JPH01169355A - アフィニティークロマトグラフィー・マトリックスの製造方法 - Google Patents

アフィニティークロマトグラフィー・マトリックスの製造方法

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JPH01169355A
JPH01169355A JP62304673A JP30467387A JPH01169355A JP H01169355 A JPH01169355 A JP H01169355A JP 62304673 A JP62304673 A JP 62304673A JP 30467387 A JP30467387 A JP 30467387A JP H01169355 A JPH01169355 A JP H01169355A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアフィニティークロマトグラフィーに係わり、
特に７フイニテイークロマトグラフイーにおいてリガン
トを固定化するために有用なマトリックス（基質）に関
する。
〔従来の技術〕
種々の生物学的に活性な物質を容易にｎ！Ｒする必要性
について長い間求められてきた。例えば酵素精製におけ
る初期の方法は面倒であり、かつ長時間を要するもので
ありた。ところが、最近、生物学的に活性な物質（本明
細書中、リガンドと呼ぶ）を適当な重合体マトリックス
上に固定化し。
ついで、この固定化されたりｆンドをその混合物中から
単離することからなる生物学的活性物質の精製法が見出
された。このリガンドはその固定化された形でも使用す
ることができるが、所望によシ適当な化学的処理によシ
固定化されているマトリックスからリガンドを解放し、
非固定化の状態で使用することもできる。このようにリ
ガンドを重合体マトリックスに共有結合的に固定する方
法の発見は酵素学、免疫学および他の種々の生物学的技
法の実行を前進させた。
生物学的リガンドを固定化する最初の方法の一つとして
水酸基を有するポリマーを臭化シアン（ＣＮＢ　ｒ　）
等の活性化剤で処理することがおこなわれた。
この活性化されたポリマーは、ついで種々の生物学的リ
ガンドを共有結合によシ直接的に結合するのに用いられ
た。ポラス（Ｐｏｒａｔｈ）等は文献、［Ｍａｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＪ　、　”固定化酵素
”。
Ｋｅ　Ｍｏ５ｂａｃｈ　、　Ｅｄ＊　、　Ｖｏｌ　、４
４　を第１９−４５頁、アカデイミック・ブレス（Ａｃ
ａｄｌｍｉｃ　Ｐｒｅ８ｇ）ニューヨーク、米国（１９
７６）に、上記のＣＮＢ　ｒ法を含め、いくつかの化学
的活性法を提示している。
水酸基を有するポリマーを活性化する初期の方法の殆ん
どは広範な使用に適していなかった。、特に、ＣＮＢ　
ｒ活性化法は次のような欠点を有するものであった。即
ち、（１）　ＣＮＢｒ活性化水酸基含有ポリマーと、こ
の活性化ポリマーと反応するリガンドのアミノ基との間
に形成された結合は不安定である；（２）この活性化ポ
リマーとＩＪ　ｇンドとの間の反応はしばしば親和性吸
着における反応生成物の利用を妨害する荷電された種の
導入をともなう；（３）　ＣＮＢｒは有害な催涙性を示
する有毒化学物質であシ、その取扱いに特別の注意を要
する。
水酸基を有するポリマーにリガンドを結合させるため、
上記のＣＮＢ　ｒ法以外の方法を見出すための努力がな
され、その結果、三塩化トリアゾン、Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミド、１，１−カルボニルジイミダゾールおよ
び成る種のエポキシ化合物などの多くの異なった試薬の
使用が提案されている。２−フルオロ−１−メチルピリ
ジニウムトルエン−４−スルホネー）　（ＦＭＰ）との
反応によシ活性化された水酸基含有ポリマーを用いた共
有結合クロマドグフィー・マトリックスの製造方法が米
国特許Ａ　４，５８２．８７５に開示されている。しか
し、例えばアミン基、チオール基、又はヒドロキシアリ
ール基を有する生物学的活性物質を直接、重合体物質に
共有結合によ逆結合させると、立体性に問題が生じ、共
