JP2003161726A - ステロイド類化合物のｌｃ−ｍｓによる高感度検出法 - Google Patents
ステロイド類化合物のｌｃ−ｍｓによる高感度検出法Info
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- JP2003161726A JP2003161726A JP2001362158A JP2001362158A JP2003161726A JP 2003161726 A JP2003161726 A JP 2003161726A JP 2001362158 A JP2001362158 A JP 2001362158A JP 2001362158 A JP2001362158 A JP 2001362158A JP 2003161726 A JP2003161726 A JP 2003161726A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】生体試料中の微量のジヒドロテストステロンを
高感度に定量することにより、極めて少量の生体試料中
ジヒドロテストステロン濃度を知るための方法が要望さ
れている。この方法が完成すれば薬物による疾病の治療
効果とジヒドロテストステロン量との関係や病態の評
価、更にはタンパク質同化ステロイドなどの不正使用の
検査に有効な方法となる。 【解決手段】生体組織および血漿中からジヒドロテスト
ステロンを抽出する。生体試料から抽出したジヒドロテ
ストステロンにN-メチルピリジニウム誘導体化を行う。
過剰な反応試薬と生体試料由来の夾雑物を固相抽出法で
除き、ジヒドロテストステロンを抽出する。HPLCでさら
に夾雑物を分離した後、質量分析計のMS/MS法により高
選択的かつ高感度にジヒドロテストステロンを検出す
る。
高感度に定量することにより、極めて少量の生体試料中
ジヒドロテストステロン濃度を知るための方法が要望さ
れている。この方法が完成すれば薬物による疾病の治療
効果とジヒドロテストステロン量との関係や病態の評
価、更にはタンパク質同化ステロイドなどの不正使用の
検査に有効な方法となる。 【解決手段】生体組織および血漿中からジヒドロテスト
ステロンを抽出する。生体試料から抽出したジヒドロテ
ストステロンにN-メチルピリジニウム誘導体化を行う。
過剰な反応試薬と生体試料由来の夾雑物を固相抽出法で
除き、ジヒドロテストステロンを抽出する。HPLCでさら
に夾雑物を分離した後、質量分析計のMS/MS法により高
選択的かつ高感度にジヒドロテストステロンを検出す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は生体試料中に微量に
含まれる1個の水酸基を有するステロイド類化合物を検
出するためのLC/MS（液体クロマトグラフィー−マスス
ペクトロメトリー）により測定する検出法に関する。本
発明は、極めて少量の生体試料を用いて、薬物による疾
病の治療効果や病態の評価、更にはタンパク質同化ステ
ロイドなどの不正使用の検査を行うために有効な手法で
ある。
含まれる1個の水酸基を有するステロイド類化合物を検
出するためのLC/MS（液体クロマトグラフィー−マスス
ペクトロメトリー）により測定する検出法に関する。本
発明は、極めて少量の生体試料を用いて、薬物による疾
病の治療効果や病態の評価、更にはタンパク質同化ステ
ロイドなどの不正使用の検査を行うために有効な手法で
ある。
【０００２】
【従来の技術】ステロイド類化合物は広く植物や動物に
分布して存在しており、生物を構成している重要な物質
として生体内各臓器に分布している。また、ほとんどの
生物はステロイドを生合成する機能を有し、そのため中
間体や代謝物が多く存在する。ステロイドは生体にとっ
て重要な生体膜の構成成分としての機能の他、特にホル
モンとして微量で特殊な生理作用を示し、生体内の調節
をつかさどり、その生理機能は多岐にわたっている（津
田恭介編：ステロイド、1971年、朝倉書店；玉舎輝彦：
性ステロイドホルモンがわかる、1999年、金芳堂）。
分布して存在しており、生物を構成している重要な物質
として生体内各臓器に分布している。また、ほとんどの
生物はステロイドを生合成する機能を有し、そのため中
間体や代謝物が多く存在する。ステロイドは生体にとっ
て重要な生体膜の構成成分としての機能の他、特にホル
モンとして微量で特殊な生理作用を示し、生体内の調節
をつかさどり、その生理機能は多岐にわたっている（津
田恭介編：ステロイド、1971年、朝倉書店；玉舎輝彦：
性ステロイドホルモンがわかる、1999年、金芳堂）。
【０００３】例えば、アンドロゲンは生殖器の発育、血
管の新生、体毛の発育、筋肉と骨格による身体の体積増
加などの生理的作用があり、更には女性ホルモンである
エストロゲン作用の抑制作用などがある。またアンドロ
ゲンはエストロゲン作用を発揮するエストラジオールな
どに変換され、エストロゲン作用にも関与している。ア
ンドロゲンの中でも代表的なテストステロンは、活性型
のジヒドロテストステロンに変換され生理作用を示す。
アンドロゲン、特にジヒドロテストステロン（androsta
n-17β-ol-3-one）は前立腺肥大や前立腺腫瘍と密接に
関係するといわれ、その濃度測定は疾病の治療効果や病
態の評価に利用されている。また、スポーツ競技会にお
けるタンパク質同化ステロイドの不正使用の検査におい
て、ジヒドロテストステロンは禁止物質の一つにもあげ
られている。
管の新生、体毛の発育、筋肉と骨格による身体の体積増
加などの生理的作用があり、更には女性ホルモンである
エストロゲン作用の抑制作用などがある。またアンドロ
ゲンはエストロゲン作用を発揮するエストラジオールな
どに変換され、エストロゲン作用にも関与している。ア
ンドロゲンの中でも代表的なテストステロンは、活性型
のジヒドロテストステロンに変換され生理作用を示す。
アンドロゲン、特にジヒドロテストステロン（androsta
n-17β-ol-3-one）は前立腺肥大や前立腺腫瘍と密接に
