CN113956338B - 一种从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物蛋白提取技术领域，具体涉及一种从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法，方法包括如下步骤：刀豆研磨成粉，加入提取液，离心收集上清液；室温条件下向上清液中低速缓慢加入PEG溶液，冰箱静置，离心后收集沉淀；将所得沉淀进行重悬，抽滤后上清过凝胶层析，首先流出的部分为脲酶，之后洗脱的部分为刀豆凝集素；得到脲酶与刀豆凝集素的上清液，分别加入硫酸铵粉末充分溶解，冷藏，离心后收集沉淀；将沉淀用透析液溶解后进行透析，透析结束后低温离心，收取上清进行冷冻干燥。本发明方法具有工艺简单、易于操控、成本相对较低的特点；用该方法制备的脲酶和刀豆凝集素具有原料利用率高、纯度较高且活性较好的优点。

Description

一种从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法

技术领域

本发明属于生物蛋白提取技术领域，具体涉及一种从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法。

背景技术

我国地域辽阔，豆类资源十分丰富。豆类脂肪含量低，富含纤维素、蛋白质等营养物质，是极佳的食用作物，在我国广泛种植，此外从豆类中提取出的许多化合物作为酶制剂在多种领域发挥重要作用，例如脲酶和刀豆凝集素。刀豆中同时富含大量脲酶和刀豆凝集素，同时提取两种蛋白的技术具有相当大的实际价值。

脲酶是一种寡聚酶，可以特异性的催化尿素分解生成氨和二氧化碳，其催化效率远高于无机催化剂且反应条件温和，反应进行迅速。最初脲酶于1962年被美国科学家从刀豆中提取分离得到并凭借这一成果成功夺得诺贝尔奖。现如今脲酶在多个领域都发挥着重要的作用；在环境治理方面，脲酶被用于处理富含尿素的污水，是污水处理的重要一步；在生物医药方面，脲酶被应用于多种检测传感器的开发和尿素检测试剂盒；在酿酒行业，重组酸性脲酶被用于对黄酒中尿素和隐性致癌物质氨基甲酸乙酯的降解；在工业生产上，固定化脲酶与其它酶联用在调节级联酶促反应的pH上发挥重要作用。凝集素是一类具有糖专一性、可以促进细胞凝集的蛋白质或糖蛋白；它们在自然界中广泛存在且在多种生命活动中都发挥了重要作用，包括刺激外周血淋巴细胞RNA合成和有丝分裂、诱发人外周血淋巴细胞产生抗癌淋巴因子、促进巨噬细胞的吞噬作用、使细胞凝集和使肿瘤细胞失活等。相关研究表明，来自于植物的植物凝集素在生物防治、恶性疾病诊断、诱导癌细胞凋亡以及抗真菌、病毒等方面具有巨大潜力。

目前国内外对于从植物中提取脲酶的研究已经取得了一些成果。庄一义在“从巨豆粉提取脲酶”一文中提到了一种提取纯化尿素酶的方法，将巨豆用氯仿和丙酮脱脂，然后采用低浓度的丙酮进行提取，冷冻放置使其沉淀，沉淀经缓冲液溶解后葡聚糖凝胶柱分离即可得到高活性的脲酶。刘东凯等人在“大豆脲酶的提取及其影响因素研究”一文中也提及了有关脲酶提取的方法并对其影响因素进行了考查，确定最佳提取方法，采用30％乙醇从大豆中提取尿素酶，固液比为1：10，最适pH值为7。崔有宏等人在“黄豆脲酶的提取与性质研究”一文中采用醋酸盐缓冲液对黄豆粉进行提取，然后通过亚硫酸钠盐析，其沉淀再经磷酸盐缓冲液溶解，透析，DEAE-纤维素柱色谱分离，洗脱液冷冻干燥后即可得到比活为67.15IU/mg的尿素酶产品。上述文献中提到了几种对脲酶的提取纯化方法，但是大部分提取成本较高，整个工艺实施时间较长。有的工艺中多次采用低含量丙酮，导致回收成本大幅度提高，且造成一定的环境污染。

