CN114874284B - 一种同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法，涉及食品深加工领域。该方法包括：利用低共熔溶剂对枸杞原料进行提取，得到枸杞浸提液，其中，所述低共熔溶剂由氢键供体和氢键受体组成，所述氢键供体为尿素和水，所述氢键受体为醋酸钠；利用乙醇将枸杞浸提液中的枸杞蛋白和多糖析出，得到枸杞蛋白和多糖的混合物；将枸杞蛋白和多糖的混合物分离后分别得到枸杞蛋白和枸杞多糖。该方法能够将蛋白和多糖从枸杞中同步提取分离出来，所得枸杞蛋白和多糖的提取率和纯度显著高于单独提取法，具有效率高、低能耗、低成本、操作便利、新型绿色、无三废排放、溶剂可循环使用等优点。

Description

一种同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法
技术领域
本发明涉及食品深加工领域，具体涉及一种同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法。
背景技术
枸杞为茄科植物多年生落叶灌木的干燥成熟果实。在朝鲜、日本、欧洲大部分地区均有种植，中国主要分布在宁夏、甘肃、新疆、青海、陕西、山西及河北等地。《中国药典》注明，仅有宁夏枸杞入中药，因此中国宁夏枸杞子最为盛名。
枸杞还具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、抗福射损伤、降血脂、降血糖、降血压、保肝、健脑、补肾、排毒、养颜和保护生殖系统等多项功能。现代中药学研究表明：枸杞的主要有效成份有多糖、色素、黄酮以及蛋白质、甜菜碱、氨基酸、类胡萝卜素等。其中，枸杞多糖是枸杞主要活性成份之一，有多种药理作用和生物活性，比如能提高人体免疫力，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤及降血糖、降血脂等作用。此外，枸杞蛋白也是枸杞的重要活性物质，枸杞蛋白含有人体必须的八种氨基酸，其氨基酸组成较为平衡。枸杞蛋白对自发性高血压有很好的疗效，同时具有很好的清除自由基的能力，能够达到抗衰老作用。因此，如何从枸杞中高效地提取枸杞多糖和枸杞蛋白成为研究的热点。
目前的研究大多采取从枸杞中单独分步提取枸杞多糖或枸杞蛋白的工艺方法，但是这些方法往往存在步骤复杂、能耗高、效率低、耗费大量资源的问题，限制了枸杞多糖和枸杞蛋白的利用效率。具体而言，现有技术中提取枸杞蛋白的方法主要是碱溶酸沉法，提取枸杞多糖的方法主要是水提醇沉法。碱溶酸沉法的原理就是利用强碱溶液从枸杞中提取枸杞蛋白，然后用强酸调整pH至等电点(pH＝4～6)沉淀蛋白，再进行离心、冻干等步骤得到枸杞蛋白。这种方法由于生产中使用强酸、强碱溶液，不仅对设备造成了一定的损害，对环境造成污染，并且强碱强酸溶液也会造成枸杞蛋白的生物活性降低甚至失活等问题。水提醇沉法提取枸杞多糖同样存在提取时间长、温度高、对多糖的生物活性有不利影响等问题。
现有技术中也存在一些改进的枸杞蛋白提取方法和枸杞多糖提取方法。例如，中国专利文献CN109511770A公开了一种枸杞下脚料中蛋白质的提取方法，虽然提高了蛋白提取率，但是提取过程中需要超声波提取仪和酸、碱、盐溶液等，提取蛋白及制备过程较复杂；中国专利文献CN106243206A公开了枸杞糖蛋白的制备方法，但需要用高压脉冲电场，成本较高；中国专利文献CN102887960A公开了一种提取枸杞多糖的工艺，是将枸杞除杂、干燥、粉碎后，用功能提取器进行脱脂脱色，再经微波提取、醇沉等步骤进行提取，然而该工艺提取枸杞多糖的得率并不高，仅为6.11％；中国专利文献CN101041698A公开了一种枸杞多糖的制备方法，通过清洗、打浆、酶解、脱色、脱蛋白、醇沉、真空干燥等步骤来获得枸杞多糖，这种方法也存在提取率不高的问题；中国专利文献CN104311690A公开了一种枸杞多糖的提取方法，需加入纤维素酶、碱性蛋白酶和无花果蛋白酶在微波条件下进行酶解，步骤较为复杂，并且冷冻粉碎所需能耗高。