関係するといわれ、その濃度測定は疾病の治療効果や病
態の評価に利用されている。また、スポーツ競技会にお
けるタンパク質同化ステロイドの不正使用の検査におい
て、ジヒドロテストステロンは禁止物質の一つにもあげ
られている。
【０００４】従来、生体中に多くの類似構造をもつステ
ロイド類化合物の測定法には高分離、高感度が要求され
てきた。例えば、ジヒドロテストステロン測定には以下
の3法が用いられていた。GC/MS（ガスクロマトグラフィ
ー−マススペクトロメトリー）法ではジヒドロテストス
テロンに揮発性を付与するためにオキシム誘導体として
測定したところ、その時の定量限界は50pg/mlである。
この誘導体化反応には加熱が必要であり、また誘導体化
により、異性体が生成する欠点を有する。LC/MS（液体
クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー）法で
は、感度を上げるためにカルボキシメチルオキシム誘導
体にして測定している。その時の定量限界は62.5pgであ
った（五反田浩太郎、新保淳、中野洋一、佐々木享子、
本間誠次郎、宮坂克彦：診療と新薬、36、277(199
9)）。ラジオイムノアッセイ法では定量限界が12.5pgと
高感度であるが、抗体の作製に時間と労力が必要であ
り、またテストステロンとの交叉反応性を回避するた
め、HPLCによりテストステロンを除く前処理が必要であ
る（V.Puri et al: J. Steroid Biochem., 14, 877-881
(1981)、 M.Hill,R.Hampl,R.Petrik and L.Starka: Pr
ostate, 28,347(1996)）。
ロイド類化合物の測定法には高分離、高感度が要求され
てきた。例えば、ジヒドロテストステロン測定には以下
の3法が用いられていた。GC/MS（ガスクロマトグラフィ
ー−マススペクトロメトリー）法ではジヒドロテストス
テロンに揮発性を付与するためにオキシム誘導体として
測定したところ、その時の定量限界は50pg/mlである。
この誘導体化反応には加熱が必要であり、また誘導体化
により、異性体が生成する欠点を有する。LC/MS（液体
クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー）法で
は、感度を上げるためにカルボキシメチルオキシム誘導
体にして測定している。その時の定量限界は62.5pgであ
った（五反田浩太郎、新保淳、中野洋一、佐々木享子、
本間誠次郎、宮坂克彦：診療と新薬、36、277(199
9)）。ラジオイムノアッセイ法では定量限界が12.5pgと
高感度であるが、抗体の作製に時間と労力が必要であ
り、またテストステロンとの交叉反応性を回避するた
め、HPLCによりテストステロンを除く前処理が必要であ
る（V.Puri et al: J. Steroid Biochem., 14, 877-881
(1981)、 M.Hill,R.Hampl,R.Petrik and L.Starka: Pr
ostate, 28,347(1996)）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】少量の生体試料で検査
することは、被検者の負担を軽減できる。特に医療現場
ではターゲット部の病態を知ることができ治療方法や方
針に役立てるため、少量の生検試料や血液で検出できる
ことが必要である。例えば、アンドロゲンの一つである
ジヒドロテストステロンは5-αリダクターゼによりテス
トステロンから活性型に変換される。そしてジヒドロテ
ストステロンはアンドロゲンリセプターに結合してアン
ドロゲン作用を発現する。微量でより強いアンドロゲン
作用を示すジヒドロテストステロンの標的組織中におけ
る存在量を知ることは、より正確なアンドロゲン作用を
考察することができる。ジヒドロテストステロンは前立
腺では組織1gあたり数ngしか存在しない。そして血漿中
濃度は、健康成人男性で0.3〜0.6ng/ml、女性では0.08
〜0.2 ng/mlと極めて低濃度である（穂坂正彦：日本不
妊学会、21、135、(1976)）。また、タンパク質同化ス
テロイドとして、不正使用の有無を検査するためには、
血液や尿中に残存する痕跡量を検出する必要がある。こ
のように生体中に微量しか存在しないジヒドロテストス
テロンを検出するためには高感度な方法が必要である。
することは、被検者の負担を軽減できる。特に医療現場
ではターゲット部の病態を知ることができ治療方法や方
針に役立てるため、少量の生検試料や血液で検出できる
ことが必要である。例えば、アンドロゲンの一つである
ジヒドロテストステロンは5-αリダクターゼによりテス
トステロンから活性型に変換される。そしてジヒドロテ
ストステロンはアンドロゲンリセプターに結合してアン
ドロゲン作用を発現する。微量でより強いアンドロゲン
作用を示すジヒドロテストステロンの標的組織中におけ
る存在量を知ることは、より正確なアンドロゲン作用を
考察することができる。ジヒドロテストステロンは前立
腺では組織1gあたり数ngしか存在しない。そして血漿中
濃度は、健康成人男性で0.3〜0.6ng/ml、女性では0.08
〜0.2 ng/mlと極めて低濃度である（穂坂正彦：日本不
妊学会、21、135、(1976)）。また、タンパク質同化ス
テロイドとして、不正使用の有無を検査するためには、
血液や尿中に残存する痕跡量を検出する必要がある。こ
のように生体中に微量しか存在しないジヒドロテストス
テロンを検出するためには高感度な方法が必要である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意検討の
結果、生体試料中の1個の水酸基を有するステロイド類
化合物を検出するために、水酸基にN-低級アルキルピリ
ジニウム基を導入して誘導体をLC/ESI-MS（液体クロマ
トグラフィー／エレクトロスプレーイオン化−マススペ
クロロメトリー）法で測定することで高感度検出が期待
されることを見出した。更に、少量の生体試料から、微
