RU1777951C - Способ получени сорбента дл выделени фибронектина - Google Patents

Abstract

Сущность изобретени : сорбент получают путем иммобилизации желатина на активированной пористой кремнеземной матрице, причем в качестве матрицы используют пористое стекло, модифицированное сшитой полиакрилатной оболочкой, содержащей активные п-нитрофенилакри- латные группы в количестве 2-90 мкмоль/г матрицы, а иммобилизацию желатина провод т путем инкубации матрицы в 1-3%- ном растворе желатина в растворе бикарбоната натри  с рН 8-9. 3 табл.

Description

Изобретение относитс  к медицинской биотехнологии, в частности к усовершенствованному способу получени  биоспецифического сорбента дл  выделени  и очистки биологически-активного белка - фибронек- тина.

Фибронектин - высокомолекул рный полифункциональный гликопротеин, который принимает участие в различных функци х клеток, включа  адгезию клеток, формирование экстрацеллюл рного мат- рикса и изменени  цитоскелета, клеточную подвижность, фагоцитоз, дифференцировку и онкологическую трансформацию.

Известен способ получени  сорбента дл  выделени  фибронектина путем иммобилизации желатина на СефарозеСЫВ, активированной бромцианом. Полученный таким способом сорбент содержит желатина 3-5. мг на 1 мл гел  и имеет емкость по фибронектину - 1 мг на 1 мл гел . Элюци  буфером, содержащим ЗМ мочевину, приводит к десорбции высокоочищенного фибронектина с 65% выходом.

Однако недостаточно высокий выход белка, низкие механические и гидродинамические характеристики сорбента не позвол ют использовать его в крупномасштабной хроматографии фибронектина.

Известен способ получени  сорбента дл  выделени  фибронектинэ, основанный на иммобилизации желатина на карбокси- метилцеллюлозе, активированной тионилх- лоридом. Элюци  белка с сорбента осуществл етс  4-4,5 М раствором мочевины при рН 7,4-7,5. Использование данного сорбента позволило повысить выход фибронектина в 1,5 раза по сравнению с желатин- Сефарозой и достигнуть 90% чистоты белка. Однако желатин-КМ целлюлоза, представ- . л юща  собой набухающий в воде пористый м гкий органический гель не может быть использована дл  препаративной наработки фибронектина.

сл С

XI xj х| О СЛ

Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам к насто щему изобретению  вл етс  способ получени  сорбента дл  выделени  фибро- нектина путем иммобилизации желатина на силикагеле, активированном глутаровым диальдегидом и нитритом натри . Иммобилизацию желатина провод т одновременно с активацией силикагел  и последующей сшивкой желатина бисакриламидом. Ука- занный способ позвол ет получить сорбент с повышенной емкостью (1,3-2,2 мг фибро- нектина на 1 мл носител ). Полученный сорбент обладает высокой стабильностью и не тер ет своих свойств при 50-кратном ис- пользовании в течение 3-х мес щев работы. Основным недостатком вышеуказанного способа  вл етс  его двухстадийность и использование целого р да органических реагентов , в том числе высокотоксичного бисакриламида.

К недостаткам указанного способа также можно отнести то, что полученный согласно ему сорбент не предназначен дл  препаративного выделени  фибронектина, а служит лишь дл  аналитического определени  фибронектина в плазме крови. Использование сорбента дл  препаративной очистки фибронектина из плазмы ограничено малой производительностью сорбента при хроматографии (допустима  скорость потока плазм.ы через колонку объемом 2,5 мл составл ет 0,25-0,5 мл/мин). В св зи с этим сорбент по способу-прототипу позвол ет получить биоспецифически сорбиро- ванныйфибронектинс

производительностью 0,043-0,067 мг/мл хмин.

Целью изобретени   вл етс  упрощение способа и повышение производитель- ности Сорбента в процессе выделени  фибронектина.

