KR20130106344A

KR20130106344A - 검출 방법

Info

Publication number: KR20130106344A
Application number: KR20137000077A
Authority: KR
Inventors: 료우타 마에바; 히로시 하라; 메구미 니시무카이; 유야 야마자키; 토루 네쯔
Original assignee: 각꼬우호우징 테이쿄다이가쿠; 국립대학법인 홋가이도 다이가쿠; 가부시키가이샤 아데카
Priority date: 2010-06-04
Filing date: 2011-06-03
Publication date: 2013-09-27
Also published as: EP2579043A1; EP2579043A4; EP2579043B1; US9134330B2; CN102947708B; KR101858199B1; CN102947708A; JP2011257148A; JP5662060B2; WO2011152519A1; US20130203176A1

Abstract

40 ~ 74 세의 특정 검진 대상자를 포함하는 광범위의 피험자에 있어서, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 종래의 마커와 높은 상관을 가지는 마커를 제공하고 그리고 대사 증후군 또는 생활 습관병의 유효한 검색 방법을 제공하는 것이다. 상기 과제는 피검 시료 중의 콜린형 플라스마로겐 농도를 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법에 의해 해결될 수 있다.

Description

검출 방법{Detection method}

본 발명은 대사 증후군(メタボリックシンドロ-ム) 또는 생활 습관병의 검출 방법 및 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 키트에 관한 것이다.

최근 동맥 경화증, 고지혈증, 당뇨병, 고혈압 및 중심성(中心性) 비만 등의 생활 습관병이, 공통의 대사 이상(代謝異常)을 기반으로 발증(發症)하는 것임이 밝혀졌고, 이들 질병의 기반이 되는 대사 이상이 대사 증후군으로 표현되게 되었다. 후생노동성(厚生勞動省) 령 제 157 호 「특정 건강 진단 조사 및 특정 보건 지도의 실시에 관한 기준 (2007년 12월 28일)」에서, 40 ~ 74세의 보험자에 특정 건강 진단 조사가 의무화되어, 대사 증후군의 진단 기준인 복부 둘레, 혈압, 혈청 트리글리세라이드(중성 지방), 고비중(高比重) 리포단백 콜레스테롤(リポ蛋白コレステロ-ル;HDL-C) 양, 혈당을 검사하는 것으로 되어서, 2008년 4월부터 실시되고 있다. 대사 증후군 진단자에게는 보건 지도도 이루어지므로, 국민의 건강에 대한 의식이 높아지고, 생활 습관병 예방으로의 움직임도 적극적으로 되고있다.

종래, 동맥 경화증의 발증 리스크 마커로서는, 고밀도 리포단백 콜레스테롤 (HDL-C), 저밀도 리포단백 콜레스테롤 (LDL-C) 양, 소립자 LDL (sdLDL), 아포리포(アポリポ) 단백질 A, 아디포넥틴, CRP (C-reactive Protein : C 반응성 단백질) 및 AIP (Atherogenic Index of Plasma: 혈청 동맥 경화 지표) 등이 알려져 있다.

sdLDL은, 중성 지방을 많이 함유하는 LDL이며, 통상의 LDL보다도 입자 크기가 작다. LDL보다도 산화되기 쉽고, 동맥 경화 야기 가능성이 높은 것으로 되어있다. 아포리포 단백질 A는, HDL을 구성하는 단백질이며, 세포 내로부터 콜레스테롤의 배출을 촉진한다. 아디포넥틴은, 지방 세포에서 분비되는 호르몬이며, 인슐린 감수성의 항진(亢進), 동맥 경화 억제 및 항염증 작용이 있다고 한다. 또한, 혈중 농도는 내장 지방의 양에 반비례 관계가 있다. CRP는, 체내의 염증 반응이 생길 때에 생성되는 단백질이며, 만성 혈관 염증이라는 측면을 갖는 동맥 경화의 마커로 주목받고있다. AIP는, 혈청 중성 지방 양과 HDL-C 양으로부터 계산 [log (중성 지방 / HDL-C 양)]되는 혈청 동맥 경화 지표이다.

또한, 동맥 경화의 발증 원인에 가장 기여하는 것은, LDL의 산화로 알려져 있다. 콜레스테롤의 대사나 수송의 이상에 의해 산화된 LDL은, 마크로파지(マクロファ-ジ)의 포말화(泡沫化)를 야기하고, 또한 호중구(好中球)로부터의 슈퍼 옥사이드 생산을 유도함으로써, 혈관 내 피하에서 한층 더 지질 과산화 및 지질 축적 등을 일으켜서 질병의 진전을 촉구한다. 따라서, LDL의 산화 억제가 동맥 경화의 발증 억제에 매우 유효하다.

한편, 플라스마로겐(プラスマロ-ゲン)은 글리세로인지질(グリセロリン脂質)의 일종이며, 글리세롤 골격의 sn-1 위치에 올레피닐(オレフィニル) 사슬 (비닐 에테르 결합), sn-2 위치에 아실 사슬, sn-3 위치에 염기가 결합된 인산을 가진 것이다. 천연에 존재하는 플라스마로겐의 주된 올레피닐 사슬의 탄소수는 16 ~ 18이며, 주된 아실 사슬은 탄소수 16 ~ 22의 지방산이다. 또한 그 인산에 결합되는 주된 염기는, 콜린과 에탄올 아민이며, 각각 콜린형 플라스마로겐 (이하, CP로 칭하는 것이 있다), 에탄올 아민형 플라스마로겐 (이하 EP로 칭하는 것이 있다)이라 칭하고, 예를 들어, 포유류의 심장과 골격근에서는 CP의 비(比)가 높고, 그의 뇌와 신장에서는 EP의 비(比)가 높은 것으로 알려져 있다.

인간 혈장 중에는 2 ~ 3 mM의 인지질이 존재하고, 그들은 리포단백질의 구성 성분이다. 그것의 모든 인지질의 60 ~ 75 %는 콜린 글리세로인지질(コリングリセロリン脂質)이고, 2 ~ 5 %는 에탄올아민 글리세로인지질이며, 10 ~ 20 %는 스핑고미엘린 인지질(スフィンゴミエリンリン脂質)이다.

혈장 중의 플라스마로겐 농도는, 0.1 ~ 0.3 mM이며, 그것의 약 40 %가 CP, 약 60 %가 EP이다. 즉, 콜린 글리세로인지질의 약 5 %, 에탄올아민 글리세로인지질의 약 60 %가 플라스마로겐이다. 그 밖의 염기를 가진 플라스마로겐은 혈중에는 거의 존재하지 않는다.

플라스마로겐의 생리적 역할로서는, 세포 융합이나 분비 작용에 관한 막 융합 작용, 정보 전달이나 생체 고분자 수송에의 관여, 산화하기 쉬운 다가 불포화 지방산의 저장체로서의 역할 및 내인성 항산화 물질로서의 역할 등이 보고되고 있다. 또한 인간의 유전적인 플라스마로겐 결손이, 심한 정신 지체, 부신 기능 장애, 백내장, 청각 장애, 또는 발육 부전 등의 병 증상을 나타내는 것, 혹은 알츠하이머(アルツハイマ-)증 환자 및 고령자에서는 혈청 플라스마로겐 양이 감소하는 것으로보고 되고 있어, 플라스마로겐이 생체 내에서 매우 중요한 역할을 담당함이 시사되어 있다 (비특허 문헌 1). 또한 플라스마로겐은, 혈중 리포단백질의 생성시에 우선적으로 도입되는 것이 알려지고, 또한 그의 내인성(內因性)의 항산화능력으로부터, LDL의 산화 방어 인자로 작용하는 것으로 생각된다.

특허 문헌 1에서는, 고지혈증자를 포함하는 중고령자 군 (148명, 평균 연령 65.2 세)의 혈액의 콜린형 플라스마로겐 및 에탄올아민형 플라스마로겐 양을 측정하여, CP/EP비가, 공복시 트리글리세라이드 (「중성 지방」을 의미한다) 및 LDL 크기 (「sdLDL」를 의미한다)와, 각각 유의한 상관성 (상관 계수 -0.359 및 0.402)을 보이고, CP/EP비를 생활 습관병 예방의 검사법으로 사용하는 것이 개시되어있다. 또한, 비특허 문헌 1은, 더욱이 전체 CP 양 또는 전체 EP 양이, HDL-C, 아포리포 단백질 A-I 및 아포리포 단백질 A-II와 각각 상관 (상관 계수> 0.28)하는 것을 개시하고 있다.

그러나 특허 문헌 1에 기재된 CP/EP비는, 공복시 트리글리세라이드 (중성 지방) 및 LDL 크기 (sdLDL)와의 상관, 및 비특허 문헌 1에 기재된 전체 CP 양 또는 전체 EP 양과, HDL-C, 아포리포 단백질 A-I 및 아포리포 단백질 A-II와의 상관은 높은 것이 아니며, 생활 습관병의 검출 마커로는 충분한 것은 아니었다

특허 문헌 1: 특개 2007-33410호 공보

비특허 문헌 1: 「저널·오브·아테로스클레로우시스·앤·토론보시스 (Journal of Atherosclerosis and Thrombosis)」2007 년, (일본) 제 14 권, p. 12-18

특허 문헌 1에서, 관상 동맥 협착의 유무, 내당능(耐糖能) 이상, 유의(有意) 협착, 연령성(年齡性), CAG, OGTT, 고지혈증, 내당능 이상, 신장, 체중, BMI, 흡연 (개수/일, 기간), 가족력, 고혈압, 통풍 등의 검사 항목과, 혈장 플라스마로겐 농도, 요산값, TC, TG 공복시, HDL, LDL, FBS, HbA1c, TC_2, TG_2, HDL_2, LDL_2, 아포단백 A-I, 아포단백 A-II, 아포단백 B, 아포단백 C-II, 아포단백 C-III, 아포단백 E, LP(A), LP-F_PGR, 리포단백α (HDL), 리포단백 β (LDL), 리포단백 preβ (VLDL), RLP-C, S_0', S_120', IRI_0 ', IRI_120', IRI_0', IRI_120', HOMA_IR, LPL, 아디포넥틴, MDA_LDL, LPL 후, ApoB48 전, ApoB48 후, LDL_size, 인지질 농도, 콜린형 플라스마로겐 (CP), 에탄올아민형 플라스마로겐 (EP), CP/EP 등의 검사 항목을 측정하고, 각 항목 간의 상관성을 조사한 것이 기재되어 있다. 그리고 공복시 트리글리세리드 (TG), HDL2, CP/EP의 각 값과, LDL 크기 사이에 유의한 상관성이 있는 것, 및 상기와 같이 CP/EP와 공복시 트리글리세리드(TG)와 사이에, 유의한 상관이 있는 것이 기재되어 있지만, 다른 검사 항목간에 상관성이 있는 것은 기재되어 있지 않다.

