CN113185572B - 一种虎奶菇细胞壁糖蛋白的提取方法 - Google Patents

一种虎奶菇细胞壁糖蛋白的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种虎奶菇细胞壁糖蛋白的提取方法，属于生物技术领域。本发明通过将干燥的或新鲜的虎奶菇菌核粉碎、PBS清洗、去垢剂‑还原剂混合溶液浸提、三氯乙酸沉淀、丙酮清洗、透析得到虎奶菇菌核细胞壁糖蛋白，所得糖蛋白占菌核细胞壁干重的4.93～5.36％，糖蛋白中总糖含量约为32％，总蛋白含量约为67％，无游离多糖和大分子蛋白质的残留。再经过柱分离可以得到不同分子量大小的糖蛋白纯品。本发明所采用的方法工艺简单，操作性强，易于实现，纯度较高，具有广阔的工业应用前景。

Description

一种虎奶菇细胞壁糖蛋白的提取方法
技术领域
本发明涉及一种虎奶菇细胞壁糖蛋白的提取方法，属于生物技术领域。
背景技术
糖蛋白(Glycoprotein)是带分支的寡糖链与蛋白质共价相连所构成的复合糖，在自然界中广泛存在，具有抗癌、抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤等多种功能和活性，其结构和功能的特殊性使之日益受到关注。
食用菌作为一种来源广泛、价格低廉、安全无害的大型真菌，栽培技术比较成熟，在糖蛋白资源的开发方面有着巨大的潜力。但对食用菌中糖蛋白进行高效的提取分离存在一定困难，现普遍采用的纯化蛋白质的方法，产物纯度较低。因此，研发一种更简便的食用菌糖蛋白提取方法对糖蛋白的功能和价值的开发具有极大的推动作用。
虎奶菇(Pleurotus tuber-regium,PTR)是一类食药两用真菌，研究表明，虎奶菇具有增强机体免疫力、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂等多种生理功能，不仅是一种非常理想的营养健康食品，还是开发天然药物资源的新领域。目前，对虎奶菇多糖、蛋白、氨基酸、凝集素等已有较充分的研究，但对其糖蛋白的研究却鲜有涉及。
发明内容
[技术问题]
提取分离食用菌中糖蛋白普遍采用的纯化蛋白质的方法，得到产物纯度较低。
[技术方案]
本发明的目的在于提供一种虎奶菇细胞壁糖蛋白的提取方法。
本发明所述方法包括以下步骤：
(1)将虎奶菇菌核磨粉，获得菌核粉末；
(2)将步骤(1)中菌核粉末加入到PBS溶液中，搅拌提取，除去滤液，再以去离子水洗涤滤渣，获得虎奶菇菌核细胞壁碎片；
(3)向步骤(2)获得的细胞壁碎片中加入去垢剂-还原剂混合溶液(DRAS)反复浸提，浸提结束后合并所得浸提液，滤去残渣，得到细胞壁糖蛋白粗提液；
(4)向步骤(3)中粗提液中加入三氯乙酸(TCA)孵育并离心得到沉淀，丙酮洗涤沉淀，离心弃上清液，使丙酮完全挥发，得到糖蛋白粗提物粉末；
(5)用水溶解步骤(4)中糖蛋白粗提物粉末并进行透析，将透析袋中截留的液体冷冻干燥，即得虎奶菇菌核细胞壁糖蛋白；
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，采用干燥的虎奶菇菌核粉碎后，过50～100目筛，获得虎奶菇干菌核粉末。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，采用新鲜的虎奶菇菌核，液氮冷冻后研磨，获得虎奶菇鲜菌核粉末。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，菌核粉末与PBS溶液的料液比为1g：(10～20)mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，以真空度0.05～0.1MPa抽滤除去滤液，并用去离子水洗涤滤渣，洗涤滤渣的次数不少于8次。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，DRAS由pH 7.5～8.5的45～55mM Tris-HCl，0.08～0.12M乙二胺四乙酸(EDTA)，1～5％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)和5～15mM二硫苏糖醇(DTT)配制而成。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，浸提所用温度为80～100℃，细胞壁碎片与DRAS的料液比为1g：(5～10)mL，提取时间为10～30min，浸提过程重复3～5次，浸提结束后合并所得浸提液，使用滤纸过滤以除去不溶性残渣。