相比于脲酶针对ConA(刀豆凝集素)提取的研究相对较少。现存对于刀豆凝集素的提取方法主要是盐析沉淀法，中国专利CN103570814A中提出了一种ConA的提取方法，具体操作流程如下：首先使用75～80％的乙醇浸泡刀豆30min，烘干24h后进行破碎，再使用生理盐水对刀豆粉末进行抽提24h，抽提结束后进行硫酸铵沉淀24h、凝胶层析纯化再用生理盐水洗；中国专利CN101340923A中涉及到使用乙醇沉淀的方法来制备植物凝集素的方法；低温提取的方法主要问题是耗时较长且最终得到的成品纯度较低。中国专利CN101508730A中公开了一种从豆类中提取凝集素的方法，具体是：使用40-60℃水提法，并辅助超声和微波的交替施加的方法来提取植物凝集素，对得到凝集素粗品再进行硫酸铵沉淀，透析干燥得到凝集素，该方法克服了低温提取时间较长以及较多化学试剂残留的问题，但同其他使用乙醇或硫酸铵沉淀的方法相同，最终所得成品纯度不高这一问题依然存在。现存的凝集素提取方法主要存在工艺时间较长，最终所得成品纯度较低，蛋白稳定性较差的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服传统技术中存在的上述问题，提供一种从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法，操作简单、工艺周期较短、得到的最终产物纯度较高且一次提取可同时获得脲酶和刀豆凝集素，大大提高了原料的利用率。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：

一种从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法，包括如下步骤：

1)提取：称取刀豆并研磨成粉，过筛后加入提取液，室温下将刀豆粉末和提取液充分搅拌均匀，使刀豆粉末中的脲酶和刀豆凝集素充分浸出，在室温下将混合物进行离心，收集上层清液；

2)PEG沉淀：在室温条件下向得到的上清液中低速缓慢加入PEG溶液混合均匀，将溶液转移至冰箱中静置，之后进行离心，移除上层清液收集下层的沉淀；

3)SepHadexG～50凝胶层析：对SepHadexG～50凝胶柱使用平衡Buffer进行平衡，向得到的沉淀中加入Wash Buffer重悬，进行抽滤后将重悬后的液体使用SepHadexG～50凝胶进行层析并依次使用Wash Buffer冲洗、Elution Buffer进行洗脱，Wash Buffer冲洗流出的液体为刀豆脲酶溶液，之后通过Elution Buffer洗脱收集到的洗脱液为刀豆凝集素溶液；

4)硫酸铵沉淀：向得到的刀豆脲酶溶液、刀豆凝集素溶液中分别低速缓慢加入硫酸铵固体粉末，待到硫酸铵粉末完全溶解后，将溶液转移至冰箱中静置进行沉淀，之后进行离心，移除上层清液收集下层的沉淀；

5)透析冻干：将得到的沉淀按照一定比例分别使用透析液进行溶解，之后进行离心，收集上清液，将收集到的上清液加入到透析袋中，再放置到冰箱中使用磁力搅拌器进行透析，透析结束后进行低温离心，离心结束后收集上层清液，对上层清液进行冷冻干燥得到刀豆脲酶晶体和刀豆凝集素晶体。

进一步地，步骤1)中，刀豆磨成粉后采用孔径80目的筛网进行筛分，筛除较大颗粒、保留粉末。

进一步地，步骤1)中，提取液的成分含有终浓度3％的PEG4000～8000、溶剂为25mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

进一步地，步骤1)中，刀豆、提取液按照1g:5ml的料液比进行混合。

进一步地，步骤2)中，PEG溶液为PEG4000～PEG8000溶液，添加终浓度为10％。

进一步地，步骤2)中，下层沉淀进行重悬，重悬Buffer成分为50mM Tris-HCl、5mg/ml甘氨酸、5mg/ml葡萄糖、30mg/ml山梨醇。

进一步地，步骤3)中，Wash Buffer成分为终浓度含有100mM NaCl的50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，Elution Buffer成分为终浓度含有100mM NaCl、100mM葡萄糖的50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