综上所述，目前单独分步从枸杞中提取蛋白和多糖的技术普遍存在着操作复杂、效率低、成本高等各种问题。因此，将枸杞中的蛋白和多糖同步提取分离出来加以综合利用，具有广阔的应用前景和重要的现实意义，本领域急需提出一种绿色环保且高效的同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法。
近年来，低共熔溶剂(DES)作为一种新型绿色的溶剂在各种生物活性物质的萃取分离方面得到广泛应用。DES大多由有机盐和有机分子通过氢键、共价键等相互作用组合而成。一般来说，DES的熔点较低，且大部分在室温下为液态，其主要特征是绿色无毒性、可生物降解，可用作多种不同的溶质的萃取溶剂，在萃取过程中用作溶剂的方法取决于其物理性质，例如可混溶性、粘度和极性等，主要应用于DNA提取、木质素提取、多糖提取、蛋白质提取和酚酸的提取等。
低共熔溶剂在枸杞有效成分提取中的应用较少，主要体现在枸杞多糖的提取方面。例如，中国专利文献CN113698506A公开了一种温度响应型低共熔溶剂及提取枸杞多糖的方法，该低共熔溶剂由氢键供体和氢键受体混合形成，氢键供体为正辛酸、正癸酸、月桂酸、十四酸中的一种，氢键受体为丁卡因、利多卡因、普鲁卡因中的一种，该低共熔溶剂会破坏枸杞蛋白，不利于枸杞蛋白和多糖的同步提取，同时其具有成本较高的缺点；中国专利文献CN112457426A公开了一种同时提取不同枸杞多糖组分的方法，是将枸杞与低共熔溶剂水溶液混合，进行脱脂，得到枸杞渣，然后加水进行均质提取，该低共熔溶剂为薄荷醇和乳酸的混合物，其原理是枸杞中的黄酮、苷类、生物碱以及单糖等小分子优先与低共熔溶剂中的氢键受体结合，绝大多数被除去，为提取多糖提供便利，该低共熔溶剂不能利用氢键提取多糖和蛋白质，而且薄荷醇和乳酸也存在成本很高的问题。
发明内容
本发明为了克服现有技术的缺陷，提供一种同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法，利用尿素、水、醋酸钠组成的低共熔溶剂能够将蛋白和多糖从枸杞中同步提取分离出来，所得枸杞蛋白和多糖的提取率和纯度显著高于单独提取法，该方法具有效率高、低能耗、低成本、操作便利、新型绿色、无三废排放、溶剂可循环使用等优点。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法，包括以下步骤：
(1)利用低共熔溶剂对枸杞原料进行提取，得到枸杞浸提液，其中，所述低共熔溶剂由氢键供体和氢键受体组成，所述氢键供体为尿素和水，所述氢键受体为醋酸钠；
(2)利用乙醇将步骤(1)得到的枸杞浸提液中的枸杞蛋白和多糖析出，得到枸杞蛋白和多糖的混合物；
(3)将步骤(2)得到的枸杞蛋白和多糖的混合物分离后分别得到枸杞蛋白和枸杞多糖。
进一步地，所述醋酸钠、尿素和水的摩尔比为1：(1～3)：(1～3)。醋酸钠、尿素和水的摩尔比优选为1：1：2，在该比例下的低共熔溶剂更为澄清、透明且粘度小，更适合用于枸杞蛋白和多糖的提取。
进一步地，所述低共熔溶剂的制备方法包括以下步骤：将所述醋酸钠、尿素和水混合，于75～95℃搅拌至澄清，得到所述低共熔溶剂。例如，搅拌时的温度可以为75℃，76℃，77℃，78℃，79℃，80℃，81℃，82℃，83℃，84℃，85℃，86℃，87℃，88℃，89℃，90℃，91℃，92℃，93℃，94℃，95℃。搅拌时的温度优选为85～95℃，在此范围下的低共熔溶剂更为澄清、透明且粘度小，更适合用于枸杞蛋白和多糖的提取。