Поставленна  цель достигаетс  описываемым способом получени  сорбента дл  выделени  фибронектина, заключающимс  втом, что в качестве активированной матрицы дл  св зывани  желатина используют пористое стекло, модифицированное сшитой полиакрилатной оболочкой, содержащей активные п-нитрофенилакрилатные группы в количестве 2-90 мкмодь/г матрицы . Процесс иммобилизации провод т путем инкубации матрицы с 1-3% раствором желатина в растворе бикарбоната натри  при рН 8-9.

Способ осуществл ют следующим образом .

П р и м е р 1. Получение сорбента дл  выделени  фибронектина (желатин-МПС- ПА).

В колбу, содержащую 250 мл 2% раствора желатина в 0,3 М растворе бикарбоната натри  с рН 8,5, внос т 50 г биосорбента МПС-ПА, перемешивают и инкубируют в течение суток при умеренном встр хивании, после чего в реакционную смесь добавл ют 5 мл этаноламина, перемешивают и выдер: живают еще сутки. Полученный сорбент промывают физиологическим раствором, 0,05 М трис-HCI буфером рНГ7,5, содержащим 1 М NaCI и 4 М мочевину дл  удалени  несв завшегос  желатина и уравновешивают в 0,02 М цитратном буфере рН 7,5, содержащем 0,01 М эпсилон-аминокапроновую кислоту и 1 М NaCI и используют дл  выделени  фибронектина из бычьей плазмы. Емкость полученного сорбента составила 2,2 мг фибронектина на 1 мл сорбента.

П р и м е р 2. Синтез сорбента провод т аналогично примеру 1, с тем отличием, что используют 1 % раствор желатина. Получают сорбент, имеющий емкость 2,0 мг фибронектина на 1 мл сорбента.

П р и м е р 3. Синтез сорбента провод т аналогично примеру 1, с тем отличием, что используют 3% раствор желатина. Получают сорбент, имеющий емкость 2,5 мг фибронектина на 1 мл сорбента.

Используемый диапазон концентраций желатина  вл етс  оптимальным по параметру числа активированных групп, наход щихс  на сорбенте.

П р и м е р 4. Инкубацию раствора желатина с биосорбентом МПС-ПА провод т при рН 8,0. Полученный сорбент обрабатывают по примеру 1. Он имеет емкость 2,0 мг фибронектина на 1 мл сорбента.

П р и м е р 5. Инкубацию раствора желатина с биосорбентом МПС-ПА провод т при рН 9,0. Полученный сорбент обрабатывают по примеру 1. Он имеет емкость 2,4 мг фибронектина на 1 мл сорбента.

П р и м е р 6. Инкубацию раствора желатина с биосорбентом МПС-ПА провод т при рН 7,5. Полученный сорбент обрабатывают по примеру 1. Он имеет емкость 0,8 мг фибронектина на 1 мл сорбента.

Пример. Инкубацию раствора желатина с биосорбентом МПС-ПА провод т при рН 9,5. Полученный сорбент обрабатывают по примеру 1. Он имеет емкость 1,0 мг фибронектина на 1 мл сорбента.

Примере. Хроматографическое выделение фибронектина из бычьей плазмы на желатин-МПС-ПА.

На колонку размером 1x3,2 см (объем 2,5 мл), заполненную сорбентом по примеру 1, нанос т со скоростью 5 мл/мин 25 мл бычьей плазмы. Колонку промывают 0,02 М цитратным буфером рН 7,5, содержащим 1

M NaCI и 0,01 М эпсилон-аминокапроновую кислоту до нулевого значени  поглощени  при 280 нм, и далее злюируют специфически сорбированный фибронектин 0,05 М трис-HCI буфером рН 7,5, содержащим 1 М NaCI и 4 М мочевину. Собирают фракции объемом 3 мл и измер ют их оптическую плотность при 280 нм. Элюат обессоливают на Сефадексе G-25, использу  0.02 М цит- ратный буфер рН 7,0, содержащий 0,05 М NaCI и 0,05 М трилона Б. Производительность сорбента в процессе выделени  фиб- ронектина составила 0,44 мг/мл.мин.

Сравнительные характеристики сорбента , полученного за вленным способом и известным, представлены в табл.1.