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，TCA的终浓度为8～12％，丙酮的添加量为沉淀的1～3倍体积，离心的条件为在2～6℃下5500～6500g离心8～12min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，粗提液中加入冰浴预冷的100％TCA使得溶液中的TCA终浓度为8～12％，冰浴25～35min，在2～6℃下5500～6500g离心8～12min，收集沉淀；加入沉淀1～3倍体积-25～-15℃预冷的丙酮，涡旋振荡，重悬沉淀，以洗去沉淀中的TCA，在2～6℃下5500～6500g离心8～12min，收集沉淀。
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，用去离子水溶解糖蛋白粗提取物粉末后加入透析袋中，以去离子水透析，间隔0.5～2h更换去离子水至透析袋外液体导电率接近去离子水，透析后将透析袋中截留的液体进行冷冻干燥，即得虎奶菇菌核细胞壁糖蛋白。
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，透析袋的截流量为7800～8200Da。
本发明还提供所述方法提取得到的虎奶菇菌核细胞壁糖蛋白，包括分子量为10～30kDa的糖蛋白。
在本发明的一种实施方式中，上述步骤(5)中分离到的虎奶菇菌核细胞壁糖蛋白还可以经柱分离纯化，得到不同分子量的糖蛋白纯品。
在本发明的一种实施方式中，所述柱分离为依次经DEAE阴离子交换柱和Superdux75凝胶柱。
本发明还提供所述方法提取得到的虎奶菇菌核细胞壁糖蛋白在食品、医药领域中的应用。
有益效果
本发明针对虎奶菇细胞壁中糖蛋白含量丰富但开发程度低的现状，提供一种有效提取的方法，所得糖蛋白占菌核细胞壁干重的5.36％，糖蛋白中总糖含量约为32％，总蛋白含量约为67％，无游离多糖和大分子蛋白质的残留。本发明所采用的方法工艺简单，操作性强，易于实现，所得糖蛋白分子量在10～30kDa，纯度较高。
附图说明
图1为虎奶菇细胞壁糖蛋白的SDS-PAGE图，注：1为Marker，2和3为虎奶菇干菌核总糖蛋白样品，4和5为虎奶菇干菌核细胞壁糖蛋白样品，6和7为虎奶菇鲜菌核总糖蛋白样品；均为同一条件下跑胶后的图像，2、4、6为跑完胶后用高碘酸-schiff碱法染色以检验其中的糖，3、5、7为跑完胶后用考马斯亮蓝法染色以检验其中的蛋白；条带I、II、III、IV为样品中含有的糖蛋白组分，其分子量均在10-35kDa之间。其中，条带II、III、IV高碘酸-schiff碱法染色较深，说明糖蛋白中糖含量较高；而条带I中高碘酸-schiff碱法染色较浅，说明其中糖含量较低。
图2为DRAS法提取的虎奶菇细胞壁糖蛋白DEAE阴离子交换柱分离图，注：图中I-IV为所收集的四个峰，根据出峰情况分别合并收集管。
图3为图2中峰II纯化后的SEC-MALLS图，表明峰形对称、纯度高，经计算分子量为18.3kDa，即图1中的条带II所指代的糖蛋白。
具体实施方式
游离多糖的测定：将所得糖蛋白用水溶解后，采用sevage法除蛋白，以苯酚-硫酸法测定除蛋白后的上清液中的糖含量。
DRAS溶液配方为：50mM Tris-HCl pH 8.0，0.1M EDTA，2％(w/v)SDS，10mM DTT。
实施例1
(1)将采收后晒干的虎奶菇菌核通过磨粉机粉碎后，过50目筛，得到虎奶菇干菌核粉末。
(2)常温下，用去离子水将过筛后的虎奶菇干菌核粉末洗涤离心3次去除杂质后，再依次用pH 6.5的PBS溶液洗涤离心3次，菌核粉末和PBS的料液比为1g：(10～20)mL，除去细胞内可溶性组分，以真空度0.05～0.1MPa抽滤除去滤液，所得残渣用超纯水洗涤8次，进一步去除细胞内可溶性组分和残留的PBS，得到菌核细胞壁碎片。
(3)按1：5(w/v)的料液比，向步骤(2)获得的细胞壁碎片中加入去垢剂-还原剂混合溶液(DRAS)进行提取；混合均匀后在100℃提取10min，结束后在常温下以转速5000g离心10min，浸提过程重复3次，合并所得上清液，使用滤纸过滤以除去不溶性残渣，得到细胞壁糖蛋白粗提液。
(4)向步骤(3)所得糖蛋白粗提液中加入预冷的100％TCA至溶液中TCA的终浓度为10％，冰浴30min，使溶液中糖蛋白沉淀，于4℃、6000g离心10min，弃上清收集沉淀；用沉淀1～3倍体积的冷丙酮洗涤沉淀后在同样条件下离心，重复5次，以去除残留的TCA，所得沉淀于通风橱内干燥使丙酮完全挥发，得到糖蛋白粗提物。
