JPH0427504B2

JPH0427504B2 -

Info

Publication number: JPH0427504B2
Application number: JP61199569A
Authority: JP
Inventors: Hiroaki Ishibashi; Shinichi Takasaki
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1986-08-26
Filing date: 1986-08-26
Publication date: 1992-05-12
Also published as: JPS6356501A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は種々の生理活性物質の分離、精製に有
用なアフイニテイクロマト用ゲルカラム充填剤に
関し、さらに詳しくは球状セルロースゲルにε−
ポリリジンを結合させた不溶性担体からなるカラ
ム充填剤に関するものである。〔従来の技術〕近年、バイオテクノロジーの進歩に伴つて細胞
培養、遺伝子操作などによつて生産される微量の
生理活性物質の分離、精製技術の重要性が増して
きている。分離、精製方法として、ゲル過、イ
オン交換、遠心分離などの組合せが利用されてき
た。これらの操作は長時間を要したり、目的物質
のロスなどが生じて問題点があつた。これに対し
て最近、生物学的親和性を利用して分離するアフ
イニテイクロマトが盛んに利用されるようになつ
た。〔発明が解決しようとする問題点〕従来のアフイニテイクロマト剤はほとんどが多
糖類のアガロースをペースとして、ブロムシアン
で活性化後リガンドを結合させる方法で製造され
ていた。リガンドとしては抗体、抗原、酵素、ア
ミノ酸、ペプチド、ホルモン、核酸などが使用さ
れている。しかしアガロースをベースとしている
ために、従来のアフイニテイゲルは軟く、機械的
強度が弱くカラムに充填してクロマトを実施する
場合に流速がでなく、工業的利用に難点があつ
た。他方リガンドの中で近年、プラスミノーゲン
の精製などに使用される塩基性アミノ酸であるリ
ジンあるいはポリリジンが注目され、これらをア
ガロースに結合させたアフイニテイゲルが開発さ
れている。しかし、これらのゲルはブロムシアン
法で結合されているので、リガンドの脱離があつ
たり、流速がでない、精製効率が悪い等の欠点が
あつた。本発明の目的は硬くて機械的強度が強く、クロ
マトを実施する場合には流速が大きく、リガンド
の脱離がなく、精製効率の良いアフイニテイクロ
マト用ゲルカラム充填剤を提供することである。〔問題点を解決するための手段〕本発明はε−ポリリジンをリガンドとして、球
状セルロースゲルに官能基を介して結合させたゲ
ルからなるアフイニテイークロマトグラフイー用
カラム充填剤に関するものである。アミノ酸であるリジンが重合したポリリジンは
従来はリジンのα−位のアミノ基がカルボキシル
基と縮合したα−ポリリジンで合成品であつた
が、本発明に使用するポリリジンとしては微生物
のストレプトマイセスアルブラス
（Streptomyces albulus）が産生するε−アミノ
基が縮合しているε−ポリリジンを使用すること
ができる。その構造式を次に示す。その製造法は特公昭59−20359号に記述されて
いる。即ち、ストレプトマイセスアルブラスをグ
リセロール、硫酸アンモニウム、酵母エキス等を
含む培養液で培養後、分離精製してポリリジンが
得られる。このポリリジンの重合度は20〜30であ
る。又、同じ発明者らの別の文献によると（醗酵
と工業43巻902頁、Agr.Biol.Chem.45巻2503頁）
このポリリジンは従来のものと異なつてリジンの
ε−位のアミノ基がα位のカルボキシル基と縮合
しているいわゆるε−ポリリジンであることも明
らかにされている。 ε−ポリリジンを結合させるセルロースは真球
状の球状粒子であり、その製造方法としては次の
様な例がある。 (1) 特開昭53−86749号に記載の方法で、セルロ
ース酢酸エステルを有機溶媒中に溶解し、この
溶液を水性媒体中にけんだくさせて、球状化
し、有機溶媒を蒸発させてセルロースエステル
粒子を得、これをケン化後セルロース粒子とす
る方法。 (2) (1)の方法の応用でセルロース酢酸エステルの
溶液に脂肪族高級アルコール等を加えて、多孔
性を調節する特開昭56−24429号の方法。 (3) セルロースをパラホルムアルデヒドとジメチ
ルスルホキシドの混合溶媒にとかして造粒する
特開昭57−159801号、特公昭57−159802号の方
法。 (4) セルロースを水酸化第２銅、塩化第１銅の濃
アンモニア水に溶解して造粒する特開昭52−
11237号の方法。 (5) ビスコースを変圧器油中に分散させて造粒す
