JP5662060B2 - 検出方法 - Google Patents
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Description
sdLDLは、中性脂肪を高含有するLDLであり、通常のLDLよりも粒子サイズが小さい。LDLよりも酸化されやすく、動脈硬化惹起性が高いとされている。アポリポ蛋白質Aは、HDLを構成する蛋白質であり、細胞内からコレステロールの排出を促進する。アディポネクチンは、脂肪細胞から分泌されるホルモンであり、インスリン感受性の亢進、動脈硬化抑制、及び抗炎症の作用があるとされる。また、血中濃度は内臓脂肪量に負の相関がある。CRPは、体内の炎症反応が生じる際に生成される蛋白質であり、慢性の血管炎症という側面を持つ動脈硬化のマーカーとして注目されている。AIPは、血清中性脂肪量とHDL−C量から計算される〔log(中性脂肪/HDL−C量)〕血漿(Plasma)動脈硬化指標である。
また、動脈硬化の発症原因に最も寄与するのは、LDLの酸化であると言われている。コレステロールの代謝や輸送の異常により酸化されたLDLは、マクロファージの泡沫化を招き、また、好中球からのスーパーオキシド産生を誘起させることにより、血管内皮下での更なる脂質過酸化や脂質の蓄積などを引き起こし、疾病の進展を促す。従って、LDLの酸化の抑制が動脈硬化の発症の抑制に極めて有効である。
血漿中のプラスマローゲン濃度は0.1〜0.3mMで、その約40%がCP、約60%がEPである。つまり、コリングリセロリン脂質の約5%、エタノールアミングリセロリン脂質の約60%がプラスマローゲンである。その他の塩基を持つプラスマローゲンは血中にはほとんど存在しない。
この理由は、特許文献1及び非特許文献1では、血清(Serum)中プラスマローゲン濃度を測定する検査法として、抽出脂質に三ヨウ化物イオンを反応させて脂質成分中のプラスマローゲンに放射性ヨウ素を特異的に結合させ、それをクロマトグラフィーの手法によりCPとEPとに分別して定量する方法によっているため、放射性ヨウ素を用いた場合の減衰率の影響などの点で充分な精度ではなかったことが、1つの原因であると思われる。
更に、特許文献1及び非特許文献1のプラスマローゲン測定方法では、内部標準物質を用いていないために、測定間、測定日間、又は測定者間のバラツキがあり、十分な相関が得られなかった可能性が考えられる。
更に、全CP量と体重(以下、「CP/体重」と称する)との比、又は全CP量と中性脂肪との比(以下、「CP/中性脂肪」と称する)も、全CP量のみよりも前記の動脈硬化症関連因子と高い相関を示すことを見出した。
前記の測定項目は、特許文献1に示されたマーカーであるCP/EPよりも各項目間の相関係数が高く、より多くの項目と相関すること、特に、肥満症の関連因子である腹囲、アディポネクチンとの相関もあることから、これらが脂質代謝異常全般を反映するマーカーとして有効性が高いことがわかった。
[1]被検試料中のコリン型プラスマローゲン濃度を測定する工程を含むことを特徴とする、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法、
[2]前記コリン型プラスマローゲン濃度が、sn−2位にオレイン酸を有するコリン型プラスマローゲン、又はsn−2位にリノール酸を有するコリン型プラスマローゲンの濃度である、[1]に記載のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法、
[3]被検試料中のリン脂質濃度、中性脂肪濃度、及び被検者の体重からなる群から選択される値を測定する工程、及び前記コリン型プラスマローゲン濃度の測定値と、前記被検試料中のリン脂質濃度の測定値、被検試料中の中性脂肪濃度の測定値、又は被検者の体重の測定値との比を計算する工程、を更に含む、[1]又は[2]に記載のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法、
[4]前記生活習慣病が、脂質異常症、高血圧症及び動脈硬化症からなる群から選択される、[1]〜[3]のいずれかに記載のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法、