量のステロイド類化合物を抽出精製する方法を考案し
た。すなわち、過剰の誘導体試薬と生体由来の夾雑物を
除去するために固相抽出法を採用した。具体的には、N-
低級アルキルピリジニウム誘導体を固相に負荷後、メタ
ノールを用いて夾雑物の完全除去を図り、次いで固相か
らN-メチルピリジニウム誘導体を溶出した。固相による
前処理後、ステロイド類化合物をLC/ESI-MS 法で検出す
る。また、特にMS/MS（エムエス/エムエス）法を用いる
ことにより、選択性を高めHPLC移動相やMS装置からのバ
ックグラウンドノイズを除き、SN比（シグナルノイズ
比）を向上させ、結果として一層の高感度検出が可能と
なった。
結果、生体試料中の1個の水酸基を有するステロイド類
化合物を検出するために、水酸基にN-低級アルキルピリ
ジニウム基を導入して誘導体をLC/ESI-MS（液体クロマ
トグラフィー／エレクトロスプレーイオン化−マススペ
クロロメトリー）法で測定することで高感度検出が期待
されることを見出した。更に、少量の生体試料から、微
量のステロイド類化合物を抽出精製する方法を考案し
た。すなわち、過剰の誘導体試薬と生体由来の夾雑物を
除去するために固相抽出法を採用した。具体的には、N-
低級アルキルピリジニウム誘導体を固相に負荷後、メタ
ノールを用いて夾雑物の完全除去を図り、次いで固相か
らN-メチルピリジニウム誘導体を溶出した。固相による
前処理後、ステロイド類化合物をLC/ESI-MS 法で検出す
る。また、特にMS/MS（エムエス/エムエス）法を用いる
ことにより、選択性を高めHPLC移動相やMS装置からのバ
ックグラウンドノイズを除き、SN比（シグナルノイズ
比）を向上させ、結果として一層の高感度検出が可能と
なった。
【０００７】即ち、本発明は次の（１）〜（８）に関す
る。 （1）生体試料中の1個の水酸基を有するステロイド類化
合物を検出するうえにおいて、該ステロイド化合物の水
酸基にN-低級アルキルピリジニウム基を導入した誘導体
をLC/MSにより測定する検出法。 （２）N-低級アルキルピリジニウム基がN-メチルピリジ
ニウム基である１項に記載の検出法。 （３）1個の水酸基を有するステロイド類化合物がアン
ドロゲン系化合物、エストロゲン系化合物、プロゲステ
ロン系化合物及びステロール系化合物のいずれから選択
される化合物である前記1又は２項に記載の検出法。 （４）1個の水酸基を有するステロイド類化合物がアン
ドロゲン系化合物である前記1又は２項に記載の検出
法。 （５）アンドロゲン系化合物がジヒドロテストステロン
である４項に記載の検出法。 （６）ステロイド化合物の水酸基に誘導体を生成した
後、固相抽出法によるメタノール洗浄により前処理し、
次いで酸を含むメタノールで溶出してLC/MS測定用試料
とする、前記１〜５のいずれかに記載の検出法。 （７）LC/MS測定において、マススペクトロメトリーの
イオン化がエレクトロスプレーイオン化によって行われ
る前記１〜６のいずれかに記載の検出法。 （８）LC/MS測定において、イオンをMS/MS手法によりお
こなう前記１〜７のいずれかに記載の検出法。
る。 （1）生体試料中の1個の水酸基を有するステロイド類化
合物を検出するうえにおいて、該ステロイド化合物の水
酸基にN-低級アルキルピリジニウム基を導入した誘導体
をLC/MSにより測定する検出法。 （２）N-低級アルキルピリジニウム基がN-メチルピリジ
ニウム基である１項に記載の検出法。 （３）1個の水酸基を有するステロイド類化合物がアン
ドロゲン系化合物、エストロゲン系化合物、プロゲステ
ロン系化合物及びステロール系化合物のいずれから選択
される化合物である前記1又は２項に記載の検出法。 （４）1個の水酸基を有するステロイド類化合物がアン
ドロゲン系化合物である前記1又は２項に記載の検出
法。 （５）アンドロゲン系化合物がジヒドロテストステロン
である４項に記載の検出法。 （６）ステロイド化合物の水酸基に誘導体を生成した
後、固相抽出法によるメタノール洗浄により前処理し、
次いで酸を含むメタノールで溶出してLC/MS測定用試料
とする、前記１〜５のいずれかに記載の検出法。 （７）LC/MS測定において、マススペクトロメトリーの
イオン化がエレクトロスプレーイオン化によって行われ
る前記１〜６のいずれかに記載の検出法。 （８）LC/MS測定において、イオンをMS/MS手法によりお
こなう前記１〜７のいずれかに記載の検出法。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明につき更に詳細に説明す
る。本発明において、対象とする生体試料はヒトから得
られる組織、血液、尿、胆汁等が挙げられ、これらは健
常人もしくは患者から採取可能である。また、本発明に
おいて、1個の水酸基を有するステロイド類化合物とは
ステロイド骨格を有する化合物に1個の水酸基が置換し
た化合物を示す。特に本発明においては、生体由来の物
質が好ましく、ステロール系化合物、プロゲステロン系
化合物、アンドロゲン系化合物、エストロゲン系化合物
等が挙げられる。なお本発明は２個以上の水酸基を有す
るステロイド類に適用した場合、生成する誘導体は四級
アンモニウムイオンを複数個有する多価イオンとなる。
マススペクトル上で出現する分子イオン（m/z値）は低
質量側にシフトした値となり、そこでは夾雑物由来のイ
オンが多量に存在するので、高感度分析には不利とな
る。そのため本発明は１個の水酸基を有するステロイド
類に適用するのが好ましい。
る。本発明において、対象とする生体試料はヒトから得
られる組織、血液、尿、胆汁等が挙げられ、これらは健
常人もしくは患者から採取可能である。また、本発明に
おいて、1個の水酸基を有するステロイド類化合物とは
ステロイド骨格を有する化合物に1個の水酸基が置換し
た化合物を示す。特に本発明においては、生体由来の物
質が好ましく、ステロール系化合物、プロゲステロン系
化合物、アンドロゲン系化合物、エストロゲン系化合物
等が挙げられる。なお本発明は２個以上の水酸基を有す
るステロイド類に適用した場合、生成する誘導体は四級