る特開昭51−5361号の方法。 (6) セルロースをチオシアン酸カルシウム塩溶液
に溶解させて造粒する特開昭55−44312号の方
法。 (7) 精製リンターを銅アンモニア溶液に溶解させ
て造粒する特開昭48−60754号の方法。次にこれら球状セルロース粒子とε−ポリリジ
ンを結合させるにはセルロースに反応性のある官
能基を導入し、その後ε−ポリリジンと反応させ
る。その方法については次のような方法がある。 (1) セルロースにホルミル基を導入し、次いでこ
れとε−ポリリジンと反応させてシツフ塩基を
形成させ、還元する方法。この場合セルロース
にホルミル基を導入するには例えば次のような
方法がある。 (2) セルロースをビスオキシランと反応させてエ
ポキシ基を導入し、このエポキシ基とε−ポリ
リジンを反応させる方法。 (3) セルロースをω−アミノアルキルアミンと反
応させてアミノ基を導入し、この末端アミノ基
とε−ポリリジンのカルボキシル基と縮合させ
る方法。 (4) セルロースをエピクロルヒトリンでエポキシ
化後、アミノ化して無水コハク酸と反応させて
カルボキシル基を導入し、この末端カルボキシ
ル基とε−ポリリジンのアミノ基を縮合させる
方法。 (5) (4)の方法で得られたカルボキシル基とＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドと反応させて活性タイ
プ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化
物）としてε−ポリリジンと結合させる方法。その他(6)ジアゾニウム誘導体による結合方法、
(7)ヒドラジド誘導体による結合方法などがある。
最近、セルロースの球状粒子でアフイニテイ用ゲ
ルでアミノ化−セルロフアイン（セルロフアイン
は商標である。以下同じ。）、ホルミル−セルロフ
アインがあり、これらを使用すると便利である。これらの結合方法を反応式に表わすと例えば次
の様になる。 (1) （セルロース）−CHO＋NH₂−（ポリリジン） →（セルロース）−CN＝Ｎ−（ポリリジン）還元剤 −−−→ （セルロース）−CH₂−NH−（ポリリジン） (3) （セルロース）−NH−（CH₂）_o−NH₂＋
HOOC−（ポリリジン）→（セルロース）−NH
−（CH₂）_o−NHCO−（ポリリジン）〔発明の効果）この様な本発明におけるε−ポリリジンが結合
したセルロースは今までにない特異的な分離精製
剤として利用できる。類似の素材としてα−ポリ
リジンが結合したアガロースゲル（シグマ製）が
あるが、ポリリジンがα−ポリリジンであり、α
位−アミノ基が縮合しているのでフリーのアミノ
基はε−位である。ε−ポリリジンはε−位のア
ミノ基が縮合しているので、α−位のアミノ基が
フリーであり、ε−ポリリジン−セルロースでも
フリーのアミノ基が多くあり、α−ポリリジン−
アガロースとは異なつた特異な性質を有し新しい
分離精製剤として非常に有用である。ポリリジン
が従来のα−ポリリジンと異なるばかりでなく、
担体ゲルがセルロースであることも大きな特徴で
ある。アガロースは多糖類であるが、その構造の
ため軟く、機械的強度が弱いという欠点がある。
このためこの様なゲルをクロマト剤としてスケー
ルアツプして工業的スケールで使用する場合、高
流速がとれない等の欠点がある。本発明のε−ポ
リリジン−セルロースは機械的強度があり、高流
速が得られ、工業的スケールでの使用もでき、新
しい分離システムとしての用途が期待できる。本発明のε−ポリリジン−セルロースではフリ
ーのα−位のアミノ基が多く存在するのでアフイ
ニテイクロマト剤として用いたとき酵素の精製、
プラスミノーゲンの単離、フアージの分離、精
製、核酸の分離、多糖類の分離などが今までの分
離材と異なつて効率良く、しかも一度に多量に可
能である。〔実施例〕以下に実施例としてε−ポリリジンのセルロー
ス球状粒子への結合方法と得られたアフイニテイ
ークロマトグラフイー用充填剤の使用例を示すが
本発明はかかる実施例のみに限定されるものでは
ない。実施例１アフイニテイ用担体として市販されているセル
ロースをホルミル化したホルミル−セルロフアイ
ン（チツソ(株)製）サクシヨンドライ品（プフナー
ロート上で吸引過したもの）50ｇ（約70ml）と
0.5ｇのε−ポリリジンを含む0.2MNa₂HPO₄−
NaOHバツフアー（PH11.0）100mlを加え30℃、
１時間撹拌した。この後水素化シアノホウ素ナト
リウム（SCBH）400mgを加え、一晩撹拌した。
さらにＬ−リジン14.6ｇ、SCBH400mgを加え、
２時間撹拌した。過後蒸留水洗浄をくり返し、
ε−ポリリジン−セルロースゲルを得た。固定化
されたε−ポリリジンはメチルオレンジによる結
合方法を利用する比色法（J.Polym.Sci.Polym.
