明細書に記載している。前記化合物は、ガスクロマトグラフィーを用いるプラスマローゲンの測定方法、高速液体クロマトグラフィーを用いるプラスマローゲンの測定方法、及び質量分析を用いるプラスマローゲンの測定方法において、内部標準物質として使用でき、特には液体クロマトグラフィータンデム質量分析器（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いたプラスマローゲンの測定方法において使用することにより、正確なプラスマローゲンの分子種の測定が可能である。

前記合成コリン型プラスマローゲンの特に好ましい態様においては、式（３）

で表される化合物を挙げることができる。

前記式（３）で表される合成コリン型プラスマローゲンは、下記反応工程式（４）に従い、製造することができる。

前記合成コリン型プラスマローゲンは、内部標準物質として、後述の総ＣＰ量の測定方法、及びＣＰの分子種の測定方法において使用することができる。また、コール酸を内部標準物質として用いた場合と比較すると、前記合成コリン型プラスマローゲンは、内部標準物質の極性、抽出効率、及び質量分析器でのイオン化効率のすべての面において、測定されるプラスマローゲンに類似していると考えられ、内部標準化合物として優れていた。すなわち、測定値のバラツキが少なく、精確な測定値を得ることが可能であった。

《被検試料からのプラスマローゲンの抽出》
本発明の検出方法におけるプラスマローゲン濃度の測定では、まず被検試料からプラスマローゲンの抽出を行う。被検試料からのプラスマローゲンの抽出方法は、リン脂質を回収できる方法であれば特に限定されるものではなく、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法、Ｆｏｌｃｈ法、ヘキサン／エタノール混合溶媒を用いる方法、エーテル／エタノール混合溶媒を用いる方法、又は被検試料を凍結乾燥させてクロロホルム／メタノール混合溶媒などの溶媒で抽出する方法を挙げることができる。これらの抽出方法において、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法は操作が煩雑であること、ヘキサン／エタノール混合溶媒を用いる方法は回収率が低いことから、エーテル／エタノール混合溶媒を用いる方法、又は凍結乾燥させてクロロホルム／メタノール混合溶媒などの溶媒で抽出する方法が好ましい。また、特に、後述の放射性ヨウ素反応試薬を用い、ＨＰＬＣで分析する方法においては、凍結乾燥試料を用いた方法は水溶性夾雑物が混入することがあり、エーテル／エタノール混合溶媒を用いる方法が好ましい。
エーテル／エタノール混合溶媒を用いる方法とは、被検試料に対してエーテル／エタノール混合溶媒を添加して抽出した後、更に水を添加してエーテル層を離層させ、エーテル層を脂質抽出液として回収する方法である。具体的には、被検試料（例えば、血清又は血漿）１．０ｍＬに対し、エーテル０．２〜２．０ｍＬ、好ましくは０．５〜１．５ｍＬ、エタノール１．０〜４．０ｍＬ、好ましくは２．０〜３．０ｍＬを加えて抽出する。このときエーテル／エタノール比が１：２〜１：４になることが好ましい。続いてエーテルを２．０〜１０ｍＬ、及び水を４．０〜１０ｍＬ加えてエーテル層と水層を分離させる。このとき加えるエーテル／水の比が１．０〜２．５であることが望ましい。上記操作により分離したエーテル層を脂質抽出液として回収する。更に回収率を高めるために、残った水層に更にエーテル２．０〜５．０ｍＬを加えて抽出を行うことができる。

また、被検試料を凍結乾燥後にクロロホルム及びメタノールを用いる方法は、例えば以下のように行うことができる。得られた被検試料（例えば、血漿）を凍結乾燥し、クロロホルム：メタノール＝２：１の混液を０．５ｍＬ添加する。この溶液を遠心分離し、上層（１）を回収する。残った下層に、クロロホルム：メタノール＝２：１の混液を１ｍＬ混合し、更に遠心分離を行い、上層（２）を回収する。前記上層（１）及び上層（２）を混合し、窒素を吹き付けることにより溶媒を除去し、固形物を１ｍＬのメタノールに溶解することによって、プラスマローゲンを含む抽出試料を得ることができる。

前記被検試料としては、ヒトを含む動物由来の試料であれば特に限定されるものではなく、例えば、ヒトを含む動物の液体試料（例えば、血液、血清、血漿、リンパ液、組織液、髄液、唾液、尿、涙、又は汗等）、臓器、細胞、及び組織などを挙げることができるが、血液、血清、又は血漿（以下、血液等と称することがある）がより好ましい。例えば、ヒトの血漿を被検試料として用いる場合は、血液を血液凝固剤（例えば、ＥＤＴＡ）の入った採血管で採血し、遠心分離により血球成分を除いて用いることができる。また、ヒトの血清を被検試料として用いる場合は、血液を採血後に室温に置き、分離した血清を用いることができる。更に、臓器、組織、又は細胞を用いる場合は、臓器、細胞、又は組織用の抽出液を用いて、プラスマローゲンの含まれた被検試料液を得ることができ、その被検試料液から、前記プラスマローゲンの抽出方法により、プラスマローゲンを抽出することができる。
抽出されたプラスマローゲンは、以下の総ＣＰ量の測定方法、及びＣＰの分子種の測定方法に用いることができる。

《総ＣＰ量の測定方法》
総ＣＰ量の測定方法は、ＣＰとＥＰを分別して測定することができる分析方法であれば、特に限定されるものではなく、ガスクロマトグラフィーを用いる方法、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法、及び質量分析方法を挙げることができるが、特には高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法、又は質量分析方法が好ましい。
被検試料（例えば、血清又は血漿）中のＣＰ量の定量としては、これまでプラスマローゲンの測定法として、ｓｎ−１位由来のジメチルアセタールの分析によりプラスマローゲンの量を換算する方法や、ＴＬＣで分画し、リン脂質クラス分けをした後にガスクロマトグラフィーにて分子種分析する方法しかなかったが、近年では液体クロマトグラフィーを使用した分析が、多数の検体を迅速に高感度で分析可能な点で多く行われるようになっており、本発明でも、この液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することができる。更に、質量分析器を用いてプラスマローゲンの分子種を分析する方法も行われるようになっており、本発明においては、質量分析器を用いることもできる。以下に、詳細に説明する。