Емкость и производительность сорбентов , полученных по примерам 1-8, при пропускании 25 мл бычьей плазмы со скоростью 5 мл/мин через колонку с 2,5 мл сорбента, а также выход фибронектина в данных примерах представлены в табл.2.

Из данных табл.1 и 2 следует, что при сохранении емкости и увеличении производительности сорбента, полученного по описываемому способу, по сравнению с сорбентом, полученным по способу-прототипу в 10-11 раз. выход фибронектина не уменьшаетс  (0,22 мг/мл по описываемому способу против 0,215мг/млпо способу-прототипу ).

П р и м е р 9, Препаративное выделение фибронектина из бычьей плазмы в режиме in batch.

В 1400 мл бычьей плазмы внос т 400 мл биосорбента желатин-МПС-ПА, полученного по примеру 1. Провод т сорбцию в объеме при перемешивании в течение 1 ч. Супернатант удал ют, сорбент промывают 0,02 М цитратным буфером рН 7,5, содержащим 1 М NaCI и 0,01 М зпсилон-аминокап- роновой кислоты дл  удалени  неспецифически сорбированных белков до нулевого поглощени  при 280 нм. Отмытый сорбент внос т в 400 мл 0,1 М трис-HCI буфера рН 7,5, содержащего 8 М мочевины и 2 М NaCI. Элюцию провод т в объеме в течение 15 мин. После удалени  элюата вторично провод т элюцию и так до полной десорбции фибронектина с сорбента. Затем элюат обессоливают на Сефадексе G-25, использу  0,02 М цитратный буфер рН 7,0, содержащий 0,05 М NaCI и 0,05 М трилон Б.

Таким образом, полученный описьпае- мым способом сорбент может быть использован в крупномасштабном производстве фибронектинэ.

5Проведен сравнительный эксперимент

по излучению кинетики сорбции фибронектина на известном (Желатин-Силикагель) и полученном (Желатин-МПС-ПА) сорбентах. Сравнение проводила с использованием

0 100 мл бычьей плазмы и 30 мл указанных сорбентов. Результаты представлены в табл.3.

Как видно из данных табл.3, максимальна  емкость известного сорбента достигает5 с  за 1 ч, тогда как описываемого сорбента - за 10 мин. Таким образом, и в batch - варианте сорбции сорбент Желатин- МПС-ПА оказываетс  в 10 раз производительнее , чем Желатин-Силикагель (дл 

0 Желатин-МПС-ПА производительность равна 2,2/10 0,22 мг/мл-мин, тогда как дл  Желатин-Силикагел  - 1,5/60 0,025 мг/млх Хмин).

Препарат фибронектина, полученный с

5 использованием сорбента по описываемому спосабу, характеризуетс  высокой гомогенностью по данным электрофореза в ПААГ. Сорбент выдерживает непрерывную эксплуатацию в течение 4 мес цев без за0 метных изменений емкости и производительности .

Таким образом, описываемый способ позвол ет упростить процесс получени  сорбента дл  выделени  фибронектина за

Claims (1)

1. 5 счет одностадийности и исключени  использовани  токсичных соединений и повысить производительность сорбента при сохранении его специфической емкости. Формула изобретени 

   0Способ получени  сорбента дл  выделени  фибронектина путем иммобилизации желатина на активированной пористой кремнеземной матрице, отличающийс  тем, что, с целью упрощени 

   5 способа и повышени  производительности сорбента в процессе выделени  фибронектина , в качестве матрицы используют пористое стекло, модифицированное сшитой полиакрилатной оболочкой, содержащей

   0 активные n-нитрофенилакрилатные группы, в количестве 2-90 мкмоль/г матрицы, а иммобилизацию желатина провод т путем инкубации матрицы, в 1-3%-ном растворе желатина в растворе бикарбоната натри  с

   5 рН 8-9.

   Таблица 1

   Параметры хроматографической очистки фибронектина на сорбенте по предлагаемому

   способу и по способу-прототипу

   Таблица 2

   Таблица 3