所述醋酸钠与尿素和水混合后以氢键形式结合到一起，形成低共熔混合物，两者的纯度需要大于95％。
进一步地，步骤(1)中，所述提取的步骤包括：将枸杞原料、蒸馏水以及低共熔溶剂混合，经搅拌、离心，得到枸杞浸提液。
进一步地，步骤(1)中，所述枸杞原料、蒸馏水以及低共熔溶剂的质量体积比(0.1～1.0)g：(1～15)mL：(5～50)mL，优选为0.5g：6mL：9mL。
进一步地，步骤(1)中，所述搅拌为在20～85℃下搅拌100～260min。例如，搅拌温度可以为20℃，30℃，40℃，45℃，55℃，65℃，75℃，85℃，搅拌时间可以为100min，120min，140min，160min，180min，200min，220min，240min，260min。优选搅拌温度为40～55℃，优选搅拌时间为120～240min。更优选为在45℃下搅拌180min。
进一步地，步骤(1)中，所述离心为在5000～8000rpm转速下离心5～15min，优选在6000rpm转速下离心10min。
进一步地，步骤(2)中，所述析出的步骤包括：将所述枸杞浸提液与乙醇混合，经搅拌、静置、离心，取离心所得沉淀物经静置、洗涤、离心，得到枸杞蛋白和多糖的混合物。
进一步地，步骤(2)中，所述乙醇的质量分数不低于95％，优选为无水乙醇。
进一步地，步骤(2)中，所述枸杞浸提液与乙醇的体积比为1：(2～4)，优选为1：(3～4)，在此范围下析出的沉淀较多，更有利于枸杞蛋白和多糖的离心收集。例如，枸杞浸提液与乙醇的体积比可以为1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5，1：4。
进一步地，步骤(2)中，所述搅拌为在20～30℃下搅拌1～5h。
进一步地，步骤(2)中，第一次静置的时间为20～60min。
进一步地，步骤(2)中，第一次离心为在8000rpm转速下离心10min。
进一步地，步骤(2)中，第二次静置的时间为20～60min。
进一步地，步骤(2)中，第二次离心为在8000rpm转速下离心10min。
进一步地，步骤(3)中，所述分离的步骤包括：向所述枸杞蛋白和多糖的混合物中加蒸馏水溶解，得混合液；向所述混合液中加入过饱和中性盐溶液，经搅拌、静置、离心，得到沉淀物和上清液；取沉淀物经静置、洗涤、离心、冻干后得到枸杞蛋白，取上清液于透析袋中透析，经洗涤、冻干后得到枸杞多糖。
进一步地，所述过饱和中性盐溶液选择过饱和硫酸铵溶液或过饱和氯化钠溶液。
进一步地，所述枸杞蛋白和多糖的混合物与蒸馏水的体积比为1：(1～3)，优选为1：(1～2)，在此范围下混合物的溶解性更好。例如，枸杞蛋白和多糖的混合物与蒸馏水的体积比可以为1：1，1：2，1：3。
进一步地，所述混合液与过饱和中性盐溶液的体积比为1：(1～3)，优选为1：(1～2)，在此范围下析出的沉淀较多，更有利于枸杞蛋白和多糖的离心收集。例如，混合液与过饱和中性盐溶液的体积比可以为1：1，1：2，1：3。
进一步地，搅拌后在4℃下静置8～16h，优选在4℃下静置12～14h，在此范围下析出的沉淀较多，更有利于枸杞蛋白和多糖的离心收集。例如，静置时间可以为8h，9h，10h，11h，12h，13h，14h，15h，16h。
进一步地，透析时间为8～12h，优选为8～10h，在此范围下盐离子的透析更为彻底。例如，透析时间可以为8h，9h，10h，11h，12h。
进一步地，所述枸杞原料为枸杞粉或者脱脂枸杞粉。
进一步地，所述枸杞原料选用红果枸杞来制备。
进一步地，所述枸杞粉的制备方法包括：将枸杞果经干燥、粉碎、过筛，得到枸杞粉。
