CN106520739A - 一种亲和层析纯化尿激酶的方法 - Google Patents

一种亲和层析纯化尿激酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种亲和层析纯化尿激酶的方法。具体的说，就是以健康成年男性新鲜尿液为原料，经过甲壳质吸附、吸附柱层析以及亲和层析等现代蛋白质高端生化分离技术来制备高纯度的尿激酶，可以将总收率提高到80%以上，总效价不低于40000iu/mg。

Description

一种亲和层析纯化尿激酶的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种应用亲和层析法制备收率高、效价稳定的尿激酶的方法。
背景技术
尿激酶是从健康男尿中分离或从人肾组织培养中获得的一种酶蛋白。直接作用于内源性纤维蛋白溶解系统，能催化裂解纤溶酶原或纤溶酶。亦能降解血循环中的纤维蛋白原，凝血因子V和凝血因子V3等，从而发挥溶栓作用。对新形成的血栓起效快、效果好，还能提高血管ADP酶活性，抑制ADP诱导的血小板凝聚，预防血栓形成。该品主要用于血栓栓塞性疾病的溶栓治疗。包括急性广泛性肺栓塞、胸痛6—12 小时内的冠状动脉栓塞和心肌梗死、症状短于3—6小时的急性期脑血管栓塞、视网膜动脉栓塞和其他外周动脉栓塞症状严重的骼-股静脉血栓形成者。也用于人工心瓣手术后预防血栓形成，保持血管插管和胸腔及心包腔引流管的通畅等。溶栓的疗效均需后继的肝素抗凝加以维持。
但现有技术对其的收率不能达到很高，效价达不到30000 iu/mg，纯度不高，对其在临床的应用有很大的制约。
本发明人自2012年开始对UK的生产工艺进行试验研究，采用现代蛋白质高端生化分离技术进行生产，使UK的总收率提高到80%以上，总效价不低于40000iu/mg，生产工艺稳定，质量可控。
发明内容
本发明提供了一种亲和层析纯化尿激酶的方法，是为了攻克高岭土吸附、耐酸性混合模式吸附等传统方法提取尿激酶收率过低、效价不高不稳定的缺点，采用亲和层析来纯化尿激酶，从而提高了尿激酶的收率，保证了效价的稳定。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种亲和层析纯化尿激酶的方法，其特征在于：选用特异树脂的亲和层析来纯化尿激酶，可以使总收率提高到80%以上，总效价不低于40000iu/mg。
该技术方案中，还具有以下技术特征：所述亲和层析法包括如下步骤：
1 尿激酶粗加工
称取1T pH在5.5-6.5的澄清男性尿液，不断搅拌，缓慢加入16.5kg甲壳质吸附完全后用氨水洗脱，再经过3.5kg硫酸铵盐析，过夜沉淀、离心后置于用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得尿激酶粗品。
2 吸附柱层析（以0.25L柱体为例）
2.1称取尿激酶粗品1kg，用洗脱液 A溶解，搅拌30分钟，离心20分钟，留取离心液；
2.2阴离子交换柱用洗脱液 B平衡，将上述离心液流经平衡好的阴离子交换柱，流速控制在110~140mL/min左右；
2.3用洗脱液B溶液洗脱，流速控制在110~140mL/min，得洗脱液；
2.4将洗脱液经超滤膜，超滤至其体积的二十分之一，得超滤液约1.65L。
3 亲和层析（以0.25L柱体为例）
3.1用洗脱液C平衡亲和层析柱，将超滤液流经平衡过的树脂柱，流速控制在110~140mL/min；
3.2上样结束后，用洗脱液C洗脱，流速110~140mL/min左右，收集洗脱液；
3.3柱中的亲和树脂经洗脱液C 洗脱后，用洗脱液 D洗涤去除吸附在上面的杂质，流速控制在110~140mL/min，密封待用；
3.4洗脱液经超滤膜超滤至一定体积，超滤液中加入一定量磷酸氢二钠溶液，继续超滤至同一体积，然后再加入等量磷酸氢二钠溶液，再经超滤膜超滤至相同体积。
4 沉淀
超滤液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小时，离心，固体再用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物。
5 冻干
将沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得尿激酶。
经核算，所得尿激酶总收率高达80%以上，按中国药典所示方法测定，总效价高达40000iu/mg以上。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：
选用亲和层析纯化尿激酶,可以更有效的去除尿激酶中的多种杂蛋白，并且使其理化性质和生物活性保持稳定，从而使产品的各项指标均符合中国药典标准。更重要的是，通过工艺的不断改进和完善，使得尿激酶总收率达到80%以上，总效价不低于40000iu/mg，创造了巨大的经济效益和社会效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，而不以任何方式限制。
实施例1
1 尿激酶粗加工
称取1T pH小于6.5的澄清尿液，不断搅拌，缓慢加入16.5kg甲壳质, 并用精密pH试纸测定，调节尿液pH到6.0；吸附完全后用氨水洗脱1h，再经过3.5kg硫酸铵盐析，过夜沉淀、离心后置于用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得尿激酶粗品。
2 吸附柱层析（以0.25L柱体为例）
2.1称取尿激酶粗品1kg，用8.5L的洗脱液 A溶解，搅拌30分钟，离心20分钟，留取离心液；
2.2 阴离子交换柱用2.5L的洗脱液 A平衡，将上述离心液流经平衡好的阴离子交换柱，流速控制在120mL/min左右；
2.3 用33L的洗脱液B溶液洗脱，流速控制在120mL/min，得洗脱液；
2.4 将洗脱液经超滤膜，超滤至其体积的二十分之一，得超滤液约1.65L。
3 亲和层析（以0.25L柱体为例）
3.1 用3.0L的洗脱液C平衡亲和层析柱，将超滤液流经平衡过的树脂柱，流速控制在120mL/min；
3.2 上样结束后，用10L的洗脱液C洗脱，流速120mL/min左右，收集洗脱液；