アンモニウムイオンを複数個有する多価イオンとなる。
マススペクトル上で出現する分子イオン（m/z値）は低
質量側にシフトした値となり、そこでは夾雑物由来のイ
オンが多量に存在するので、高感度分析には不利とな
る。そのため本発明は１個の水酸基を有するステロイド
類に適用するのが好ましい。
【０００９】ステロール系化合物としては、例えばラノ
ステロール、ジヒドロラノステロール、チモステロー
ル、4α−メチルコレステロール、デスモステロール、7
-デヒドロコレステロール、ラトステロール、メトステ
ノール、コレステロール等が挙げられる。プロゲステロ
ン系化合物としては、例えばプレグネノロン、11-デオ
キシコルチコステロン、17α-ヒドロキシプレグネネジ
オン、17α-ヒドロキシプロゲステロン、20α-ヒドロキ
シプロゲステロン等が挙げられる。
ステロール、ジヒドロラノステロール、チモステロー
ル、4α−メチルコレステロール、デスモステロール、7
-デヒドロコレステロール、ラトステロール、メトステ
ノール、コレステロール等が挙げられる。プロゲステロ
ン系化合物としては、例えばプレグネノロン、11-デオ
キシコルチコステロン、17α-ヒドロキシプレグネネジ
オン、17α-ヒドロキシプロゲステロン、20α-ヒドロキ
シプロゲステロン等が挙げられる。
【００１０】アンドロゲン系化合物としては、例えば11
-ケトアンドロステロン、11-ケトエチオコラノロン、テ
ストステロン、アンドロステロン、エピアンドロステロ
ン、エチオコラノロン、デヒドロエピアンドロステロ
ン、11-ヒドロキシアンドロステンジオン、7-ケトデヒ
ドロエピアンドロステロン、アンドロステン-3α-オー
ル、ジヒドロテストステロン等が挙げられる。エストロ
ゲン系化合物としてはエストロン等が挙げられる。本発
明において、1個の水酸基を有するステロイド類化合物
としては、アンドロゲン系化合物が好ましく、特に好ま
しくはジヒドロテストステロンである。これら、本発明
で用いる1個の水酸基を有するステロイド類化合物は良
く知られた物質であり、適宜公知の方法で合成して得る
か若しくは試薬として入手可能である。
-ケトアンドロステロン、11-ケトエチオコラノロン、テ
ストステロン、アンドロステロン、エピアンドロステロ
ン、エチオコラノロン、デヒドロエピアンドロステロ
ン、11-ヒドロキシアンドロステンジオン、7-ケトデヒ
ドロエピアンドロステロン、アンドロステン-3α-オー
ル、ジヒドロテストステロン等が挙げられる。エストロ
ゲン系化合物としてはエストロン等が挙げられる。本発
明において、1個の水酸基を有するステロイド類化合物
としては、アンドロゲン系化合物が好ましく、特に好ま
しくはジヒドロテストステロンである。これら、本発明
で用いる1個の水酸基を有するステロイド類化合物は良
く知られた物質であり、適宜公知の方法で合成して得る
か若しくは試薬として入手可能である。
【００１１】本発明において、N-低級アルキルピリジニ
ウム基とはピリジンのＮ位にＣ１〜Ｃ４アルキルが置換
した基を示す。Ｃ１〜Ｃ４のアルキル基としては、例え
ばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−
ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル等が挙げられる。
本発明ではメチルで置換されたN-メチルピリジニウム基
が好ましい。水酸基へのN-低級アルキルピリジニウム基
の導入には、例えば、2-フロロ-1-メチルピリジニウム
試薬(アルドリッチ社製)等によって調製される。
ウム基とはピリジンのＮ位にＣ１〜Ｃ４アルキルが置換
した基を示す。Ｃ１〜Ｃ４のアルキル基としては、例え
ばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−
ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル等が挙げられる。
本発明ではメチルで置換されたN-メチルピリジニウム基
が好ましい。水酸基へのN-低級アルキルピリジニウム基
の導入には、例えば、2-フロロ-1-メチルピリジニウム
試薬(アルドリッチ社製)等によって調製される。
【００１２】また、前処理法として用いた固相抽出法
は、例えばBond Elut C18（バリアン社製）等のＯＤＳ
タイプの固相に吸着させた後、メタノールで洗浄して酸
を含むメタノールで溶出することにより生体由来の夾雑
物を効果的に除くことができる。更に、LC/MS測定にお
いて、マススペクトロメトリーのイオン化は、適宜大気
圧化学イオン化（APCI）、高速原子衝撃（FAB）、サー
モスプレーイオン化（TSP）、エレクトロスプレーイオ
ン化（ESI）を選択することによって行われる。ESIでは
極性を付与した誘導体にすることによりイオン化効率が
向上し、APCIやTSPなどの他のイオン化に比べて高熱を
必要としないため熱分解も少ない。また、FABではイオ
ン化効率が悪く高感度が得られない。従って本発明にお
いて、エレクトロスプレーイオン化（ESI）を用いるこ
とが好ましい。本発明において、MS/MS手法とはMS1で得
られたプレカーサーイオン（ここではインタクトモレキ
ュラーカチオン）を選択し、MS2でプレカーサーイオン
をアルゴンガスにより分解させ、生じるプロダクトイオ
ンを検出する方法であり、高選択性によりSN比が向上し
高感度になる。
は、例えばBond Elut C18（バリアン社製）等のＯＤＳ
タイプの固相に吸着させた後、メタノールで洗浄して酸
を含むメタノールで溶出することにより生体由来の夾雑
物を効果的に除くことができる。更に、LC/MS測定にお
いて、マススペクトロメトリーのイオン化は、適宜大気
圧化学イオン化（APCI）、高速原子衝撃（FAB）、サー
モスプレーイオン化（TSP）、エレクトロスプレーイオ
ン化（ESI）を選択することによって行われる。ESIでは
極性を付与した誘導体にすることによりイオン化効率が
向上し、APCIやTSPなどの他のイオン化に比べて高熱を