有結合された物質の生物学的活性に悪影響を与える。
ポリマー表面とリガンドとの間に配置させることができ
るスペーサ、即ち有機化合物はポリマーマトリックスに
対して接近して結合されたＩＪ　ｆｆンドに基づく立体
妨害を解消するのに役立つ。これを目的として直鎖型ス
ペーサおよび分岐型スペーサの双方を用いることができ
る。文献、「固定化酵素およびタンＩ？り質の生物医学
的応用（ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｏｂｉｌｌｚｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　
ａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ）　Ｊ　”分析におけるナイロ
ンチューブに付着した酵素の電位”、　Ｖｏｌ　、　２
　、　Ｔ、　Ｍ、　Ｓ、　Ｃｈａｎｇ。
Ｅｄ、、第３１７−３４０頁、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅ
ｓｓ、　二ｚ−ヨーク、米国（１９７７）にはポリリジ
ン・スペーサの使用が説明されている（第３２３頁参照
）。
文献、［タン／４’り質および酵素の生物工学的応用（
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔ＠１ｎｓａｎｄ　Ｅｎｚｙｍ
ｅｓ）Ｊ　、　”分析における固定化酵素の応用”　、
　Ｚ、ＢｏｈａｋおよびＮ、　５ｈａｒｏｎ　、　Ｅｄ
、　、第２６７−２７８頁、　Ａｃａｄｉｍｌｃ　Ｐｒ
ｅｓｓ　、ニエーヨーク、米国（１９７７）には酵素の
共有結合による付着のため、ペクチンアミン、即ち１，
３−ジアミノプロノ臂ンー２−オールおよびペクチンか
ら誘導されるポリアミンの使用が開示されている（第２
７１頁参照Σ米国特許Ａ４，１５２，４１１にはマーク
付きを椎診断具、例えばチロキシン、ポリ−１−リジン
およびわさびペルオキシダーゼを含むものの製造および
使用が開示されている。
スペーサ・アームの概念が文献、ケミカル・エンジニア
リング・ニュース（Ｃｈｅｍ、　Ｅｎｇ、　Ｎｅｗｓ、
）。
１９８５年８月２６日、第１７−３２頁、”アフィニテ
ィー・クロマトグラフィー”に論ぜられている。この文
献において、短かいアルキル鎖のスペーサ・アーム、例
えばヘキサメチレンジアミン、およびリジンとアラニン
との枝分れコポリマーを多官能性アンカー剤スペーサと
して使用することが開示されている。
〔発明が解決しようとする問題点） 本発明は広範な有機質リガンドに対し使用することがで
きるクロマトグラフィー・マトリックスを提供すること
を主目的とする。
さらに本発明はスペーサを有するアフィニティークロマ
トグラフィ・マトリックスを提供することを目的とする
。
さらに本発明は生物学的活性に悪影響を及ぼすおそれが
ないクロマトグラフィー感応性生物学的物質についての
手段を提供することを目的とする。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明はアフィニティークロマトグラフィーおよびリガ
ンド固定化に有用なマトリックスおよびその製造方法を
提供するものであって、生物学的に不活性の重合体スペ
ーサを用いることを特徴とする。この用いられるス４−
サはポリエチレンイミンである。本発明のマトリックス
は、水酸基を有するポリマーを２−フルオロ−１−メチ
ルピリジニウムトルエン−４−スルホネー）　（ＦＭＰ
）　色反応させて、このポリマー中の水酸基の少なくと
もいくつかが置換されて１−メチル−２−ピリドキシト
ルエン−４−スルホネート基を形成した活性化ポリマー
を生成させる工程と、この１−メチル゛　−２−ピリド
キシ置換ポリマーをポリエチレンイミンと反応させて、
この２リマー中の１−メチル−２−ピリドキシ基の少な
くともいくつかがポリエチレンイミンによシ置換された
アフィニティークロマトグラフィー・マトリックスを生
成させる工程とを含む方法によシ製造することができる
。
〔実施例〕
本発明は広範囲の有機質リガンド、例えば酵素、核ｆｉ
　：／　ｔｚり質、抗原、抗体、ハゲチン、ホルモン、