进一步地，所述脱脂枸杞的制备方法包括：将枸杞果经干燥、粉碎、过筛，得到枸杞粉；将所述枸杞粉与脱脂剂混合，间歇性搅拌，经冷却、离心，取离心所得沉淀物经干燥、粉碎过筛，得到脱脂枸杞粉。
进一步地，所述干燥为将所述枸杞果干燥至水分含量为5～10％。例如，可以将枸杞果经烘箱60℃过夜干燥。
进一步地，枸杞果经干燥、粉碎后，过60～100目筛。
进一步地，所述脱脂剂选择正己烷或石油醚。
进一步地，所述枸杞粉与脱脂剂的质量体积比为1g：(1.5～3)mL，优选为1g：2mL。
进一步地，所述间歇性搅拌的温度为40～65℃，时间为2～5h，优选为3～4h，在此范围下枸杞粉的脱脂更为彻底。
进一步地，所述离心的条件为：转速4000～7000rpm，时间10～30min，优选的，所述离心的条件为：转速4000～6000rpm，时间10～20min。
进一步地，取离心所得沉淀物经干燥、粉碎后过60～100目筛，优选过80～100目筛。
进一步地，所述枸杞原料为脱脂枸杞粉，步骤(1)中，所述枸杞原料、蒸馏水以及低共熔溶剂的质量体积比(0.1～1.0)g：(1～10)mL：(5～50)mL。例如，枸杞原料、蒸馏水以及低共熔溶剂的质量体积比可以为：0.1g：1mL：5mL，0.1g：2mL：6mL，0.2g：3mL：7mL，0.2g：4mL：8mL，0.3g：5mL：9mL，0.3g：5mL：10mL，0.4g：6mL：12mL，0.4g：7mL：14mL，0.5g：8mL：16mL，0.5g：9mL：18mL，0.6g：10mL：20mL，0.6g：6mL：20mL，0.7g：6mL：22mL，0.7g：7mL：24mL，0.8g：7mL：26mL，0.8g：8mL：28mL，0.9g：8mL：30mL，0.9g：9mL：35mL，0.9g：9mL：40mL，0.9g：9mL：45mL，1.0g：10mL：50mL。优选为0.5g：5mL：15mL，在此条件下，减少低共熔溶剂的用量，不仅使得蛋白和多糖提取效果较优，且不会造成浪费，并且减少了蛋白和多糖析出过程中所需要的乙醇的量。
进一步地，所述的同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法还包括：将步骤(1)中离心得到的枸杞渣重复所述步骤(1)～(3)进行二次提取分离。
进一步地，所述的同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法还包括：将步骤(2)中离心得到的上清液进行旋蒸，分别回收低共熔溶剂和乙醇，并将回收得到的低共熔溶剂和乙醇循环使用，优选的，旋蒸的条件为：温度38～55℃，转速20～40rpm，时间30～60min，更优选的，旋蒸的条件为：温度39～49℃，转速20～30rpm，时间30～50min。回收得到的低共熔溶剂和乙醇可循环使用3～8次。
用醋酸钠-尿素体系从枸杞中提取枸杞蛋白和多糖，主要是利用该低共熔溶剂具有对生物大分子(枸杞蛋白和多糖)很好的萃取效果的特性，在整个提取过程中，枸杞蛋白和多糖溶于低共熔溶剂中，并且枸杞蛋白和多糖在低共熔溶剂中具有较高的溶解度，因此，当枸杞蛋白和多糖被乙醇析出后，低共熔溶剂中不溶解大量的溶质(枸杞蛋白和多糖)，仍具有继续萃取枸杞蛋白和多糖的能力，即已提取过枸杞蛋白和多糖并利用旋蒸方式与乙醇分离后的回收的低共熔溶剂仍可用于枸杞蛋白的提取。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明利用低共熔溶剂法同时提取分离枸杞蛋白和多糖，是利用低成本的醋酸钠、尿素和水以氢键结合到一起形成低共熔溶剂，基于该低共熔溶剂对生物大分子具有高度溶解和特异性作用的能力，实现枸杞中蛋白和多糖的同步提取分离。具体而言，本发明利用低共熔溶剂同时提取枸杞蛋白和多糖，使其有效地溶解于溶剂中，然后利用乙醇沉淀枸杞蛋白和多糖，最后将蛋白和多糖进行分离。