必要としないため熱分解も少ない。また、FABではイオ
ン化効率が悪く高感度が得られない。従って本発明にお
いて、エレクトロスプレーイオン化（ESI）を用いるこ
とが好ましい。本発明において、MS/MS手法とはMS1で得
られたプレカーサーイオン（ここではインタクトモレキ
ュラーカチオン）を選択し、MS2でプレカーサーイオン
をアルゴンガスにより分解させ、生じるプロダクトイオ
ンを検出する方法であり、高選択性によりSN比が向上し
高感度になる。
【００１３】次に、実際の生体試料中のステロイド類化
合物の検出法について説明する。なお、各生体試料の性
質・採取量、各ステロイド類化合物の理化学的性質によ
り各々調製、抽出、測定の条件を適宜変更しても差し支
えない。 Ａ．生体試料の採取と保存 対象とする生体試料は健常人もしくは患者から組織、血
液、尿、胆汁等を採取して用いる。血液は採血後直ちに
ヘパリン処理を行って高速遠心分離で血球と血漿画分に
分離し、血漿を得る。血漿は直ちに-80℃程度で保存す
る。他の試料は、手術時の生検あるいは直接採取した後
サンプル管に入れ、直ちに-80℃程度で保存する。
合物の検出法について説明する。なお、各生体試料の性
質・採取量、各ステロイド類化合物の理化学的性質によ
り各々調製、抽出、測定の条件を適宜変更しても差し支
えない。 Ａ．生体試料の採取と保存 対象とする生体試料は健常人もしくは患者から組織、血
液、尿、胆汁等を採取して用いる。血液は採血後直ちに
ヘパリン処理を行って高速遠心分離で血球と血漿画分に
分離し、血漿を得る。血漿は直ちに-80℃程度で保存す
る。他の試料は、手術時の生検あるいは直接採取した後
サンプル管に入れ、直ちに-80℃程度で保存する。
【００１４】Ｂ．生体組織からのステロイド類化合物の
抽出 約5〜10mgという極めて少量の生体組織中のステロイド
類化合物を効率良く抽出するために、メタノールを含む
アルカリ溶液中に１時間70〜80℃で加温溶解させて調製
する。溶解液を水で希釈後Bond Elut C18およびアブ
セルートネクサス（バリアン社製）、オアシス（ウォー
ターズ社製）、スペルクリン（スペルコ社製）、エムポ
アディスク（３Ｍ社製）、アイソルート（インターナシ
ョナルソーベントテクノロジー社）等に負荷し、水で洗
浄したのち、酢酸エチルでステロイド類化合物を溶出す
る。溶媒を留去し、誘導体用試料とする。
抽出 約5〜10mgという極めて少量の生体組織中のステロイド
類化合物を効率良く抽出するために、メタノールを含む
アルカリ溶液中に１時間70〜80℃で加温溶解させて調製
する。溶解液を水で希釈後Bond Elut C18およびアブ
セルートネクサス（バリアン社製）、オアシス（ウォー
ターズ社製）、スペルクリン（スペルコ社製）、エムポ
アディスク（３Ｍ社製）、アイソルート（インターナシ
ョナルソーベントテクノロジー社）等に負荷し、水で洗
浄したのち、酢酸エチルでステロイド類化合物を溶出す
る。溶媒を留去し、誘導体用試料とする。
【００１５】Ｃ．血漿からのステロイド類化合物の抽出
血漿0.05〜0.5mlに10倍量程度の水を加えて希釈し、少
量のメタノールとアルカリを加えて混合して調製する。
これをBond Elut C18等に負荷し、水で洗浄したの
ち、ステロイド類化合物を酢酸エチルで溶出する。溶媒
を留去し、ヘキサン／酢酸エチル（10:1）程度に溶解
し、Bond Elut Silicaに負荷する。ヘキサン／酢酸エ
チル（10:1）程度で洗浄後、ステロイド類化合物を適宜
ヘキサン／酢酸エチル混合液で溶出する。溶媒を留去
後、誘導体用試料とする。
量のメタノールとアルカリを加えて混合して調製する。
これをBond Elut C18等に負荷し、水で洗浄したの
ち、ステロイド類化合物を酢酸エチルで溶出する。溶媒
を留去し、ヘキサン／酢酸エチル（10:1）程度に溶解
し、Bond Elut Silicaに負荷する。ヘキサン／酢酸エ
チル（10:1）程度で洗浄後、ステロイド類化合物を適宜
ヘキサン／酢酸エチル混合液で溶出する。溶媒を留去
後、誘導体用試料とする。
【００１６】Ｄ．誘導体生成および精製法
組織及び血漿から抽出精製した誘導体用試料は少量のジ
クロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフランまた
はアセトニトリル等に溶解したのち、アセトニトリルに
溶解した誘導体化試薬（2-フロロ-1-メチルピリジニウ
ム試薬(アルドリッチ社製)等）を加え、さらにトリエチ
ルアミンを加えて、室温１時間撹拌する。その後、溶媒
を留去したのち、水を加えて反応物を溶解する。Bond E
lut C18に負荷した後、水、メタノールで順次洗浄す
る。N-メチルピリジニウム化ステロイド類化合物は2〜1
0％の酸たとえばギ酸、酢酸、TFA（トリフルオロ酢酸）
を含むメタノール溶液で溶出する。
クロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフランまた
はアセトニトリル等に溶解したのち、アセトニトリルに
溶解した誘導体化試薬（2-フロロ-1-メチルピリジニウ
ム試薬(アルドリッチ社製)等）を加え、さらにトリエチ
ルアミンを加えて、室温１時間撹拌する。その後、溶媒
を留去したのち、水を加えて反応物を溶解する。Bond E
lut C18に負荷した後、水、メタノールで順次洗浄す
る。N-メチルピリジニウム化ステロイド類化合物は2〜1
0％の酸たとえばギ酸、酢酸、TFA（トリフルオロ酢酸）
を含むメタノール溶液で溶出する。
【００１７】Ｅ．LC/ESI-MS/MS法による分析
検出にはN-低級アルキルピリジニウム誘導体を高感度に
測定できるエレクトロスプレーイオン化(ESI)又はFAB、
APCI、TSPのイオン化による質量分析計を用いるが、ESI
法が好ましい。HPLC（高速液体クロマトグラフィー）に
はオンライン濃縮セミミクロHPLCシステムを用いる。試
料はほぼ全量を注入後、濃縮カラムで試料の濃縮を行
い、カラムスイッチングにより分析カラムで夾雑物との