ビタミン、ポリペプチド、その他の生物学的に活性な化
合物を固定化又は共有結合的にクロマトグラフィー分離
する手段を提供する。生物学的活性を有するリガンドは
通常の環境下ではクロマトグラフィー・マトリックスと
の立体的相互反応により生物学的活性が損失され易い。
ポリエチレンイミンスペーサの使用により、そのような
損失を防止することができる。ポリエチレンイミンと反
応し得る求電子基を有するリガンドはこの方法にょシ容
易にクロマトグラフィー分離することができる。
このようなリガンドの例としてはアシル化剤、例エバカ
ルビン酸、ハロダン化アシル、ハロゲン化スルホニル、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｐ−ニトロベンゾエー
トの如き活性エステル、イミドエステル、アルデヒド、
エポキシド、チオエポキシド、ノビニルスホネート等で
ある。対象のＩＪ　、ｌｆンドが求電子基を有していな
い場合、又は問題の基そのものがリガンドの生物学的活
性に関与する場合、例えば、そのような基が酵素の活性
部位又はその近傍にある場合は、ポリエチレンイミンス
ペーサを誘導してリガンドがその生物学的活性に悪影響
を受けることなく反応し得る官能基を形成させるように
することが望ましい。
以下、本発明を第１図および第２図を参照して説明する
。これら図には全体の反応課程における桟々の工程が示
されている。
本発明の方法の最初の工程は少なくとも１個の反応性水
酸基を有するポリマー（構造式１）を２−フルオロ−１
−メチルビリジニウムトルエン−４−スルホネート（構
造式２）と第１図に示すように反応させることである。
反応性水酸基を少なくとも１個有するものであれば種々
の重合体物質を用いることができよう。
そのうち、有用な主なポリマーとしては多糖類、例えば
セルロース（紙など）；デキストランおよび架橋化デキ
ストラン；アガロースおよび架橋化アガロースである。
他の有用な重合体物質の例としては天然、半合成および
合成物質であって水酸基を有するものである。例えば、
ポリエチレングリコール；ポリビニルアルコール例えば
ＦＲＡＣＴＯＧＥＬＴＳＫ　（商標、親水性ビニルポリ
マーから合成された多孔質半硬質球状グルであって、Ｃ
，ＨおよびＯ原子のみから構成されているもの、Ｅ、Ｍ
ｅｒｋ社（西独）製）；ポリアクリレート（例えばポリ
ヒドロキシメチルメチルアクリレート）又はＴＲｌ５Ａ
ＣＲＹＬ　ＧＦ　２０００　（商標、Ｎ−アクリロイル
−２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパ
ンジオール、Ｒｅａｃｔｌｆｓ　ＩＢＦ社（フランス）
製）；およびブリコツアーゼガラスおよびシリカの粒体
でありて、炭素原子に結合された水酸基を少なくとも１
個有する基を結合してなるものである。以下、このよう
なポリマーをグルとも呼ぶ。このポリマーは必要に応じ
、ビーズ状、その他任意の形状で提供することができる
。
贋以外に他の２−ノ＼ロー１−メチルピリゾニウム塩と
して、例えば２−クロロ−１−メチルピリジニウム塩と
して用いることもできる。しかし、２−フルオロ−１−
メチルピリジニウム塩が活性の大きいことから好ましい
。
水酸基含有ポリマーと、ＦＭＰ又は他の２−ハロー１−
メチルピリジニウム塩との間の反応は水性溶液又は極性
有機溶媒、例えばアセトニトリル、アセトン、ジメチル
ホルムアミド又はテトラヒドロフラン中で、第３アミン
（例えばトリエチルアミン（ＴＥＡ）又はトリブチルア
ミン（ＴＢＡ）　）等の塩基の存在下でおこなうことが
できる。常温、常圧のゆるやかな条件下で、水酸基含有
ポリマーとＦＭＰとの間の反応は急激かつ円滑におこな
うことができ、約１ないし１５分間で終了する。その結
果得られる２−アルコキシ−１−メチルピリジニウム塩
（構造式３）は以下、活性化ポリマー又は活性化グルと
も呼ぶ。この活性化ポリマーは求核試薬、例えばポリエ
チレンイミン（構造式４）によシ容易に攻撃される。な
ぜならば、この１−メチル−２−ピリドキシ基は良好な
脱離基であり、求核置換により容易に１−メチル−２−
ピリドン（構造式　）に変換されるからである。