进一步地，步骤4)中，所述刀豆脲酶溶液中硫酸铵的沉淀浓度为30％(m/v)，所述刀豆凝集素溶液中硫酸铵的沉淀浓度为60％(m/v)。

进一步地，步骤4)中，所述冰箱静置沉淀时的温度设置为4℃，沉淀时间为16h；沉淀结束后的刀豆脲酶溶液需要再过一次SepHadex G～25凝胶层析进行脱盐去除硫酸铵，其目的是为了防止脲酶溶液中存在的硫酸铵对脲酶检测时产生影响。

进一步地，步骤5)中，所述脲酶透析的透析液成分为100mM氯化钠的50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，Con A透析的透析液成分为ddH₂O，透析时间为每2h更换一次透析Buffer，进行3次，温度为4℃，磁力搅拌转速为700rpm；透析结束后低温离心；进行冷冻干燥是温度为-60℃，时间为48h。

本发明的有益效果是：

1、本发明以刀豆粉为原料，以柠檬酸-柠檬酸钠作为缓冲溶液体系，其缓冲能力强，且不影响蛋白质活性，能够保持蛋白质结构稳定；整个工艺流程步骤较少，耗时时间较短，且不需要在提取剂中添加巯基乙醇；在抽提结束后，以聚乙二醇为沉淀剂，使得混合蛋白溶液中的脲酶和Con A发生沉降，而PEG本身则会与水溶液发生分层，可以简单地将其分离出来获得较高纯度的蛋白溶液；再进行简单的凝胶层析，利用Con A易于糖类物质结合的性质使Con A结合在凝胶柱上而脲酶不会结合在凝胶柱上，使用Wash Buffer直接洗脱得到脲酶溶液，再利用含高浓度葡萄糖的Buffer洗脱得到Con A溶液；使用硫酸铵沉淀蛋白再重悬提高蛋白浓度接着透析除去小分子物质，最终得到纯度好且蛋白浓度高的脲酶和Con A蛋白。

2、采用本发明方法进行蛋白提取可以同时得到脲酶和Con A，最终得到的脲酶粉末和Con A粉末纯度超过90％，纯化后蛋白得率为1.5％左右且操作时间大大缩短，得到的脲酶比活力达到35U/mg，利用兔血红细胞凝集试验检测，提取得到的Con A于红血球反应最低浓度达到64μg/ml。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上的所有优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明方法的工艺流程图；

图2为本发明实施例收集到的脲酶的SDS-PAGE图；

图3为本发明实施例收集到的Con A的SDS-PAGE图；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

一种从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法，包括如下步骤：

1)提取：将刀豆机械破碎后过80目的网筛进行分筛，筛分后得到细密的刀豆粉末。称取刀豆粉末按照1kg刀豆粉末：5L提取液的料液比加入提取液在室温条件下混合均匀，使刀豆粉末中的脲酶和Con A充分浸提，然后将浸提液进行在室温条件下10000g离心30min，除去沉淀收集上清。

2)PEG沉淀：向步骤1)中所得的浸提液中加入终浓度10％的PEG溶液混合均匀后置于4℃冰箱中静置，静置结束后在4℃下10000g离心30min，离心后去除含有变性杂蛋白的液体收集目的蛋白。

3)凝胶层析：先将得到的蛋白沉淀进行溶解，层析柱进行清洗和平衡后将收集到的蛋白溶液流经葡聚糖凝胶G50并使用Elution Buffer进行洗脱，通过紫外检测器进行观测并分别收集脲酶和Con A的洗脱液，脲酶存在于Wash Buffer中，而Con A则被ElutionBuffer洗脱；上述Wash Bufffer中含有离子浓度100mM的NaCl，溶剂为离子浓度50mM、pH＝6.0的柠檬酸-柠檬酸钠溶液，Elution Buffer中含有离子浓度100mM的葡萄糖和离子浓度100mM的NaCl，溶剂为离子浓度50mM、pH＝6.0的柠檬酸-柠檬酸钠溶液。