分離を行うことでよい。
測定できるエレクトロスプレーイオン化(ESI)又はFAB、
APCI、TSPのイオン化による質量分析計を用いるが、ESI
法が好ましい。HPLC（高速液体クロマトグラフィー）に
はオンライン濃縮セミミクロHPLCシステムを用いる。試
料はほぼ全量を注入後、濃縮カラムで試料の濃縮を行
い、カラムスイッチングにより分析カラムで夾雑物との
分離を行うことでよい。
【００１８】質量分析計で測定するには、各誘導体のマ
ススペクトルからインタクトモレキュラーカチオンを検
出して測定することができる。更には、例えばインタク
トモレキュラーカチオンをプレカーサーイオンとしてMS
/MS測定を行うと、プロダクトイオンが検出されるの
で、このイオンを測定すれば一層特異性を増した測定法
となり、生体由来の夾雑物による妨害から逃れることが
出来る。また、定量に際しては内部標準物質の添加が必
要であり、この場合、測定対象のステロイド類化合物と
近似する化合物でも差し支えないが、望ましくは測定対
象のステロイド類化合物の重水標識体などの安定同位体
標識化合物を用いることが好ましい。これら内部標準物
質は生体試料を調製する際に添加される。
ススペクトルからインタクトモレキュラーカチオンを検
出して測定することができる。更には、例えばインタク
トモレキュラーカチオンをプレカーサーイオンとしてMS
/MS測定を行うと、プロダクトイオンが検出されるの
で、このイオンを測定すれば一層特異性を増した測定法
となり、生体由来の夾雑物による妨害から逃れることが
出来る。また、定量に際しては内部標準物質の添加が必
要であり、この場合、測定対象のステロイド類化合物と
近似する化合物でも差し支えないが、望ましくは測定対
象のステロイド類化合物の重水標識体などの安定同位体
標識化合物を用いることが好ましい。これら内部標準物
質は生体試料を調製する際に添加される。
【００１９】
【実施例】次に、実施例として、本発明の生体組織中の
ジヒドロテストステロン（androstan-17β-ol-3-one）
の検出法について詳細に説明する。なお、本発明におい
ては、これらの実施例に限定されるものではない。 生体試料の採取と保存 前立腺試料は生検後速やかにサンプル管に入れ、測定ま
で-80℃で保存した。血液は採血後直ちにヘパリン処理
を行って高速遠心分離で血球と血漿画分に分離し、血漿
を得た。血漿は速やかに-80℃で保存した。
ジヒドロテストステロン（androstan-17β-ol-3-one）
の検出法について詳細に説明する。なお、本発明におい
ては、これらの実施例に限定されるものではない。 生体試料の採取と保存 前立腺試料は生検後速やかにサンプル管に入れ、測定ま
で-80℃で保存した。血液は採血後直ちにヘパリン処理
を行って高速遠心分離で血球と血漿画分に分離し、血漿
を得た。血漿は速やかに-80℃で保存した。
【００２０】生体組織からのジヒドロテストステロン
の抽出 生体組織約10mgを秤量し、アセトニトリルに溶解した内
部標準物質の一定量50μlを添加し、メタノールを含む
アルカリ溶液中に１時間70〜80℃で加温溶解させる。溶
解液を水で希釈後Bond Elut C18に負荷し、水で洗浄
して、ジヒドロテストステロンを酢酸エチルで溶出す
る。溶媒を留去し、誘導体用試料とする。
の抽出 生体組織約10mgを秤量し、アセトニトリルに溶解した内
部標準物質の一定量50μlを添加し、メタノールを含む
アルカリ溶液中に１時間70〜80℃で加温溶解させる。溶
解液を水で希釈後Bond Elut C18に負荷し、水で洗浄
して、ジヒドロテストステロンを酢酸エチルで溶出す
る。溶媒を留去し、誘導体用試料とする。
【００２１】 血漿からのジヒドロテストステロンの
抽出 血漿0.1〜0.25mlに一定量の内部標準物質を加え、10倍
量の水を加えて、少量のメタノールとアルカリを加えて
混合する。これをBond Elut C18に負荷し、水で洗浄
したのち、ジヒドロテストステロンを酢酸エチルで溶出
する。溶媒を留去し、ヘキサン／酢酸エチル（10:1）に
溶解し、Bond Elut Silicaに負荷する。ヘキサン／酢
酸エチル（10:1）で洗浄後、ジヒドロテストステロンを
ヘキサン／酢酸エチル（6:1）で溶出する。溶媒を留去
後、誘導体用試料とする。
抽出 血漿0.1〜0.25mlに一定量の内部標準物質を加え、10倍
量の水を加えて、少量のメタノールとアルカリを加えて
混合する。これをBond Elut C18に負荷し、水で洗浄
したのち、ジヒドロテストステロンを酢酸エチルで溶出
する。溶媒を留去し、ヘキサン／酢酸エチル（10:1）に
溶解し、Bond Elut Silicaに負荷する。ヘキサン／酢
酸エチル（10:1）で洗浄後、ジヒドロテストステロンを
ヘキサン／酢酸エチル（6:1）で溶出する。溶媒を留去
後、誘導体用試料とする。
【００２２】 誘導体生成および精製法
組織及び血漿から抽出精製した誘導体用試料は少量のジ
クロロメタンに溶解したのち、アセトニトリルに溶解し
た2-フロロ-1-メチルピリジニウム試薬(アルドリッチ社
製)を加え、さらにトリエチルアミンを加えて、室温１
時間撹拌して誘導体生成を行う。その後、溶媒を留去し
たのち、水を加えて反応物を溶解する。Bond Elut C1
8に負荷した後、0.3％アンモニア水、水、メタノール、
そして0.1％ギ酸を含む50％メタノール溶液で順次洗浄
する。N-メチルピリジニウム化ジヒドロテストステロン
は10％ギ酸を含むメタノール溶液で溶出する。
クロロメタンに溶解したのち、アセトニトリルに溶解し
た2-フロロ-1-メチルピリジニウム試薬(アルドリッチ社
製)を加え、さらにトリエチルアミンを加えて、室温１
時間撹拌して誘導体生成を行う。その後、溶媒を留去し
たのち、水を加えて反応物を溶解する。Bond Elut C1
8に負荷した後、0.3％アンモニア水、水、メタノール、
そして0.1％ギ酸を含む50％メタノール溶液で順次洗浄
する。N-メチルピリジニウム化ジヒドロテストステロン
は10％ギ酸を含むメタノール溶液で溶出する。