２−アルコキシ−１−メチルピリジニウム塩（構造式３
）とポリエチレンイミン（構造式４）との反応は第１図
に説明されている。ポリエチレンイミンは分子量が約１
，０００ないし２０，０００の範囲のものを使用するこ
とができる。しかし、分子量約ｉ、ｏｏｏないし２０，
０００の範囲のものが好ましい。ポリエチレンイミンは
その分岐度に関しても種々異なる。分岐度が増えれば反
応に供し得るアミノ基の数も増える。構造式４および５
においては分岐が１個の場合のみが示されている。反応
は適当な極性有機溶媒、例えばアセトニトリル、アセト
ン又はテトラヒドロフラン中でおこなわれる。
得られる反応生成物は末端アミノ基を有する（本明細書
で、これをアミノ−末端グルとも呼ぶ）。
対象となるリガンドがアミノ−末端グルのアミン基と反
応し得る求電子基を有する場合、非修飾アミノ−末端グ
ルがそのような求電子リガンドのためのアフィニティー
クロマトグラフィー・マトリックスとして役立つ。他方
、対象となるリガンドがポリエチレンイミンのアミン基
と容易に反応する基を有しない場合、例えばりガント自
身が反応性アミノ基を有する場合は、アミノ−末端グル
を適当な誘導化剤又は求電子リガンドと反応させて誘導
化し、上記グルに、第２図に示す如く、対象となるリガ
ンドの活性官能基と容易に反応し得る基を与えることが
好ましい。
例えば、アミノ−末端グルは硫化エチレン（構造式７）
との反応によシ容易にチオールグル（構造式８）に変換
させることができる。このチオールグルは２，２−ジチ
オピリジン（構造式１３）との反応により活性化され、
活性化チオールグル（構造式１４）となり、これはスル
フヒドリル含有リガンド、例えばスルフヒドリル含有酵
素についてのクロマトグラフィー・マトリックスとして
用いることができる。アミノ−末端グルをアラルキルカ
ルボン酸（構造式９）と反応させてフェニル−末端グル
（構造式１０）に変換すること、又はアミノ−末端グル
を適当な無水物、例えば無水コハク酸（構造式１１）と
反応させてカルゲキシー末端グル（構造式１２）に変換
することも容易・におこなうことができる。これら又は
その他の誘導化アミノル末端グルは適当なりガントにつ
いてのアフィニティークロマトグラフィー・マトリック
スとして使用することができる。
構造式８，１０および１２においては、誘導化剤との反
応が構造式５に示すアミノ−末端グル第１アミノ基にお
いて生起する例について記載されている。しかし、アミ
ノ−末端グルと誘導化剤との反応は存在し得る如何なる
第２又は第３アミン基においても生起し得る。
以下、具体的な実施例について説明するが、これらは本
発明の範囲を限定することを意因するものでないことを
理解されるべきである。
実施例１ セファロースＣＬ−４Ｂ　（架橋化アガロースゲル、Ｐ
ｈａｒｍａｃｌａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、
スウェーデン国）５ゴを２００ゴの蒸留水で５回洗りた
。この洗ったグルを１．２ミリモルの４−ジメチルアミ
ノピリジンを含む蒸留水５ｄ中に懸濁させた。このグル
懸濁液を室温で５分間攪拌した。この懸濁液にＦＭＰを
１．０ミリモル加えた。このグル溶液をさらに１５分間
連続的に攪拌したのち、２００ｍ／の蒸留水で５回洗い
、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１２００ａｔで５回、さらに蒸留水２
００プで５回洗った。
実施列２ ＦＭＰによる活性化に先立ち、　ＴＲｌ５ＡＣＲＹＬ　
ＧＦ　２０００ｆル（１２００ｍ／）を、１６００７ｄ
Ｏ蒸留水で５回、１６００＋ｉＪのエチルアルコールで
３回、１６００ｍ／の乾燥アセトンで１回、連続的に洗
滌した。ついで、真空濾過により過剰のアセトンを除去
したのち、そのグルを１６００１１１の乾燥アセトン中
に懸濁させ、１０分間攪拌した。このグルを１６００ａ
ｔの乾燥アセトンで再度洗滌したのち、質空濾過により
過剰の溶媒を除去した。次に、この乾燥グルを最初に８
０℃に加熱された乾燥用オープンに５時間収容し、つい
で８０℃に加熱された真空オーブン中に１４時間放置し
た。そののち、この乾燥グルを２．６コの乾燥トリエチ
