ES2567580T3 - PC-O 44:4 - Un biomarcador para la adiposidad visceral - Google Patents

Abstract

Uso de la 1-O-alquil-2-acilglicerofosfocolina 44:4 (PC-O 44:4), como un biomarcador, para detectar y / o cuantificar la adiposidad visceral y / o los cambios en la adiposidad visceral.

Description

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El biomarcador PC-O 44:4, puede evaluarse conjuntamente con los biomarcadores PC-O 44:6, PC-O 42:4, y PC-O

40:3.

El biomarcador PC-O 44:4, puede evaluarse conjuntamente con los biomarcadores PC-O 44:6, PC-O 42:4, PC-O 40:3, y PC-O 40:4.

El biomarcador PC-O 44:4, puede evaluarse conjuntamente con los biomarcadores PC-O 44:6, PC-O 42:4, PC-O 40:3, PC-O 40:4, y la glutamina.

El biomarcador PC-O 44:4, puede evaluarse conjuntamente con los biomarcadores PC-O 44:6, PC-O 42:4, PC-O 40:3, PC-O 40:4, glutamine y tirosina.

La ventaja de evaluar más que de un biomarcador, es la consistente en que, cuantos más biomarcadores se evalúan, más fiable será la diagnosis. Así, por ejemplo, si más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, ó 7 biomarcadores, exhiben las elevaciones o disminuciones en las concentraciones, de la forma la cual se ha descrito anteriormente, arriba, es entonces mayor el poder predictivo para la presencia o ausencia y el grado de la obesidad visceral, así como el riesgo para los trastornos o desórdenes asociados.

En concordancia con lo anteriormente expuesto, los inventores, han identificado incluso otros biomercadores adicionales, los cuales pueden utilizarse para predecir la adiposidad visceral y riesgo de desarrollar trastornos o desórdenes asociados.

Así, por ejemplo, se encontró el hecho de que, unas concentraciones incrementados de la fenilalanina, la Leucina, Isoleucina, la palmitoilcarnitina (C16), la caproilcarnitina (C10), la octenoilcarnitina (C8:1), la lisofosfatidilcolina (LPC) 24:0, la fosfatidilcolina (PC)PC 30:0, y / o PC 34:4 en los fluidos corporales, o unas concentraciones disminuidas de las PC-O 34:1, PC-O 34:2, PC-O 36:2, PC-O 36:3, PC-O 40:6, PC-O 42:2, PC-O 42:3, PC-O 44:3, PC-O 44:5, PC 42:0, y / o PC 42:2 en los fluidos corporales, en comparación con los correspondientes valores de referencia, previamente obtenidos, indican un adiposidad visceral incrementada y un riesgo incrementado para los trastornos o desórdenes asociados.

PC es fosfatidilcolina. LPC es lisofosfatidilcolina. C es acilcarnitina.

A la inversa, unas concentraciones disminuidas de fenilalanina, Leucina, Isoleucina, C10 (decanoilcarnitina), C16 (Palmitoilcarnitina), C8:1 (Octenoil-Carnitina) LPC 24:0, PC 30:0, y / o PC 34:4 en los fluidos corporales, o unas concentraciones incrementadas de PC-O 34:1, PC-O 34:2, PC-O 36:2, PC-O 36:3, PC-O 40:6, PC-O 42:2, PC-O 42:3, PC-O 44:3, PC-O 44:5, PC 42:0, y / o PC 42:2 en los fluidos corporales, en comparación con los valores de referencia, previamente obtenidos, indican una adiposidad visceral disminuida y un riesgo disminuido para los trastornos o desórdenes asociados.

Así, de este modo, los procedimientos de la presente invención, pueden comprender, de una forma adicional, las etapas de determinar el nivel de por lo menos uno biomarcador adicional, seleccionado de entre el grupo consistente en la fenilalanina, la Leucina, la Isoleucina, C10 (decanoilcarnitina), C16 (Palmitoilcarnitina), C8:1 (Octenoil-Carnitina), LPC 24:0, PC 30:0, PC 34:4, PC-O 34:1, PC-O 34:2, PC-O 36:2, PC-O 36:3, PC-O 40:6, PC-O 42:2, PC-O 42:3, PC-O 44:3, PC-O 44:5, PC 42:0, y / o PC 42:2 en la muestra de fluido corporal, y comparar el nivel, en el sujeto, de por lo menos uno de entre la fenilalanina, la Leucina, la Isoleucina, C10, C16, C8:1, carnitina, LPC 24:0, PC 30:0, PC 34:4, PC-O 34:1, PC-O 34:2, PC-O 36:2, PC-O 36:3, PC-O 40:6, PC-O 42:2, PC-O 42:3, PC-O 44:3, PC-O 44:5, PC 42:0, y / o PC 42:2 con respecto a un valor de referencia predeterminado, en donde, el valor de referencia predeterminado en cuestión, se basa en los niveles promedio de fenilalanina, Leucina, Isoleucina, C10, C16, C8:1, carnitina, LPC 24:0, PC 30:0, PC 34:4, PCO 34:1, PC-O 34:2, PC-O 36:2, PC-O 36:3, PC-O 40:6, PC-O 42:2, PC-O 42:3, PC-O 44:3, PC-O 44:5, PC 42:0, y / o PC 42:2, en una muestra de fluido corporal, de una población normal de control, sana, o en los niveles de fenilalanina, Leucina, Isoleucina, C10 (decanoilcarnitina), C16 (Palmitoilcarnitina), C8:1 (Octenoil-Carnitina), LPC 24:0, PC 30:0, PC 34:4, PC-O 34:1, PC-O 34:2, PC-O 36:2, PC-O 36:3, PC-O 40:6, PC-O 42:2, PC-O 42:3, PC-O 44:3, PC-O 44:5, PC 42:0, y / o PC 42:2, en el mismo fluido corporal, obtenido del mismo sujeto, previamente, y en donde, un nivel incrementado de fenilalanina, Leucina, Isoleucina, C10, C16, C8:1, carnitina, LPC 24:0, PC 30:0, y / o PC 34:4, en el fluido corporal y / o un nivel disminuido de PC-O 34:1, PC-O 34:2, PC-O 36:2, PC-O 36:3, PC-O 40:6, PC-O 42:2, PC-O 42:3, PC-O 44:3, PC-O 44:5, PC 42:0, y / o PC 42:2, en la muestra de fluido corporal, en comparaciones con los valores de referencia predeterminados, indica una adiposidad visceral incrementada.