(5)将步骤(4)中干燥的糖蛋白粗提物以去离子水溶解后加入截留分子量为8000Da的透析袋中，去离子水透析，每1h换一次水，待透析袋外液体导电率接近去离子水，将透析袋中截留的液体进行冷冻干燥，即得虎奶菇菌核细胞壁糖蛋白。
将步骤(5)所得细胞壁糖蛋白用上样液溶解后，进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，所用胶浓度为5％浓缩胶和20％分离胶；蛋白上样量为25μg，电泳缓冲液配制方法为：25mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％(w/v)SDS；130V电压下跑完浓缩胶后，再于180V电压下跑分离胶；电泳结束后，分别用高碘酸-schiff碱法染色和考马斯亮蓝法染色以检验其中的糖和蛋白，结果如图1。
经检测，所得干菌核细胞壁糖蛋白占菌核细胞壁干重的5.36％，糖蛋白中总糖含量为32％，总蛋白含量约为67％，不含游离多糖和分子量大于70kDa的大分子蛋白质。其中，总糖和总蛋白的测定方法分别为苯酚-硫酸法和BCA法。
经进一步DEAE阴离子交换柱和Superdux 75凝胶柱柱分离获得纯化糖蛋白组分，如图2所示，收集的四个峰与图1的I、II、III、IV糖蛋白组分相对应，其中相对含量较高的糖蛋白分子量为18.3kDa，如图3所示，为图2峰II纯化后的SEC-MALLS图。
实施例2
(1)将采收后晒干的虎奶菇菌核通过磨粉机粉碎后，过50目筛，得到虎奶菇干菌核粉末。
(2)常温下，用去离子水将过筛后的虎奶菇干菌核粉末洗涤离心3次去除杂质后，再依次用pH 7.0的PBS溶液洗涤离心3次，菌核粉末和PBS的料液比为1g：(10～20)mL，除去细胞内可溶性组分，以真空度0.05～0.1MPa抽滤除去滤液，所得残渣用超纯水洗涤8次，进一步去除细胞内可溶性组分和残留的PBS，得到菌核细胞壁碎片。
(3)按1：10(w/v)的料液比，向步骤(2)获得的细胞壁碎片中加入DRAS进行提取；混合均匀后在90℃提取20min，结束后在常温下以转速5000g离心10min，浸提过程重复3次，合并所得上清液，使用滤纸过滤以除去不溶性残渣，得到细胞壁糖蛋白粗提液。
(4)向步骤(3)所得糖蛋白粗提液中加入预冷的100％TCA至溶液中TCA的终浓度为10％，冰浴30min，使溶液中糖蛋白沉淀，于4℃、6000g离心10min，弃上清收集沉淀；用沉淀1～3倍体积的冷丙酮洗涤沉淀后在同样条件下离心，重复5次，以去除残留的TCA，所得沉淀于通风橱内干燥使丙酮完全挥发，得到糖蛋白粗提物。
(5)将步骤(4)中干燥的糖蛋白粗提物以去离子水溶解后加入截留分子量为8000Da的透析袋中，去离子水透析，每1h换一次水，待透析袋外液体导电率接近去离子水，将透析袋中截留的液体进行冷冻干燥，即得虎奶菇菌核细胞壁糖蛋白。
经检测，所得干菌核细胞壁糖蛋白占菌核细胞壁干重的4.93％，不含游离多糖和分子量大于70kDa的大分子蛋白质。
经进一步DEAE阴离子交换柱和Superdux 75凝胶柱柱分离获得纯化糖蛋白组分，如图2所示，收集的四个峰与图1的I、II、III、IV糖蛋白组分相对应，其中相对含量较高的糖蛋白分子量为13.7kDa，即图1中条带III所示糖蛋白。
实施例3
(1)将采收后的新鲜虎奶菇菌核浇以液氮冷冻后，研磨，得到虎奶菇鲜菌核粉末。
(2)常温下，用去离子水将鲜菌核粉末洗涤离心3次去除杂质后，再依次用pH 6.5的PBS溶液洗涤离心3次，菌核粉末和PBS的料液比为1g：(10～20)mL，除去细胞内可溶性组分，以真空度0.05～0.1MPa抽滤除去滤液，所得残渣用超纯水洗涤10次，进一步去除细胞内可溶性组分和残留的PBS，得到鲜菌核细胞壁碎片。
(3)按1：5(w/v)的料液比，向步骤(2)获得的细胞壁碎片中加入DRAS进行提取；混合均匀后在90℃提取10min，结束后在常温下以转速5000g离心10min，浸提过程重复3次，合并所得上清液，使用滤纸过滤以除去不溶性残渣，得到细胞壁糖蛋白粗提液。
(4)向步骤(3)所得糖蛋白粗提液中加入预冷的100％TCA至溶液中TCA的终浓度为10％，冰浴30min，使溶液中糖蛋白沉淀，于4℃、6000g离心10min，弃上清收集沉淀。用沉淀1～3倍体积的冷丙酮洗涤沉淀后在同样条件下离心，重复5次，以去除残留的TCA，所得沉淀于通风橱内干燥使丙酮完全挥发，得到糖蛋白粗提物。