（ＨＰＬＣによる総ＣＰ量の測定）
ＨＰＬＣを用いた被検試料（例えば、血清又は血漿）中の総ＣＰ量の定量方法としては、内部標準としてｃＡＰを被検試料に添加し抽出するか、又はｃＡＰを抽出脂質に添加し、メタノール中で放射性ヨウ素試薬と反応させて、生成される放射性ヨウ素結合ＣＰをＨＰＬＣで溶出して放射活性を測定する方法によることが好ましい。

放射性ヨウ素反応試薬の調製においては、市販の放射性ヨウ素（Ｎａ^１２５Ｉ）を、メタノール中、ｐＨ５．５〜６．０の酸性条件下で、過酸化水素などの酸化剤により、一晩、室温で酸化することによって行うことができる。この試薬中には、プラスマローゲンに特異的に結合する放射性三ヨウ化物（Ｉ^３−）が７０％以上含有される。

被検試料からの抽出脂質と放射性ヨウ素反応試薬との反応においては、ＣＰを含有するメタノール溶解試料（例えば、血清抽出試料０．００１〜０．１ｍＬ、ＣＰ推定含量０．１〜４００ｎｍｏｌ）と放射性ヨウ素反応試薬（例えば、ヨウ素原子１０ｍＭ試薬０．００１〜０．１ｍＬ）とを混合し、一定温度（通常４℃〜３０℃）、一定時間（通常、１２〜２４時間）静置することで行う。
ＨＰＬＣの溶出条件においては、コリングリセロリン脂質、エタノールアミングリセロリン脂質、及び内部標準が分別できるカラム（例えば、Ｄｉｏｌカラムなど）を用い、適当な溶出溶媒（例えば、アセトニトリル／水／酢酸／アンモニア）を用いて溶出することができる。
ＣＰ（正確には、ＣＰ由来のヨウ素結合コリングリセロリン脂質）の検出は、ガンマカウンター（好ましくはフロー型ガンマカウンター）で放射活性を測定することにより行う。

前記放射性ヨウ素反応試薬の内部標準物質としては、化学量論的にヨウ素と結合し、かつ脂溶性の化合物を用いることができるものであれば限定されるものはなく、例えば、２−ヒドロキシエチルビニルエーテルやジエチレングリコールビニルエーテルなどのビニルエーテル化合物や血清中にほとんど存在しないリゾプラスマローゲン、セリンプラスマローゲン、前記生体内に存在しない合成コリン型プラスマローゲン（特には、Ｒ^３が炭素数４〜６又は２２〜２４のアルキル基を有する合成コリン型プラスマローゲン）及び１−アルケニル環状ホスファチジン酸を挙げることができるが、好ましくは、１−アルケニル環状ホスファチジン酸（ｃＡＰ）を用いる。ｃＡＰはコリングリセロリン脂質と物理化学的性状が類似し、ＨＰＬＣでの分離が容易であり、かつ保存安定性が高いからである。

（質量分析による総ＣＰ量の測定）
質量分析器による総ＣＰ量の分析方法は、後述の質量分析器を用いたＣＰの分子種の測定方法に従って行うことができる。すなわち、被検試料からのプラスマローゲンの抽出、内部標準物質、及び質量分析器は、特に限定されるものではない。後述のＣＰの分子種の測定においては、生体内に存在する主要な３０種のコリン型プラスマローゲンの濃度を測定することが可能であるが、それらの濃度を合計することによって、被検試料中の総ＣＰ量を求めることができる。

《ＣＰの分子種の測定方法》
ＣＰの分子種の測定方法は、ＣＰの分子種を分離して測定することができる方法であれば、特に限定されることはなく、例えばガスクロマトグラフィーを用いる方法、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法、及び質量分析方法を挙げることができるが、特には質量分析方法が好ましい。質量分析方法も、特に限定されるものではないが、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる質量分析法（以下、ＬＣ／ＭＳ法と称する）、ガスクロマトクラフィー（ＧＣ）を用いる質量分析法（以下、ＧＣ／ＭＳ法と称する）、及びキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を用いる質量分析法（以下、ＣＥ−ＭＳ法と称する）を挙げることができ、特には、ＬＣ／ＭＳの１つである液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（以下、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法と称する）が好ましい。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法は、感度が高く、更にはプラスマローゲンの多様な分子種を分析することが可能であるからである。

被検試料からのプラスマローゲンの抽出方法は特に限定されるものではなく、前記の抽出方法を用いることができるが、好ましい抽出方法は、凍結乾燥後にクロロホルム及びメタノールを用いる方法である。内部標準物質は、ＣＰの分子種ごとの検量線を作成できる限り限定されるものではないが、構造の類似性から、前記合成コリン型プラスマローゲンが好ましい。合成コリン型プラスマローゲンの調製は、前記の化学合成又は酵素合成によって行うことができ、特に制限されない。また、合成コリン型プラスマローゲンの種類も、生体内に存在しないものであれば、特に限定されるものではないが、前記式（３）で表されるｓｎ−１位がトリコサン酸、ｓｎ−２位がオレイン酸のコリン型プラスマローゲン（以下、ｐ２３：０／１８：１と称することがある）が好ましい。

合成コリン型プラスマローゲンは、プラスマローゲン抽出前の被検試料に添加してもよく、またプラスマローゲン抽出後の試料に添加してもよいが、抽出効率の補正も可能であることから、プラスマローゲン抽出前の被検試料に添加する方が好ましい。