Chem.Ed.22巻、1281ページ、1984年参照）で定
量されゲル１ml当り５mgであつた。実施例２特開昭55−44312号の実施例１の方法で造粒し
たセルロースゲルのサクシヨンドライ品100ｇを
1N−NaOH溶液80mlにけんだくさせさらに
NaBH₄5ｇと12mlの１，４−ビス−（２，３−エ
ポキシピロキシ）−ブタンを加え、25℃で５時間
反応させた。反応終了後、過して水でよく洗滌
した。この様にして得られたエポキシ活性化−セ
ルロースゲルのサクシヨンドライ品100ｇを
0.2MNa₂CO₃溶液130mlにけんだくさせε−ポリ
リジン1.2ｇを加え、４℃で15時間反応させた。
反応終了後1.0MNaClで洗滌した。過剰のエポキ
シ基を除くために中性条件で5M−塩酸ヒドロキ
シアミンを100ml加えて撹拌後過した。固定化
されたε−ポリリジンはゲル１ml当り４mgであつ
た。実施例３特開昭56−24429号の実施例１の方法で造粒し
たセルロースゲルのサクシヨンドライ品100ｇを
0.4MのKIO₄溶液130mlを加え１時間室温で撹拌
した。水でよく洗滌後、1.0Mのヘキサメチレン
シアミン150mlを加え６時間撹拌した。反応終了
後水洗した。このようにして得られたアミノ化−
セルロースゲル100ｇにε−ポリリジン3.0ｇを含
む0.1M炭酸ナトリウム150mlと１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
1.0ｇを加え室温で３時間撹拌した。反応終了後
過し、水洗後、0.1M炭酸ナトリウム150mlとＬ
−リジン2.0ｇを加え、１時間反応後水洗した。
固定化されたε−ポリリジンはゲル１ml当り10mg
であつた。実施例４アフイニテイ用担体として市販されているセル
ロースをアミノ化したアミノ化−セルロフアイン
（チツソ(株)製）のサクシヨンドライ品100ｇを
0.1MNaClで洗滌後、150mlの1.1MNaClにけんだ
くさせた。これに12ｇの無水コハク酸を少量づつ
加えた。その間20％NaOHを加えPHを6.0に保ち
ながら30℃で６時間撹拌した。過してゲルを
0.1M−NaOH中にけんだくさせ室温で30分間撹
拌した。その後このゲルを水洗してスクシニルア
ミノセルロースゲルを得た。このゲル100ｇに1.5
ｇのε−ポリリジンを含む0.2MNa₂HPO₄−
NaOHバツフアー（PH11.0）200mlと１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド塩酸塩1.5ｇを加え、室温で８時間撹拌し
た。さらにＬ−リジン5.0ｇを加え、２時間撹拌
した。反応終了後は水洗を十分おこなつた。固定
化されたε−ポリリジンはゲル１ml当り4.0mgで
あつた。実施例５実施例４で得たスクシニルアミノセルロースゲ
ルをジオキサン中で充分に洗滌して脱水後、300
mlのジオキサンにけんだくさせた。最終濃度が
各々0.1Mになる様にＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドとジシクロヘキシルカルボジイミドを加え
た。60分間撹拌した。700mlのジオキサン、500ml
のメタノール、400mlのジオキサンで洗滌した。
この様にしてＮ−ヒドロキシスキシンイミドエス
テル化セルロースゲルを得た。このゲル10ｇ（サ
クシヨンドライ品）に１％NaClを含む
0.01MNaHCO₃（PH7.5）を50ml加えけんだくさせ
たε−ポリリジン0.8ｇを加え室温で20時間撹拌
した。残存活性基をブロツクするために0.1M−
トリス塩酸（PH9.0）で室温で１時間撹拌した。
次いで0.5M−NaCl含有の0.05Mホウ酸緩衝液
（PH4.0）にて洗滌した。このようにしてε−ポリ