[5]メタボリックシンドローム又は生活習慣病の、発症予防用又は治療効果のモニタリング用である、[1]〜[3]のいずれかに記載のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法、
[6]プラスマローゲンの分析用内部標準物質として、
下記一般式(1)
一般式(2)
[7]プラスマローゲンの分析用内部標準物質として、前記一般式(1)で表される1−アルケニル環状ホスファチジン酸、を含むことを特徴とする、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出キット、及び
[8]プラスマローゲンの分析用内部標準物質として、前記一般式(2)で表される化合物を含むことを特徴とする、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出キット、
に関する。
従って、本発明の検出方法又は検出キットは、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の、リスク又は重篤度を、従来に比べ、より正確に診断することができ、本発明により見出されたマーカーは、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の、リスク又は重篤度を、従来のマーカーに比べ、より正確に示している。
本発明のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法は、被検試料中のコリン型プラスマローゲン濃度を測定する工程を含む。
本発明者らは、新規な内部標準物質として、1−アルケニル環状ホスファチジン酸〔1−alk−1’−enyl−sn−glycerol−2,3−cyclic phosphate(以下、cAPと称することがある)〕、又は合成コリン型プラスマローゲンを用いることで、コリン型プラスマローゲンの正確な含有量の測定が可能となることを見出した。以下に、本発明の検出方法において内部標準物質として用いることのできる1−アルケニル環状ホスファチジン酸、及び合成コリン型プラスマローゲンについて説明する。
(1−アルケニル環状ホスファチジン酸)
本発明の検出方法において、内部標準物質として用いることのできる1−アルケニル環状ホスファチジン酸(cAP)は、下記一般式(1)
で表される化合物である。
前記cAPは、内部標準物質として、後述の総CP量の測定方法において使用することができる。
発明の検出方法において、内部標準物質として用いることのできる合成コリン型プラスマローゲンは、下記一般式(2)
本発明の検出方法におけるプラスマローゲン濃度の測定では、まず被検試料からプラスマローゲンの抽出を行う。被検試料からのプラスマローゲンの抽出方法は、リン脂質を回収できる方法であれば特に限定されるものではなく、Bligh&Dyer法、Folch法、ヘキサン/エタノール混合溶媒を用いる方法、エーテル/エタノール混合溶媒を用いる方法、又は被検試料を凍結乾燥させてクロロホルム/メタノール混合溶媒などの溶媒で抽出する方法を挙げることができる。これらの抽出方法において、Bligh&Dyer法は操作が煩雑であること、ヘキサン/エタノール混合溶媒を用いる方法は回収率が低いことから、エーテル/エタノール混合溶媒を用いる方法、又は凍結乾燥させてクロロホルム/メタノール混合溶媒などの溶媒で抽出する方法が好ましい。また、特に、後述の放射性ヨウ素反応試薬を用い、HPLCで分析する方法においては、凍結乾燥試料を用いた方法は水溶性夾雑物が混入することがあり、エーテル/エタノール混合溶媒を用いる方法が好ましい。
エーテル/エタノール混合溶媒を用いる方法とは、被検試料に対してエーテル/エタノール混合溶媒を添加して抽出した後、更に水を添加してエーテル層を離層させ、エーテル層を脂質抽出液として回収する方法である。具体的には、被検試料(例えば、血清又は血漿)1.0mLに対し、エーテル0.2〜2.0mL、好ましくは0.5〜1.5mL、エタノール1.0〜4.0mL、好ましくは2.0〜3.0mLを加えて抽出する。このときエーテル/エタノール比が1:2〜1:4になることが好ましい。続いてエーテルを2.0〜10mL、及び水を4.0〜10mL加えてエーテル層と水層を分離させる。このとき加えるエーテル/水の比が1.0〜2.5であることが望ましい。上記操作により分離したエーテル層を脂質抽出液として回収する。更に回収率を高めるために、残った水層に更にエーテル2.0〜5.0mLを加えて抽出を行うことができる。