プラスマローゲンの質量分析における、内部標準化合物を用いた補正の方法は、特に限定されるものではないが、既知の段階希釈した濃度のプラスマローゲンと、既知の濃度の内部標準化合物とから、作成した検量線を用いる方法が好ましい。すなわち、検量線はプラスマローゲンの濃度の異なる標準溶液に、内部標準化合物を添加した検体を用いて、作成することができる。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法による質量分析において、検量線を作成する場合には、内部標準化合物のピークフラグメントの面積と、プラスマローゲンのピークフラグメントの面積との比を求め、この比をグラフ上にプロットすることにより信頼性の高い検量線を作成することができる。実際の測定においては、生体試料に既知量の内部標準化合物を添加し、得られた検量線に、内部標準化合物のピークフラグメントと、検体中のプラスマローゲンのピークフラグメントの面積比を当てはめることにより、精確な測定値を得ることができる。

プラスマローゲンを質量分析する場合には、イオン化によりいくつかのフラグメントが生成されることが知られており、検量線を作成するためのフラグメントは特に限定されるものではないが、前記合成コリン型プラスマローゲン、及び試料中のプラスマローゲンのピークフラグメントとしては、例えば下記一般式（５）

で表されるコリンリン酸由来のフラグメント（以下、「コリンリン酸フラグメント」と称することがある）を用いることが好ましい。前記合成コリン型プラスマローゲンの前記コリンリン酸フラグメント、及び試料中のプラスマローゲンの前記コリンリン酸フラグメントの面積比をプロットすることにより、検量線を作成することができる。

作成された検量線を用いて、プラスマローゲンの分子種ごとの濃度の測定が可能である。被検試料中の主要なコリン型プラスマローゲンの分子種は、ｓｎ−１位が１６：０、１８：０、又は１８：１の３種類、ｓｎ−２位が１６：０、１８：０、１８：１、１８：２、１８：３、２０：４、２０：５、２２：４、２２：５、又は２２：６の１０種類である。従って、生体内の主要なコリン型プラスマローゲンの分子種は３０種類である。なおエタノールアミン型プラスマローゲンの分子種のｓｎ−１位の側鎖、及びｓｎ−２位の側鎖も同様であり、生体内の主要なエタノールアミン型プラスマローゲンの分子種も３０種類である。また、すべてのコリン型プラスマローゲンの分子種の濃度を合計することによって、被検試料中の総ＣＰ量を求めることもできる。
また、本明細書において、ｓｎ−１位の側鎖は、「−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ^１」を意味し、側鎖に含まれる炭素数と二重結合の表記については、例えば「１６：１」と記載した場合は、側鎖に含まれる炭素数が１６であり、ビニルエーテル結合を除いた二重結合が１であることを示す。また、ｓｎ−２位の側鎖は、「−ＣＯ−Ｒ^２」を意味し、側鎖に含まれる炭素数と二重結合の表記については、例えば「２０：４」と記載した場合は、側鎖に含まれる炭素数が２４であり、二重結合が４であることを示す。

《総ＣＰ量によるメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出》
前記総ＣＰ量の測定方法によって得られた総ＣＰ量の測定値は、後述の実施例に示すように、体重（相関係数：−０．３３４）、腹囲（相関係数：−０．３７５）、中性脂肪（相関係数：−０．３２７）、ＨＤＬ−Ｃ（相関係数：０．７１４）、ｓｄＬＤＬ（相関係数：−０．２２４）、ＡＩＰ（相関係数：−０．５７６）、及びアディポネクチン（相関係数：０．３１４）と高い相関性を示す（表３及び表４）。
また、総ＣＰ量は、健常者群では６５．９μＭであるのに対して、メタボリックシンドローム群では５６．５μＭであり、メタボリックシンドローム群で有意に低いことがわかる（表５）。

《ＣＰの分子種の濃度によるメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出》
本発明の検出方法においては、総ＣＰ量以外にＣＰのそれぞれの分子種の濃度を用いることができる。例えば、ｓｎ−１位及びｓｎ−２位の側鎖の違いにより３０種類のＣＰの分子種ごとの濃度を用いることもでき、ｓｎ−１位の側鎖の違いにより３種類の分子種ごとの濃度を用いることもでき、またｓｎ−２位の側鎖の違いにより、１０種類のＣＰの分子種ごとの濃度を用いることもできるが、ｓｎ−２位にオレイン酸を有するコリン型プラスマローゲン（以下、Ｃ１８：１ＣＰと称することがある）又はｓｎ−２位にリノール酸を有するコリン型プラスマローゲン（以下、Ｃ１８：２ＣＰと称することがある）の濃度を用いることが好ましく、特に好ましくはＣ１８：１ＣＰの濃度を用いる。

前記Ｃ１８：１ＣＰの濃度の測定値は、実施例に示すように、体重（相関係数：−０．４３８）、腹囲（相関係数：−０．４６１）、中性脂肪（相関係数：−０．４１５）、ＨＤＬ−Ｃ（相関係数：０．７５７）、ｓｄＬＤＬ（相関係数：−０．３１９）、ＡＩＰ（相関係数：−０．６４１）、及びアディポネクチン（相関係数：０．４４６）と高い相関性を示す（表４）。またＣ１８：１ＣＰの濃度は、健常者群では６．３μＭであるのに対して、メタボリックシンドローム群では４．８μＭであり、メタボリックシンドローム群で有意に低いことがわかる（表５）。

《ＣＰの濃度及びリン脂質濃度の比による検出》
本発明の検出方法の別の態様においては、被検試料中のコリン型プラスマローゲン濃度の測定値と、被検試料中のリン脂質濃度の測定値との比によって、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出をすることができる。コリン型プラスマローゲン濃度は、総ＣＰ量、ＣＰの分子種の濃度のいずれも用いることができるが、好ましくは、Ｃ１８：１ＣＰ又はＣ１８：２ＣＰの濃度である。
また、コリン型プラスマローゲン濃度の測定値と、被検試料中のリン脂質濃度の測定値との比の計算方法は特に限定されるものではないが、例えば「ＣＰの濃度／リン脂質濃度」によって計算することができる。この計算方法の場合、リン脂質中の総コリン型プラスマローゲン濃度、又はリン脂質中のＣＰの分子種の濃度を意味している。