リジンを官能基を介して結合したセルロースゲル
が得られた。ε−ポリリジンの結合量はゲル１ml
当り６mgであつた。実施例６（プラスミノーゲンの精製）実施例１で調整したε−ポリリジン−セルロー
スゲルを径1.2cm×９cmのカラムに充填し、
50mMのリン酸バツフアー（PH7.5）（以下「開始
バツフアー」という。）で平衡化した。このカラ
ムに人血清200mlを流速22ml／hrで添加し、溶出
液の吸光度（280nｍ）が0.05以下になるまで開始
バツフアーで洗滌した。弱い非特異的吸着物質を
除くために更に0.5Mの食塩を含む開始バツフア
ー50mlでカラムを洗滌した。ついで0.2Mのε−
アミノカプロン酸溶液70mlを流しプラスミノーゲ
ンを溶出した。以上の操作で12mgのプラスミノー
ゲンが回収された。これはSDSポリアクリルアミ
ドグラジエンド電気泳動で純品と確認された。ゲ
ルの単位容量当りの回収率は1.2mg／mlであつた。比較例１実施例６においてε−ポリリジン−セルロース
ゲルに代えてε−ポリリジン−アガロースを使用
し、他を全く同様な条件でおこない６mgのプラス
ミノーゲンが回収された。ゲルの単位容積当りの
回収率は0.6mg／mlであつた。実施例６と比較例１の比較から本発明のアフイ
ニテイークロマトグラフイー用充填剤の精製効率
は従来のものよりもはるかにすぐれていることが
明らかである。実施例７（T4フアージの分離、精製）実施例２で調製したε−ポリリジン−セルロー
スゲル１mlをガラス製カラム（径0.8cm×２cm）
に充填し、0.15MNaClを含む0.02Mリン酸バツフ
アー（PH7.4）（以下「開始バツフアー」という。）
10mlで平衡化した。これにT4フアージ1.5×10⁸
個／mlを含む開始バツフアー１mlを添加し、２
ml／hrの流速で流した。さらに開始バツフアー10
mlで洗滌した。この時カラムより溶出して来た液
を集め全体を12mlとした。これを素通り液とし
た。次に0.5M−NaClを含む0.05M−グリシン塩
酸バツフアー（PH3.0）５mlで流速４ml／hrで溶
出した。これを溶出液とした。対照としてε−ポ
リリジンが結合していない特開昭55−44312号の
実施例１の方法で造粒したセルロースゲルを用い
て同じ実験を行ない、各々素通り液、溶出液を回
収した。以上のサンプル中のフアージ数を大腸菌
（Escherichia Coli）を用いた寒天二重層で検定
した。結果は次の第１表のとおりであり、ε−ポ
リリジン−セルロースゲルはT4フアージを吸着
することが明らかとなり、フアージの分離、精製
に有用である。

【表】実施例８（ヒアルロン酸の精製）ストレプトコツカスズ−エピデミカス
（Streptococcus Zooepidemicus）FERM BP−
878菌をペプトン1.5％、酵母エキス0.5％、牛血
清0.5％、リン酸１カリウム0.3％、リン酸２カリ
ウム0.2％、ブドウ糖２％、チオ硫酸ナトリウム
0.01％、亜硫酸ナトリウム0.002％及び硫酸マグ
ネシウム0.01％を含む水溶液（PH7.0）で培養し
た。（醗酵方法については61年度農芸化学会講演
要旨集P.510参照。）培養液は１で32℃で30時
間、醗酵をおこなつた。終了後加熱処理して菌体
を分離した。液にエタノール約500mlを加え、
結晶を析出させた。析出した結晶を取し500ml
の0.05Mトリスバツフアー（PH7.5）に溶解させ
て、実施例３で製造したε−ポリリジン−セルロ
ースゲル２（径８cm×40cm）を詰めたカラムに
加え2.0MNaClを加えるグラジエント法で溶出さ
せた。流量（600ml／hr）溶出液を25mlずつ分取
し、ヒアルロン酸の定量はBitter（Anal.Biochem
４ 330（1962））のウロン酸を測定する方法で