Una adiposidad visceral incrementada, incrementa el riesgo de desarrollar trastornos o desórdenes asociados con un exceso de grasa visceral.

Así, por consiguiente, en los procedimientos de la presente invención, el grado de adiposidad visceral, puede utilizarse como una indicación para la probabilidad o riesgo de desarrollar trastornos o desórdenes asociados con un exceso de grasa visceral.

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662,67 µM de fluido corporal para la glutamina, 1,47 µM de fluido corporal para la PC-O 44:6, 0,84 µM de fluido corporal para la PC-O 44:4, 1,27 µM de fluido corporal para la PC-O 42:4, 2,65 µM de fluido corporal para la PC-O 40:4, 1,37 µM de fluido corporal para la PC-O 40:3, 52,97 µM de fluido corporal para la fenilalanina, 193,56 µM de fluido corporal para las Leucina + Isoleucina, 0,19 µM de fluido corporal para la C10, 0,06 µM de fluido corporal para la C16, 0,03 µM de fluido corporal para la C8:1, 0,25 µM de fluido corporal para la LPC 24:0, 4,18 µM de fluido corporal para la PC 30:0, 1,11 µM de fluido corporal para la PC 34:4,

9.84 µM de fluido corporal para la PC-O 34:1, 11,49 µM de fluido corporal para la PC-O 34:2, 11,79 µM de fluido corporal para la PC-O 36:2, 7,20 µM de fluido corporal para la PC-O 36:3, 3,68 µM de fluido corporal para la PC-O 40:6, 0,56 µM de fluido corporal para la PC-O 42:2, 0,89 µM de fluido corporal para la PC-O 42:3, 0,21 µM de fluido corporal para la PC-O 44:3, 2,17 µM de fluido corporal para la PC-O 44:5, 0,56 µM de fluido corporal para la PC 42:0, 0,22 µM de fluido corporal para la PC 42:2.

En los sujetos normales, los valores medios de referencia, pueden ser, aproximadamente

75,00 µM de fluido corporal para la tirosina, 748,27 µM de fluido corporal para la glutamina, 1,21 µM de fluido corporal para la PC-O 44:6, 0,50 µM de fluido corporal para la PC-O 44:4, 1,12 µM de fluido corporal para la PC-O 42:4, 3,24 µM de fluido corporal para la PC-O 40:4, 2,10 µM de fluido corporal para la PC-O 40:3, 49,17 µM de fluido corporal para la fenilalanina, 197,52 µM de fluido corporal para la Leucina + Isoleucina, 0,29 µM de fluido corporal para la C10, 0,09 µM de fluido corporal para la C16, 0,04 µM de fluido corporal para la C8:1, 0,77 µM de fluido corporal para la LPC 24:0, 4,10 µM de fluido corporal para la PC 30:0, 1,42 µM de fluido corporal para la PC 34:4, 8,20 µM de fluido corporal para la PC-O 34:1, 9,26 µM de fluido corporal para la PC-O 34:2, 12,67 µM de fluido corporal para la PC-O 36:2, 5,83 µM de fluido corporal para la PC-O 36:3, 4,45 µM de fluido corporal para la PC-O 40:6, 0,82 µM de fluido corporal para la PC-O 42:2, 1,08 µM de fluido corporal para la PC-O 42:3, 0,22 µM de fluido corporal para la PC-O 44:3, 1,82 µM de fluido corporal para la PC-O 44:5, 0,65 µM de fluido corporal para la PC 42:0, 0,35 µM de fluido corporal para la PC 42:2.

Los sujetos a ser sometidos a test de ensayo con el procedimiento de la presente invención, puede ser un ser humano o un animal, de una forma particular, un mamífero, por ejemplo, los animales típicos, pueden ser los animales de compañía o domésticos, tales como los consistentes en los gatos, en los perros o en loa animales de granja, por ejemplo.

Aquellas personas expertas en el arte especializado de la técnica, entenderán el hecho de que, éstas, podrán combinar, de una forma libre, la totalidad de las características de la presente invención, las cuales se describen aquí, en este documento de solicitud de patente, sin salirse del ámbito de la presente invención, de la forma mediante la cual ésta se revela. De una forma particular, las características las cuales se describen aquí, para los

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procedimientos de la presente invención, pueden aplicarse a otros procedimientos y al uso de la presente invención, y viceversa.