ルアミン（ＴＥＡ　）を含有する乾燥アセトン５００＋
ａ／中に懸濁させ、５０ｇのＦＭＰおよび乾燥Ｎ、Ｎ−
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）７５０Ｒ１中にＴＥＡ
　７５　ｍ／溶解したものと混合し、これらを室温にて
０．５ないし３時間攪拌した。未反応の贋を戸別したの
ち、このグルを１１の乾燥ＤＭＦで洗滌し、ついで乾燥
ＤＭＦ　１１中に１０分間の攪拌により懸濁させた。こ
のＦＭＰ−活性化グルを次に、１０００ｔ／の乾燥アセ
トンで２回、４ｍＭＨＣＡを含む１０００ｒ！Ｌｌのア
セト／で１回、１０００ｍの４　ｍＭＨＣ２で２回、さ
らに１０００ｄの乾燥アセトンで２回、連続的に洗滌し
た。この洗滌したＦＭＰ−活性化グルを室温、真空下で
乾燥させた。
実施例３ ジメチルホルムアミド（Ｄ■゛）中での２−フルオロ−
１−メチルピリジニウムトルエン−４−スルホネートハ
伊　　を用いたＦＲＡＣＴＯＧＥＬ　ＴＳＫの活性化 乾燥ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ　ＴＳＫ　ＨＷ　７５　（Ｆ　
）　６　ｇを４−ジメチルアミノピリジン２ミリモル（
２４４ダ）含む乾燥ＤＭＦ　２５　ｍｌ中に＠濁させた
。この懸濁物中に、５ミリモル（１，４２ｇ　）のＦ’
ＭＰおよび５．５ミリモル（６７１Ｆ＋１ｐ）の４−ジ
メチルアミノピリジンを含む乾燥ＤＭＦ　２０　ｍｌを
添加した。この懸濁物を室温で１〜２時間攪拌した。こ
の活性化グルをついで２５０ゴのＤＭＦで４回、２５０
−の乾燥アセトンで３回、連続的に洗滌した。この洗滌
された活性化ダルを真空下、室温にて乾燥させ、４℃に
て保存した。
実施列４ ｐ紙の活性化 ホワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）　ｉｐ紙黒５４（直径
９ｃｒＲ）、５枚を７５℃にセットした真空オーブン中
に２４時間放置した。ついで室温まで冷却したのち、こ
れら戸紙を２００ｄのＤＭＦを収容した結晶化皿中に浸
漬した。次に、この皿を１０　Ｏｒｐｍにて１０分間振
とうさせたのち、中のＤＭＦを流出させた。
ついで、この皿に４ミリモルの４−ジメチルアミノピリ
ジン（ＤＭＡＰ）を含む乾燥ＤＭＦ　１００　ｍＪを加
え、再び５分間、１００　ｒｐｍにて攪拌した。次に、
１０ミリモルの２−フルオロ−１−メチルピリジニウム
トルエン−４−スルホネー）　（ＦＭＰ）および１０，
１ミリモルのＤＭＡＰを含むＤＭＦ’１００ｍをこの皿
に添加した。室温にて２時間、１００　ｒｐｍでこの皿
を振とうさせた。次に、溶液を除去したのち、乾燥ＤＭ
Ｆ″を加え、この皿を１０　Ｏｒｐｍにて１０分間振と
うさせ、洗滌をおこなった。この洗滌操作をさらに２回
繰り返した。ＤＭＦを斜傾により流出させたのち、２５
０ｄの乾燥アセトンを皿中のＦ紙に添加し、皿を１００
　ｒｐｍにて１０分間振とうさせた。この乾燥アセトン
による洗滌をさらに２回繰り返した。最後に、これらｐ
紙を室温にて風乾し、４℃の乾燥雰囲気中に保存した。
実施例５ アミノ−末端ダルの製造 ポリエチレンイミン（分子量、１８００）１４　ｇを１
００ｍ１のアセトニトリル中に溶解させ念。この溶液に
実施列２のＦＭＰ−活性化グル２０ｇを加えた。得られ
た懸濁物を室温にて１５〜２４時間攪拌した。このグル
を次にこの懸濁物から除去し、さらに２００ｄの蒸留水
中に再び懸濁させ、室温にて１時間攪拌した。この最後
の工程をさらに２回縁シ返した。次に、このグルを１０
００１ｎｌの蒸留水で３回、ＩＭＮａＣｔ１０００ｍＡ
！で３回、１０００ｍ／の蒸留水で３回、６００ｄのア
セトニトリルで３回、６００ｉ／の乾燥アセトンで３回
、連続的に洗滌した。得られたアミノ−末端デルを真空
下、室温で乾燥させた。
実施例６ チオールグルの製造 実施例５の方法によυつくられた乾燥状態のアミノ−末
端グル２０ｇを乾燥アセトン１２０１ｄ中に懸濁させた
。この懸濁液に硫化エチレン４　ｒｎｌを加えた。得ら
れた混合物を室温で１８時間攪拌した。次にこのダルを
１０００ｍ／の蒸留水で３＠。
６００　ｍｌのアセトンで３回、１０１００Ｏの蒸留水
で３回、１０００ゴのアセトンで３回、１０００ゴのＩ
