SU1454846A1 - Способ получени L-лизин- @ -оксидазы - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к препаративной энзимологии и касаетс  выделени  высокоочищенного фермента и может быть использовано в медицине и науч- . ных исследовани х. Целью изобретени   вл етс  повьшение выхода целевого продукта и упрощение способа. Способ заключаетс  в следующем. После культивировани  Trichodermai hazzia- num Rifai отдел ют культуральную жидкость центрифугированием, осаждают примеси сульфатом аммони  (35% насыщени ) , центрифугируют и провод т хроматографии на гидрофобном сорбенте бутилсилохроме и аффинном сорбенте лизин-сефарозе СЬ4Б, а полученный ферментный раствор насыщают сульфатом аммони  i с (О

Description

1

Изобретение относитс  к препаративной энзимологии и касаетс  выделени  высокоочищенного фермента и может быть использовано в медицине и научных исследовани х.

Цель изобретени  - повышение выхода целевого продукта и упрощение способа.

Способ заключаетс  в следующем.

После культивировани  Trichoder- гла hazzianum Rifai отдел ют -культу- ральную жидкость центрифугированием, осаждают примеси сульфатом аммони - (35% насыщени ), центрифугируют и провод т хроматографию на гидрофобном сорбенте бутилсилохроме, а затем диализованные фракции фермента

10

15

нанос т на колонку с аффинным сорбентом лизин-сефарозой CL4B и злюи- руют фермент линейным градиентом хлористого натри  от О до 1 м, причем обе хроматографии провод тс  при рН 5,5-7,4, а полученный ферментный раствор насыщают сульфатом аммони .

Использованный бутилсилохромовый сорбент содержит в качестве специфических лигандов бутиловые радикалы, обеспечивающие специфическое гидрофобное взаимодействие их с лизинокси- дазой.

L-Лизин-сефароза CL4B относитс  к биоспецифическому сорбенту по отношению к ферменту.

4 СП

4

СЮ 4

О5

Сорбенты с выбранными структурами обладают необходимыми свойствами, которые позвол ют достичь поставленную цель, т.е. освободитьс  от сопутству- ющих ферменту примесей и получить его с 56,0%-ным выходом.

Пример 1. Способ получени  высокоочищенной L-лизин- ct -оксидазы

Получение сорбента бутштеилохро- ма 500/80.

Получение бутилглицидилового эфира .

В колбу вместимостью 1 л, снабженную механической мешалкой, термометром , капельной воронкой и обратным холодильником, ввод т 456,8 мл н-бутанола и 20 мл BF (. Температуру смеси поднимают до и при перемешивании ввод т по капл м в течение 4 ч 395 мл эпихлорпздрина. Смесь оставл ют на 14 ч, после гего при перемешивании при 20-25 С ввод т по капл м 250 мл 50%-ного раствора NaOH. Выделившийс  эфир отдел ют, промывают четырьм  порци ми дистиллированной воды и продукт высушивают над безводным N§864. Эфир фильтруют и перегон ют в вакууме при 57-63 С/ /19 мм рт. ст.

Получение бутилсилохрома 500/80, В колбу вместимостью 500 мл, снабженную механической мешалкой, тгрмо- метром и обратным холодильником, внос т 100 г силохрома эпоксидного 500/80 (ТУ 6-09-10-1618-84), добавл ют 350 мл абсолютного диоксана, 10 мл бутилглицидилового эфира и при перемешивании .суспензии ввод т ho калл м 7 мл бора трехфтористого эфирата. Суспензию перемешивают в течение 5-10 мин при комнатной температуре , после чего температуру подниь1ают до 90 С и смесь перемеши- вают 2 ч при 9О°С. Полученный оорбент отфильтровывают, промывают диок саном, этанолом, дистиллированной водой, ацетоном и высушивают при 60-7О с в течение 24 ч. Концентраци остатков бутила в сорбенте составл ет 80 мкмоль/г.

Получение сорбента лизин-сефарозы CL4B.

28 мл сефаро ы СЬ4Б заливают .: , 26,4 мл 1 М натриевой щелочи и ввод т при перемешивании по капл м в течение 15 мин 5,6 мл эпихлоргидрин Суспензию перемешивают еще 1 ч при комнатной температуре и 1 ч при 60

5

0

5

Затем отмывают 6 раз чередованием . по 30 мл водой и этанолом. После чего эпоксидированную сефарозу заливают раствором, полученным следующим образом .,3,1 г хлоргидрата лизипа раствор ют в 20 мл дистиллированпой воды, прибавл ют 9,3 г основной углекислой меди, перемешивают 15 мин при 80 С, фильтруют и осадок промывают 5 мл дистиллированной воды, рН фильтрата довод т до 9,9, добавл ют карбонат натри  до концентрации 1 М. Полученную суспензию перемешивают А ч при 80 С, фильтруют и осадок промывают последовательно 400 мл дистиллированной воды, 500 мл 0,1 М ЭДТА, 300 мл воды, 500 мл О, 1 М карбонатом натри  и 400 мл. воды.