Otras ventajas y características adicionales de la presente invención resultarán evidentes, a raíz de los ejemplos y figuras los cuales se facilitan abajo, a continuación.

La tabla 1, muestra unas características clínicas del cohorto seleccionado, según su estratificación en cuatro cuartiles, en base a su contenido de grasa visceral, según se evalúa mediante el valor de log10 del factor de relación (ratio) o cociente de la grasa intraperitoneal / abdominal, mediante tomografía computerizada.

Los valores, se presentan como (±SD) media. ALAT = alanina aminotransferasa, ASAT= aspartato aminotransferasa, BMI = índice de masa corporal, GGT= gamma-glutamiltranspeptidasa, HDL-C= lipoproteína colesterol de alta densidad, HOMAIR = evaluación del modelo de homeostasis de la resistencia a la insulina, LDL-C= lipoproteína colesterol de baja densidad, MAP = presión sanguínea arterial media, NEFAs = ácidos grasos no esterificados, TG = triglicéridos.

La tabla 2, muestra las concentraciones de metabolitos, presentados como (±SD) media, para cada uno de los cuatro cuartiles, en base a su contenido de grasa visceral, según se evalúa mediante el valor de log10 del factor de relación (ratio) o cociente de la grasa intraperitoneal / abdominal, mediante tomografía computerizada.

La figura 1, muestra la reconstrucción estadística de los perfiles de plasma sanguíneo mediante 1H NMR, mediante la utilización de un análisis de bosques aleatorios, para identificar los modelos patrón metabólicos, asociados con la adiposidad visceral (según se identifica mediante casillas cuadradas). GPCs = gilcerofosfolípidos, PUFAs = ácidos grasos poliinsaturados (de sus iniciales en idioma inglés, polyunsaturated fatty acids), UFAs = ácidos grasos insaturados (de sus iniciales en idioma inglés, unsaturated fatty acids).

La figura 2 muestra la importancia y la robustez de los metabolitos, en la predicción de la adiposidad de grasa visceral, según se evalúa mediante análisis de bosques aleatorios. Los valores medios agrupados, disminuyen, en cuanto a lo referente a la precisión, después de n = 10000 generaciones de bosques aleatorios. Una importancia mayor de la variable, corresponde a unos mayores valores medios agrupados, los cuales disminuyen en cuanto a lo referente a su precisión.

Las figuras 3 – 1, 3 -2, y 3 – 3, muestran diferencias de metabolitos entre los sujetos de alta grasa visceral y los sujetos de baja grasa visceral, para cada uno de los metabolitos seleccionados. Se procede a un trazado de los gráficos, para cada uno de los cuartiles, en base a su contenido de grasa corporal, según se valor mediante el valor de log10, de volumen de grasa intraperitoneal, medido mediante tomografía computerizada, 1 = quartil 1, 2 = quartil 2, 3 = quartil 3, 4 = quartil 4.

EJEMPLOS

Sujetos y diseño experimental

El ensayo clínico, se basaba en un estudio observacional el cual se llevó a cabo en 40 mujeres caucasianas obesas, sanas, en el en centro hospitalario universitario “Centre Hospitalier Universitaire Baudios” (CHUV, Lausanne, Suiza). El protocolo del estudio, se aprobó por parte de un comité ético independiente, el cual se encontraba ubicado en el citado centro hospitalario universitario (CHUV). Los participantes en el estudio, tenían un índice de masa corporal (BMI), correspondiente a un valor situado dentro de unos márgenes de 28 y 40, éstos tenían una edad situada entre los 25 años y los 45 años, y no mostraban rasgos de enfermedad metabólica (diabetes del tipo 2, enfermedad cardiovascular o síndrome metabólico). Las muestras biológicas resultantes (a saber, muestras de orina y muestras de orina de 24 horas), se almacenaron a una temperatura de – 80 °C, hasta la realización de los análisis metabólicos.

Evaluación de la composición corporal

Se procedió a llevar a cabo una exploración corporal de rastreo total, con objeto de determinar ambas, la distribución de la grasa abdominal y la composición corporal total. Las exploraciones corporales de rastre total, se llevaron a cabo en un sistema de exploración de rastreo por absorciometría de rayos X de doble energía (DXE) equipado con sistema informático, del tipo, “GE Lunar iDAX system” (versión del programa de software informático: enCORE, versión 12.10.113), mediante uno modo de exploración de rastreo, el cual se realizó, de una forma automática, mediante el dispositivo de exploración en cuestión. Para la medición mediante absorciometría de rayos X de doble energía (DXA), todos los sujeto llevaban un bata hospitalaria, y a éstos se les había retirado la totalidad de los artefactos metálicos los cuales pudieran eventualmente llevar. La unidad informática de absorciometría de rayos X de doble energía (iDXA), se calibró diariamente, mediante la utilización un espectro de calibración del tipo “GE Lunar phantom”. La realización de la totalidad de las exploraciones de rastreo o escáners, se llevaron a cabo por parte de un operador experimentado y entrenado, siguiendo el manual de instrucciones para el operador, para el