なお、被検試料中の全リン脂質を測定する方法については、定法に従うことができ、例えば、抽出脂質を灰化処理して生成するリン量についてリンモリブデン反応などを用いて定量する方法、又はＨＰＬＣ法、あるいはコリンオキシダーゼ・ＤＡＯＳ法（リン脂質Ｃ−テストワコーなどのキット）で測定する方法などで行うことができる。

《ＣＰの濃度及び被検者の体重の比による検出》
本発明の検出方法の別の態様においては、被検試料中のコリン型プラスマローゲン濃度の測定値と、被検者の体重の測定値との比によって、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出をすることができる。コリン型プラスマローゲン濃度は、総ＣＰ量、ＣＰの分子種の濃度のいずれも用いることができるが、好ましくは、Ｃ１８：１ＣＰ又はＣ１８：２ＣＰの濃度である。
また、コリン型プラスマローゲン濃度の測定値と、被検者の体重の測定値との比の計算方法は特に限定されるものではないが、例えば「ＣＰの濃度／被検者の体重（ｋｇ）」によって計算することができる。この計算方法の場合、体重１ｋｇあたりのコリン型プラスマローゲン濃度の値を意味している。また、被験者の体重の測定方法については、定法に従うことができる。

《ＣＰの濃度及び中性脂肪の濃度の比による検出》
本発明の検出方法の別の態様においては、被検試料中のコリン型プラスマローゲン濃度の測定値と、中性脂肪の濃度の測定値との比によって、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出をすることができる。コリン型プラスマローゲン濃度は、総ＣＰ量、ＣＰの分子種の濃度のいずれも用いることができるが、好ましくは、Ｃ１８：１ＣＰ又はＣ１８：２ＣＰの濃度である。
また、コリン型プラスマローゲン濃度の測定値と、中性脂肪の濃度の測定値との比の計算方法は特に限定されるものではないが、例えば「ＣＰの濃度／中性脂肪の濃度」によって計算することができる。被検試料の中性脂肪含量を測定する方法については、定法に従うことができる。

前記ＣＰの濃度及びリン脂質濃度の比による検出、ＣＰの濃度及び被検者の体重の比による検出、及びＣＰの濃度及び中性脂肪の濃度の比による検出は、いずれも体重、腹囲、中性脂肪、ＨＤＬ−Ｃ、ｓｄＬＤＬ、ＡＩＰ、及びアディポネクチンと高い相関性を示し（表３及び表４）、健常者群とメタボリックシンドローム群とで有意に異なるものであるが、特にはＣＰの濃度及び中性脂肪の濃度の比、ＣＰの濃度及び被検者の体重の比、及びＣＰの濃度及びリン脂質濃度の比の順番で、有意である傾向が見られた。

本発明の検出方法においては、被検試料中のコリン型プラスマローゲン濃度（又はコリン型プラスマローゲンの分子種の濃度）を測定し、その測定値を健常者の被検試料中のコリン型プラスマローゲン濃度の測定値から設定した基準値と比較することによって、メタボリックシンドローム又は生活習慣病を検出することが可能である。健常者の基準値、或いはメタボリックシンドローム又は生活習慣病のカットオフ値の設定は、管理された臨床治験によって決定される。
本発明の検出方法は、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の発症予防用、又は治療効果のモニタリング用として用いることができる。また、メタボリックシンドローム又は生活習慣病リスク又は重篤度の指標として用いることが可能である。特に、中性脂肪、ｓｄＬＤＬ、及びＡＩＰが高値であることは、動脈硬化症の原因であり、ＨＤＬ−Ｃ、アディポネクチンは低値であることが、動脈硬化症の発症の原因である。本発明の検出方法によって得られたコリン型プラスマローゲン濃度、コリン型プラスマローゲンの分子種の濃度、ＣＰの濃度及びリン脂質濃度の比、ＣＰの濃度及び被検者の体重の比、及びＣＰの濃度及び中性脂肪の濃度の比は、中性脂肪、ＨＤＬ−Ｃ、ｓｄＬＤＬ、アディポネクチン、及びＡＩＰと相関性が高く、動脈硬化症の発症予防又は動脈硬化症のリスクのマーカーとして用いることが可能である。

《生活習慣病》
本発明の方法により検出される生活習慣病は、食事、睡眠、又は嗜好品（例えば、タバコ、又はお酒）などの生活習慣を主な原因とする疾患であれば限定されるものではないが、糖尿病、脂質異常症（高脂血症）、高血圧症、肥満症、がん、脳卒中、動脈硬化症、心筋症、心筋梗塞、不整脈、脂肪肝、アルコール性肝障害、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胆石症、歯周病、通風、抗尿酸血症、及び骨粗しょう症を挙げることができる。本発明の検出方法によれば、特に脂質異常症、高血圧症及び動脈硬化症を、高率に検出することができる。

《メタボリックシンドローム》
本発明の方法により検出されるメタボリックシンドロームは、ウエスト周囲径が男性で８５ｃｍ、女性で９０ｃｍ以上を「要注意」とし、その中で（１）血清脂質異常（トリグリセリド値１５０ｍｇ／ｄＬ以上、又はＨＤＬコレステロール値４０ｍｇ／ｄＬ未満）（２）血圧高値（最高血圧１３０ｍｍＨｇ以上、又は最低血圧８５ｍｍＨｇ以上）（３）高血糖（空腹時血糖値１１０ｍｇ／ｄＬ）の３項目のうち２つ以上を有する被験者の症状を意味する。

［２］メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出キット
本発明のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出キットは、プラスマローゲンの分析用内部標準物質として、下記一般式（１）

（式中、Ｒ^３は、炭素数４〜２６のアルキル基又はアルケニル基であり、Ｍは水素原子又は対カチオンである）で表される１−アルケニル環状ホスファチジン酸、又は
下記一般式（２）