抽出されたプラスマローゲンは、以下の総CP量の測定方法、及びCPの分子種の測定方法に用いることができる。
総CP量の測定方法は、CPとEPを分別して測定することができる分析方法であれば、特に限定されるものではなく、ガスクロマトグラフィーを用いる方法、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法、及び質量分析方法を挙げることができるが、特には高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いる方法、又は質量分析方法が好ましい。
被検試料(例えば、血清又は血漿)中のCP量の定量としては、これまでプラスマローゲンの測定法として、sn−1位由来のジメチルアセタールの分析によりプラスマローゲンの量を換算する方法や、TLCで分画し、リン脂質クラス分けをした後にガスクロマトグラフィーにて分子種分析する方法しかなかったが、近年では液体クロマトグラフィーを使用した分析が、多数の検体を迅速に高感度で分析可能な点で多く行われるようになっており、本発明でも、この液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用することができる。更に、質量分析器を用いてプラスマローゲンの分子種を分析する方法も行われるようになっており、本発明においては、質量分析器を用いることもできる。以下に、詳細に説明する。
HPLCを用いた被検試料(例えば、血清又は血漿)中の総CP量の定量方法としては、内部標準としてcAPを被検試料に添加し抽出するか、又はcAPを抽出脂質に添加し、メタノール中で放射性ヨウ素試薬と反応させて、生成される放射性ヨウ素結合CPをHPLCで溶出して放射活性を測定する方法によることが好ましい。
HPLCの溶出条件においては、コリングリセロリン脂質、エタノールアミングリセロリン脂質、及び内部標準が分別できるカラム(例えば、Diolカラムなど)を用い、適当な溶出溶媒(例えば、アセトニトリル/水/酢酸/アンモニア)を用いて溶出することができる。
CP(正確には、CP由来のヨウ素結合コリングリセロリン脂質)の検出は、ガンマカウンター(好ましくはフロー型ガンマカウンター)で放射活性を測定することにより行う。
質量分析器による総CP量の分析方法は、後述の質量分析器を用いたCPの分子種の測定方法に従って行うことができる。すなわち、被検試料からのプラスマローゲンの抽出、内部標準物質、及び質量分析器は、特に限定されるものではない。後述のCPの分子種の測定においては、生体内に存在する主要な30種のコリン型プラスマローゲンの濃度を測定することが可能であるが、それらの濃度を合計することによって、被検試料中の総CP量を求めることができる。
CPの分子種の測定方法は、CPの分子種を分離して測定することができる方法であれば、特に限定されることはなく、例えばガスクロマトグラフィーを用いる方法、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法、及び質量分析方法を挙げることができるが、特には質量分析方法が好ましい。質量分析方法も、特に限定されるものではないが、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いる質量分析法(以下、LC/MS法と称する)、ガスクロマトクラフィー(GC)を用いる質量分析法(以下、GC/MS法と称する)、及びキャピラリー電気泳動(CE)を用いる質量分析法(以下、CE−MS法と称する)を挙げることができ、特には、LC/MSの1つである液体クロマトグラフィータンデム質量分析法(以下、LC−MS/MS法と称する)が好ましい。LC−MS/MS法は、感度が高く、更にはプラスマローゲンの多様な分子種を分析することが可能であるからである。
LC−MS/MS法による質量分析において、検量線を作成する場合には、内部標準化合物のピークフラグメントの面積と、プラスマローゲンのピークフラグメントの面積との比を求め、この比をグラフ上にプロットすることにより信頼性の高い検量線を作成することができる。実際の測定においては、生体試料に既知量の内部標準化合物を添加し、得られた検量線に、内部標準化合物のピークフラグメントと、検体中のプラスマローゲンのピークフラグメントの面積比を当てはめることにより、精確な測定値を得ることができる。