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posicionamiento y la obtención de datos. Durante la consulta, de un transcurso de tiempo correspondiente a una duración de aproximadamente una hora, se procedió a llevar a cabo la totalidad de las exploraciones de rastreo corporal, dos veces, para cada sujeto, con reposicionamiento o recolocación, entre las exploraciones de rastreo. Las exploraciones de rastreo o escáners, se analizaron mediante el sistema de software informático enCORE (versión 12.00.207). Las regiones de interés (ROIs – [de sus iniciales en idioma inglés, correspondientes a Region of Interest] -), se determinaron de una forma automática, mediante el sistema de software informático enCORE (Auto ROI), para la región correspondiente a la totalidad del cuerpo, para la región de los brazos, para la región de las piernas, para la región del tronco, y para la región ginoide. Un operario experto en la realización de mediciones por absorciometría de rayos X de doble energía, procedió a la verificación y, así mismo, también, cuando fuere indicado, al roposicionamiento o recolocación de los emplazamientos de la regiones de interés (ROIs), (experto en ROI). De una forma adicional a la exploración de rastreo o escaneado asistida mediante sistema de software informático, se procedió a llevar a cabo mediciones de la cintura y de la cadera.

Las mediciones de tomografía computerizada (CT), se llevaron a cabo en un dispositivo de exploración de rastreo o escáner mediante cromatografía computerizada con un multidetector de 64 cortes (VCT Lightspeed, GE Medical Systems, Milwaukee, USA). Los sujetos a ser sometidos a la exploración de rastreo, se colocaron en una posición tal, como para que éstos yacieran en una posición supina, con sus brazos arriba y su cabeza y piernas, elevadas mediante un cojín. Se requiere una exploración de rastreo individual (10 mm), del abdomen, en el nivel de las vértebras L4 – L5, y se procede al análisis del área de la sección transversal del tejido adiposo, expresada en centímetros cuadrados. Se procedió a la utilización de los siguientes parámetros para la obtención de datos: 12 kv, 100 – 200 mA, con una modulación de dosis en el eje z, y un campo de visión de 500 mm. Se procede a una reconstrucción de las imágenes transversales axiales, de 5 mm de espesor de corte o rebanada, mediante la utilización de un núcleo estándar. El proceso de cuantificación, utiliza un algoritmo semi-interactivo, comercialmente disponible en el mercado, para la segmentación de la grasas subcutánea e intraabdominal, en una estación de trabajo del tipo “Advantage Window Workstation” (GE Medical Systems).

Química clínica

Se procedió a determinar los valores correspondientes al plasma total, al colesterol de alta densidad (HDL) y al colesterol de baja densidad (LDL), a los triglicéridos, a los uratos, a la creatinina, a las concentraciones de sodio y de potasio, a la alanina aminotransferasa (ALAT), a la aspartato aminotransferasa (ASAT)=, a la gammaglutamiltranspeptidasa (GGT), y a la presión arterial media (MAP), mediante a la utilización de métodos de laboratorio de rutina. El estatus de la resistencia a la insulina, se evaluó como un modelo de evaluación de la homeostasis de la resistencia a la insulina (HOMA -IR), correspondientemente en concordancia con la fórmula anteriormente descrita, arriba (Mathews et al., 1985): insulina (µU/ml) x glucoa (µMol/l) / 22,5.

Preparación de las muestras y análisis de espectroscopia de 1H-NMR

Se procedió a introducir muestras de plasma de sangre con heparina (400 µl), en tubos de NMR de 5 mm, con 200 µl de una solución de tampón fosfato deuterizada (KH2PO4 con una concentración final de 0,2 M). Como substancia de bloqueo, se procedió a utilizar el deuterio. Los perfiles metabólicos, se midieron en un espectrómetro de 660 MHz, del tipo “Bruker Avance III 600 MHz spectrometer”, equipado con una sonda criogénica inversa, de 5 mm, a 300 K (Bruker Biospin, Rheinstetten, Alemania). Se obtuvo, para cada muestra de plasma, la secuencia de impulsos unidimensionales de 1H-NMR estándar, con supresión de agua (RD=4s), la secuencia de eco de espín, Carr-PurcellMeiboom-Gill (CPMG), con supresión de agua (RD=4s), y la secuencia editada por difusión (RD=4s). Para cada experimento unidimensional, se procedió a recopilar 32 exploraciones de rastreo o escáners, mediante la utilización de 98 K puntos de datos. Los espectros de 1H-NMR, se procesaron mediante la utilización de un paquete de software informático del tipo TOPSPIN (versión 2.1, Bruker, Alemania), previamente a la transformación de Fourier. Los espectros de NMR obtenidos, se ajustaron manualmente en cuanto a lo referente a la fase, y se corrigieron con respecto a los datos de base de referencia, y se reverenciaron al cambio químico del protón anomérico de la αglucosa, en δ 5,2396, para el espectro de plasma. La asignación de las resonancias de 1H-NMR, a los metabolitos específicos, se llevó a cabo mediante el emparejamiento de ajuste en nuestra base de datos de NMR, desarrollada en nuestra casa, de los compuestos puros, mediante la utilización de los datos existentes en la literatura especializada (véase, a dicho efecto, Fan, T. W. (1996) Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, -Progreso en la espectroscopia de resonancia magnético nuclear -, 28, 161 -219; Nicholson, J. K., et al. (1995) Anal. Chem. 67, 793 -811). La identificación de los metabolitos, se confirmó mediante las técnicas de NMR, consistentes en la espectroscopia de correlación 2 D de 1H-1H (2D 1H-1H correlation SpectroscopY (COSY) (Hurd, R. E. (1990) J. Magn. Reson. 87, 422 -428), Espectroscopia de correlación total 1H-1H (1H-1H TOtal Correlation Spectroscopy) (TOCSY) (Bax, A. & Davis (1985) J. Magn. Reson. 65, 355 -360) y Correlación cuántica heteronuclear individual 1H13C (1H-13C Heteronuclear Single Quantum Correlation (HSQC) (Bodenhausen, G. & Ruben (1980) Chemical Physics Letters 69, 185 -189).