Ｍ　ＮａＣ２で３回、１０００ｄの蒸留水で３回、６０
０ゴのアセトンで３回、連続的に洗滌した。
この得られたチオールグルはそのままアフィニティーク
ロマトグラフィー・マトリックスとして使用することも
できるが、２．２−−）チオピリジンで処理して遊離ス
ルフヒドリル基を有するリガンドに対し使用することも
できる。
実施例７ 活性化チオールグルの製造 実施例６の戸別されたチオールグルを２０ｍＭのジチオ
トレイトール１００７ｄ中に懸濁させ、２時間攪拌した
。このチオールグルを１０００ｙｔｌの蒸留水で３回、
１０００ｄのＩ　Ｍ　Ｎｍ（、ｔで３回、６００ｒＬｌ
のアセトンで３回、１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ
の重炭酸ナトリウムとアセトンとの混合物（６〇−４０
ｖ／ｖ　）　５００−で２回洗滌した。この洗滌したグ
ルを０．３　Ｍの２，２−ジテオピリジン４０ゴ中に懸
濁させ、これを２４〜４８時間攪拌した。この活性化さ
れたチオールグルを６００ＷＬｌの６０チアセトンで３
回、４００ｍの１　ｍＭ　ＥＤＴＡで５回、１００　Ｑ
ｍ／の０．５　Ｍ　ＮａＣ２で５回、連続的に洗滌した
。
この活性化したチオールグルをシん酸塩で緩衝した食塩
水中にて４℃で保存した。
この活性化したチオールグルは例えばタチナタマメウレ
アーゼ又はβ−ガラクトシダーゼ等の複離スルフヒドリ
ル基を有する酵素を固定化するのに用いることができる
。
実施列８ フェニルグルの製造 ４−フェニルグル３２８４〜（２０ミリモル）；Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミド２３００ｍ９（２０ミリモル）
：Ｎ、Ｎ−ジシクロへキシルカルゲゾイミド４１３０ダ
（２５ミリモル）および２５ｍＪの乾燥トリエチルアミ
ンを乾燥ＤＭＦ’　３００　ｙｄ中に溶解させ、室温で
２０時間攪拌した。析出物を除去したのち、上澄液を、
１００−の乾燥アセトンおよび７　ｍｌの乾燥トリエチ
ルアミン中に懸濁させた実施列５の乾燥アミノ−末端グ
ル２０ｇに加え、ついで室温で２４時間攪拌した。次に
、このグルを２００ｍ１のＤＭＦで５回、２００ｒｎｌ
の０．５　Ｍ　ＮａＣ１で５回、１　ｍＭのＮａＯＨに
溶かした０、　５　Ｍ　ＮａＣ１溶液２００ｍ／で５回
、１ｍＭのＵＣ２に溶かした０、５ＭＮａＣ２溶液２０
０ｒＩＩｌで５回、１ｍＭのＮａＯＨ２００ｍｌで５回
、蒸留水２００ｍ／で５回、連続的に洗滌した。洗滌後
、このグルを、１Ｍの硫酸アンモニウムを含むｐＨ７，
０のυん酸ナトリウム緩衝液（０，０１Ｍ）中にて保存
した。
このフェニルグルは重合体キャリヤーから立体的に（ｓ
ｔｓｒｉｃａｌｌｙ）に除去された疎水性連鎖を有し、
タンノ２り質、例えば血清アルブミンの精製に使用する
ことができる。
実施例９ カルブキシ−末端ゲルのＨ１ｉｌ＆ 実施例５のアミノ−末端グル４５ｇをテトラヒドロフラ
ン３００ｆｆｉ／中に懸濁させ、これに４−ジメチルア
ミノピリシン３ミリモル（０，３７ｇ）、無水コハク酸
１５ミリモル（１，５ｇ）およびトリエチルアミン４．
５ｄを加えた。この得られた懸濁液を室温にて２４時間
、攪拌した。次に、このケ°ルを３０＋１１／の蒸留水
で５回、６００ｍ１の０．５　ＭＮａＣＬで２回、３０
０ｔｎｌの蒸留水で５回、連続的に洗滌した。このグル
をりん酸塩緩衝食塩水中にて４℃で、懸濁、保存した。
このカルメキシー末端グルはアミノ基含有リガンド、例
えば酵素、抗原、抗体、ノ・フラン、タン・４り質、核
タンパク質、ホルモン、ビタミン等の精製のためのアフ
ィニティークロマトグラフィー・マトリックスとして使
用することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の重合体マ）　ＩＪラックス製造を説明
するだめの概略的フローシート図、第２図は本発明のマ
トリックスを用いた種々の誘導化反応を説明する概略的
フローシート図である。 出願人代理人　　弁理士　鈴　江　武　彦＋ 工 ○ 工 Ｎ　　　　　　　　　　　　　　ψ 工

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）少なくとも１個の水酸基を有する重合体物質を２