同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法可同时获得两种枸杞中的活性物质，不需要操作复杂或大功率的仪器，方法简单，提取效率高；低成本低共熔溶剂的使用实现了溶剂可回收利用，达到了废物、废液零排放的效果；同步提取蛋白和多糖的方法作用条件温和，不会对蛋白和多糖的生物活性造成破坏，达到蛋白和多糖的高效提取分离，提取率高，同时也获得较高纯度的枸杞蛋白和多糖。
2、与传统的碱溶酸沉法提取枸杞蛋白相比，利用低共熔溶剂提取枸杞中的枸杞蛋白不需要使用大量的强酸、强碱或盐溶液，并且溶剂可回收利用，不会造成浪费；与传统的水提醇沉法提取枸杞多糖相比，采用同时提取法时间短、温度低、对多糖的生物活性无不利影响。因此，本发明提供的方法克服了单独提取蛋白或多糖的方法所存在的污染环境、操作复杂、效率低、能耗高等一系列问题，有利于降低能耗和成本，提高效率，同时本发明提取的枸杞蛋白和多糖提取率和产物纯度均比单独提取法得到大幅提高。
3、本发明提供的方法中所使用的低共熔溶剂和乙醇可回收利用，回收后的低共熔溶剂仍表现为均匀液体状态，无固态沉淀，重复利用性好，回收后仍可作为溶剂来提取枸杞蛋白和多糖，仍有较高的提取率，具有无废液、废物排放，绿色环保的优点。
4、经验证，很多有机溶剂与醋酸钠-尿素体系不互溶，无法用于析出枸杞蛋白和多糖。本发明选择乙醇作为溶剂，一方面具有无毒性、气味较小等优点，适合用于食品加工生产；另一方面，在醋酸钠-尿素浸提液加入乙醇静置后，不仅醋酸钠-尿素体系可以和乙醇互溶，而且枸杞蛋白和多糖可以由原来的醋酸钠-尿素体系转移至乙醇体系中，析出枸杞蛋白和多糖。同时，经验证，相比于其他低共熔溶剂体系，只有本发明提出的醋酸钠-尿素提取枸杞蛋白和多糖的浸提液可以用乙醇将蛋白和多糖析出，得到枸杞蛋白和多糖沉淀。其作用原理如下：一方面乙醇的加入使溶液的介电常数降低，溶质分子(枸杞蛋白和多糖)之间的静电引力增加，从而聚集成沉淀；另一方面乙醇自身强烈的水合作用能破坏颗粒表面的水合层，从而导致枸杞蛋白和多糖颗粒析出。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例4提取枸杞蛋白和多糖的工艺流程图；
图2为本发明实施例1制备的低共熔溶剂；
图3为本发明实施例3(加水6mL时)提取枸杞蛋白和多糖后回收的低共熔溶剂，其中(a)图是回收一次的低共熔溶剂；(b)图是回收的乙醇；
图4为本发明实施例3(加水6mL时)制备得到的枸杞蛋白；
图5为本发明实施例3(加水6mL时)制备得到的枸杞多糖；
图6为本发明实验例2中不同低共熔溶剂(甜菜碱-尿素、甜菜碱-乙二醇、甜菜碱-甘油、ChCl-乙二醇、ChCl-醋酸)对枸杞蛋白的提取率；
图7为本发明实验例2中不同低共熔溶剂(NaAc-尿素、ChCl-尿素、ChCl-BOD、ChCl-丙三醇、ChCl-草酸)对枸杞蛋白的提取率。
图8为本发明实验例2中不同低共熔溶剂(甜菜碱-尿素、甜菜碱-乙二醇、甜菜碱-甘油、ChCl-乙二醇、ChCl-醋酸)对枸杞多糖的提取率；
图9为本发明实验例2中不同低共熔溶剂(NaAc-尿素、ChCl-尿素、ChCl-BOD、ChCl-丙三醇、ChCl-草酸)对枸杞多糖的提取率。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中所用的枸杞果品种均为红果枸杞，购自宁夏中宁县。
实施例中各指标的检测和计算方法如下：
1、低共熔溶剂的蛋白提取率
利用考马斯亮蓝法测定枸杞浸提液中的蛋白含量，蛋白提取率按照下式进行计算：
蛋白提取率＝(浸提液中的蛋白含量/样品中的蛋白含量)×100％