Preparación de las muestras, para un equipo de análisis, a modo de kit, del tipo “Biocrates Life Sciences Absolute IDQTM kit analysis”

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Se procedió a utilizar el equipo de análisis, a modo de kit, del tipo “Biocrates Life Sciences Absolute IDQTM kit analysis”, para las muestras de plasma en EDTA, tal y como se ha publicado, con anterioridad (véase, a dicho efecto (Römisch-Margl, W., C. Prehn, R. Bogumil, C. Röhring, K. Suhre, J. Adamski, Procedure for tissue sample preparation and metabolite extraction for high-throughput targeted metabonomics, -Procedimiento para la preparación de muestras de tejido y para la extracción de metabolitos, para metabonómica de alto rendimiento, objetivizada como diana -. Metabonomics, 2011. Online First [publicacion primera en online). La preparación de las placas de pozos, y la aplicación y la extracción, se llevaron a cabo en concordancia con las instrucciones del fabricante. Se procedió a cargar un volumen final de 10 µl de plasma, en la placa, provista de 96 pozos, los cuales contenían los patrones estándar isotópicamente marcados. La cromatografía líquida, se llevó a cabo en un sistema de cromatografía líquida a presión ultra alta del tipo “Dionex Ultimate 3000 ultra high pressure liquid chromatography (UHPLC) system” (Dionex AG, Olten, Suiza), acoplado a un espectrómetro de masas del tipo “3200 Q TRAP mass spectrometer” (AB Sciex; Foster City, CA, USA), equipado con una fuente de ionización del tipo “TurboV ion source”, que operaba en un modo de ionización por electroproyección (ESI – de sus siglas en idioma inglés, correspondientes a electrospray ionization -). Los extractos de muestras (20 µl), se inyectaron dos veces (en los modos de ESI positiva y negativa), mediante la utilización de un gradiente de caudal de flujo de 0 – 2,4 minutos: 30 µl / minuto, 2,4 – 2, 8 minutos: 200 ml / minuto, 2,9 -3 minutos: 30 ml / minuto. Los parámetros de MS se ajustaron a los siguientes valores: temperatura de desolvatación (TEM): 200 °C, alto voltaje: -4500 V (ESI -), (ESI -), 5500 V (ESI +), gases de cortina (CUR) y nebulizador (GS1 y GS2): nitrógeno; 20, 40, y 50 psi; respectivamente, presión de gas de la colisión de nitrógeno: 5 mTorr. La obtención de MS/MS, se llevó a cabo en un modo de seguimiento de control programado de la reacción (SRM), con valores potenciales optimizados de desagrupación, para los s163 metabolitos sometidos a exploración de rastreo en este ensayo de escaneado. Se procedió a importar los archivos de datos en bruto, (sistema informático de análisis del tipo “Analist software, versión 1.5.1; AB Sciex, Foster City, CA, USA), introduciéndolos en el sistema informático de análisis del tipo “analysis software MetIQ”, para calcular las concentraciones de los metabolitos. La lista de todos metabolitos detectables, se encuentra comercialmente disponible en el mercado, de procedencia de la firma Biocrates Life Sciences, Austria (http://biocrates.com).

Análisis de datos multivariantes

Se procedió a convertir el espectro de NMR en el plasma, en puntos de datos de 22K, en el rango de δ 0,2 – 10,0, atizando un método de rutina de MATLAB, excluyendo la señal residual de agua, entre δ 54,68 – 5,10. Las intensidades de los cambios químicos, se normalizaron a la suma de todas las intensidades, dentro del rango especificado, previamente al análisis quimiométrico. Los análisis quimiométricos, se llevaron a cabo mediante la utilización de un paquete de software informático del tipo “software package SIMCA-P+” (versión 12.0.1, Umetrics AB, Umea, Suecia), y métodos de rutina de desarrollo propio, del tipo MATLAB (The MathWorks Inc., Natick, MA, USA). Con objeto de detectar la presencia de similitudes entre los perfiles metabólicos, se utilizaron los siguientes métodos de análisis: Principal Component Analysis (PCA), -Análisis de los componentes principales-, (Wold, S., et al. (1987) Chemom. Intell. Lab. Syst. 2, 37 -52), Projection to Latent Structures (PLS)-, Proyección a las estructuras implicitas -, (Wold, S., et al. (1987) PLS Meeting, Frankfurt), y Orthogonal Projection to Latent Structures (O-PLS) -, Proyección orthogonal a las estructuras implícitas -, (Trygg, J. & Wold (2003) J. Chemom. 17, 53 -64). Con objeto de proceder a la evaluación del modelo, se utilizó un procedimiento de validación por septuplicado (es decir, de una repetición de siete veces) (véase, a dicho efecto, (Cloarec, 0., et al. (2005) Anal. Chem. 77, 517-526). La precisión de la clasificación del modelo O–PSL–DA, se estableció a partir de las muestras previstas, en el ciclo de validación cruzada, por septuplicado.