4)硫酸铵沉淀：向收集到的脲酶溶液中加入30％(m/v)硫酸铵、Con A溶液中加入60％的硫酸铵混合均匀，放置在4℃冰箱中静置16h进行沉淀，蛋白沉淀之后在4℃下10000g离心30min收集蛋白沉淀。

5)透析冻干：硫酸铵沉淀后得到的蛋白沉淀分别使用透析液溶解，所述进行脲酶透析的透析液成分为离子浓度100mM的NaCl，溶剂为离子浓度50mM、pH＝6.0的柠檬酸-柠檬酸钠溶液，进行Con A透析的透析液成分为ddH₂O。之后在4℃下10000g离心30min收集上清，将收集到的上清进行透析，每2h更换一次透析Buffer，共进行3次透析。透析完成后的蛋白溶液装在合适的容器中放置到冷冻干燥机中进行冷冻干燥，所述冷冻干燥机温度为-60℃，冷冻干燥时间约48h。称量并记录最终所得蛋白的重量，经检测最终得到纯度超过90％的Con A和纯度超过90％的脲酶。

本发明的具体实施例如下：

实施例1

将刀豆进行研磨并通过80目筛网机械筛除不溶性杂质后得到刀豆粉末，称取200g粉末倒入到2L烧杯中并加入1L含终浓度3％PEG的50mM柠檬酸-柠檬酸钠(pH＝6.0)溶液。将磁力搅拌器温度设置为常温预热后，放置混合后的溶液开始搅拌，200rpm搅拌1h后进行离心(25℃、10000g、30min)，收集上清进行抽滤去除上清中存在的不溶性颗粒，记录收得的蛋白抽提液体积为860ml。

向得到的上清中加入终浓度10％的PEG4000溶液，搅拌均匀后置于4℃冰箱中静置，静置结束后在4℃下10000g离心30min，去除上清收集沉淀，得到的沉淀使用160ml重悬Buffer进行重悬，所述重悬Buffer成分为0.1M NaCl+0.1M柠檬酸钠(pH 6.0)，重悬溶解后放置在4℃冰箱过夜，并进行抽滤保留清液172ml。

葡聚糖凝胶柱G50使用平衡Buffer进行平衡，所诉平衡Buffer成分中含有100mM的NaCl、溶剂为50mM、pH＝6.0的柠檬酸-柠檬酸钠溶液。将收集到的溶液通过蠕动泵以8ml/L的上样速度缓慢的上样，上样完成后依次使用Wash Buffer和Elution Buffer进行洗脱，所述Wash Bufffer中含有离子浓度100mM的NaCl，溶剂为离子浓度50mM、pH＝6.0的柠檬酸-柠檬酸钠溶液Elution Buffer中含有离子浓度100mM的葡萄糖和离子浓度100mM的NaCl，溶剂为离子浓度50mM、pH＝6.0的柠檬酸-柠檬酸钠溶液。通过紫外检测器进行观测并分别收集出峰范围内的目的蛋白的洗脱液。记录所得到脲酶洗脱液的体积360ml，Con A洗脱液1.18L。

使用NaOH调节脲酶溶液pH＝6.0，之后向其中加入终浓度160g(40％)的硫酸铵混合均匀后放置在4℃沉淀1h，4℃下10000g离心30min收集沉淀，并用50ml 10Mm/L柠檬酸-柠檬酸钠(pH＝6.0)进行溶解得到蛋白溶液55ml。向所得Con A溶液中加入708g(60％)的硫酸铵混合均匀后放置在4℃沉淀1h，4℃下10000g离心30min收集沉淀，并用50ml纯水进行溶解得到蛋白溶液71ml。