（式中、Ｒ^１は、炭素数７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２１のアルキル基であり、Ｒ^２は、炭素数８〜２１のアルキル基又はアルケニル基である）で表される化合物を含む。

本発明のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出キットは、本発明のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法に用いることができる。従って、前記キットには、被検試料からプラスマローゲンを抽出する抽出試薬を含むことができる。例えば、抽出試薬としては、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法に用いる抽出試薬、Ｆｏｌｃｈ法に用いる抽出試薬、ヘキサン／エタノール混合溶媒、エーテル／エタノール混合溶媒、又はクロロホルム／メタノール混合溶媒を挙げることができる。また、本発明のキットにはメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出用であることを明記した取り扱い説明書を含むことができる。包装容器にメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出用であることを明記することもできる。また、本発明の検出キットは、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の診断に用いることができる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１》
２１〜６６歳の被験者４５１人（男性３８２人、女性６９人、平均年齢３９．６歳、４０歳以上２１６人）の血液から分画した血清を用意した。その一部から脂質を抽出してＣＰを定量した。また、その一部を用い、リン脂質Ｃ−テストワコーによりリン脂質濃度を測定した。

まず、ＣＰ量の定量方法についてはＨＰＬＣを用いた定量法により、以下の方法で行った。

血清（Serum）からの総脂質の抽出は、以下のようにして行った。血液を遠心分離して得た血清０．１５ｍＬに、エーテル０．１２ｍＬ、及びエタノール０．３６ｍＬを添加し、１０分間混合した。２Ｍ塩化ナトリウム水溶液０．９ｍＬ、エーテル０．４８ｍＬを添加し、５分間混合した。３０００ｒｐｍ、１５分遠心後、上層を採取した。下層に更にエーテル０．３ｍＬを添加し、５分間混合した。３０００ｒｐｍ、１５分遠心後、上層を採取した。採取液を合わせ、窒素吹き付けにより溶媒を留去した後、内部標準物質（ｃＡＰ）０．１ｍＭを含むメタノール０．１ｍＬに溶解した。

内部標準物質であるｃＡＰは、以下のようにして調製した。リゾコリンプラスマローゲン（Doosan Serdary Reseach Laboratories、クロロホルム溶解）約５ｍｇを５０ｍＬねじ口試験管に採取した。クロロホルムを窒素吹き付けで乾固し、直ちに、エーテル１．５ｍＬ、１００ｍＭ酢酸ナトリウム−４０ｍＭ塩化カルシウム緩衝液（ｐＨ５．６）１．５ｍＬ、ホスホリパーゼＤ（名糖産業）１０Ｕを添加した後、攪拌しながら、４０℃の温浴で反応させた。３時間程度反応後、ＴＬＣにより、ほとんどのリゾプラスマローゲンが消失したことを確認した。反応液に窒素を吹き付け、エーテルを一度留去した後、再度エーテル１．２ｍＬ、及びエタノール３．６ｍＬを添加し、１０分間混合した。２Ｍ塩化ナトリウム水溶液９．０ｍＬ、エーテル４．８ｍＬを添加し、５分間混合する。３０００ｒｐｍ、１５分遠心後、上層を採取した。下層に更にエーテル３．０ｍＬを添加し、５分間混合する。３０００ｒｐｍ、１５分遠心後、上層を採取した。採取液を合わせ、窒素吹き付けにより溶媒を留去した後、適量のメタノールに溶解して０．１ｍＭとした。

三ヨウ化物イオン（Ｉ^３−）を含む反応試薬は以下のようにして調製した。市販の放射性ヨウ素（Ｎａ^１２５Ｉ、３７ＭＢｑ／０．０１ｍＬ）、５０ｍＭ水酸化ナトリウム−２０ｍＭヨウ化カリウム−メタノール溶液１．０ｍＬ、２．０Ｍ酢酸−メタノール溶液０．３ｍＬ、１．０Ｍ過酸化水素−メタノール溶液０．６ｍＬ、メタノール０．１ｍＬを混合し、室温で一晩静置した。これを１０ｍＭヨウ素反応試薬とし、室温で保存して用いた。

各血清抽出脂質試料０．０４ｍＬと１０ｍＭヨウ素反応試薬０．０１ｍＬとを混合し、４℃で１６時間反応させた。反応試料（サンプル）０．０２ｍＬ（内部標準物質としてｃＡＰを１．７４ｎｍｏＬ含む）を以下の条件でＨＰＬＣに供した。溶出液はアセトニトリル／水／酢酸／アンモニア（９３：６．８９５：０．０７：０．０３５）を用い、流速１．０ｍＬ／分、イソクラチックで溶出した。カラムはＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ１００ Ｄｉｏｌ ２５０−４（Ｍｅｒｃｋ）を用いた。測定時間は１５分以上で行った。検出器はフロー型γカウンタ（ＢＩＯＳＣＡＮ）を用いた。

データ解析にはＳＭＡＲＴＣＨＲＯＭ（ＫＹＡテクノロジーズ）を用い、ＣＰとｃＡＰのピーク面積値を予め作成した検量線により換算定量した。検量線は、メタノール溶液中でヨウ素分子がプラスマローゲンのビニルエーテル結合に特異的に結合することを利用して、その吸光度変化から定量する方法により定量した値と上記測定に供して得たピーク面積値とから作成した。

なお、まず定量試験を４回行い、内部標準を使用した効果の検証を行った。
血清０．０１５ｍＬを０．０２０ｍＬに変更した以外は上述の総脂質の抽出方法にしたがい血清抽出試料を得た後、同様にヨウ素反応試薬との反応を行い、得られた反応試料（サンプル）をＨＰＬＣに供した。ここで、反応試料（サンプル）０．０２ｍＬ中に含まれるｃＡＰ含量（Ａ）と、測定されたｃＡＰ含量（Ｂ）から、補正係数＝（Ａ）／（Ｂ）の値を求め、測定されたＣＰ含量にこの補正係数を乗じた値とを算出し、４回測定分の標準偏差と変動係数について、表１に記載した。なお、ＣＰ含量に内部標準物質を使用しない場合、すなわち、補正係数を乗じない場合についても４回測定分の標準偏差と変動係数を算出し、同様に表１に記載した。
また、ＥＰ含量についても同様に測定し、結果を表１に記載した。