전술한 바와 같이, 특허 문헌 1에서는, CP/EP비 및 공복시 트리글리세라이드 (중성 지방) 및 CP/EP비 및 sdLDL에 유의한 상관을 얻을 수 있지만, 상관 계수는 각각 -0. 359와 0.402로 약간 낮았다. 또한, 비특허 문헌 1에 있어서, 전체 CP양과, HDL-C, 아포리포단백질 A-I 및 아포리포단백질 A-II와의 상관도, 각각 0.308, 0.435 및 0.241이며, 높은 것은 아니다.

그 이유는, 특허 문헌 1 및 비특허 문헌 1에서는, 혈액 중 플라스마로겐 농도를 측정하는 검사법으로, 추출 지질에 삼요오드화물 이온을 반응시켜 지질 성분 중의 플라스마로겐에 방사성 요오드를 특이적으로 결합시키고, 그것을 크로마토그래피 기법에 의해 CP와 EP로 분별하여 정량하는 방법에 의하므로, 방사성 요오드를 이용한 경우의 감쇠율의 영향 등의 측면에서 충분한 정확도는 없었던 것이, 하나의 원인이라고 생각된다.

또한, 특허 문헌 1 및 비특허 문헌 1의 플라스마로겐 측정 방법으로는, 내부 표준 물질을 사용하지 않기 때문에, 측정 동안, 측정일 사이 또는 측정자 사이의 오차가 있어, 충분한 상관을 얻지 못한 가능성을 생각할 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 40 ~ 74 세의 특정 검진 대상자를 포함한 광범위의 피험자에 있어서, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 종래의 마커와 높은 상관을 가지는 마커를 제공하는 것 및 대사 증후군 또는 생활 습관병의 유효한 검출 방법을 제공하는 것이다. 또한, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 리스크 또는 중독도(重篤度)를 나타낼 수 있는 마커를 제공하고, 또한 대사 증후군 또는 생활 습관병의 리스크 또는 중독도의 분석 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해, 먼저, 플라스마로겐의 분석 방법에 있어서, 보다 정밀도가 높은 혈액 중의 플라스마로겐을 정량하는 방법을 예의 검토한 결과, 상기 특허 문헌 1에 기재된 검사법에서, 내부 표준 물질로서, 1-알케닐 환상 포스파티딘산(1-alk-1'-enyl-sn-glycerol-2,3-cyclic phosphate (이하 cAP라고 칭하는 경우가 있음))을 이용하는 것으로, 보다 정밀도를 높이기 위한 분석법이 될 수 있음을 발견했다. 그리고 또한, 내부 표준 물질로서, 합성 콜린형 플라스마로겐을 사용하고 플라스마로겐을 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석기 (이하 LC-MS/MS)에 의해 분석함으로써, CP의 sn-2 위치에 결합한 지방산의 분석 (CP의 분자종(分子鐘)의 분석)이 정밀도가 높은 수준에서 가능하다는 것을 발견했다.

상기의 내부 표준 물질을 이용한 두 가지 분석 방법에 의해, 중질병환자를 제외한 20 ~ 60대의 피험자 451명을 대상으로 한 조사를 실시한 결과, 전체 혈청 플라스마로겐 양과 비교하여, CP 양, 특히 sn-2 위치에 결합한 지방산이 올레인산인 CP (이하 C18 : 1CP로 칭한다) 함량, 또는 sn-2 위치에 결합한 지방산이 리놀레산(リノ-ル酸)산인 CP (이하 C18 : 2CP로 칭한다) 함량이, HDL-C, 중성 지방, sdLDL 외에, 복부 둘레, 아디포넥틴, AIP 등의 동맥 경화증 관련 인자와 강하게 상관하는 것을 확인했다.

또한 전체 인지질 양과 전체 CP 양의 비(이하 「CP/PL」로 칭한다)는, CP 양만 보다도 상기의 동맥 경화증 관련 인자와 높은 상관 관계를 나타내는 것을 발견했다.

또한, 전체 CP양과 체중(이하 「CP/체중」으로 칭한다)의 비, 또는 전체 CP 양과 중성 지방과의 비(이하 「CP/중성 지방」이라 칭한다)도, 전체 CP 양만에 의한 것 보다도 상기의 동맥 경화증 관련 인자와 높은 상관 관계를 나타내는 것을 발견했다.

상기의 측정 항목은, 특허 문헌 1에 표시된 마커인 CP/EP 보다도 각 항목 간의 상관 계수가 높고, 더 많은 항목과 상관되는 것, 특히, 비만증의 관련 인자인 복부 둘레, 아디포넥틴과의 상관도 있어서, 이들이 지질 대사 이상 전반을 반영하는 마커로서 유효성이 높은 것으로 나타났다.

즉, 본 발명은,

[1] 피검 시료 중의 콜린형 플라스마로겐 농도를 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법,

[2] 상기 콜린형 플라스마로겐 농도가, sn-2 위치에 올레인산을 가지는 콜린형 플라스마로겐, 또는 sn-2 위치에 리놀레산(リノ-ル酸)을 가지는 콜린형 플라스마로겐의 농도인, [1] 에 기재된 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법,

[3] 피검 시료 중의 인지질의 농도 인지질 농도, 피검 시료 중의 중성 지방 농도 및 피검자의 체중 이루어진 군에서 선택되는 값을 측정하는 공정, 및 상기 콜린형 플라스마로겐 농도의 측정 값과 상기 피검 시료 중의 인지질 농도의 측정, 피검 시료 중의 중성 지방 농도의 측정값 또는 피검자의 체중의 측정값의 비를 계산하는 공정을 더 포함하는, [1] 또는 [2]에 기재된 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법,

[4] 상기 생활 습관병이, 지질 이상증, 고혈압증 및 동맥 경화증으로 이루어진 군에서 선택되는, [1] ~ [3]의 어느 하나에 기재되어 있는 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법,

[5] 대사 증후군 또는 생활 습관병의 발병 예방용 또는 치료 효과의 모니터링용인, [1] ~ [3]의 어느 하나에 기재되어 있는 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법,

[6] 플라스마로겐의 분석용 내부 표준 물질로,

다음 일반식 (1)

(식 중, R³는, 탄소수 4 ~ 26의 알킬기 또는 알케닐기이며, M은 수소 원자 또는 카운터 양이온(對カチオン)이다)으로 표시되는 1-알케닐 환상 포스파티딘산, 및

일반식 (2)

(식 중, R¹은 탄소수 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 또는 21의 알킬기이고, R²는 탄소수 8 ~ 21의 알킬기 또는 알케닐기이다)로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물의 적어도 하나를 이용하는, 청구항 1 ~ 5 중의 어느 하나에 기재되어 있는 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법,

[7] 플라스마로겐의 분석용 내부 표준 물질로서, 상기 일반식 (1)로 표시되는 1-알케닐 환상 포스파티딘산을 포함한 것을 특징으로 하는, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 키트, 및

[8] 플라스마로겐의 분석용 내부 표준 물질로서, 상기 일반식 (2)로 표시되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 키트, 에 관한 것이다.

본 발명의 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법 또는 검출 키트에 따르면, 종래의 검출 방법과 비교하여, 높은 비율로 대사 증후군 또는 생활 습관병을 검출하는 것이 가능하며, 특히 대사 증후군을 높은 비율로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 검출 방법 또는 검출 키트에 의해 얻어진 측정값은, 생활 습관병의 마커인 HDL-C, sdLDL, AIP, 복부 둘레, 체중, 또는 아디포넥틴의 측정값과의 높은 상관을 보인다. 또한, 본 발명의 검출 방법 또는 검출 키트에서, 내부 표준 물질로서, 1-알케닐 환상 포스파티딘산 또는 합성 콜린형 플라스마로겐을 사용함에 의해, 정확하게 콜린형 플라스마로겐의 양을 측정하는 것이 가능하게 되고, 또한 콜린형 플라스마로겐의 분자종(分子種)의 정확한 분석도 가능하게 되었다.

따라서, 본 발명의 검출 방법 또는 검출 키트는 대사 증후군이나 생활 습관병의 리스크 또는 중독도(重篤度)를, 종래에 비해, 보다 정확하게 진단할 수 있으며, 본 발명에 의해 발견된 마커는, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 리스크 또는 중독도를 종래의 마커에 비해 더욱 정확하게 보여주고 있다.

[1] 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법

본 발명의 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법은, 피검 시료 중의 콜린형 플라스마로겐 농도를 측정하는 공정을 포함한다. 본 발명의 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법은, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 진단 방법으로 사용될 수 있다. 또한, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 진단 방법은 in vitro에서의 진단 방법이다. 즉, 인간을 포함한 동물에서 분리한 피검 시료 중의 콜린형 플라스 마로겐 농도를, in vitro로 측정하는 공정을 포함하는 것이다.