(5)将步骤(4)中干燥的糖蛋白粗提物以去离子水溶解后加入截留分子量为8000Da的透析袋中，去离子水透析，每1h换一次水，待透析袋外液体导电率接近去离子水，将透析袋中截留的液体进行冷冻干燥，即得虎奶菇菌核细胞壁糖蛋白。
经检测，所得鲜菌核细胞壁糖蛋白占菌核细胞壁干重的5.19％，不含游离多糖和分子量大于70kDa的大分子蛋白质。
经进一步DEAE阴离子交换柱和Superdux 75凝胶柱柱分离获得纯化糖蛋白组分，如图2所示，收集的四个峰与图1的I、II、III、IV糖蛋白组分相对应，其中相对含量较高的糖蛋白分子量为13.7kDa和13.1kDa，即图1中条带III和条带IV所示糖蛋白。
为更好验证本发明中所采用的方法对虎奶菇菌核细胞壁中的糖蛋白的提取效果，进行了如下的对比实验。
对比例1
在实施例1的基础上，将虎奶菇菌核粉末直接进行提取DRAS提取，省去PBS溶液洗涤过程，其余条件均同本发明实施例1，经检测，所得糖蛋白组分占菌核干重的8.9％，含游离多糖8％，大分子蛋白质21％。
对比例2
在实施例1的基础上，将DRAS溶液配方改为：50mM Tris-HCl pH 8.0，5mM DTT，其余条件均同本发明实施例1，经检测，所得糖蛋白组分占菌核细胞壁干重的3.1％，含游离多糖11％，大分子蛋白质17％。
对比例3
在实施例1的基础上，省略TCA沉淀和丙酮洗涤的步骤，直接将蛋白粗提液进行透析，其余条件均同本发明实施例1，经检测，所得糖蛋白组分占菌核细胞壁干重的9.3％，含游离多糖24％，大分子蛋白质28％。
对比例方法所得糖蛋白含有较多的多糖和/或蛋白质等大分子干扰组分，导致糖蛋白纯度较低。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种虎奶菇细胞壁糖蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将虎奶菇菌核磨粉，获得菌核粉末；
(2)将步骤(1)获得的菌核粉末加入到PBS溶液中，搅拌提取，除去滤液，再以去离子水洗涤滤渣，获得细胞壁碎片；菌核粉末和PBS溶液的料液比为1g：(10～20)mL；
(3)向步骤(2)获得的细胞壁碎片中加入去垢剂-还原剂混合溶液反复浸提，浸提结束后合并所得浸提液，滤去残渣，得到细胞壁糖蛋白粗提液；去垢剂-还原剂混合溶液由pH7.5～8.5的45～55mM Tris-HCl，0.08～0.12M乙二胺四乙酸，1% ～5％十二烷基硫酸钠和5～15mM二硫苏糖醇配制而成；细胞壁碎片与去垢剂-还原剂混合溶液的料液比为1g：(5～10)mL；
(4)向步骤(3)获得的粗提液中加入三氯乙酸孵育并离心得到沉淀，丙酮洗涤沉淀，离心弃上清，使丙酮完全挥发，得到糖蛋白粗提物粉末；三氯乙酸的终浓度为8% ～12％，丙酮的添加量为沉淀的1～3倍体积；
(5)用水溶解步骤(4)中的糖蛋白粗提物粉末并进行透析，将透析袋中截留的液体冷冻干燥，即得虎奶菇菌核细胞壁糖蛋白；透析袋的截流量为7800～8200Da。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，将干燥的虎奶菇菌核磨粉、过50～100目筛，获得虎奶菇菌核粉末；或取新鲜的虎奶菇菌核冷冻后研磨，获得虎奶菇菌核粉末。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中，洗涤滤渣的次数不少于8次。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，浸提所用温度为80～100℃，浸提时间为10～30min，浸提过程重复3～5次。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，离心的条件为在2～6℃下5500～6500g离心8～12min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，透析至透析袋外液体导电率接近去离子水后将透析袋中截留的液体进行冷冻干燥。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)得到的虎奶菇菌核细胞壁糖蛋白经柱分离纯化，得到不同分子量的糖蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，柱分离为依次经DEAE阴离子交换柱和Superdux 75凝胶柱。
9.权利要求1～8任一所述方法提取得到的虎奶菇菌核细胞壁糖蛋白在食品领域中的应用。
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