表１の結果からわかるように、内部標準物質としてｃＡＰを使用して測定した測定値は、使用しない測定値に比べて標準偏差及び変動係数が顕著に小さく、血清中のプラスマローゲンの測定方法として優れていることがわかる。
このため、ＣＰ量の測定については、このｃＡＰを内部標準として使用することとした。

《実施例２》
本実施例では、実施例１の２１〜６６歳の被験者４５１人（男性３８２人、女性６９人、平均年齢３９．６歳、４０歳以上２１６人）の血清を用いコリン型プラスマローゲンの分子種の測定を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて行った。
血清（Serum）からの総脂質の抽出は、以下のようにして行った。血液を遠心分離して得た血清０．１５ｍＬを凍結乾燥し、内部標準物質として、ｓｎ−１位がトリコサン酸、ｓｎ−２位がオレイン酸の合成コリン型プラスマローゲン（ｐ２３：０／１８：１）５０ｐｍｏＬを含むクロロホルム：メタノール＝２：１の混液０．５ｍＬを加え、１０分間混合後、３０分間室温で放置した。３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離後、上層を採取した。下層に更にクロロホルム：メタノール＝２：１の混液を１ｍＬ加え、混合・放置後、遠心分離を行い、上層を採取し、先の採取液と合わせ、窒素の吹きつけにより、溶媒を除去後、１ｍＬのメタノールに溶解し、フィルターを通したあと、適宜メタノールで希釈したのち、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて解析した。

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定条件は以下のとおりである。
＜ＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）の条件＞
ＬＣ システム：Ａｃｃｅｌａ ＵＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ
溶離液Ａ：５ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
溶離液Ｂ：アセトニトリル
カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ８（２．１×１００ｍｍ，１．７μｍ）
カラム温度：６０℃
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＨＰＬＣの溶離液の条件を表２に示す。

＜ＭＳ／ＭＳ（タンデム質量分析）の条件＞
ＭＳシステム：ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ ｓｙｓｔｅｍ
イオン化モード：ＨｅａｔｅｄＥＳＩ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ
キャピラリー電圧：３．２ｋＶ
コーン電圧：３５Ｖ
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ温度：４００℃
Ｓｏｕｒｃｅ温度：８０℃
衝突エネルギー：３２ｅＶ（コリン型プラスマローゲン）

なお、被検試料中のコリン型プラスマローゲンの定量を行うための検量線の作成は、以下のように行った。合成したｐ１６：０／２０：４の合成コリン型プラスマローゲンを、メタノールに溶解し、標準原液（１．７μｍｏｌ／ｍＬ）を調製した。前記標準原液をメタノールで希釈し、０．０８５ｐｍｏｌ、０．１７ｐｍｏｌ、０．３４ｐｍｏｌ、及び０．５１ｐｍｏｌの４種類の濃度の標準溶液を調製した。次に、それぞれの標準溶液に、合成したｐ２３：０／１８：１を１００ｐｍｏｌ添加した。それぞれの標準溶液を、前記のＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定条件に従って解析した。得られたそれぞれの標準溶液中のｐ１６：０／２０：４と、ｐ２３：０／１８：１とのコリンリン酸由来フラグメント（一般式（５）のコリンリン酸フラグメント）の面積比（ｐｅａｋ ａｒｅａ ｒａｔｉｏ）を計算し、検量線を作成した。この検量線を用いてヒトの血漿試料中のコリン型プラスマローゲンの定量を行った。

また、内部標準物質として、前記ｓｎ−１位がトリコサン酸、ｓｎ−２位がオレイン酸の合成コリン型プラスマローゲン（ｐ２３：０／１８：１）を用いた場合、内部標準物質としてコール酸を用いた場合、及び外部標準法を用いた場合において、血清試料中のコリン型プラスマローゲンの平均値及び標準偏差を比較した。その結果、内部標準として合成コリン型プラスマローゲン（ｐ２３：０／１８：１）を用いた場合は、外部標準を用いたもの及びコール酸を内部標準として用いたものと比較すると、数値が高く、ばらつき（標準偏差）も小さく、内部標準物質としてプラスマローゲンを使用し、補正した数値の精度が高かった。

コリン型プラスマローゲンの分子種は、ｓｎ−１位が１６：０、１８：０、又は１８：１の３種類、ｓｎ−２位が１６：０、１８：０、１８：１、１８：２、１８：３、２０：４、２０：５、２２：４、２２：５、又は２２：６の１０種類であり、従って、測定したコリン型プラスマローゲンの分子種は３０種類である。これらの分子種のうち、ｓｎ−２位が１８：１（オレイン酸）のもの及び１８：２（リノール酸）について、表４にデータを示した。

《実施例３》
一方、上記被験者４５１人について、年齢、性、身長、体重、ＢＭＩ、腹囲、血圧、ＧＯＴ、ＧＰＴ、γ−ＧＴＰ、尿酸、中性脂肪、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、血糖値、アディポネクチン、ｓｄＬＤＬ、ｈｓＣＲＰ、ＡＩＰなどの検査項目の測定・計算を行い、血清プラスマローゲン量、ＣＰ量、ＥＰ量、ＣＰ／ＰＬ（リン脂質）、ＣＰ／体重、ＣＰ／中性脂肪、ＣＰ／ＥＰと各項目間での相関性が調べられた。

上記のうち、体重、腹囲、中性脂肪、ＨＤＬ−Ｃ、ｓｄＬＤＬ、アディポネクチン、ＡＩＰの検査項目と、ＣＰ量、ＣＰ／ＰＬ、ＣＰ／体重、ＣＰ／中性脂肪、ＣＰ／ＥＰの各値との相関性について表３に記載した。