본 발명의 검출 방법에서는, 피검 시료 중의 총량의 콜린형 플라스마로겐 농도 또는 콜린형 플라스마로겐의 분자종(分子種)의 농도를 측정한다. 여기서 콜린형 플라스마로겐 농도, 또는 콜린형 플라스마로겐의 분자종의 농도 측정에 있어서, 내부 표준 물질을 첨가하지 않고, 분석·측정을 한 경우, 분석에서 당연히 발생하는 샘플 간의 추출 효율의 차이, 또한 예를 들어 질량 분석기에 제공했을 때의 이온화 효율의 인젝션(インジェクション) 별 차이를 보정할 수 없다. 따라서, 내부 표준 물질을 첨가하는 것이 수행된다. 그런데 종래는 내부 표준 물질로서 코르(コ-ル)산 등을 사용하고 있었지만, 그 극성이나 이온화 효율 등이 플라스마로겐과 크게 다르기 때문에, 정확한 플라스마로겐 함량의 측정값이라고는 말 할 수 없었다.

본 발명자들은, 새로운 내부 표준 물질로서, 1-알케닐 환상 포스파티딘산 〔1-alk-1'-enyl-sn-glycerol-2,3-cyclic phosphate (이하 cAP라고 칭하는 경우가 있음)], 또는 합성 콜린형 플라스마로겐을 이용함으로써, 콜린형 플라스마로겐의 정확한 함유량의 측정이 가능해진다는 것을 발견했다. 이하에서, 본 발명의 검출 방법에서 내부 표준 물질로 사용될 수 있는 1-알케닐 환상 포스파티딘산 및 합성 콜린형 플라스마로겐에 대해서 설명한다.

《내부 표준 물질》

(1-알케닐 환상 포스파티딘산)

본 발명의 검출 방법에 있어서, 내부 표준 물질로 사용될 수 있는 1-알케닐 환상 포스파티딘산 (cAP)는 다음 일반 식 (1)

(식 중, R³는, 탄소수 4 ~ 26의 알킬기 또는 알케닐기이며, M은 수소 원자 또는 카운터 양이온(對カチオン)이다)으로 표시되는 화합물이다.

상기 1-알케닐 환상 포스파티딘산에 있어서, R³는 탄소수 4 ~ 26의 알킬기 또는 알케닐기이고, 바람직하게는 탄소수 8 ~ 22의 알킬기 또는 알케닐기이며, 보다 바람직하게는 탄소수 12 ~ 18의 알킬기 또는 알케닐기이며, 가장 바람직하게는 탄소수 14 ~ 16의 알킬기 또는 알케닐기이다. 또한, 알케닐기에 비해 알킬기인 것이 바람직하다. 플라스마로겐의 sn-1의 위치의 측쇄는, 그것의 대부분이 16:0, 18:0 및 18:1의 비닐 에테르 결합을 가지는 탄화수소기이며, R³의 탄소수가 3 이하 또는 27 이상의 알킬기를 가지는 1-알케닐 환상 포스파티딘산의 경우, 거동이 다르게 될 가능성이 있기 때문에 바람직하지 않다.

상기 cAP의 조제는 화학 합성 또는 효소 합성하여 수행할 수 있다. 가격적으로 유리한 효소 합성법에 대해서는, 특개 2001-178489호 공보에 기재된 방법에 준해서 수행할 수 있으며, 1-리조리플라스마로겐(１－リゾリプラスマロ-ゲン) (예를 들면, 1-리조콜린 플라스마로겐(１－リゾコリンプラスマロ-ゲン))과 포스포리파아제(ホスホリパ-ゼ)D (예를 들면 Actinomadura sp.Strain No.362 유래의 포스포리파아제D)와의 반응 생성물로서, 1-리조포스파티딘산 플라스마로겐과 함께 cAP를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명자들은 에테르/에탄올 혼합 용매를 사용하여 재추출함에 의해, 1-리조포스파티딘산 플라스마로겐을 제거할 수 있어서, 고순도 cAP를 얻을 수 있음을 발견하고 있다.

상기 cAP는 내부 표준 물질로서, 후술하는 총 CP량의 측정법에서 사용할 수있다.

(합성 콜린형 플라스마로겐)

발명의 검출 방법에 있어서, 내부 표준 물질로 사용될 수 있는 합성 콜린형 플라스마로겐은, 다음 일반식 (2)

(식 중, R¹은 탄소수 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 또는 21의 알킬기이고, R²는 탄소수 8 ~ 21의 알킬기 또는 알케닐기이다)으로 표시되는 화합물이다.

상기 합성 콜린형 플라스마로겐에서, R¹은 탄소수 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 또는 21의 홀수의 알킬기이며, 바람직하게는 탄소수 7, 9, 11, 19, 또는 21의 알킬기이며, 보다 바람직하게는 탄소수 7, 9, 19 또는 21의 알킬기이며, 가장 바람직하게는 탄소수 19 또는 21의 알킬기이다. 플라스마로겐의 sn-1위치의 측쇄는, 그의 대부분이 16:0,18:0 및 18:1의 비닐에테르 결합을 가지는 탄화수소기이며, 탄소수가 홀수인 탄화수소기는 생체 내에서 거의 존재하지 않는다. 따라서 R¹이 홀수의 알킬기인 본 발명의 상기 화합물을, 내부 표준 화합물로서 플라스마로겐의 분석에 이용함으로써, 각종 분석에서 용출 위치가 다르게 되어, 생체 내의 플라스마로겐과 명확하게 구별하는 것이 가능하다.

상기 일반식 (2)로 표시되는 화합물은, 본 발명자가 특허출원 2009-296744 호 명세서에 기재하고 있다. 상기 화합물은, 가스 크로마토그래피를 사용하는 플라스마로겐의 측정 방법, 고속 액체 크로마토그래피를 사용하는 플라스마로겐의 측정 방법 및 질량 분석을 이용하는 플라스마로겐의 측정 방법에 있어서, 내부 표준 물질로 사용할 수 있으며, 특히 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석기 (LC-MS/MS)를 이용한 플라스마로겐의 측정 방법에서 사용함으로써, 정확한 플라스마로겐의 분자 종의 측정이 가능하다.

상기 합성 콜린형 플라스마로겐의, 특히 바람직한 양태에서는, 식 (3)

로 표시되는 화합물을 들 수 있다.

상기 식 (3)으로 표시되는 합성 콜린형 플라스마로겐은, 하기 반응 공정식 (4)에 따라, 제조할 수 있다.

상기 합성 콜린형 플라스마로겐은, 내부 표준 물질로서, 후술하는 총 CP량의 측정 방법 및 CP의 분자종의 측정 방법에서 사용할 수 있다. 또한 코르(コ-ル)산을 내부 표준 물질로서 사용한 경우와 비교하면, 상기 합성 콜린형 플라스마로겐은, 내부 표준 물질의 극성, 추출 효율 및 질량 분석기에서의 이온화 효율의 모든 면에 있어서, 측정된 플라스마로겐과 유사한 것으로 간주되어, 내부 표준 화합물로서 우수했다. 즉, 측정값의 편차가 적고, 정확한 측정값을 얻을 수 있었다.

《피검 시료에서 플라즈마로겐의 추출》

본 발명의 검출 방법에서 플라스마로겐 농도의 측정으로는, 우선 피검 시료에서 플라스마로겐의 추출을 행한다. 피검 시료로부터의 플라스마로겐의 추출 방법은, 인지질을 회수할 수 있는 방법이면 특별히 한정되는 것이 아니며, Bligh & Dyer법, Folch법, 핵산/에탄올 혼합 용매를 이용하는 방법, 에테르/에탄올 혼합 용매를 이용하는 방법, 또는 피검 시료를 동결 건조시켜 클로로포름/메탄올 혼합 용매 등의 용매로 추출하는 방법을 들 수 있다. 이러한 추출 방법에서, Bligh & Dyer법은 조작이 번잡한 점, 핵산/에탄올 혼합 용매를 사용하는 방법은 회수율이 낮기 때문에, 에테르/에탄올 혼합 용매를 사용하는 방법, 또는 동결 건조시켜 클로로포름/메탄올 혼합 용매 등의 용매로 추출하는 방법이 바람직하다. 또한, 특히 후술의 방사성 요오드 반응 시약을 이용하여, HPLC로 분석하는 방법에서는, 동결 건조 시료를 이용한 방법은 수용성 협잡물(挾雜物)이 혼입될 수 있어서, 에테르/에탄올 혼합 용매를 이용하는 방법이 바람직하다.

에테르/에탄올 혼합 용매를 이용하는 방법은, 피검 시료에 대해서 에테르/에탄올 혼합 용매를 첨가하여 추출한 후, 더욱 물을 첨가하여 에테르 층을 이층(離層)시켜서, 에테르층을 지질 추출액으로서 회수하는 방법이다. 구체적으로는, 피검 시료 (예를 들면, 혈청 또는 혈장) 1.0 mL 대해, 에테르 0.2 ~ 2.0 mL, 바람직하게는 0.5 ~ 1.5 mL, 에탄올 1.0 ~ 4.0 mL, 바람직하게는 2.0 ~ 3.0 mL를 추가하여 추출한다. 이때 에테르/에탄올 비율(比)이 1:2 ~ 1:4로 되는 것이 바람직하다. 이어서 에테르를 2.0 ~ 10 mL 및 물을 4.0 ~ 10 mL 가해서 에테르층과 물층을 분리시킨다. 이때 추가하는 에테르/물의 비율이 1.0 ~ 2.5 인 것이 바람직하다. 상기 작업에서 의해 분리한 에테르층을 지질 추출액으로서 회수한다. 더욱 회수율을 높이기 위해 남은 물층에 더욱 에테르 2.0 ~ 5.0 mL를 추가하여 추출할 수 있다.