将上述脲酶蛋白溶液和Con A蛋白溶液分别装入透析袋中，4℃过夜透析，所述透析液分别为10mM柠檬酸-柠檬酸铵(pH＝6.0)和纯水。收集透析后样品再4℃下10000g离心30min回收上清，将上清置于合适的容器中进行冷冻干燥，所述冷冻干燥温度为-60℃，冷冻干燥时间为48h。记录收得脲酶1.6g、Con A 1.9g。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (7)

1.一种从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）提取：称取刀豆并研磨成粉，过筛后加入提取液，室温下将刀豆粉末和提取液充分搅拌均匀，使刀豆粉末中的脲酶和刀豆凝集素充分浸出，在室温下将混合物进行离心，收集上层清液；

提取液的成分含有终浓度3％的PEG4000～8000、溶剂为25mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；

2）PEG沉淀：在室温条件下向得到的上清液中低速缓慢加入PEG溶液混合均匀，将溶液转移至冰箱中静置，之后进行离心，移除上层清液收集下层的沉淀；

3）SephadexG~50凝胶层析：对SephadexG~50凝胶柱使用平衡Buffer进行平衡，向得到的沉淀中加入Wash Buffer重悬，进行抽滤后将重悬后的液体使用SephadexG~50凝胶进行层析并依次使用Wash Buffer冲洗、Elution Buffer进行洗脱，Wash Buffer冲洗流出的液体为刀豆脲酶溶液，之后通过Elution Buffer洗脱收集到的洗脱液为刀豆凝集素溶液；

Wash Buffer成分为终浓度含有100mM NaCl的50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，ElutionBuffer成分为终浓度含有100mM NaCl、100mM葡萄糖的50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；

刀豆脲酶溶液中硫酸铵的沉淀浓度为30% m/v，刀豆凝集素溶液中硫酸铵的沉淀浓度为60% m/v；

4）硫酸铵沉淀：向得到的刀豆脲酶溶液、刀豆凝集素溶液中分别低速缓慢加入硫酸铵固体粉末，待到硫酸铵粉末完全溶解后，将溶液转移至冰箱中静置进行沉淀，之后进行离心，移除上层清液收集下层的沉淀；

5）透析冻干：将得到的沉淀按照一定比例分别使用透析液进行溶解，之后进行离心，收集上清液，将收集到的上清液加入到透析袋中，再放置到冰箱中使用磁力搅拌器进行透析，透析结束后进行低温离心，离心结束后收集上层清液，对上层清液进行冷冻干燥得到刀豆脲酶晶体和刀豆凝集素晶体。

2.根据权利要求1所述的从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法，其特征在于：步骤1）中，刀豆磨成粉后采用孔径80目的筛网进行筛分，筛除较大颗粒、保留粉末。

3.根据权利要求1所述的从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法，其特征在于：步骤1）中，刀豆、提取液按照1g:5ml的料液比进行混合。

4.根据权利要求1所述的从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法，其特征在于：步骤2）中，PEG溶液为PEG4000~PEG8000溶液，添加终浓度为10%。

5.根据权利要求1所述的从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法，其特征在于：步骤2）中，下层沉淀进行重悬，重悬Buffer成分为50mM Tris-HCl、5mg/ml甘氨酸、5mg/ml葡萄糖、30mg/ml山梨醇。

6.根据权利要求1所述的从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法，其特征在于：步骤4）中，所述冰箱静置沉淀时的温度设置为4℃，沉淀时间为16h；沉淀结束后的刀豆脲酶溶液需要再过一次Sephadex G~25凝胶层析进行脱盐去除硫酸铵。

7.根据权利要求1所述的从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法，其特征在于：步骤5）中，所述脲酶透析的透析液成分为100mM氯化钠的50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，ConA透析的透析液成分为ddH₂O，透析时间为每2h更换一次透析Buffer，进行3次，温度为4℃，磁力搅拌转速为700rpm；透析结束后低温离心；进行冷冻干燥是温度为-60℃，时间为48h。

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