样品(脱脂枸杞粉)中蛋白含量采用凯氏定氮仪进行检测。
2、蛋白纯度
利用凯氏定氮仪直接测出所得枸杞蛋白的蛋白纯度。
3、低共熔溶剂的多糖提取率
利用苯酚硫酸法分别测定枸杞浸提液中的多糖含量以及样品(脱脂枸杞粉)中的多糖含量，多糖提取率按照下式进行计算：
多糖提取率＝(浸提液中的多糖含量/样品中的多糖含量)×100％
采用苯酚硫酸法测定多糖含量的方法如下：以葡萄糖为标准品制作标准曲线：称取烘干后的葡萄糖25.0mg于250mL容量瓶中，加水至刻度并摇匀，分别取0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL，0.7mL，0.8mL葡萄糖标准溶液，分别加水补至1.0mL，然后加入5％苯酚溶液及1.6mL浓硫酸，充分摇匀，室温放置25min之后在490mm测吸光度，蒸馏水按同样显色操作为空白，以多糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。样品同标曲之操作，测定吸光值，代入标准曲线，即可得多糖含量。
4、多糖纯度
多糖纯度按照下式进行计算：
多糖纯度＝测定所得枸杞多糖中的多糖含量/所得枸杞多糖质量
实施例1低共熔溶剂在不同温度下提取枸杞蛋白和多糖
按照如下步骤制备脱脂枸杞粉：
a)将枸杞果放置在阴凉、干燥通风处自然风干，在烘箱中60℃温度下烘至枸杞果水分含量约10％，再用粉碎机将其粉碎，过100目筛，得到枸杞粉；
b)将步骤a)所得枸杞粉用正己烷脱脂，将枸杞粉与正己烷按照质量体积比1g：2mL混合，在55℃下间歇性搅拌4h，冷却至室温后以4000rpm的转速离心10min，取沉淀物在通风橱晾干，用粉碎机将其粉碎，过80目筛，即得到脱脂枸杞粉。
按照如下步骤制备低共熔溶剂：
将醋酸钠、尿素和水按照摩尔比1：1：2混合，于85℃搅拌至澄清，得到低共熔溶剂。
按照如下步骤同步提取分离枸杞蛋白和多糖：
(1)称取脱脂枸杞粉0.5000g置于锥形瓶中，加5mL蒸馏水溶解，再向其中加入15mL低共熔溶剂混合均匀，分别在20℃，30℃，40℃，45℃、55℃、65℃、75℃和85℃水浴条件下磁力搅拌180min，在6000rpm转速下离心10min，得到枸杞浸提液；
(2)向步骤(1)得到的枸杞浸提液中加入4倍体积的无水乙醇，在25℃下搅拌3h，静置60min，取下层沉淀在8000rpm转速下离心10min，取离心所得沉淀物静置60min，取下层沉淀用无水乙醇洗涤，洗涤得到的固体在8000rpm转速下离心10min，得到枸杞蛋白和多糖的混合物；
(3)按照体积比1：1向步骤(2)得到的枸杞蛋白和多糖的混合物中加蒸馏水溶解，得混合液，按照体积比1：1向混合液中加入过饱和硫酸铵溶液，搅拌混匀后在在4℃下静置12h，取下层沉淀在8000rpm转速下离心10min，离心后得到沉淀物和上清液，取沉淀物静置60min，取下层沉淀用过饱和硫酸铵溶液洗涤，洗涤得到的固体在8000rpm转速下离心10min，取离心所得沉淀物冻干后得到枸杞蛋白，取上清液于透析袋中透析12h，经洗涤、冻干后得到枸杞多糖；
(4)收集步骤(2)中离心得到的上清液，利用旋转蒸发仪在温度51℃、转速20rpm的条件下旋蒸50min，收集低共熔溶剂和乙醇用来循环使用。
因为旋蒸之后，低共熔溶剂和乙醇分别全部收集，回收的处理方法几乎未造成溶剂损失，需要说明的是，在收集过程中有操作的原因如挂壁等现象会导致极为微量的损失，因此回收率约为100％。在包括蛋白和多糖的提取、加入无水乙醇使蛋白和多糖析出以及利用旋蒸的方式分离回收低共熔溶剂在内的整个工艺流程中，均未发现有尿素或者醋酸钠晶体析出，同时也未出现低共熔溶剂凝固现象，说明低共熔溶剂体系未发生改变，可以重复用于枸杞蛋白和多糖的提取。