또한 피검 시료를 동결 건조후에 클로로포름과 메탄올을 이용하는 방법은, 예를 들어 다음과 같이 할 수 있다. 얻은 피검 시료(예를 들어, 혈장)를 동결 건조하고, 클로로포름:메탄올 = 2:1의 혼합액을 0.5 mL 첨가한다. 이 용액을 원심 분리하여 상층(1)을 회수한다. 남은 하층에, 클로로포름:메탄올 = 2:1의 혼합액을 1 mL 섞고, 더 원심 분리하여 상층(2)을 회수한다. 상기 상층(1)과 상층(2)를 혼합하고 질소를 분사하여 용매를 제거하고 고형물을 1 mL의 메탄올에 용해함에 의해, 플라스마로겐을 포함한 추출 시료를 얻을 수 있다.

상기 피검 시료로는, 인간을 포함한 동물 유래 시료이면 특별히 한정되는 것이 아니며, 예를 들면, 인간을 포함한 동물의 액체 시료 (예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 조직액, 수액, 타액, 소변, 눈물 또는 땀 등), 장기, 세포 및 조직 등을 들 수 있지만, 혈액, 혈청 또는 혈장 (이하 혈액 등으로 칭할 수 있다)이 보다 바람직하다. 예를 들어, 인간의 혈장을 피검 시료로 사용하는 경우에는, 혈액을 혈액 응고제 (예를 들면, EDTA)가 들어 있는 채혈관에서 채혈하고, 원심 분리에 의해 혈구 성분을 제외하고 사용할 수 있다. 또한 인간의 혈청을 피검 시료로 사용하는 경우에는, 혈액을 채혈 후에 실온에 두어, 분리한 혈청을 사용할 수 있다. 또한, 장기, 조직, 또는 세포를 이용하는 경우는, 장기, 세포 또는 조직의 추출액을 이용하여 플라스마로겐이 포함된 피검 시료액을 얻을 수 있으며, 그 피검 시료 액으로부터, 상기 플라스마로겐의 추출 방법에 따라, 플라스마로겐을 추출할 수 있다.

추출된 플라스마로겐은, 이하의 총 CP량의 측정 방법 및 CP의 분자종의 측정 방법에 사용될 수 있다.

《총 CP량의 측정 방법》

총 CP량의 측정 방법은, CP와 EP를 분리하여 측정할 수 있는 분석 방법이면, 특별히 한정되는 것이 아니며, 가스 크로마토그래피를 이용하는 방법, 고속 액체 크로마토그래피를 이용하는 방법 및 질량 분석 방법을 들 수 있지만, 특히 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하는 방법, 또는 질량 분석 방법이 바람직하다.

피검 시료 (예를 들면, 혈청 또는 혈장) 중의 CP양의 정량(定量)으로서는, 지금까지 플라스마로겐의 측정법으로서, sn-1 위치 유래의 디메틸 아세탈의 분석을 통해 플라스마로겐의 양을 환산하는 방법이나, TLC에서 분획하고, 인지질 클라스 분류한 후에 가스 크로마토그래피에서 분자종 분석하는 방법 밖에 없었지만, 최근에는 액체 크로마토그래피를 사용한 분석이, 다수의 검체를 신속하게 고감도로 분석할 수 있는 점에서, 많이 행해지게 되어서, 본 발명에서도, 이 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용할 수 있다. 또한, 질량 분석기를 이용하여 플라스마로겐의 분자종을 분석하는 방법도 이루어지게 되어, 본 발명에서는, 질량 분석기를 사용할 수도 있다. 이하에서 상세하게 설명한다.

(HPLC에 의한 총 CP양의 측정)

HPLC를 이용한 피검 시료(예를 들면, 혈청 또는 혈장) 중의 총 CP양의 정량 방법으로서는, 내부 표준으로서 cAP을 피검 시료에 첨가하여 추출하거나, 또는 cAP를 추출 지질에 첨가하여, 메탄올 중에서 방사성 요오드 시약과 반응시켜서, 생성된 방사성 요오드 결합 CP를 HPLC에서 용출하여 방사 활성을 측정하는 방법에 의한 것이 바람직하다.

방사성 요오드 반응 시약의 조제에 있어서는, 시판하는 방사성 요오드 (Na¹²⁵I)를 메탄올 중, pH 5.5 ~ 6.0의 산성 조건 하에서, 과산화수소 등의 산화제에 의해, 하룻밤 실온에서 산화하여 수행할 수 있다. 이 시약 중에는 플라스마로겐에 특이적으로 결합하는 방사성 삼요오드화물 (I^3-)이 70 % 이상 함유된다.

피검 시료로부터의 추출 지질과 방사성 요오드 반응 시약과의 반응에 있어서는, CP를 함유하는 메탄올 용해 시료 (예를 들면, 혈청 추출 시료 0.001 ~ 0.1 mL, CP 추정 함량 0.1 ~ 400 nmol)와 방사성 요오드 반응 시약 (예를 들면, 요오드 원자 10 mM 시약 0.001 ~ 0.1 mL)을 혼합하여, 일정 온도 (보통 4 ℃ ~ 30 ℃), 일정 시간 (일반적으로 12 ~ 24 시간) 정치(靜置)하는 것으로 실시한다.

HPLC의 용출 조건에서는, 콜린 글리세로인지질, 에탄올아민 글리세로인지질,및 내부 표준을 분별할 수 있는 컬럼 (예를 들면, Diol 컬럼 등)을 이용해, 적당한 용출 용매 (예를 들어, 아세토니트릴/물/초산/암모니아 )를 이용하여 용출할 수 있다.

CP (정확하게는, CP 유래의 요오드 결합 콜린 글리세로인지질)의 검출은, 감마 카운터 (바람직하게는 플로(フロ-)형 감마 카운터)에서 방사 활성을 측정하여 실시한다.

상기 방사성 요오드 반응 시약의 내부 표준 물질로서는, 화학양론적으로 요오드와 결합하며 지용성 화합물을 사용할 수 있는 것이면 한정되는 것은 아니고, 예를 들어, 2-히드록시 에틸 비닐에테르나 디에틸렌글리콜 비닐에테르 등의 비닐 에테르 화합물이나 혈청 중에 거의 존재하지 않는 리조플라스마로겐, 세린플라스마로겐, 상기 생체 내에 존재하지 않는 합성 콜린형 플라스마로겐 (특히, R³가 탄소수 4 ~ 6 또는 22 ~ 24의 알킬기를 가지는 합성 콜린형 플라스마로겐) 및 1-알케닐 환상 포스파티딘산을 꼽을 수 있지만, 바람직하게는 1-알케닐 환상 포스파티딘산 (cAP)을 사용한다. cAP 콜린 글리세로인지질과 물리 화학적 성상(性狀)이 유사하고, HPLC에서의 분리가 용이하며 저장 안정성이 높기 때문이다.

(질량 분석에 의한 총 CP양의 측정)

질량 분석기에 의한 총 CP양의 분석 방법은, 후술하는 질량 분석기를 이용한 CP의 분자종의 측정 방법에 따라 할 수 있다. 즉, 피검 시료로부터의 플라스마로겐의 추출, 내부 표준 물질 및 질량 분석기는 특별히 한정되는 것은 아니다. 후술하는 CP의 분자종의 측정에 있어서는, 생체 내에 존재하는 주요한 30종의 콜린형 플라스마로겐의 농도를 측정하는 것이 가능하지만, 그 농도를 합계함에 의해, 피검 시료 중의 총 CP양을 구할 수 있다.

《CP의 분자종의 측정 방법》

CP의 분자종의 측정 방법은, CP의 분자종을 분리하여 측정할 수 있는 방법이면 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 가스 크로마토그래피를 이용하는 방법, 고속 액체 크로마토그래피를 이용하는 방법 및 질량 분석 방법을 들 수 있지만, 특히 질량 분석 방법이 바람직하다. 질량 분석 방법도, 특히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하는 질량 분석법 (이하 LC/MS 법이라고 칭한다), 가스 크로마토크래피(ガスクロマトクラフィ-;GC)를 이용하는 질량 분석법 (이하, GC/MS법이라 칭한다) 및 캐필러리(キャピラリ-) 전기 영동(CE)를 이용하는 질량 분석법 (이하 CE-MS 법이라 칭한다)을 꼽을 수 있으며, 특히, LC/MS의 하나인 액체 크로마토그래피 텐덤 질량 분석법 (이하 LC-MS/MS법이라 칭한다)이 바람직하다. LC-MS/MS 법은 감도가 높고, 또한 플라스마로겐의 다양한 분자종을 분석하는 것이 가능하기 때문이다.

피검 시료로부터의 플라스마로겐을 추출하는 방법은 특별히 한정되는 것이 아니라, 상기의 추출 방법을 사용할 수 있지만, 바람직한 추출 방법은, 동결 건조 후에 클로로포름과 메탄올을 이용하는 방법이다. 내부 표준 물질은, CP의 분자종 별 검량선을 작성할 수 있는 한 한정되는 것은 아니지만, 구조의 유사성으로부터, 상기 합성 콜린형 플라스마로겐이 바람직하다. 합성 콜린형 플라스마로겐의 조제는, 상기의 화학 합성 또는 효소 합성에 의하여 수행할 수 있으며, 특히 제한되지 않는다. 또한 합성 콜린형 플라스마로겐의 종류도 생체 내에 존재하지 않는 것이면, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 상기 식 (3)으로 표시되는 sn-1 위치가 토리코산(トリコサン酸), sn- 2 위치가 올레인산의 콜린형 플라스마로겐 (이하 p23 : 0/18 : 1로 칭할 수 있다)이 바람직하다.

합성 콜린형 플라스마로겐은, 플라스마로겐 추출 이전의 피검 시료에 첨가해도 좋고, 또 플라스마로겐 추출 후의 시료에 첨가하여도 좋지만, 추출 효율 보정도 가능하므로, 플라스마로겐 추출 이전 피검 시료에 첨가하는 것이 바람직하다.