    −フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４−ス
    ルホネートと反応させて、上記水酸基の少なくともいく
    つかが１−メチル−２−ピリドキシ基に変換された活性
    化ポリマーを形成させる工程と； この１−メチル−２−ピリドキシ置換ポリマーをポリエ
    チレンイミンと反応させて、上記１−メチル−２−ピリ
    ドキシ基の少なくともいくつかが上記ポリエチレンイミ
    ンにより置換されたアフィニティークロマトグラフィー
    ・マトリックスを形成する工程と； を具備してなるアフィニティークロマトグラフィー・マ
    トリックスの製造方法。
  2. （２）上記重合体物質が多糖類である特許請求の範囲第
    １項記載の製造方法。
  3. （３）上記多糖類がデキストランである特許請求の範囲
    第２項記載の製造方法。
  4. （４）上記多糖類が架橋化デキストランである特許請求
    の範囲第２項記載の製造方法。
  5. （５）上記多糖類がアガロースである特許請求の範囲第
    ２項記載の製造方法。
  6. （６）上記多糖類が架橋化アガロースである特許請求の
    範囲第２項記載の製造方法。
  7. （７）上記多糖類がセルロースである特許請求の範囲第
    ２項記載の製造方法。
  8. （８）重合体物質がゲル状のものである特許請求の範囲
    第１項記載の製造方法。
  9. （９）重合体物質がＮ−アクリロイル−２−アミノ−２
    −ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールの重合
    体である特許請求の範囲第１項記載の製造方法。
  10. （１０）重合体物質がポリビニルアルコールである特許
    請求の範囲第１項記載の製造方法。
  11. （１１）重合体物質が紙である特許請求の範囲第１項記
    載の製造方法。
  12. （１２）重合体物質を上記２−フルオロ−１−メチル−
    ピリジニウムトルエン−４−スルホネートと水性溶液中
    で反応させる特許請求の範囲第１項記載の製造方法。
  13. （１３）重合体物質を上記２−フルオロ−１−メチル−
    ピリジニウムトルエン−４−スルホネートと極性有機溶
    媒中で反応させる特許請求の範囲第１項記載の製造方法
    。
  14. （１４）少なくとも１個の水酸基を有する重合体物質を
    ２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４−
    スルホネートと反応させて、上記水酸基の少なくともい
    くつかが１−メチル−２−ピリドキシ基に変換された活
    性化ポリマーを形成させる工程と； この１−メチル−２−ピリドキシ置換ポリマーをポリエ
    チレンイミンと反応させて、上記１−メチル−２−ピリ
    ドキシ基の少なくともいくつかが上記ポリエチレンイミ
    ンにより置換されたポリエチレンイミン置換ポリマーを
    形成させる工程と；このポリエチレンイミン置換ポリマ
    ーを、そのうちのアミノ基と反応し得る求電子リガンド
    と反応させる工程と； を具備してなるアフィニティークロマトグラフィー・マ
    トリックスの製造方法。
  15. （１５）上記求電子リガンドがアラルキルカルボン酸で
    ある特許請求の範囲第１４項記載の製造方法。
  16. （１６）上記求電子リガンドが硫化エチレンである特許
    請求の範囲第１４項記載の製造方法。
  17. （１７）上記求電子リガンドが硫化エチレンであって、
    上記ポリエチレンイミン置換ポリマーと硫化エチレンと
    の反応生成物を２，２−ジチオピリジンと反応させる特
    許請求の範囲第１４項記載の製造方法。
  18. （１８）求電子リガンドが無水カルボン酸である特許請
    求の範囲第１４項記載の製造方法。
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