また、本明細書において、sn−1位の側鎖は、「−CH=CH−R1」を意味し、側鎖に含まれる炭素数と二重結合の表記については、例えば「16:1」と記載した場合は、側鎖に含まれる炭素数が16であり、ビニルエーテル結合を除いた二重結合が1であることを示す。また、sn−2位の側鎖は、「−CO−R2」を意味し、側鎖に含まれる炭素数と二重結合の表記については、例えば「20:4」と記載した場合は、側鎖に含まれる炭素数が24であり、二重結合が4であることを示す。
前記総CP量の測定方法によって得られた総CP量の測定値は、後述の実施例に示すように、体重(相関係数:−0.334)、腹囲(相関係数:−0.375)、中性脂肪(相関係数:−0.327)、HDL−C(相関係数:0.714)、sdLDL(相関係数:−0.224)、AIP(相関係数:−0.576)、及びアディポネクチン(相関係数:0.314)と高い相関性を示す(表3及び表4)。
また、総CP量は、健常者群では65.9μMであるのに対して、メタボリックシンドローム群では56.5μMであり、メタボリックシンドローム群で有意に低いことがわかる(表5)。
本発明の検出方法においては、総CP量以外にCPのそれぞれの分子種の濃度を用いることができる。例えば、sn−1位及びsn−2位の側鎖の違いにより30種類のCPの分子種ごとの濃度を用いることもでき、sn−1位の側鎖の違いにより3種類の分子種ごとの濃度を用いることもでき、またsn−2位の側鎖の違いにより、10種類のCPの分子種ごとの濃度を用いることもできるが、sn−2位にオレイン酸を有するコリン型プラスマローゲン(以下、C18:1CPと称することがある)又はsn−2位にリノール酸を有するコリン型プラスマローゲン(以下、C18:2CPと称することがある)の濃度を用いることが好ましく、特に好ましくはC18:1CPの濃度を用いる。
本発明の検出方法の別の態様においては、被検試料中のコリン型プラスマローゲン濃度の測定値と、被検試料中のリン脂質濃度の測定値との比によって、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出をすることができる。コリン型プラスマローゲン濃度は、総CP量、CPの分子種の濃度のいずれも用いることができるが、好ましくは、C18:1CP又はC18:2CPの濃度である。
また、コリン型プラスマローゲン濃度の測定値と、被検試料中のリン脂質濃度の測定値との比の計算方法は特に限定されるものではないが、例えば「CPの濃度/リン脂質濃度」によって計算することができる。この計算方法の場合、リン脂質中の総コリン型プラスマローゲン濃度、又はリン脂質中のCPの分子種の濃度を意味している。
本発明の検出方法の別の態様においては、被検試料中のコリン型プラスマローゲン濃度の測定値と、被検者の体重の測定値との比によって、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出をすることができる。コリン型プラスマローゲン濃度は、総CP量、CPの分子種の濃度のいずれも用いることができるが、好ましくは、C18:1CP又はC18:2CPの濃度である。
また、コリン型プラスマローゲン濃度の測定値と、被検者の体重の測定値との比の計算方法は特に限定されるものではないが、例えば「CPの濃度/被検者の体重(kg)」によって計算することができる。この計算方法の場合、体重1kgあたりのコリン型プラスマローゲン濃度の値を意味している。また、被験者の体重の測定方法については、定法に従うことができる。
本発明の検出方法の別の態様においては、被検試料中のコリン型プラスマローゲン濃度の測定値と、中性脂肪の濃度の測定値との比によって、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出をすることができる。コリン型プラスマローゲン濃度は、総CP量、CPの分子種の濃度のいずれも用いることができるが、好ましくは、C18:1CP又はC18:2CPの濃度である。
また、コリン型プラスマローゲン濃度の測定値と、中性脂肪の濃度の測定値との比の計算方法は特に限定されるものではないが、例えば「CPの濃度/中性脂肪の濃度」によって計算することができる。被検試料の中性脂肪含量を測定する方法については、定法に従うことができる。