플라스마로겐의 질량 분석에서, 내부 표준 화합물을 이용한 보정 방법은, 특히 한정되는 것은 아니지만, 기지(旣知)의 단계 희석한 농도의 플라스마로겐과 기지의 농도의 내부 표준 화합물로부터, 작성한 검량선을 이용하는 방법이 바람직하다. 즉, 검량선은 플라스마로겐의 농도가 다른 표준 용액에, 내부 표준 화합물을 첨가한 검체를 이용하여, 작성할 수 있다.

LC-MS/MS법에 의한 질량 분석에서, 검량선을 작성하는 경우에는, 내부 표준 화합물의 피크(ピ-ク) 프래그먼트(フラグメント)의 면적과, 플라스마로겐의 피크 프래그먼트의 면적과의 비(比)를 구하고, 이 비를 그래프 상에 플롯트(プロット)함으로써 신뢰성이 높은 검량선을 만들 수 있다. 실제 측정에서는 생체 시료에 알려진 양의 내부 표준 화합물을 첨가하고, 얻은 검량선에 내부 표준 화합물의 피크 프래그먼트와, 검체 중의 플라스마로겐의 피크 프래그먼트의 면적비를 적용하여, 정확한 측정값을 얻을 수 있다.

플라스마로겐을 질량 분석하는 경우에는, 이온화에 의해 일부 프래그먼트가 생성되는 것으로 알려져 있으며, 검량선을 작성하기 위한 프래그먼트는 특히 한정되는 것은 아니지만, 상기 합성 콜린형 플라스마로겐 및 시료 중의 플라스마로겐의 피크 프래그먼트로서는, 예를 들면 하기의 일반식 (5)

로 표현되는 콜린인산(コリンリン酸) 유래의 프래그먼트 (이하 「콜린인산 프래그먼트」라고 칭할 수 있다)를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 합성 콜린형 플라스마로겐의 상기 콜린인산 프래그먼트 및 시료 중의 플라스마로겐의 상기 콜린인산 프래그먼트의 면적비를 플로트함에 의해, 검량선을 작성할 수 있다.

작성된 검량선을 이용하여, 플라스마로겐의 분자종 마다의 농도 측정이 가능하다. 피검 시료 중의 주요한 콜린형 플라스마로겐의 분자종은 sn-1위치가 16:0, 18:0 또는 18:1의 3 종류, sn-2위치가 16:0, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:4, 20:5, 22:4, 22:5 또는 22:6의 10 종류이다. 따라서, 생체 내의 주요한 콜린형 플라스마로겐의 분자종은 30종이다. 또한 에탄올아민형 플라스마로겐의 분자종의 sn-1위치의 측쇄 및 sn-2위치의 측쇄도 마찬가지이며, 생체 내의 주요한 에탄올아민형 플라스마로겐의 분자종도 30 종류가 있다. 또한 모든 콜린형 플라스마로겐의 분자종의 농도를 합계함에 의해, 피검 시료 중의 총 CP양을 구할 수도 있다.

또한, 본 명세서에서 sn-1위치의 측쇄는 「-CH = CH-R¹」을 의미하고, 측쇄에 포함된 탄소수와 이중 결합의 표기에 있어서는, 예를 들어 「16:1」이라고 기재 한 경우, 측쇄에 포함된 탄소수가 16이고, 비닐 에테르 결합을 제외한 이중 결합이 1임을 나타낸다. 또한 sn-2위치의 측쇄는 「-CO-R²」를 의미하고, 측쇄에 포함 된 탄소수와 이중 결합의 표기에 있어서는, 예를 들어 「20:4」라고 기재한 경우는, 측쇄에 포함된 탄소수가 24이며, 이중 결합이 4임을 나타낸다.

《총 CP량에 의한 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출》

상기 총 CP량의 측정 방법에 의해 얻어진 총 CP양의 측정값은, 후술하는 실시예에 나타난 바와 같이, 체중(상관 계수: -0.334), 복부 둘레(상관 계수: -0.375 ), 중성 지방(상관 계수: -0.327), HDL-C(상관 계수: 0.714), sdLDL(상관 계수: -0.224), AIP(상관 계수: -0. 576) 및 아디포넥틴(상관 계수: 0.314)과 높은 상관성을 나타낸다 (표 3 및 표 4).

또한 총 CP양은, 정상인 군에서는 65.9 μM 인 것에 대해서, 대사 증후군 군에서는 56.5 μM이며, 대사 증후군 군에서 유의(有意)하게 낮은 것을 알 수 있다 (표 5).

《CP의 분자종의 농도에 따른 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출》

본 발명의 검출 방법에서는, 총 CP양 이외에 CP 각각의 분자종의 농도를 사용할 수 있다. 예를 들어, sn-1위치 및 sn-2위치의 측쇄의 차이에 따라 30 종류의 CP의 분자종 별 농도를 사용할 수 있고, sn-1위치의 측쇄의 차이에 따라 3 종류의 분자종 별 농도를 사용할 수 있으며, sn-2위치의 측쇄의 차이에 따라 10 종류의 CP의 분자종 별 농도를 사용할 수도 있지만, sn-2위치에 올레인산을 가지는 콜린형 플라스마로겐 (이하, C18:1CP로 칭할 수 있다) 또는 sn-2위치에 리놀레산을 가지는 콜린형 플라스마로겐 (이하, C18:2CP로 칭할 수 있다)의 농도를 이용하는 것이 바람직하며, 특히 바람직하게는 C18:1CP의 농도를 사용한다.

상기 C18:1CP의 농도의 측정값은 실시예와 나타난 바와 같이, 체중(상관 계수: -0.438), 복부 둘레(상관 계수: -0.461), 중성 지방(상관 계수: -0.415), HDL-C(상관 계수: 0.757), sdLDL(상관 계수: -0.319), AIP(상관 계수: -0.641) 및 아디포넥틴(상관 계수: 0.446)과 높은 상관성을 나타낸다 (표 4). 또한 C18:1CP의 농도는, 정상인 군에서는 6.3 μM 임에 대해서, 대사 증후군 군에서는 4.8 μM이며, 대사 증후군 군에서 유의하게 낮은 것을 알 수 있다 (표 5).

《CP의 농도 및 인지질 농도의 비에 의한 검출》

본 발명의 검출 방법의 다른 양태에 있어서는, 피검 시료 중의 콜린형 플라스마로겐 농도의 측정값과 피검 시료 중의 인지질 농도의 측정값의 비율에 따라서 대사 증후군 또는 생활 습관병을 검출할 수 있다. 콜린형 플라스마로겐 농도는 총 CP양, CP의 분자종의 농도 모두에 사용할 수 있지만, 바람직하게는, C18:1CP 또는 C18:2CP의 농도이다.

또한 콜린형 플라스마로겐 농도의 측정값과, 피검 시료 중의 인지질 농도의 측정값의 비를 계산하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 「CP의 농도/인지질 농도」에 의해 계산할 수 있다. 이 계산 방법의 경우, 인지질 중의 총 콜린형 플라스마로겐 농도 또는 인지질 중의 CP의 분자종의 농도를 의미하고 있다.

또한 피검 시료 중의 모든 인지질을 측정하는 방법에서는, 정법(定法)에 따를 수 있어서, 예를 들면, 추출 지방질을 회화(灰化)처리하여 생성하는 인(リン)량에 있어서 인몰리브덴 반응 등을 이용해서 정량하는 방법, 또는 HPLC 법 또는 콜린 옥시다제(コリンオキシダ-ゼ)·DAOS 법 (인지질 C-테스트 와코(テストワコ-) 등의 키트)으로 측정하는 방법 등으로 행할 수 있다.

《CP의 농도 및 피검자의 체중 비에 의한 검출》

본 발명의 검출 방법의 다른 양태에 있어서는, 피검 시료 중의 콜린형 플라스마로겐 농도의 측정값과, 피검자의 체중의 측정값의 비에 따라서, 대사 증후군 또는 생활 습관병을 검출할 수 있다. 콜린형 플라스마로겐 농도는, 총 CP양, CP의 분자종의 농도 모두 사용할 수 있지만, 바람직하게는, C18:1CP 또는 C18:2CP의 농도이다.

또한 콜린형 플라스마로겐 농도의 측정값과 피검자의 체중의 측정값의 비를 계산하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 「CP의 농도/피험자의 체중(kg)」에 의해 계산할 수있다. 이 계산 방법의 경우, 체중 1kg 당 콜린형 플라스마로겐 농도 값을 의미한다. 또한 피검자의 체중의 측정 방법에 있어서는, 정법(定法)에 따를 수 있다.

《CP의 농도 및 중성 지방의 농도의 비에 의한 검출》

본 발명의 검출 방법의 다른 양태에 있어서는, 피검 시료 중의 콜린형 플라스마로겐 농도의 측정값과, 중성 지방의 농도 측정값의 비에 따라서, 대사 증후군 또는 생활 습관병을 검출할 수 있다. 콜린형 플라스마로겐 농도는 총 CP양, CP의 분자종의 농도 모두 사용할 수 있지만, 바람직하게는 C18:1CP 또는 C18:2CP의 농도이다.

또한 콜린형 플라스마로겐 농도의 측정값과, 중성 지방의 농도 측정값의 비를 계산하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 「CP의 농도/중성 지방의 농도」에 의해 계산할 수 있다. 피검 시료의 중성 지방 함량을 측정하는 방법에 있어서는 정법에 따를 수 있다.