Los datos de MS objetivizados como diana, se analizaron mediante el método de análisis de bosques aleatorios mediante la utilización de un paquete del tipo ’randomForest’ (A. Liaw y M. Wiener (2002). Classification and Regression by randomForest, -Clasificación y regresión mediante el método de los bosques aleatorios -. R News 2(3), 18 -22). Running in the R environment -, Gestión en el entorno de R -, (R Development Core Team (2011). R: A language and environment for statistical computing, -Un lenguaje y entorno para la computación estadística. R Foundation for Statistical Computing, -Fundación R para la computación estadística, Viena, Austria. ISBN 3-90005107-0, URL http://www.R-project.org/.). Se procedió a llevar a cabo, así mismo, también, test de ensayo de univariantes de significancia o trascendencia, en R, para la confirmación,

Debido a la distribución no normal de la adiposidad visceral, se procedió a emplear los siguientes parámetros, para la realización de los análisis metabolómicos subsiguientes: valor de transformación logarítmica del contenido de grasa visceral, del factor de relación o cociente de la grasa intraperitoneal / subcutánea (ratio 1), o del factor de relación de la grasa intraperitoneal / subcutánea (ratio 2).

Las características antropométricas y bioquímicas del cohorte, se muestran en la Tabla 1, de conformidad con la estratificación en cuatro cuartiles (Q1-4, n = 10) en base al valor de log10 de factor de relación o cociente de la grasa intraperitoneal / abdominal (ratio 2), medido mediante la utilización de métodos de CT. La glucosa en ayunas (p < 0,10) y la insulina en ayunas (p < 0,05), así como el valor de HOMA-IR en ayunas (p < 0.05), eran mayores, e los sujetos con la adiposidad visceral más alta (Q4), en comparación con (Q1). Los valores de la transformación logarítmica del factor de relación o cociente (ratio) de la grasa intraperitoneal / subcutánea, o del factor de relación o cociente (ratio) de la grasa intraperitoneal / abdominal, son los valores los cuales se utilizaron, de una forma

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preferencial, con objeto de proceder a estratificar los sujetos, en concordancia con su adiposidad visceral, ya que, estos parámetros, mostraron ser independientes con respecto a al índice de masa corporal (BMI), la cintura, la cadera, la alanina aminotransferasa (ALAT), la presión sanguínea arterial media MAP, y los índices calorimétricos, lo cual no era el caso para los valores de transformación logarítmica de volumen de grasa interperitoneal. De una forma de digno interés, en este cohorte, los valores de colesterol HDL y de colesterol HDL y el colesterol total, no eran estadísticamente diferentes entre los grupos.

Con objeto de identificar las signaturas fenotípicas de la deposición de la grasa visceral, se procedió a analizar las muestras de plasma, mediante la utilización de 1H-NMR, y de un método metabólico de LC-MS(MS, con especificación de objetivos. Los análisis en cuestión, se llevaron a cabo en las muestras de plasma en ayunas. Los análisis de OPLS (Proyección ortogonal a las estructuras implícitas) de las muestras recogidas, mostraban algunas asociaciones sutiles pero significativas, entre los lípidos del plosma sanguíneo, y la deposición de grasa visceral (R2X: 0,29; R2Y: 0,68; Q2Y: 0,32). Se procedió así mismo, también, a emplear el análisis de bosques aleatorios, con objeto de confirmar la asociación estadística existente entre los lípidos específicos del plasma y el estatus de la grasa visceral (véase, a dicho efecto, la Figura 1), la cual sugería una remodelación de los lípidos específicos del plasma, marcada mediante los cambios en los modelos patrón de los glicerofosfolípicos y de la saturación de los ácidos grasos.

Así, por lo tanto, se procedió a utilizar una matabonómica de LC-MS/MS, con objetivos específicos, para proporcionar una información estructural y mediciones cuantitativas de 163 metabolitos, incluyendo a los aminoácidos, a los azúcares, a las acil-carnitinas, a los esfingolípidos, y a los glicerofosfolípidos. Mediante la utilización del análisis de OPLS, fue posible el determinar una signatura metabólica para la adiposidad de la grasas visceral (R2X: 0,29; R2Y: 0,68; Q2Y: 0,32).