【００２３】 LC/ESI-MS/MS法による分析
溶媒を留去した試料は濃縮用HPLCの移動相0.1mlに再溶
解し、ほぼ全量を注入した。試料は４分間濃縮カラムに
流した後、カラムスイッチを行い、分析カラムへ流路を
切り替え質量分析計に導入した。イオン化はエレクトロ
スプレーイオン化(ESI)法を用いた。分析条件は表１に
示した。
解し、ほぼ全量を注入した。試料は４分間濃縮カラムに
流した後、カラムスイッチを行い、分析カラムへ流路を
切り替え質量分析計に導入した。イオン化はエレクトロ
スプレーイオン化(ESI)法を用いた。分析条件は表１に
示した。
【００２４】
【表１】
【００２５】質量分析計で測定したときのN-メチルピリ
ジニウム誘導体のESIマススペクトルは、m/z382がイン
タクトモレキュラカチオンとして検出された（図１）。
またm/z382をプレカーサーイオンとしたときのMS/MS測
定を行うと、m/z255にプロダクトイオンが強い強度で検
出される。MS/MS手法により測定することで一層特異性
を増し、生体由来の夾雑物による妨害から逃れることが
出来る。そこでm/z382をプレカーサーイオンとしたとき
のプロダクトイオンm/z255をモニターするselected rea
ction monitoring(SRM)法で測定したところ、5pgのジヒ
ドロテストステロンが検出できた（図２）。内部標準物
質には安定同位体で標識した17-18O,17-d1,19-d3ジヒド
ロテストステロンを用いた（N.Watanabeら: J.Mass Spe
ctrom.Soc.Jpn.,45,367(1997)）。内部標準物質は5(10)
-エストレン-3,17-ジオンを原料とし馬場らの方法に従
い（S.Baba,ら:J.Labelled Com. Radiopharmaceutical
s,14,783(1978)）、6工程でまず19位のメチル基に重水
素標識した4-アンドロステン-3,17-ジオンを合成した。
さらに17α位に重水素、17位に重酸素を標識したテスト
ステロンに導き、接触還元でテストステロンからジヒド
ロテストステロンを合成した。このときに還元された5
位の水素はαとβの異性体が生成した。生体中のジヒド
ロテストステロンはα体であるためHPLCで分離し、α体
のピーク面積比を求めて、ジヒドロテストステロンの濃
度を算出した。
ジニウム誘導体のESIマススペクトルは、m/z382がイン
タクトモレキュラカチオンとして検出された（図１）。
またm/z382をプレカーサーイオンとしたときのMS/MS測
定を行うと、m/z255にプロダクトイオンが強い強度で検
出される。MS/MS手法により測定することで一層特異性
を増し、生体由来の夾雑物による妨害から逃れることが
出来る。そこでm/z382をプレカーサーイオンとしたとき
のプロダクトイオンm/z255をモニターするselected rea
ction monitoring(SRM)法で測定したところ、5pgのジヒ
ドロテストステロンが検出できた（図２）。内部標準物
質には安定同位体で標識した17-18O,17-d1,19-d3ジヒド
ロテストステロンを用いた（N.Watanabeら: J.Mass Spe
ctrom.Soc.Jpn.,45,367(1997)）。内部標準物質は5(10)
-エストレン-3,17-ジオンを原料とし馬場らの方法に従
い（S.Baba,ら:J.Labelled Com. Radiopharmaceutical
s,14,783(1978)）、6工程でまず19位のメチル基に重水
素標識した4-アンドロステン-3,17-ジオンを合成した。
さらに17α位に重水素、17位に重酸素を標識したテスト
ステロンに導き、接触還元でテストステロンからジヒド
ロテストステロンを合成した。このときに還元された5
位の水素はαとβの異性体が生成した。生体中のジヒド
ロテストステロンはα体であるためHPLCで分離し、α体
のピーク面積比を求めて、ジヒドロテストステロンの濃
度を算出した。
【００２６】この分析条件下で得られたジヒドロテスト
ステロンの検量線を図３に示した。検量線はジヒドロテ
ストステロン5〜100pgの濃度範囲で相関係数0.9997の良
好な直線を得た。試料中のN-メチルピリジニウム誘導体
のピーク面積と内部標準物質とのピーク面積比を求めて
ジヒドロテストステロンの濃度を算出した。患者Aの前
立腺9.3mg中のジヒドロテストステロン量は36.4pgであ
った。患者Bの前立腺10.1mg中には50.8pg存在した。さ
らに血漿では、患者Cの血漿0.25ml中には80.7pg、患者D
の血漿0.25ml中には68.3pgのジヒドロテストステロンが
検出された。健常人男性の0.1mlの血漿E、Fではそれぞ
れ42.7、41.3pgであった。これらの前立腺と血漿中ジヒ
ドロテストステロンを定量した結果を表２に示した。
ステロンの検量線を図３に示した。検量線はジヒドロテ
ストステロン5〜100pgの濃度範囲で相関係数0.9997の良
好な直線を得た。試料中のN-メチルピリジニウム誘導体
のピーク面積と内部標準物質とのピーク面積比を求めて
ジヒドロテストステロンの濃度を算出した。患者Aの前
立腺9.3mg中のジヒドロテストステロン量は36.4pgであ
った。患者Bの前立腺10.1mg中には50.8pg存在した。さ
らに血漿では、患者Cの血漿0.25ml中には80.7pg、患者D
の血漿0.25ml中には68.3pgのジヒドロテストステロンが
検出された。健常人男性の0.1mlの血漿E、Fではそれぞ
れ42.7、41.3pgであった。これらの前立腺と血漿中ジヒ
ドロテストステロンを定量した結果を表２に示した。
【００２７】
表2 前立腺及び血漿中ジヒドロテストステロン
試料 No 秤量値 定量値(ジヒドロテストステロン)
前立腺 患者Ａ 9.3mg 36.4pg
患者Ｂ 10.1mg 50.8pg
血漿 患者Ｃ 0.25mL 80.7pg
患者Ｄ 0.25mL 68.3pg
健常人Ｅ 0.1mL 42.7pg
健常人Ｆ 0.1mL 41.3pg