おこなつた。その結果を第１図に示す。ウロン酸
の分析値が高いフラクシヨンNo.20〜No.40までを集
めて透析で脱塩後、濃縮、凍結乾燥してヒアルロ
ン酸の製品3.0ｇを得た。ここに得られたヒアル
ロン酸は次の様な性質を有し、高品質であつた。分子量：96万（粘度法）ヒアルロン酸：89％水分：10％蛋白質：＜0.1％核酸：＜0.5％グルコサミノグルカン硫酸塩：＜0.01％実施例９（アフイニテイークロマトグラフイー用充填剤
の流速の測定）次の様な条件で実施例４で製造した本発明のア
フイニテイークロマトグラフイー用充填剤と市販
のα−ポリリジン−アガロース（シグマ製）の流
速を測定した。カラム：1.6×20cm 溶出液：50mMリン酸バツフアー（PH7.0）この結果を第２図に示す。この図より本発明の
アフイニテイークロマトグラフイー用充填剤は従
来品のアガロース系アフイニテイークロマトグラ
フイー用充填剤と比較して問題なく流速が大であ
ることが明らかであり、工業的に大量に使用する
場合に非常に有利である。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例８で行なつたヒアルロン酸のア
フイニテイクロマトグラフイーによる溶出曲線を
示す図、第２図はカラムのみ(A)、本発明アフイニ
テイークロマトグラフイー用充填剤を詰めたカラ
ム(B)及び市販のα−ポリリジン−アガロースを詰
めたカラム(C)に50mMリン酸バツフアー（PH7.0）
を流したときの流速を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１球状セルロース粒子に官能基を介してε−ポ
リリジンが結合した生物化学的親和性を有するゲ
ルからなるアフイニテイークロマトグラフイー用
カラム充填剤。２前記ε−ポリリジンがストレプトマイセスア
ルブラス（Streptomyces albulus）の醗酵より
得られる重合度20〜30のものであることを特徴と
する第１項記載のカラム充填剤。３ ε−ポリリジンと反応する官能基を導入した
球状セルロース粒子とε−ポリリジンとを反応さ
せ必要に応じて後処理することを特徴とする球状
セルロース粒子に官能基を介してε−ポリリジン
が結合した生物化学的親和性を有するゲルからな
るアフイニテイークロマトグラフイー用カラム充
填剤の製造方法。４前記ε−ポリリジンと反応する官能基を導入
した球状セルロース粒子が、球状セルロース粒子
にホルミル基を導入したものであり、前記後処理
が還元であることを特徴とする第３項記載のカラ
ム充填剤の製造方法。５前記ε−ポリリジンと反応する官能基を導入
した球状セルロース粒子が、球状セルロース粒子
にエポキシ基を導入したものであることを特徴と
する第３項記載のカラム充填剤の製造方法。６前記ε−ポリリジンと反応する官能基を導入
した球状セルロース粒子が、球状セルロース粒子
とω−アルキルアミンの末端アミンとの反応生成
物であることを特徴とする第３項記載のカラム充
填剤の製造方法。７前記ε−ポリリジンと反応する官能基を導入
した球状セルロース粒子が、球状セルロース粒子
にカルボキシル基を導入したものであることを特
徴とする第３項記載のカラム充填剤の製造方法。８前記ε−ポリリジンと反応する官能基を導入
した球状セルロース粒子が、球状セルロース粒子
にカルボキシル基を導入し、このカルボキシル基
をＮ−ヒドロキシスクシンイミドでエステル化し
たものであることを特徴とする第３項記載のカラ
ム充填剤の製造方法。９前記ε−ポリリジンがストレプトマイセスア
ルブラス（Streptomyces Albulus）の醗酵より
得られる重合度20〜30のものであることを特徴と
する第３項ないし第８項のいずれかに記載のカラ
ム充填剤の製造方法。