また、体重、腹囲、中性脂肪、ＨＤＬ−Ｃ、ｓｄＬＤＬ、アディポネクチン、及びＡＩＰの検査項目と、ＣＰ量、Ｃ１８：１ＣＰ、Ｃ１８：１ＣＰ／ＰＬ、Ｃ１８：１ＣＰ／中性脂肪、Ｃ１８：１ＣＰ／体重、Ｃ１８：２ＣＰ、Ｃ１８：２ＣＰ／ＰＬ、Ｃ１８：２ＣＰ／中性脂肪、Ｃ１８：２ＣＰ／体重、及びＣＰ／ＥＰの各値との相関性について表４に記載した。

上記の結果、まずＣＰ量について、動脈硬化症の危険因子とされる各検査項目と高い相関性がみられた。例えば、体重に対する相関係数について−０．３３４、腹囲に対する相関係数について−０．３７５、中性脂肪に対する相関係数について−０．３２７、ＨＤＬ−Ｃに対する相関係数について０．７１４、ｓｄＬＤＬに対する相関係数について−０．２２４、ＡＩＰに対する相関係数について−０．５７６、アディポネクチンに対する相関係数について０．３１４であった。

また、全リン脂質量と全ＣＰ量との比（以下ＣＰ／ＰＬ）は、全ＣＰ量のみよりもそれらの因子と高い相関を示すことを見出した。例えば、体重に対する相関係数について−０．３７４、腹囲に対する相関係数について−０．４０８、中性脂肪に対する相関係数について−０．５４２、ｓｄＬＤＬに対する相関係数について−０．４５８、ＡＩＰに対する相関係数について−０．６７４、アディポネクチンに対する相関係数について０．３１９であった。

更に、一般検診の項目に必ずある体重、中性脂肪と全ＣＰ量との比も全ＣＰ量のみよりもそれらの因子と高い相関を示すことを見出した。例えば、ＣＰ／体重は、腹囲に対する相関係数について−０．６７２、中性脂肪に対する相関係数について−０．３９８、ＨＤＬ−Ｃに対する相関係数について０．７３２、ｓｄＬＤＬに対する相関係数について−０．３４７、ＡＩＰに対する相関係数について−０．６３１、アディポネクチンに対する相関係数について０．４１３であった。ＣＰ／中性脂肪は、体重に対する相関係数について−０．４０６腹囲に対する相関係数について−０．４５２、ｓｄＬＤＬに対する相関係数について−０．５４４、アディポネクチンに対する相関係数について０．３５８であった。

次に、ＣＰ分子種の分析の結果、２位の脂肪酸がオレイン酸（Ｃ１８：１ＣＰ）、又はリノール酸（Ｃ１８：２ＣＰ）である場合、ＣＰ量のみよりも上記の検査項目中の動脈硬化症及びメタボリックシンドローム関連因子と高い相関を示すことを見出した。例えば、Ｃ１８：１ＣＰは、体重に対する相関係数について−０．４３８、腹囲に対する相関係数について−０．４６１、ＨＤＬ−Ｃに対する相関係数について０．７５７、中性脂肪に対する相関係数について−０．４１５、ｓｄＬＤＬに対する相関係数について−０．３１９、アディポネクチン対する相関係数について０．４４６、ＡＩＰに対する相関係数について−０．６４１であった。

更にＣＰ１８：１／ＰＬは、ＣＰ量のみよりもそれらの因子と高い相関を示すことを見出した。例えば、体重に対する相関係数について−０．４６３、腹囲に対する相関係数について−０．４７９、中性脂肪に対する相関係数について−０．５７２、ｓｄＬＤＬに対する相関係数について−０．５００、アディポネクチン対する相関係数について、０．４５３、ＡＩＰに対する相関係数について、−０．７１５であった。

また、一般検診の項目に必ずある体重、中性脂肪と全ＣＰ１８：１量との比は、総ＣＰ量のみとの比よりも上記の検査項目中の動脈硬化症及びメタボリックシンドローム関連因子と高い相関を示すことを見出した。例えば、ＣＰ１８：１／中性脂肪と、腹囲に対する相関係数は−０．４７７、ｓｄＬＤＬに対する相関係数は−０．５４４、体重に対する相関係数は−０．４４３、アディポネクチンに対する相関係数は０．４０８であった。ＣＰ１８：１／体重は、ＨＤＬ−Ｃに対する相関係数は０．７３１、腹囲に対する相関係数は−０．６６６、ＡＩＰに対する相関係数は−０．６４１、アディポネクチンに対する相関係数は０．４７４であり、いずれも総ＣＰ量を用いた相関よりはるかに高い相関係数を得た。

また、Ｃ１８：２ＣＰも、Ｃ１８：１ＣＰに匹敵する相関係数を示す。例えば、体重に対する相関係数について−０．３３４、腹囲に対する相関係数について−０．４０７、ＨＤＬ−Ｃに対する相関係数について０．６５１、中性脂肪に対する相関係数について−０．３３９、ｓｄＬＤＬに対する相関係数について−０．２６５、アディポネクチン対する相関係数について０．３７１、ＡＩＰに対する相関係数について−０．５６２であった。

更にＣＰ１８：２／ＰＬは、ＣＰ１８：２量のみよりもそれらの因子と高い相関を示すことを見出した。例えば、体重に対する相関係数について−０．３６１、腹囲に対する相関係数について−０．４２３、中性脂肪に対する相関係数について−０．５０８、ｓｄＬＤＬに対する相関係数について−０．４４４、ＡＩＰに対する相関係数について、−０．６３４であった。

また、一般検診の項目に必ずある体重、中性脂肪と全ＣＰ１８：１量との比は、総ＣＰ量のみとの比よりも上記の検査項目中の動脈硬化症及びメタボリックシンドローム関連因子と高い相関を示すことを見出した。例えば、ＣＰ１８：２／中性脂肪と、腹囲に対する相関係数は−０．４９６、ｓｄＬＤＬに対する相関係数は−０．４９２、体重に対する相関係数は−０．４５４、アディポネクチンに対する相関係数は０．３９１であった。ＣＰ１８：２／体重は、腹囲に対する相関係数は−０．６１１、アディポネクチンに対する相関係数は０．４３５であり、いずれも総ＣＰ量を用いた相関よりはるかに高い相関係数を得た。