상기 CP의 농도 및 인지질 농도의 비에 의한 검출, CP의 농도 및 피검자의 체중의 비에 의한 검출 및 CP의 농도 및 중성 지방의 농도의 비에 의한 검출은, 모두 체중, 복부 둘레, 중성 지방, HDL-C, sdLDL, AIP 및 아디포넥틴과 높은 상관성을 보이며 (표 3 및 표 4), 정상인 군과 대사 증후군 군에서 유의하게 다른 것이지만, 특히 CP의 농도 및 중성 지방의 농도의 비, CP의 농도 및 피검자의 체중의 비 및 CP의 농도 및 인지질 농도의 비 순서로, 유의의 경향이 보였다.

본 발명의 검출 방법에서는, 피검 시료 중의 콜린형 플라스마로겐 농도 (또는 콜린형 플라스마로겐의 분자종의 농도)를 측정하고, 그의 측정값을 정상인 피검 시료 중의 콜린형 플라스마로겐 농도의 측정값으로부터 설정한 기준치와 비교함에 의해, 대사 증후군 또는 생활 습관병을 검출할 수 있다. 정상인의 기준치 혹은 대사 증후군 또는 생활 습관병의 컷오프값의 설정은, 관리된 임상 시험에 의해 결정된다.

본 발명의 검출 방법은, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 발병 예방용 또는 치료 효과의 모니터링용으로 사용할 수 있다. 또한, 대사 증후군 또는 생활 습관병 리스크 또는 중독도의 지표로서 사용할 수 있다. 특히, 중성 지방, sdLDL 및 AIP가 높은 값인 것은, 동맥 경화증의 원인이며, HDL-C, 아디포넥틴은 낮은 값인 것이 동맥 경화증의 발병 원인이다. 본 발명의 검출 방법에 의해 얻은 콜린형 플라스마로겐 농도, 콜린형 플라스마로겐의 분자종의 농도, CP의 농도 및 인지질 농도의 비, CP의 농도 및 피검자의 체중의 비 및 CP의 농도 및 중성 지방의 농도의 비는 중성 지방, HDL-C, sdLDL, 아디포넥틴 및 AIP와 상관성이 높고, 동맥 경화증의 발병 예방 또는 동맥 경화증의 위험의 마커로 이용하는 것이 가능하다.

《생활 습관병》

본 발명의 방법에 의해 검출되는 생활 습관병은, 식사, 수면, 또는 기호품 (예를 들면, 담배 또는 술) 등의 생활 습관을 주요한 원인으로 하는 질환이면 한정되는 것은 아니지만, 당뇨병, 지질 이상증 (고지혈증), 고혈압증, 비만증, 암, 뇌졸중, 동맥 경화증, 심근증, 심근 경색, 부정맥, 지방간, 알코올성 간 장애, 위궤양, 십이지장 궤양, 담석증, 치주병, 통풍, 항요산 혈증 및 골다공증을 들 수 있다. 본 발명의 검출 방법에 따르면, 특히 지질 이상증, 고혈압증 및 동맥 경화증을 높은 비율로 검출할 수 있다.

《대사 증후군》

본 발명의 방법에 의해 검출되는 대사 증후군은, 복부 둘레가 남성에서 85cm, 여성에서 90cm 이상을 「요주의」로 하고, 그 중에서 (1) 혈청 지질 이상 (트리글리세리드 값 150 mg/dL 이상, 또는 HDL 콜레스테롤 값 40 mg/dL 미만) (2) 혈압 고가(高價) (최고 혈압 130 mmHg 이상 또는 최저 혈압 85 mmHg 이상) (3) 고혈당 (공복시 혈당값 110 mg/dL)의 3 항목 중 2 개 이상을 가지는 피검자의 증상을 의미한다.

[2] 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 키트

본 발명의 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 키트는, 플라스마로겐의 분석용 내부 표준 물질로서, 하기의 일반식 (1)

(식 중, R³는, 탄소수 4 ~ 26의 알킬기 또는 알케닐기이며, M은 수소 원자 또는 카운터 양이온(對カチオン)이다)으로 표시되는 1-알케닐 환상 포스파티딘산, 또는

하기 일반식(2)

(식 중, R¹은 탄소수 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 또는 21의 알킬기이고, R²는 탄소수 8 ~ 21의 알킬기 또는 알케닐기이다)로 표시되는 화합물을 포함한다.

본 발명의 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 키트는, 본 발명의 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법에 사용될 수 있다. 따라서, 상기 키트에는 피검 시료로부터 플라스마로겐을 추출하는 추출 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추출 시약으로는, Bligh & Dyer법에 사용하는 추출 시약, Folch 법에 사용하는 추출 시약, 핵산/에탄올 혼합 용매, 에테르/에탄올 혼합 용매, 또는 클로로포름/메탄올 혼합 용매를 꼽을 수 있다. 또한, 본 발명의 키트에는 대사 증후군이나 생활 습관병의 검출용임을 명기한 취급 설명서를 포함할 수 있다. 포장 용기에 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출용임을 명기할 수도 있다. 또한, 본 발명의 검출 키트는 대사 증후군이나 생활 습관병의 진단에 사용될 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

《실시예 1》

21 ~ 66세의 피험자 451 명 (남성 382 명, 여성 69 명, 평균 연령 39.6 세, 40 세 이상 216 명)의 혈액에서 분획한 혈청을 마련했다. 그것의 일부에서 지질을 추출하고 CP를 정량했다. 또한 그 일부를 이용하여 인지질 C-테스트 와코에 의해 인지질 농도를 측정했다.

먼저 CP양의 정량 방법에 있어서 HPLC를 이용한 정량법으로, 이하의 방법으로 실시했다.

혈액으로부터의 총 지질의 추출은, 이하와 같이 하여 실시했다. 혈액을 원심 분리하여 얻은 혈청 0.15 mL에, 에테르 0.12 mL 및 에탄올 0.36 mL를 첨가하여, 10 분간 혼합했다. 2M 염화나트륨 수용액 0.9 mL, 에테르 0.48 mL를 첨가하고, 5 분간 혼합했다. 3000 rpm, 15 분 원심 후, 상층을 채취했다. 하층에 더욱 에테르 0.3 mL를 첨가하여 5 분간 혼합했다. 3000 rpm, 15 분 원심 후 상층을 채취했다. 채취액을 합하고, 질소 분사하여 용매를 증류제거(留去)한 후 내부 표준 물질 (cAP) 0.1 mM을 포함하는 메탄올 0.1 mL에 용해했다.

내부 표준 물질인 cAP은 하기와 같이 하여 조제했다. 리조콜린플라스마로겐 (후나코시(フナコシ), 클로로포름 용해) 약 5 mg을 50 mL 나사 마개(ねじ口) 시험관에 채취했다. 클로로포름을 질소 분사에서 건조하고, 즉시, 에테르 1.5 mL, 100 mM 초산 나트륨-40 mM 염화칼슘 완충액 (pH 5.6) 1.5 mL, 포스포리파아제D (명당산업(名糖産嶪)) 10U를 첨가한 후, 교반하면서, 40 ℃의 온욕(溫浴)으로 반응시켰다. 3 시간 정도 반응 후, TLC에 의해, 대부분의 리조플라스마로겐이 사라진 것을 확인했다. 반응액에 질소를 분사하고, 에테르를 증류제거(留去)한 후, 다시 에테르 1.2 mL 및 에탄올 3.6 mL를 첨가하여 10 분간 혼합했다. 2M 염화나트륨 수용액 9.0 mL, 에테르 4.8 mL를 첨가하여, 5 분간 혼합한다. 3000 rpm, 15 분 원심 후, 상층을 채취했다. 하층에 더욱 에테르 3.0 mL를 첨가하여 5 분간 혼합한다. 3000 rpm, 15 분 원심 후, 상층을 채취했다. 채취액을 합하고, 질소 분사하여 용매를 증류제거(留去)한 후 적당량의 메탄올에 용해하여 0.1 mM로 했다.

삼요오드 이온 (I^3-)을 포함하는 반응 시약은 이하와 같이 하여 준비했다. 시판하는 방사성 요오드 (Na¹²⁵I, 37 MBq/0.01 mL), 50 mM 수산화 나트륨-20 mM 요오드화 칼륨-메탄올 용액 1.0 mL, 2.0 M 초산-메탄올 용액 0.3 mL, 1.0 M 과산화수소-메탄올 용액 0.6 mL, 메탄올 0.1 mL를 혼합하여 실온에서 하룻밤 정치했다. 이를 10 mM 요오드 반응 시약으로 하여 실온에서 보존하여 사용했다.

각 혈청 추출 지질 시료 0.04 mL와 10 mM 요오드 반응 시약 0.01 mL을 혼합하여, 4 ℃에서 16 시간 반응시켰다. 반응 시료 (샘플) 0.02 mL (내부 표준 물질로 cAP을 1.74 nmoL 포함)을 다음 조건에서 HPLC에 제공했다. 용출액은 아세토니트릴/물/초산/암모니아 (93:6.895:0.07:0.035)를 이용해 유속 1.0 mL/분, 이소쿠라틱(イソクラチック)에서 용출했다. 컬럼은 Lichrospher100 Diol 250-4 (Merck)를 사용했다. 측정 시간은 15 분 이상에서 실시했다. 검출기는 플로(フロ-) 형 γ 카운터 (BIOSCAN)를 이용했다.

데이터 분석에는 SMARTCHROM (KYA 테크놀로지)를 이용해, CP와 cAP의 피크 면적값을 미리 작성한 검량선에 의해 환산 정량했다. 검량선은, 메탄올 용액 중에서 요오드 분자가 플라스마로겐의 비닐에테르 결합에 특이적으로 결합하는 것을 이용하여, 그 흡광도 변화로부터 정량하는 방법에 의해 정량한 값과 상기 측정에 제공하여 얻은 피크 면적값으로부터 만들어 냈다.

또한, 먼저 정량 시험을 4 회 실시하고, 내부 표준을 사용한 효과의 검증을 실시했다.