本实施例不同提取温度下得到的蛋白提取率如表1所示。
表1不同提取温度下的蛋白提取率
温度(℃) 20 30 40 45 55 65 75 85
蛋白提取率(％) 10.12 15.23 17.82 18.09 16.46 14.76 13.05 12.80
如表1所示，当提取温度在45℃时枸杞蛋白的提取率最高，经检测在该提取温度下得到的枸杞蛋白纯度为70.55％，多糖提取率为36.72％，多糖纯度为69％。
实施例2低共熔溶剂在不同提取时间下提取枸杞蛋白和多糖
脱脂枸杞粉和低共熔溶剂的制备方法同实施例1。
按照如下步骤同步提取分离枸杞蛋白和多糖：
(1)称取脱脂枸杞粉0.5000g置于锥形瓶中，加5mL蒸馏水溶解，再向其中加入15mL低共熔溶剂混合均匀，分别在45℃水浴条件下磁力搅拌60min、120min、180min、240min、300min，在6000rpm转速下离心10min，得到枸杞浸提液；
步骤(2)～(4)同实施例1。
本实施例不同提取时间下得到的蛋白提取率如表2所示。
表2不同提取时间下的效果数据
提取时间(min) 60 120 180 240 300
蛋白提取率(％) 16.06 16.83 18.60 13.82 19.03
如表2所示，当提取时间为300min时枸杞蛋白的提取率最高，然而该搅拌时间较长，为了工业生产中降低能耗，不会优先选择该提取时间，当提取时间为180min时枸杞蛋白的提取效果较佳，经检测在该提取时间下得到的枸杞蛋白纯度为71.39％，多糖提取率为36.58％，多糖纯度为70.21％。
实施例3低共熔溶剂在不同加水量下提取枸杞蛋白和多糖
脱脂枸杞粉和低共熔溶剂的制备方法同实施例1。
按照如下步骤同步提取分离枸杞蛋白和多糖：
(1)称取脱脂枸杞粉0.5000g置于锥形瓶中，分别加1.5mL，3mL，4.5mL，6mL，7.5mL蒸馏水溶解，再向其中加入低共熔溶剂(蒸馏水与低共熔溶剂共15mL)混合均匀，在45℃水浴条件下磁力搅拌180min，在6000rpm转速下离心10min，得到枸杞浸提液；
步骤(2)～(4)同实施例1。
本实施例不同加水量下得到的蛋白提取率如表3所示。
表3不同加水量下的效果数据
加水量(mL) 1.5 3 4.5 6 7.5
蛋白提取率(％) 16.2 18.2 30.1 44.02 29.51
如表3所示，当加水量为6mL时枸杞蛋白的提取率最高，经检测在该加水量下得到的枸杞蛋白纯度为74.3％，多糖提取率为45％，多糖纯度为83.26％。
实施例4两次提取枸杞蛋白和多糖
脱脂枸杞粉和低共熔溶剂的制备方法同实施例1。
按照如下步骤同步提取分离枸杞蛋白和多糖：
(1)称取脱脂枸杞粉0.5000g置于锥形瓶中，加6mL蒸馏水溶解，再向其中加入低共熔溶剂9mL混合均匀，在45℃水浴条件下磁力搅拌180min，在6000rpm转速下离心10min，得到枸杞浸提液；
步骤(2)～(4)同实施例1；
(5)将步骤(1)中离心得到的枸杞渣重复步骤(1)～(3)进行二次提取分离，二次提取分离的过程中利用步骤(4)回收的低共熔溶剂和乙醇。
本实施例两次提取分离得到的蛋白提取率和多糖提取率如表4所示。
表4两次提取中低共熔溶剂对枸杞蛋白的提取率
提取次数 第一次 第二次 两次总计
蛋白提取率(％) 44.02 12.04 56.06
多糖提取率(％) 45 13 58
如表4所示，通过两次提取可获得较高的蛋白提取率和多糖提取率，特别是在二次提取过程中使用回收的低共熔溶剂和乙醇，具有无废液、废物排放，绿色环保的优点。
实施例5低共熔溶剂提取枸杞蛋白和多糖的可重复利用性
脱脂枸杞粉和低共熔溶剂的制备方法同实施例1。
按照如下步骤同步提取分离枸杞蛋白和多糖：