3.3 柱中的亲和树脂经洗脱液C 洗脱后，用5.0L的洗脱液 D洗涤去除吸附在上面的杂质，流速控制在120mL/min，密封待用；
3.4 洗脱液经超滤膜超滤至170mL，超滤液中加入磷酸氢二钠溶液830mL，继续超滤至170mL，然后再加入830mL磷酸氢二钠溶液，再经超滤膜超滤至170mL。
4 沉淀
超滤液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小时，离心，固体再用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物。
5 冻干
将沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得尿激酶。
经核算，所得尿激酶总收率为84%，按中国药典所示方法测定，总效价高达48260iu/mg。
实施例2
1 尿激酶粗加工
称取1T pH5.5-6.5的澄清男性尿液，不断搅拌，缓慢加入16.5kg甲壳质, 并用精密pH试纸测定，调节尿液pH到6.0；吸附完全后用氨水洗脱1h，再经过3.5kg硫酸铵盐析，过夜沉淀、离心后置于用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得尿激酶粗品。
2 吸附柱层析（以0.25L柱体为例）
2.1 称取尿激酶粗品1kg，用8.5L的洗脱液 A溶解，搅拌30分钟，离心20分钟，留取离心液；
2.2 阴离子交换柱用3.0L的洗脱液 A平衡，将上述离心液流经平衡好的树脂柱，流速控制在130mL/min左右；
2.3 用33L的洗脱液B溶液洗脱，流速控制在130mL/min，得洗脱液；
2.4 将洗脱液经超滤膜，超滤至其体积的二十分之一，得超滤液约1.65L。
3 亲和层析（以0.25L柱体为例）
3.1 用3.0L的洗脱液C平衡亲和层析柱，将超滤液流经平衡过的树脂柱，流速控制在130mL/min；
3.2 上样结束后，用10L的洗脱液C洗脱，流速130mL/min左右，收集洗脱液；
3.3 柱中的亲和树脂经洗脱液C 洗脱后，用7.5L的洗脱液 D洗涤去除吸附在上面的杂质，流速控制在130mL/min，密封待用；
3.4 洗脱液经超滤膜超滤至170mL，超滤液中加入磷酸氢二钠溶液830mL，继续超滤至170mL，然后再加入830mL磷酸氢二钠溶液，再经超滤膜超滤至170mL。
4 沉淀
超滤液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小时，离心，固体再用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物。
5 冻干
将沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得尿激酶。
经核算，所得尿激酶总收率为82%，按中国药典所示方法测定，总效价高达46300iu/mg。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.一种纯化尿激酶的方法，该方法包括：将尿激酶粗品通过离子交换层析、超滤液沉淀、沉淀物冻干步骤进行纯化，所得纯化后的尿激酶的总收率提高到80%以上，总效价不低于40000iu/mg。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述尿激酶粗品是通过以男性尿液为原料，将原料依次经过甲壳质吸附、氨水洗脱、硫酸铵盐析制备得到的。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述吸附柱层析包括如下步骤：
（1）用洗脱液A溶解尿激酶粗品，搅拌、离心，留取离心液，所述洗脱液A为0.01-0.3moL/L的醋酸盐缓冲液；
（2）用洗脱液B平衡吸附柱，将上述离心液上柱，洗脱液B为0.01-0.5moL/L醋酸钠和0.1-5moL/L NaCl的缓冲液；
（3）用洗脱液B洗脱吸附柱，收集洗脱液；
（4）用洗脱液C平衡亲和层析柱，将超滤液上柱，洗脱液C为0.01-0.5moL/L甘氨酸和0.1-5moL/L NaCl的缓冲液；
（5）上样结束后，用洗脱液C洗脱，收集洗脱液；
（6）柱中的亲和树脂经洗脱液C洗脱后，用洗脱液 D洗涤去除吸附在上面的杂质，密封待用，洗脱液D为0.01-0.3moL/L盐酸和0.1-5moL/L NaCl的缓冲液；
（7）将洗脱液经超滤膜，加入磷酸盐缓冲液反复超滤，得超滤液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.5moL/L。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述吸附柱为阴离子交换柱。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述阴离子交换柱包括：强阴离子交换柱Q-Sephadex A-25,Q-Sephadex A-50,Q-Sephadex C-25,Q-Sephadex C-50；弱阴离子交换柱DEAE-Cellulose DE-22，DEAE-Cellulose DE-23，DEAE-Cellulose DE-51，DEAE-CelluloseDE-52，DEAE-Cellulose DE-53。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述亲和层析柱包括：CM-Sephadex A-25,CM-Sephadex A-50,CM-Sephadex C-25,CM-Sephadex C-50，SP-Sepharose 2B,SP-Sepharose 4B,SP-Sepharose 6B，SP-Sepharose CL-2B,SP-Sepharose CL-4B,SP-Sepharose CL-6B。
8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述超滤液沉淀步骤包括超滤液中加入乙醇沉淀。
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