혈청 0.015 mL을 0.020 mL로 변경한 이외는 상술한 총 지질의 추출 방법에 따라 혈청 추출 시료를 얻은 후, 마찬가지로 요오드 반응 시약과의 반응을 하여, 얻은 반응 시료 (샘플)를 HPLC에 제공했다. 여기서 반응 시료 (샘플) 0.02 mL 중에 포함된 cAP 함량 (A)과, 측정된 cAP 함량 (B)로부터, 보정 계수 = (A)/(B)의 값을 구하고, 측정된 CP 함량에 이 보정 계수를 곱한 값을 산출하고, 4 회 측정분의 표준 편차와 변동 계수에 대해서 표 1에 기재하였다. 또한 CP 함량에 내부 표준 물질을 사용하지 않는 경우, 즉, 보정 계수를 곱하지 않는 경우에 대해서도 4 회 측정분의 표준 편차와 변동 계수를 산출하여, 동일하게 표 1에 기재 하였다.

또한 EP 함량에 대해서도 동일하게 측정하여, 결과를 표 1에 기재 하였다.

표 1의 결과에서 알 수 있듯이, 내부 표준 물질로 cAP를 사용하여 측정한 측정값은 사용하지 않은 측정치에 비해 표준 편차와 변동 계수가 현저하게 작아서, 혈청 중의 플라스마로겐의 측정 방법으로서 우수한 것임을 알 수 있다.

이 때문에, CP양의 측정에서는, cAP를 내부 표준으로 사용하기로 했다.

《실시예 2》

본 실시예에서는, 실시예 1의 21 ~ 66 세의 피험자 451 명 (남성 382 명, 여성 69 명, 평균 연령 39.6 세, 40 세 이상 216 명)의 혈청을 사용한 콜린형 플러스 마로겐의 분자종의 측정을, LC-MS/MS를 이용해서 수행했다.

혈액으로부터의 총 지질의 추출은, 이하와 같이 하여 수행했다. 혈액을 원심 분리하여 얻은 혈청 0.15 mL을 동결 건조하여, 내부 표준 물질로서, sn-1위치가 토리코산(トリコサン)산, sn-2위치가 올레인산의 합성 콜린형 플라스마로겐 (p23:0/18:1) 50 pmoL을 포함하는 클로로포름:메탄올=2:1의 혼합액 0.5 mL를 가하고, 10 분간 혼합한 후, 30 분간 실온에서 방치했다. 3000 rpm, 15 분간 원심 분리 후, 상층을 채취했다. 하층에 또한 클로로포름:메탄올=2:1의 혼합액을 1 mL 첨가하여, 혼합·방치한 후, 원심 분리를 행하여, 상층을 채취하고, 선행(先行)의 채취액과 합하고, 질소의 분사에 의해, 용매를 제거한 후, 1mL 메탄올에 용해하고, 필터를 통과 한 후, 적절한 메탄올로 희석한 후, LC-MS/MS를 이용하여 분석했다.

LC-MS/MS 측정 조건은 다음과 같다.

<LC(고속 액체 크로마토그래피)의 조건>

LC 시스템: Accela UHPLC System

용리액 A: 5 mM 포름산(ギ酸)암모늄 수용액

용리액 B: 아세토니트릴

컬럼 : Waters ACQUITY UPLC BEH C8 (2.1 × 100 mm, 1.7 μm)

칼럼 온도: 60 ℃

유속: 0.6mL/min

UHPLC의 용리액 조건을 표 2에 나타낸다.

MS 시스템: TSQ Quantum system

이온화 모드: HeatedESI, positive

캐필러리 전압: 3.2kV

콘(コ-ン) 전압: 35V

Desolvation 온도: 400 ℃

Source 온도: 80 ℃

충돌 에너지: 32eV (콜린형 플라스마로겐)

또한, 피검 시료 중의 콜린형 플라스마로겐의 정량을 위한 검량선 작성은, 이하와 같이 수행했다. 합성한 p16:0/20:4의 합성 콜린형 플라스마로겐을 메탄올에 용해하고, 표준 원액 (1.7 μmol/mL)을 조제했다. 상기 표준 원액을 메탄올로 희석하여, 0.085 pmol, 0.17 pmol, 0.34 pmol 및 0.51 pmol의 4 가지 농도의 표준 용액을 조제했다. 그런 다음 각각의 표준 용액에 합성한 p23:0/18:1을 100 pmol 첨가했다. 각각의 표준 용액을, 상기의 LC-MS/MS 측정 조건에 따라 해석했다. 얻어진 각 표준 용액 중의 p16:0/20:4와, p23:0/18:1의 콜린인산 유래 프래그먼트 (일반식 (5)의 콜린인산 프래그먼트)의 면적비 (peak area ratio)를 계산하고, 검량선을 작성했다. 이 검량선을 이용하여 인간의 혈장 시료 중의 콜린형 플라스마로겐의 정량을 실시했다.

또한, 내부 표준 물질로서, 상기 sn-1위치가 토리코산산, sn-2위치가 올레인산의 합성 콜린형 플라스마로겐 (p23:0/18:1)을 이용한 경우, 내부 표준 물질로서 코르산을 이용한 경우, 및 외부 표준법을 이용한 경우에 있어서, 혈청 시료 중의 콜린형 플라스마로겐의 평균값 및 표준 편차를 비교했다. 그 결과, 내부 표준으로 합성 콜린형 플라스마로겐 (p23:0/18:1)을 이용하는 경우는, 외부 표준을 이용한 것 및 코르산을 내부 표준으로 이용한 것과 비교하면, 수치가 높고, 차이 (표준 편차)도 작아, 내부 표준 물질로서 플라스마로겐을 사용하여, 보정한 수치의 정밀도가 높았다.

콜린형 플라스마로겐의 분자종은, sn-1위치가 16:0, 18:0 또는 18:1의 3 종류, sn-2위치가 16:0, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:4, 20:5, 22:4, 22:5 또는 22:6의 10 종류이며, 따라서 측정한 콜린형 플라스마로겐의 분자종은 30종류이다. 이러한 분자종 중 sn-2위치가 18:1 (올레인산)의 것과 18:2 (리놀레산)에 대해서는, 표 4에 데이터를 나타냈다.

《실시예 3》

한편, 상기 피험자 451 명에 대해, 나이, 성별, 신장, 체중, BMI, 복부 둘레, 혈압, GOT, GPT, γ-GTP, 요산, 중성 지방, HDL-C, LDL-C, 포도당, 아디포넥틴, sdLDL, hsCRP, AIP 등의 검사 항목의 측정·계산을 수행하여, 혈청 플라스마로겐양, CP양, EP양, CP/PL (인지질), CP/체중, CP/중성 지방, CP/EP와 각 항목 간의 상관성을 조사했다.

상기 것 중, 체중, 복부 둘레, 중성 지방, HDL-C, sdLDL, 아디포넥틴, AIP의 검사 항목과, CP양, CP/PL, CP/체중, CP/중성 지방, CP/EP의 각 값과의 상관성에 대해 표 3에 기재했다.

또한, 체중, 복부 둘레, 중성 지방, HDL-C, sdLDL, 아디포넥틴 및 AIP의 검사 항목과 CP양, C18:1CP, C18:1CP/PL, C18:1CP/중성 지방, C18:1CP/체중, C18:2CP, C18:2CP/PL, C18:2CP/중성 지방, C18:2CP/체중 및 CP/EP의 각 값과의 상관성에 대해서는 표 4에 기재했다.

상기의 결과, 먼저 CP양에 대해서, 동맥 경화증의 위험 인자로 되는 각 검사 항목과 높은 상관성이 보였다. 예를 들어, 체중에 대한 상관 계수에 있어서 -0.334, 복부 둘레에 대한 상관 계수에 있어서 -0.375, 중성 지방에 대한 상관 계수에 있어서 -0.327, HDL-C에 대한 상관 계수에 있어서 0.714, sdLDL 대한 상관 계수에 있어서 -0.224, AIP에 대한 상관 계수에 있어서 -0.576, 아디포넥틴 대한 상관 계수에 있어서 0.314였다.

또한 전체 인지질 양과 전체 CP 양의 비 (이하 CP/PL)는 전체 CP 양만에 의한 것 보다도 그들 인자와 높은 상관 관계를 나타내는 것을 발견했다. 예를 들어, 체중에 대한 상관 계수에 있어서 -0.374, 복부 둘레에 대한 상관 계수에 있어서 -0.408, 중성 지방에 대한 상관 계수에 있어서 -0.542, sdLDL 대한 상관 계수에 있어서 -0.458, AIP 대한 상관 계수에 있어서 -0.674, 아디포넥틴 대한 상관 계수에 있어서 0.319였다.

또한, 일반 검진 항목에 반드시 있는 체중, 중성 지방과 총 CP 양의 비도 전체 CP 양만에 의한 것 보다도 그들 인자와 높은 상관 관계를 나타내는 것을 발견했다. 예를 들어, CP/체중은, 복부 둘레에 대한 상관 계수에 있어서 -0.672, 중성 지방에 대한 상관 계수에 있어서 -0.398, HDL-C에 대한 상관 계수에 있어서 0.732, sdLDL 대한 상관 계수에 있어서 -0.347, AIP에 대한 상관 계수에 있어서 -0.631, 아디포넥틴 대한 상관 계수에 있어서 0.413였다. CP/중성 지방은, 체중에 대한 상관 계수에 있어서 -0.406 복부 둘레에 대한 상관 계수에 있어서 -0.452, sdLDL 대한 상관 계수에 있어서 -0.544, 아디포넥틴 대한 상관 계수에 있어서 0.358였다.