Получение бесклеточной культураль- ной жидкости, содержащей L-лизин- ; - .-оксидазу.

Продуцент лизшшксидазы Tricho- (derma hazzianum Rifai культивируют глубинным способом на питательной среде следующего состава, г/л: 50 пшеничных отрубей и 50 , при 28 С на качалке в течение 6 сут. Клетки микроорганизмов и твердые 0 осадки отдел ют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 0,5 ч. В центрифугате определ ют удельную L-лизHH-t -оксидазную активность, котора.  составл ет 1,07 Е/мг белка

(1170 мл).

Осаждение примесе й аммоний сульфатом .

В бесклеточную культуральную жидкость в объеме 1170 мл (рН 7,1) с удельной активностью 1,28 Е/мг белка при перемешивании на магнитной мешалке в течение 5 мин добавл ют аммоний сульфат марки х.ч. (244,5 г) до 35% насыщени . Перемешивание про- должают еще 1 ч,, затем выпавший осаг док центрифугируют при 3000 об/мин в течение 1 ч. Осадок отбрасывают, а супернатант объемом 1250 мл (содер- -жание белка 2012 мг, лизиноксидазна  активность 2585 ед) нанос т на колонку с сорбентом бутилсилохром 500/80.

Хроматографи  ферментного раствора на сорбенте бутилсилохром 500/80.

Хроматографию провод т при 4 С. Стекл нную колонку размером 50x70 мм заполн ют 100 г бутилсилохрома (конц. лиганда 80 мкМ/г), уравновешивают трем  объемами (350 мл) 0,02 М натрий фосфатного буфера (рН 6,6). За35

40

50

55

тем нанос т на так нодготовленную , колонку с сорбентом со скоростью 200 мл/ч с помощью перистальтического насоса 1250 мл ферментного раствора Е 1 М аммоннй сульфате (35% насыщени ).

Колонку промывают 420 мп 1 М раствора аммоний сульфата в.0,02 М натрий фосфатном буфере в течение 7 ч (скорость тока 50 мл/ч). При этом отмываютс  , которые отбрасывают . Затем переключают насос на исходный Oj02 М натрий фосфатный буфер и элюированне продолжают со скоростью 25 мл/ч. Порцию элюата объемом 130 мл, не обладающего ферментативной активностью, отбрасывают, а последующие .фракции объемом 240 мл собирают , определ ют лизиноксидазную активность и белок, которые равны 1913 ед. и 218 мг соответственно, что отвечает удельной активности 8,77 Е/мг белка, выход по активности .на этой стадии 74%.

Диализ. ,

Элюат объемом 240 мл (уд. акт. 8,77 Е/мг) диализируют против 0,01 М универсального буфера (УБ), состо щего из равных по объему 0,01 М уксусной , борной и ОрТОфОСфОрНОЙ JCHCnOT

(рН 7,4), при 4 С в течение 20 ч и нанос т на L-лизин-сефарозу СЬ4Б, уравновешенную 0,02 М универсальным буфером, рН 7,4.

Хроматографи  ферментного раствора на сорбенте Ь-лизин-сефарозе СЪЛВ.

Хроматографию провод т при 4 С. Стекл нную колонку размером 25x140мм

обладающего лизиноксидазнсй ферментативной активностью, отбрасывают, а последующий элюат в количестве 72 мл собирают, определ ют L-лизин-с(-окси- дазную активность и содержание белка, насыщают до 35% аммоний сульфатом н хран т. Удельна  лизиноксндазна  активность составл ет 27,0 Е/мг, выход 10 по активности на этой стадни хроматографии равен 95%. Общий выход от начальной активности в культуральной среде по примеру I составл ет 51.8%. Пример 2. Способ получени  15 высокоочищенной L-лизин-о(-оксидазы провод т аналогично примеру 1, только хроматографию L-лизин- -оксидазы на сорбенте бутилсилохроме провод т при рН 7,4. Получают фермент с вы- 20 ходом 56,0%, с удельной активностью целевого продукта 31,5 Е/мг белка.

Пример 3. Способ получени  высокоочищенной Ъ-лизин-(( -оксидазы провод т аналогично примеру 1, толь- 25 ко хроматографию L-лизин-(.-оксидазы на сорбенте бутилсилрхроме провод т при рН 5,5. Получают фермент с выходом 49,2%, с удельной активностью 26,5 Е/мг белка.