本発明の検出方法は、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の発症予防用、又は治療効果のモニタリング用として用いることができる。また、メタボリックシンドローム又は生活習慣病リスク又は重篤度の指標として用いることが可能である。特に、中性脂肪、sdLDL、及びAIPが高値であることは、動脈硬化症の原因であり、HDL−C、アディポネクチンは低値であることが、動脈硬化症の発症の原因である。本発明の検出方法によって得られたコリン型プラスマローゲン濃度、コリン型プラスマローゲンの分子種の濃度、CPの濃度及びリン脂質濃度の比、CPの濃度及び被検者の体重の比、及びCPの濃度及び中性脂肪の濃度の比は、中性脂肪、HDL−C、sdLDL、アディポネクチン、及びAIPと相関性が高く、動脈硬化症の発症予防又は動脈硬化症のリスクのマーカーとして用いることが可能である。
本発明の方法により検出される生活習慣病は、食事、睡眠、又は嗜好品(例えば、タバコ、又はお酒)などの生活習慣を主な原因とする疾患であれば限定されるものではないが、糖尿病、脂質異常症(高脂血症)、高血圧症、肥満症、がん、脳卒中、動脈硬化症、心筋症、心筋梗塞、不整脈、脂肪肝、アルコール性肝障害、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胆石症、歯周病、通風、抗尿酸血症、及び骨粗しょう症を挙げることができる。本発明の検出方法によれば、特に脂質異常症、高血圧症及び動脈硬化症を、高率に検出することができる。
本発明の方法により検出されるメタボリックシンドロームは、ウエスト周囲径が男性で85cm、女性で90cm以上を「要注意」とし、その中で(1)血清脂質異常(トリグリセリド値150mg/dL以上、又はHDLコレステロール値40mg/dL未満)(2)血圧高値(最高血圧130mmHg以上、又は最低血圧85mmHg以上)(3)高血糖(空腹時血糖値110mg/dL)の3項目のうち2つ以上を有する被験者の症状を意味する。
本発明のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出キットは、プラスマローゲンの分析用内部標準物質として、下記一般式(1)
下記一般式(2)
21〜66歳の被験者451人(男性382人、女性69人、平均年齢39.6歳、40歳以上216人)の血液から分画した血清を用意した。その一部から脂質を抽出してCPを定量した。また、その一部を用い、リン脂質C−テストワコーによりリン脂質濃度を測定した。
血清0.015mLを0.020mLに変更した以外は上述の総脂質の抽出方法にしたがい血清抽出試料を得た後、同様にヨウ素反応試薬との反応を行い、得られた反応試料(サンプル)をHPLCに供した。ここで、反応試料(サンプル)0.02mL中に含まれるcAP含量(A)と、測定されたcAP含量(B)から、補正係数=(A)/(B)の値を求め、測定されたCP含量にこの補正係数を乗じた値とを算出し、4回測定分の標準偏差と変動係数について、表1に記載した。なお、CP含量に内部標準物質を使用しない場合、すなわち、補正係数を乗じない場合についても4回測定分の標準偏差と変動係数を算出し、同様に表1に記載した。
また、EP含量についても同様に測定し、結果を表1に記載した。
このため、CP量の測定については、このcAPを内部標準として使用することとした。
本実施例では、実施例1の21〜66歳の被験者451人(男性382人、女性69人、平均年齢39.6歳、40歳以上216人)の血清を用いコリン型プラスマローゲンの分子種の測定を、LC−MS/MSを用いて行った。
血清(Serum)からの総脂質の抽出は、以下のようにして行った。血液を遠心分離して得た血清0.15mLを凍結乾燥し、内部標準物質として、sn−1位がトリコサン酸、sn−2位がオレイン酸の合成コリン型プラスマローゲン(p23:0/18:1)50pmoLを含むクロロホルム:メタノール=2:1の混液0.5mLを加え、10分間混合後、30分間室温で放置した。3000rpm、15分間遠心分離後、上層を採取した。下層に更にクロロホルム:メタノール=2:1の混液を1mL加え、混合・放置後、遠心分離を行い、上層を採取し、先の採取液と合わせ、窒素の吹きつけにより、溶媒を除去後、1mLのメタノールに溶解し、フィルターを通したあと、適宜メタノールで希釈したのち、LC−MS/MSを用いて解析した。
<LC(高速液体クロマトグラフィー)の条件>
LC システム:Accela UHPLC System