다음, CP 분자종의 분석 결과, 2 위치의 지방산이 올레인산 (C18:1CP) 또는 리놀레산 (C18:2CP)인 경우, CP 양만에 의한 것 보다도 상기의 검사 항목 중의 동맥 경화증 및 대사 증후군 관련 인자와 높은 상관 관계를 나타내는 것을 발견했다. 예를 들어, C18:1CP는, 체중에 대한 상관 계수에 있어서 -0.438, 복부 둘레에 대한 상관 계수에 있어서 -0.461, HDL-C에 대한 상관 계수에 있어서 0.757, 중성 지방에 대한 상관 계수에 있어서 -0.415, sdLDL 대한 상관 계수에 있어서 -0.319, 아디포넥틴 대한 상관 계수에 있어서 0.446, AIP에 대한 상관 계수에 있어서 -0.641였다.

또한 CP18:1/PL는, CP 양만에 의한 것 보다도 그들 요인과 높은 상관 관계를 나타내는 것을 발견했다. 예를 들어, 체중에 대한 상관 계수에 있어서 -0.463, 복부 둘레에 대한 상관 계수에 있어서 -0.479, 중성 지방에 대한 상관 계수에 있어서 -0.572, sdLDL 대한 상관 계수에 있어서 -0.500, 아디포넥틴 대한 상관 계수에 있어서, 0.453, AIP에 대한 상관 계수에 있어서, -0.715였다.

또한 일반 검진 항목에 반드시 있는 체중, 중성 지방과 총 CP18:1 량의 비는 총 CP양만의 비 보다도 상기의 검사 항목 중의 동맥 경화증과 대사 증후군 관련 인자와 높은 상관을 나타내는 것을 발견했다. 예를 들어, CP18:1/중성 지방과, 복부 둘레에 대한 상관 계수는 -0.477, sdLDL 대한 상관 계수는 -0.544, 체중에 대한 상관 계수는 -0.443, 아디포넥틴 대한 상관 계수는 0.408였다. CP18:1/체중은, HDL-C에 대한 상관 계수는 0.731, 복부 둘레에 대한 상관 계수는 -0.666, AIP에 대한 상관 계수는 -0.641, 아디포넥틴 대한 상관 계수는 0.474 이며, 모두 총 CP 량을 이용한 상관보다는 훨씬 높은 상관 계수를 얻었다.

또한 C18:2CP도, C18:1CP에 필적하는 상관 계수를 보여준다. 예를 들어, 체중에 대한 상관 계수에 있어서 -0.334, 복부 둘레에 대한 상관 계수에 있어서 -0.407, HDL-C에 대한 상관 계수에 있어서 0.651, 중성 지방에 대한 상관 계수에 있어서 -0.339, sdLDL 대한 상관 계수에 있어서 -0.265, 아디포넥틴 대한 상관 계수에 있어서 0.371, AIP에 대한 상관 계수에 있어서 -0.562였다.

더욱 CP18:2/PL는, CP18:2 양만에 의한 것 보다도 그들 인자와 높은 상관 관계를 나타내는 것을 발견했다. 예를 들어, 체중에 대한 상관 계수에 있어서 -0.361, 복부 둘레에 대한 상관 계수에 있어서 -0.423, 중성 지방에 대한 상관 계수에 있어서 -0.508, sdLDL 대한 상관 계수에 있어서 -0.444, AIP 대한 상관 계수에 있어서, -0.634였다.

또한 일반 검진 항목에 반드시 있는 체중, 중성 지방과 총 CP18:1 량의 비는 총 CP양만의 비 보다도 상기 검사 항목 중의 동맥 경화증과 대사 증후군 관련 인자와 높은 상관을 나타내는 것을 발견했다. 예를 들어, CP18:2/중성 지방과, 복부 둘레에 대한 상관 계수는 -0.496, sdLDL 대한 상관 계수는 -0.492, 체중에 대한 상관 계수는 -0.454, 아디포넥틴 대한 상관 계수는 0.391였다. CP18:2/체중, 복부 둘레에 대한 상관 계수는 -0.611, 아디포넥틴 대한 상관 계수는 0.435이며, 모두 총 CP 량을 이용한 상관보다는 훨씬 높은 상관 계수를 얻었다.

《실시예 4》

실시예 1의 피험자 451 명 중, 대사 증후군 진단 대상자인 40 세 이상의 피험자 156 명을, 대사 증후군의 판정 기준에 따라, 웨이스트 둘레 직경이 남성에서 85cm, 여성에서 90cm 이상을 「요주의」로 하고, 그 중에서 (1) 혈청 지질 이상 (트리글리세리드 값 150 mg/dL 이상 또는 HDL 콜레스테롤 40 mg/dL 미만) (2) 혈압 고가(高價) (최고 혈압 130 mmHg 이상 또는 최저 혈압 85 mmHg 이상) (3) 고혈당 (공복시 혈당치 110 mg/dL)의 3 항목 중 2 개 이상이 있는 피험자를 「메타포군(メタボ群)」, 3 항목 중 1 항목이 있는 피험자는 「준메타포군」으로 하고, 나머지를 「정상인 군」으로 했다.

이 3 군의, 혈청 플라스마로겐 양, CP 양, EP 양, CP/PL (인지질), CP/체중, CP/중성 지방, CP/EP, C18:1CP 양, C18:1CP/PL (인지질), C18:1CP/중성 지방, C18: 1CP/체중, C18:2CP 양, C18:2CP/PL (인지질), C18:2CP/중성 지방, C18:2CP/체중에 대해서, 각각의 평균값을 표 5에 기재했다.

또한 혈청 플라스마로겐의 sn-2위치의 주요 지방산은 C20:4 (아라키돈산) 인 것으로부터, C20:4CP 양, C20:4CP/PL (인지질), C20:4CP/중성 지방, C20:4CP/체중에 대해서도 측정·산출하고, 또한, 정상인 군을 1로 했을 경우의 상기 지표의 상대값을 표 6에 기재했다.

또한 혈청 플라스마로겐의 sn-2위치의 C20:4은 33.8 %, C18:2는 20.8 %, C18:1은 6.4 %였다.

상기 결과, 혈청 플라스마로겐 양, EP 양은, 3 군 모두 거의 차이가 보이지 않은 것에 대해, 그 밖의 다른 마커에서는, 3 군 사이에 유의한 차이가 보였다. 또한, CP 양에 관련된 값에 비해, C18:1CP 양 또는 C18:2CP 양에 관련된 값 쪽이, 특히 C18:1CP 양에 관련된 값이 보다 큰 차이를 보였다. 또한 인지질 함량의 비, 체중과의 비, 중성 지방과의 비의 순으로 뚜렷한 차이를 보였다. 또한 CP/EP에 있어서는, 메타포군의 값에서는 다른 마커와 같이 정상인 군과의 차이가 보이지만, 준 메타군의 수치는 정상인 군과의 차이가 작아서, 대사 증후군의 징후를 예견하기에는 다른 마커에 비해 열등한 것을 알 수 있다.

또한 2위치의 지방산으로서, 혈청 플라스마로겐의 주요 구성 지방산인 C20:4를 포함한 C20:4CP에 관련된 값에 비해 C18:1CP 또는 C18:2CP에 관련된 값 쪽이, 특히 C18:1CP에 관련된 값이 (B)/(A)의 값이 현저하게 작고, 즉 정상인 군과 메타 포군과의 차이가 큰 것을 알 수 있다.

본 발명의 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법 및 검출 키트는, 건강 진단 등에서 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 마커로 사용될 수 있다.

이상, 본 발명을 특정 측면에 따라 설명했지만, 당업자에게 자명의 변형이나 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims

피검 시료 중의 콜린형 플라스마로겐 농도를 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 콜린형 플라스마로겐 농도가, sn-2 위치에 올레인산을 가지는 콜린형 플라스마로겐 또는 sn-2 위치에 리놀레산을 가지는 콜린형 플라스마로겐의 농도인, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 피검 시료 중의 인지질의 농도 인지질 농도, 피검 시료 중의 중성 지방 농도 및 피검자의 체중으로 이루어진 군에서 선택되는 값을 측정하는 공정 및
상기 콜린형 플라스마로겐 농도의 측정값과, 상기 피검 시료 중의 인지질 농도 측정값, 피검 시료 중의 중성 지방 농도의 측정값 또는 피검자의 체중의 측정값과의 비를 계산하는 공정을 더 포함하는, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법.
청구항 1 내지 3의 어느 한 항에 있어서, 상기 생활 습관병이, 지질 이상증, 고혈압증 및 동맥 경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법.
청구항 1 내지 3의 어느 한 항에 있어서, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 발병 예방용 또는 치료 효과 모니터링용인, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법.
청구항 1 내지 5 중의 어느 한 항에 있어서, 플라스마로겐의 분석용 내부 표준 물질로서, 하기 일반식 (1)
[화학식 1]

(식 중, R³는 탄소수 4 ~ 26의 알킬기 또는 알케닐기이며, M은 수소 원자 또는 카운터 양이온이다)으로 표시되는 1-알케닐 환상 포스파티딘산, 및
일반식 (2)
[화학식 2]

(식 중, R¹은 탄소수 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 또는 21의 알킬기이고, R²는 탄소수 8 ~ 21의 알킬기 또는 알케닐기이다)으로 표시되는 화합물로
이루어진 군에서 선택되는 화합물의 적어도 하나를 이용하는, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 방법.
플라스마로겐의 분석용 내부 표준 물질로서, 하기 일반식 (1)
[화학식 3]

(식 중, R³는 탄소수 4 ~ 26의 알킬기 또는 알케닐기이며, M은 수소 원자 또는 카운터 양이온이다)으로 표시되는 1-알 케닐 환상 포스파티딘산을 포함한 것을 특징으로 하는, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 키트.
플라스마로겐의 분석용 내부 표준 물질로서, 일반식 (2)
[화학식 4]

(식 중, R¹은 탄소수 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 또는 21의 알킬기이고, R²는 탄소수 8 ~ 21의 알킬기 또는 알케닐기이다)으로 표시되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로하는, 대사 증후군 또는 생활 습관병의 검출 키트.