30

Формула

3 о б р е тен и  

35

Способ получени  L-лизин-« -оксидазы из культуральной жидкости гриба Trichoderma hazzianum Rifai, включающий осаждение примесей фермента сульфатом аммони  с последующим проведением двухэтапной очистки путем хроматографии с получением целевых

Стекл нную колонку ра.м..и........ . последующим осажде- заполн ют 100 мл (25 г сухого вещест ц i -, ., тпм аммони .

ва) набухшего сорбента L-лизин-сефа- розы CL4B уравновешивают 200 мл 0,01 М унив-ерсального буфера, рН 6,6. Затем нанос т на так подготовленную колонку со скоростью 24 мл/ч 240 мл 5 диализата (210 мг белка, 2034 ед. лизиноксидазной активности). Исходным буфером (тот ме уравновешиваюпщй) объемом 420 мл со скоростью 24 мл/ч вымы. примеси- и отбрасывают. За- gg тем исходный буфер замен ют на гра- .диент равных по объему(исходньй бут- фер - 1 М раствор натри  хлористого) и элюирование продолжают с той же скоростью. Порцию 120 мл элюата, не

кием последнего сульфатом аммони , отличающийс  тем, что, с целью повьшени  выхода целевого продукта и упрощени  способа, на пер вом этапе хроматографию провод т на гидрофобном сорбенте бутилсилохроме, а на втором - ведут аффинную хромато графию на лизин-сефарозе CL4B и на обоих этапах рН устанавливают 5,5- 7,4, при этом перед проведением аф-: финной хроматографии осуществл ют дополнительную очистку элюата диализом , а осаждение после аффинной хроматографии провод т сульфатом аммони  35% насыщени .

T

54846

обладающего лизиноксидазнсй ферментативной активностью, отбрасывают, а последующий элюат в количестве 72 мл собирают, определ ют L-лизин-с(-окси- дазную активность и содержание белка, насыщают до 35% аммоний сульфатом н хран т. Удельна  лизиноксндазна  активность составл ет 27,0 Е/мг, выход 10 по активности на этой стадни хроматографии равен 95%. Общий выход от начальной активности в культуральной среде по примеру I составл ет 51.8%. Пример 2. Способ получени  15 высокоочищенной L-лизин-о(-оксидазы провод т аналогично примеру 1, только хроматографию L-лизин- -оксидазы на сорбенте бутилсилохроме провод т при рН 7,4. Получают фермент с вы- 20 ходом 56,0%, с удельной активностью целевого продукта 31,5 Е/мг белка.

Пример 3. Способ получени  высокоочищенной Ъ-лизин-(( -оксидазы провод т аналогично примеру 1, толь- 25 ко хроматографию L-лизин-(.-оксидазы на сорбенте бутилсилрхроме провод т при рН 5,5. Получают фермент с выходом 49,2%, с удельной активностью 26,5 Е/мг белка.

30

Формула

3 о б р е тен и  

Способ получени  L-лизин-« -оксиазы из культуральной жидкости гриба Trichoderma hazzianum Rifai, включающий осаждение примесей фермента сульфатом аммони  с последующим проведением двухэтапной очистки путем хроматографии с получением целевых

. последующим осажде- i -, ., тпм аммони .

. последующим осажде- i -, ., тпм аммони .

кием последнего сульфатом аммони , отличающийс  тем, что, с целью повьшени  выхода целевого продукта и упрощени  способа, на первом этапе хроматографию провод т на гидрофобном сорбенте бутилсилохроме, а на втором - ведут аффинную хроматографию на лизин-сефарозе CL4B и на обоих этапах рН устанавливают 5,5- 7,4, при этом перед проведением аф-: финной хроматографии осуществл ют дополнительную очистку элюата диализом , а осаждение после аффинной хроматографии провод т сульфатом аммони  35% насыщени .

Claims (1)

1. Формула изобретения

   Способ получения L-лизин-οί-оксидазы из культуральной жидкости гриба Trichoderma hazzianum Rifai, включающий осаждение примесей фермента сульфатом аммония с последующим проведением двухэтапной очистки путем хроматографии с получением целевых фракций элюата и последующим осаждением последнего сульфатом аммония, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения способа, на первом этапе хроматографию проводят на гидрофобном сорбенте бутилсилохроме, а на втором - ведут аффинную хроматографию на лизин-сефарозе CL4B и на обоих этапах pH устанавливают 5,57,4, при этом перед проведением аф-: финной хроматографии осуществляют дополнительную очистку элюата диализом, а осаждение после аффинной хроматографии проводят сульфатом аммония 35% насыщения.