《実施例４》
実施例１の被験者４５１人のうち、メタボリックシンドローム診査対象者である４０歳以上の被験者１５６人を、メタボリックシンドロームの判定基準に従い、ウエスト周囲径が男性で８５ｃｍ、女性で９０ｃｍ以上を「要注意」とし、その中で（１）血清脂質異常（トリグリセリド値１５０ｍｇ／ｄＬ以上、又はＨＤＬコレステロール値４０ｍｇ／ｄＬ未満）（２）血圧高値（最高血圧１３０ｍｍＨｇ以上、又は最低血圧８５ｍｍＨｇ以上）（３）高血糖（空腹時血糖値１１０ｍｇ／ｄＬ）の３項目のうち２つ以上を有する被験者を「メタボ群」、３項目のうち１項目を有する被験者は「準メタボ群」とし、残余を「健常者群」とした。
この３群の、血清プラスマローゲン量、ＣＰ量、ＥＰ量、ＣＰ／ＰＬ（リン脂質）、ＣＰ／体重、ＣＰ／中性脂肪、ＣＰ／ＥＰ、Ｃ１８：１ＣＰ量、Ｃ１８：１ＣＰ／ＰＬ（リン脂質）、Ｃ１８：１ＣＰ／中性脂肪、Ｃ１８：１ＣＰ／体重、Ｃ１８：２ＣＰ量、Ｃ１８：２ＣＰ／ＰＬ（リン脂質）、Ｃ１８：２ＣＰ／中性脂肪、Ｃ１８：２ＣＰ／体重について、それぞれの平均値を表５に記載した。
なお、血清プラスマローゲンのｓｎ−２位の主要脂肪酸はＣ２０：４（アラキドン酸）であったことから、Ｃ２０：４ＣＰ量、Ｃ２０：４ＣＰ／ＰＬ（リン脂質）、Ｃ２０：４ＣＰ／中性脂肪、Ｃ２０：４ＣＰ／体重についても測定・算出し、更に、健常者群を１とした場合の上記指標の相対値を表６に記載した。
なお、血清プラスマローゲン中のｓｎ−２位のＣ２０：４は３３．８％、Ｃ１８：２は２０．８％、Ｃ１８：１は６．４％であった。

上記の結果、血清プラスマローゲン量、ＥＰ量は、３群ともほとんど差が見られなかったのに対し、その他のマーカーでは、３群の間で有意な差異が見られた。更に、ＣＰ量に関連した値に比べ、Ｃ１８：１ＣＰ量又はＣ１８：２ＣＰ量に関連した値のほうが、特にＣ１８：１ＣＰ量に関連した値が、より大きな差が見られた。また、リン脂質含量との比、体重との比、中性脂肪との比の順により明確な差が見られた。なお、ＣＰ／ＥＰについては、メタボ群の値では他のマーカーと同様の健常者群との差がみられるが、準メタボ群の値は健常者群との差が小さく、メタボリックシンドロームの兆候を予見するには、他のマーカーに比べて劣っていることがわかる。
また２位の脂肪酸として、血清プラスマローゲンの主要構成脂肪酸であるＣ２０：４を含むＣ２０：４ＣＰに関連した値に比べ、Ｃ１８：１ＣＰ又はＣ１８：２ＣＰに関連した値のほうが、特にＣ１８：１ＣＰに関連した値が、（Ｂ）／（Ａ）の値が顕著に小さく、すなわち、健常者群とメタボ群との差異が大きいことがわかる。

本発明のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法、及び検出キットは、健康診断等において、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出マーカーとして用いることができる。

Claims (7)

1. 被検試料中のｓｎ−２位にオレイン酸を有するコリン型プラスマローゲン、又はｓｎ−２位にリノール酸を有するコリン型プラスマローゲン濃度を測定する工程を含むことを特徴とする、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法。
2. 被検試料中のリン脂質濃度、中性脂肪濃度、及び被検者の体重からなる群から選択される値を測定する工程、及び
   前記コリン型プラスマローゲン濃度の測定値と、前記被検試料中のリン脂質濃度の測定値、被検試料中の中性脂肪濃度の測定値、又は被検者の体重の測定値との比を計算する工程、
   を更に含む、請求項１に記載のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法。
3. 前記生活習慣病が、脂質異常症、高血圧症及び動脈硬化症からなる群から選択される、請求項１又は２に記載のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法。
4. メタボリックシンドローム又は生活習慣病の、発症予防用又は治療効果のモニタリング用である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法。
5. プラスマローゲンの分析用内部標準物質として、
   下記一般式（１）
   

   

   （式中、Ｒ^３は、炭素数４〜２６のアルキル基又はアルケニル基であり、Ｍは水素原子又は対カチオンである）で表される１−アルケニル環状ホスファチジン酸、及び
   一般式（２）
   

   

   （式中、Ｒ^１は、炭素数７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２１のアルキル基であり、Ｒ^２は、炭素数８〜２１のアルキル基又はアルケニル基である）で表される化合物、
   からなる群から選択される化合物の少なくとも１つを用いる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法。
6. プラスマローゲンの分析用内部標準物質として、下記一般式（１）
   

   

   （式中、Ｒ^３は、炭素数４〜２６のアルキル基又はアルケニル基であり、Ｍは水素原子又は対カチオンである）で表される１−アルケニル環状ホスファチジン酸、を含むことを特徴とする、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出キット。
7. プラスマローゲンの分析用内部標準物質として、一般式（２）
   

   

   （式中、Ｒ^１は、炭素数７、９、１１、１３、１５、１７、１９、又は２１のアルキル基であり、Ｒ^２は、炭素数８〜２１のアルキル基又はアルケニル基である）
   で表される化合物を含むことを特徴とする、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出キット。