Con objeto de proceder a seleccionar los marcadores más vigorosos, se utilizó el método de la precisión en el decrecimiento medio %, de los datos fuera de banda (“out of bag”), como una característica importante de la variable. Así, de este modo, ha sido posible determinar las variables las cuales discriminan de la mejor forma a los sujetos, en concordancia con sus estatus de grasa visceral (Q1 versus Q4). Ambos, los Q1 y Q4, se evaluaron mediante la utilización de sendos valores de la trasformación logarítmica del volumen de la grasa intraperitoneal correspondientes al ratio 1 (factor de relación o cociente de la grasa intraperitoneal / subcutánea o al ratio 2 (factor de relación de la grasa intraperitoneal / subcutánea (ratio 2). La simulación, se utilizó así mismo, también, para evaluar las variaciones metabólicas interdiarias, mediante la consideración de cada visita, de una forma separada (datos no mostrados). Finalmente, se retuvieron 26 metabolitos, como siendo de importancia, para clasificar a los sujetos en concordancia con su adiposidad de grasa visceral (véanse, a dicho efecto, las figuras 2, 3 – 1, 3 – 2, 3 – 3). La adiposidad visceral, se asoció con las concentraciones incrementantes de los aminoácidos circulantes, incluyendo a la glutamina, a la leucina / isoleucina, a la fenilalanina, y a la tirosina. Estos modelos patrón, se asociaron con altas concentraciones de acilcarnitinas, incluyendo a la palmitoilcarnitina (C16), a la caproilcarnitina (C10), a la octenoilcarnitina (C8:1), y a la lisofosfatidilcolina LPC 24:0, y a los diacilfosfolípidos, incluyendo a las PC 30:0, PC 34:4. De una forma adicional, se marcó, mediante un agotamiento de los éteres de acilo consistentes en los PC-O 36:3, PC-O 40:3, PCO 40:4, PC-O 40:6, PC-O 42:2, PC-O 42:3, PC-O 42:4, PC-O 44:3, PC-O 44:4, PC-O 44:6, y dos diacilfosfocolinas (PC 42:0 y PC 42:2). Con objeto de evaluar la capacidad discriminatoria de cada componente de la signatura, se procedió a llevar a cabo tests de ensayo de la suma de rangos de (Wilcoxon Rank sum tests”), entre los grupos de adiposidad de grasa visceral (la totalidad de los metabolitos, se encuentran listados en la Tabla 2, en concordancia con el descriptor sometido a test de ensayo, a saber, el valor logarítmico decimal (log10) del ratio 2).

La figura 2, recopila los biomarcadores seleccionados, conjuntamente con su peso, en la clasificación de la adiposidad visceral, mediante el valor logarítmico decimal (log10) del contendido de grasa visceral, valor logarítmico decimal (log10) del ratio 1 ó el valor logarítmico decimal (log10) del ratio 2. Estos marcadores, mostraban una sensibilidad y una especificidad de 0,90, para la grasa visceral, en el modo de validación cruzada (Sencv, Specv).

Tabla 1

Factor

Primer quartil Q1 Segundo quartil Q2 Tercer quartil Q3 Cuarto quartil Q4 Valores de P del test de Mann-Whitney (Q1-Q4)

Edad, años BMI, Kg / m2 Ratio log10grasa inter-peritoneal /abdominal Cintura, cm Cadera, cm Ratio cintura /

33,9 ± 4.89 34,1 ± 3,27 -0,70 ± 0,05 122 ± 5.47 97,28 ± 8,28 0,80 ± 0,07 140,40 ± 1,35 32,80 ± 3,58 36,34 ± 3,62 0,61 ± 0,02 128 ± 7,48 103,39 ± 8,7 0,81 ± 0,06 140,80 ± 1,32 38,00 ± 4,42 37,00 ± 2,95 0,52 ± 0,02 127,34 ± 6,29 108.72 ± 11.71 0,85 ± 0,07 141,50 ± 1,58 37,60 ± 5.82 34,59 ± 4.42 0,40 ± 0,06 122,28 ± 9,65 104,73 ± 13,84 0,84 ± 0,09 139,9 ± 1,10 0,13897 0,93969 1,25506E-09 0,56498 0,45838 0,35104 0,32 894

cadera Na, mmol / l Ka, mmol / l

4,05 ± 0,18 4,10 ± 0,18 3,99 ± 0,25 4,04 ± 0,18 0,87656

Tabla 1 (continuación)

Factor

Primer quartil Q1 Segundo quartil Q2 Tercer quartil Q3 Cuarto quartil Q4 Valores de P del test de Mann-Whitney (Q1-Q4)

Glucosa, mmol

4,95 ± 0,35 5,17 ± 0,52 5,41 ± 0,49 5,37 ± 0,5 0,05716

/ l

65,60 ± 9,45 65,2 ± 11,2 64,78 ± 9,28 70,3 ± 6,53 0,2563

Creatinina,

5,52 ± 1,01 5,58 ± 0,85 5.31 ± 0,68 5,48 ± 0,97 0,90965

mmol/ l

1,54 ± 0,43 1,32 ± 0,29 1,38 ± 0,25 1,32 ± 0,24 0,18104

Colesterol,

3,77 ± 1,07 4,42 ± 1,22 3,99 ± 0,97 4,24 ± 0,95 0,28901

mmol/l

3,50, 0,97 3,56 ± 0,88 3,34 ± 0,61 3,47 ± 0,79 1

HDL mmol / l

1,04 ± 0,43 2,25 ± 2,1 1,28 ± 0,45 1, 52 ± 0,57 0,09354

Ratio HDL /

275,20 ± 41,93 363,22 ± 71,45 303,40 ± 75,28 285,00 ± 31,70 0,35268

colest.