溶離液A:5mMギ酸アンモニウム水溶液
溶離液B:アセトニトリル
カラム:Waters ACQUITY UPLC BEH C8(2.1×100mm,1.7μm)
カラム温度:60℃
流速:0.6mL/min
UHPLCの溶離液の条件を表2に示す。
MSシステム:TSQ Quantum system
イオン化モード:HeatedESI,positive
キャピラリー電圧:3.2kV
コーン電圧:35V
Desolvation温度:400℃
Source温度:80℃
衝突エネルギー:32eV(コリン型プラスマローゲン)
一方、上記被験者451人について、年齢、性、身長、体重、BMI、腹囲、血圧、GOT、GPT、γ−GTP、尿酸、中性脂肪、HDL−C、LDL−C、血糖値、アディポネクチン、sdLDL、hsCRP、AIPなどの検査項目の測定・計算を行い、血清プラスマローゲン量、CP量、EP量、CP/PL(リン脂質)、CP/体重、CP/中性脂肪、CP/EPと各項目間での相関性が調べられた。
実施例1の被験者451人のうち、メタボリックシンドローム診査対象者である40歳以上の被験者156人を、メタボリックシンドロームの判定基準に従い、ウエスト周囲径が男性で85cm、女性で90cm以上を「要注意」とし、その中で(1)血清脂質異常(トリグリセリド値150mg/dL以上、又はHDLコレステロール値40mg/dL未満)(2)血圧高値(最高血圧130mmHg以上、又は最低血圧85mmHg以上)(3)高血糖(空腹時血糖値110mg/dL)の3項目のうち2つ以上を有する被験者を「メタボ群」、3項目のうち1項目を有する被験者は「準メタボ群」とし、残余を「健常者群」とした。
この3群の、血清プラスマローゲン量、CP量、EP量、CP/PL(リン脂質)、CP/体重、CP/中性脂肪、CP/EP、C18:1CP量、C18:1CP/PL(リン脂質)、C18:1CP/中性脂肪、C18:1CP/体重、C18:2CP量、C18:2CP/PL(リン脂質)、C18:2CP/中性脂肪、C18:2CP/体重について、それぞれの平均値を表5に記載した。
なお、血清プラスマローゲンのsn−2位の主要脂肪酸はC20:4(アラキドン酸)であったことから、C20:4CP量、C20:4CP/PL(リン脂質)、C20:4CP/中性脂肪、C20:4CP/体重についても測定・算出し、更に、健常者群を1とした場合の上記指標の相対値を表6に記載した。
なお、血清プラスマローゲン中のsn−2位のC20:4は33.8%、C18:2は20.8%、C18:1は6.4%であった。
また2位の脂肪酸として、血清プラスマローゲンの主要構成脂肪酸であるC20:4を含むC20:4CPに関連した値に比べ、C18:1CP又はC18:2CPに関連した値のほうが、特にC18:1CPに関連した値が、(B)/(A)の値が顕著に小さく、すなわち、健常者群とメタボ群との差異が大きいことがわかる。
Claims (7)
- 被検試料中のsn−2位にオレイン酸を有するコリン型プラスマローゲン、又はsn−2位にリノール酸を有するコリン型プラスマローゲン濃度を測定する工程を含むことを特徴とする、メタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法。
- 被検試料中のリン脂質濃度、中性脂肪濃度、及び被検者の体重からなる群から選択される値を測定する工程、及び
前記コリン型プラスマローゲン濃度の測定値と、前記被検試料中のリン脂質濃度の測定値、被検試料中の中性脂肪濃度の測定値、又は被検者の体重の測定値との比を計算する工程、
を更に含む、請求項1に記載のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法。 - 前記生活習慣病が、脂質異常症、高血圧症及び動脈硬化症からなる群から選択される、請求項1又は2に記載のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法。
- メタボリックシンドローム又は生活習慣病の、発症予防用又は治療効果のモニタリング用である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のメタボリックシンドローム又は生活習慣病の検出方法。
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