【００２８】誘導体化の反応は室温で１時間以内と簡便
で迅速である。生成した誘導体は極めて安定である。こ
の方法の定量限界は5pgであり、極少量の生体試料中の
微量のジヒドロテストステロン量を定量できることか
ら、数mgの生体試料があれば、ジヒドロテストステロン
量を高感度に定量することが可能となった。
で迅速である。生成した誘導体は極めて安定である。こ
の方法の定量限界は5pgであり、極少量の生体試料中の
微量のジヒドロテストステロン量を定量できることか
ら、数mgの生体試料があれば、ジヒドロテストステロン
量を高感度に定量することが可能となった。
【００２９】
【発明の効果】極少量の生体試料中ジヒドロテストステ
ロンを高感度に測定するために、N-メチルピリジニウム
誘導体化を行い、LC/MS法で測定する方法を発明した。
本法を用いてヒト前立腺及び血漿中のジヒドロテストス
テロンを高感度に測定することができた。また、本発明
は、極めて少量の生体試料を用いて、薬物による疾病の
治療効果や病態の評価、更にはタンパク質同化ステロイ
ドなどの不正使用の検査を行うために有効な手法であ
る。本発明により、生体試料中の1個の水酸基を有する
ステロイド類化合物を検出するうえで高感度に測定でき
る有用な方法を提供できる。
ロンを高感度に測定するために、N-メチルピリジニウム
誘導体化を行い、LC/MS法で測定する方法を発明した。
本法を用いてヒト前立腺及び血漿中のジヒドロテストス
テロンを高感度に測定することができた。また、本発明
は、極めて少量の生体試料を用いて、薬物による疾病の
治療効果や病態の評価、更にはタンパク質同化ステロイ
ドなどの不正使用の検査を行うために有効な手法であ
る。本発明により、生体試料中の1個の水酸基を有する
ステロイド類化合物を検出するうえで高感度に測定でき
る有用な方法を提供できる。
【図１】ジヒドロテストステロンをN-メチルピリジニウ
ム誘導体としたときのマススペクトルを図１に示す。
ム誘導体としたときのマススペクトルを図１に示す。
【図２】ジヒドロテストステロン5pgをN-メチルピリジ
ニウム誘導体にしたときのSRMを図２に示す。
ニウム誘導体にしたときのSRMを図２に示す。
【図３】ジヒドロテストステロンの検量線を図３に示
す。
す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 30/72 Ｇ０１Ｎ 30/72 Ｃ
Claims (8)
- 【請求項1】生体試料中の1個の水酸基を有するステロイ
ド類化合物を検出するうえにおいて、該ステロイド化合
物の水酸基にN-低級アルキルピリジニウム基を導入した
誘導体をLC/MSにより測定する検出法。 - 【請求項２】N-低級アルキルピリジニウム基がN-メチル
ピリジニウム基である請求項１に記載の検出法。 - 【請求項３】1個の水酸基を有するステロイド類化合物
が、アンドロゲン系化合物、エストロゲン系化合物、プ
ロゲステロン系化合物及びステロール系化合物のいずれ
から選択される化合物である請求項1又は２に記載の検
出法。 - 【請求項４】1個の水酸基を有するステロイド類化合物
がアンドロゲン系化合物である請求項1又は２に記載の
検出法。 - 【請求項５】アンドロゲン系化合物がジヒドロテストス
テロンである請求項４に記載の検出法。 - 【請求項６】ステロイド化合物の水酸基に誘導体を生成
した後、固相抽出法によるメタノール洗浄により前処理
し、次いで酸を含むメタノールで溶出してLC/MS測定用
試料とする、請求項１〜５のいずれかに記載の検出法。 - 【請求項７】LC/MS測定において、マススペクトロメト
リーのイオン化がエレクトロスプレーイオン化（ＥＳ
Ｉ）によって行われる請求項１〜６のいずれかに記載の
検出法。 - 【請求項８】LC/MS測定において、イオンをMS/MS手法に
よりおこなう請求項１〜７のいずれかに記載の検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001362158A JP3774888B2 (ja) | 2001-11-28 | 2001-11-28 | ステロイド類化合物のｌｃ−ｍｓによる高感度検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001362158A JP3774888B2 (ja) | 2001-11-28 | 2001-11-28 | ステロイド類化合物のｌｃ−ｍｓによる高感度検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003161726A true JP2003161726A (ja) | 2003-06-06 |
| JP3774888B2 JP3774888B2 (ja) | 2006-05-17 |
Family
ID=19172707
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001362158A Expired - Fee Related JP3774888B2 (ja) | 2001-11-28 | 2001-11-28 | ステロイド類化合物のｌｃ−ｍｓによる高感度検出法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3774888B2 (ja) |
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| JP2007132741A (ja) * | 2005-11-09 | 2007-05-31 | Aska Pharmaceutical Co Ltd | ステロイドの測定方法 |
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Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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