21,40 ± 3,24 21,4 ± 4,48 24.00 ± 6,94 24,50 ± 6,7 0,40157

LDL, mmol / l

18,40 ± 6,11 19,20 ± 5,07 23,50 ± 8,34 27,10 ± 13,28 0,13971

TG, mmol / l

0,86 ± 0,25 0,91 ± 0,21 0,99 ± 0,3 1,08 ± 0,34 0,12066

Uratos, µmol / l

57,80 ± 18,6 71,10 ± 19,75 62,40 ± 20,97 57,80 ± 14,15 0,8796

ASAT, U / l

20,00 ± 11,86 17,50 ± 6,88 21,10 ± 4,84 25,44 ± 11,26 0,19122

ALAT, U / l

1357,00 ± 1434,00 ± 1469,00 ± 1433,00 ± 0,36362

Ratio ALAT/

191,78 142,61 152,49 210,82

ASAT

13,60 ± 9,21 22,12 ± 6,32 24,36 ± 7,22 25,44 ± 4.62 0,01468

MAP, mm Hg

4,24 ± 2,02 4,95 ± 1,49 6,06 ± 1,87 6,12 ± 1,23 0,01149

GGT, U / l

544,50 ± 580,60 ± 301,38 596,20 ± 185,79 585,10 ± 188,62 0,66426

Calorimetría, kcal / 24 horas Insulina HOMA – IR NEFAs µmol / l

201,51

Tabla 2

Metabolito

Primer quartil Q1 Segundo quartil Q2 Tercer quartil Q3 Cuarto quartil Q4 Valores de P del test de Mann-Whitney (Q1-Q4)

Glutamina, µmol

615,56 ± 748 ± 193,49 792,1 ± 260,61 714 ± 94,02 0,02468

/ l

107,95

61,97 ± 11,02

80,54 ± 22,21 75,91 ± 21,83 80,99 ± 24,69 0,05347

Tirosina, µmol / l

0,22 ± 0,1 0,2 ± 0,09 0,14 ± 0,06 0,3 ± 0,19 0,40018

Caproilcarnitina,

µmol / l

0,07 ± 0,02 0,07 ± 0,03 0,07 ± 0,03 0,1 ± 0,04 0,12065

Palmitoilcarnitina

µmol / l

0,04 ± 0,02 0,05 ± 0,02 0,05 ± 0,04 0,05 ± 0,02 0,25258

Octenoilcarnitina

µmol / l

0,36 ± 0,25 0,51 ± 0,24 0,52 ± 0,36 0,46 ± 0,31 0,21613

LPC 24:0, µmol /

4.43 ± 1.48 5,17 ± 2,35 5,75 ± 1,98 5,57 ± 1,76 0,1564

l

1,3 ± 0,46 1,53 ± 1,14 1,41 ± 0,52 1,55 ± 0,75 0,31537

PC 30:0, µmol / l

0,65 ± 0,23 0,48 ± 0,16 0,47 ± 0,08 0,48 ± 0,14 0,07889

PC 34:4, µmol / l

0,2 ± 0,06 0,19 ± 0,11 0,13 ± 0,05 0,17 ± 0,08 0,40018

PC 42:0, µmol / l

9,94 ± 2,22 9,78 ± 3,84 8,48 ± 2,15 8,53 ± 0,99 0,17752

PC 42:2, µmol / l

10,66 ± 3,5 9,31 ± 3,51 9,38 ± 4,57 8,77 ± 1,76 0,21102

PC-O 34:1 µmol

11,29 ± 2,64 11,86 ± 2,68 10,38 ± 3,08 9,17 ± 2,09 0,07865

/ l

7,04 ± 1,68 6,7 ± 2,61 7,11 ± 1,82 5,5 ± 1,24 0,02792

PC-O 34:2 µmol

1,41 ± 0,27 1,46 ± 0,38 1,27 ± 0,3 0,86 ± 0,42 0,00421

/ l

2,79 ± 0,56 2,9 ± 0,73 2,47 ± 0,69 2,02 ± 0,83 0,01784

PC-O 36:2 µmol

2,81 ± 0,86 3,27 ± 1,09 2,8 ± 0,84 2,74 ± 1,09 0,06525

/ l

0,66 ± 0,23 0,56 ± 0,14 0,53 ± 0,16 0,45 ± 0,18 0,05347

PC-O 36:3 µmol

0,89 ± 0,2 0,92 ± 0,14 0,9 ± 0,27 0,63 ± 0,26 0,06525

/ l

1,34 ± 0,33 1,09 ± 0,28 1,09 ± 0,37 0,82 ± 0,22 0,00298

PC-O 40:3 µmol

0,21 ± 0,06 0,02 ± 0,04 0,15 ± 0,06 0,17 ± 0,05 0,1564

/ l

0,8 ± 0,3 0,67 ± 0,24 0,63 ± 0,19 0,51 ± 0,18 0,01721

PC-O 40:4 µmol

2,29 ± 0,74 2,03 ± 0,55 1,9 ± 0,74 1,71 ± 0,7 0,04113

/ l

1,52 ± 0,56 1,22 ± 0,3 1,11 ± 0,5 1,03 ± 0,32 0,01013

PC-O 40:6 µmol / l PC-O 42:2 µmol / l PC-O 42:3 µmol / l PC-O 42:4 µmol / l PC-O 44:3 µmol / l PC-O 44:4 µmol / l PC-O 44:5 µmol / l PC-O 44:6 µmol / l Fenilalainina, µmol / l

49,9 ± 14,16 50,47 ± 8,45 62,82 ± 22,17 56,42 ± 8,38 0,04113

Tabla 2 (continuación)

Metabolito

Primer quartil Q1 Segundo quartil Q2 Tercer quartil Q3 Cuarto quartil Q4 Valores de P del test de Mann-Whitney (Q1-Q4)

Leucina + Isoleucina, µmol / l

181,44 ± 53,02 214,2 ± 56,71 202,4 ± 27,39 228,8 ± 33,83 0,04536

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2