(1)称取脱脂枸杞粉0.5000g置于锥形瓶中，加6mL蒸馏水溶解，再向其中加入低共熔溶剂共15mL混合均匀，在45℃水浴条件下磁力搅拌180min，在6000rpm转速下离心10min，得到枸杞浸提液；
步骤(2)～(4)同实施例1；
(5)再次称取脱脂枸杞粉0.5000g置于锥形瓶中，重复步骤(1)再次得到枸杞浸提液，在此过程中使用步骤(4)回收的低共熔溶剂。
本实施例利用原低共熔溶剂和旋蒸回收的低共熔溶剂分别得到的蛋白提取率和多糖提取率如表5所示。
表5重复使用回收的低共熔溶剂对枸杞蛋白和多糖的提取率
提取用的溶剂 原低共熔溶剂 回收的低共熔溶剂
蛋白提取率(％) 44.02 41.02
多糖提取率(％) 45 43.23
重复使用回收的低共熔溶剂所具有的高提取率说明低共熔溶剂在提取蛋白质和多糖的过程中以及加入无水乙醇析出蛋白和多糖的过程中，只是利用有机溶剂沉淀法析出枸杞蛋白和多糖，低共熔溶剂的溶剂体系未被破坏，所以仍可用于枸杞蛋白和多糖的提取。
实验例1与单独提取枸杞蛋白和枸杞多糖的方法对比
将本发明提供的同步提取枸杞蛋白和多糖的方法与现有技术中单独提取枸杞蛋白和单独提取枸杞多糖的方法进行效果对比，得出的效果数据如表6所示。
同时提取的方法参照本发明实施例4进行；
单独提取蛋白的方法为碱溶酸沉法，具体操作如下：
将相同质量脱脂枸杞粉置于锥形瓶中，按料液比10mL/g加水，均匀搅拌，用浓度2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至9，在45℃的水浴锅中提取2.5h，之后在6000r/min下离心10min，取上清，倒入干净锥形瓶中，添加质量分数7％的盐酸调节pH值至4，静置半小时，在6000r/min下离心10min，弃上清，加水复溶，测蛋白含量经过真空干燥得到枸杞蛋白。利用考马斯亮蓝法测定复溶液中的蛋白含量，蛋白提取率按照下式进行计算：
蛋白提取率＝(复溶液中的蛋白含量/样品中的蛋白含量)×100％
单独提取多糖的方法为水提醇沉法，具体操作如下：
将实施例1制备的脱脂枸杞粉用质量浓度80％的乙醇脱单糖和低聚糖，得到的固体溶于100℃水中提取120min，提取液用无水乙醇沉淀多糖，再用无水乙醇、丙酮洗涤，经过真空干燥得到枸杞多糖。利用苯酚硫酸法分别测定提取液中的多糖含量以及样品(脱脂枸杞粉)中的多糖含量，多糖提取率按照下式进行计算：
多糖提取率＝(提取液中的多糖含量/样品中的多糖含量)×100％
表6本发明同时提取法和单独提取枸杞蛋白和多糖方法的效果对比
方法 蛋白提取率 蛋白纯度 多糖提取率 多糖纯度
同时提取(实施例4) 56％ 75％ 58％ 86％
单独提取蛋白(碱溶酸沉法) 27.93％ 67.34％ — —
单独提取多糖(水提醇沉法) — — 41.23％ 82.36％
如表6所示，本发明提供的同步提取法能够得到高纯度的枸杞蛋白和多糖，并且相较于单独提取法显著提高了蛋白提取率和多糖提取率。
实验例2与其他低共熔溶剂对比
对比不同低共熔溶剂(NaAc-尿素、ChCl-尿素、ChCl-BOD、ChCl-丙三醇、ChCl-草酸、甜菜碱-尿素、甜菜碱-乙二醇、甜菜碱-甘油、ChCl-乙二醇、ChCl-醋酸)对枸杞蛋白和多糖的提取效果，具体方法如下：
称取实施例1制备的脱脂枸杞粉0.5000g置于锥形瓶中，加4.5mL蒸馏水溶解，再向其中加入低共熔溶剂10.5mL混合均匀，在45℃水浴条件下磁力搅拌180min，在6000rpm转速下离心10min，得到枸杞浸提液；
分别计算各低共熔溶剂的枸杞蛋白提取率和枸杞多糖提取率。
其中，各低共熔溶剂的制备方法如下：
NaAc-尿素：将醋酸钠、尿素和水按照摩尔比1：1：2混合，于85℃搅拌至澄清；ChCl-尿素：将两者按照摩尔比1：2混合，于85℃搅拌至澄清；ChCl-BOD：将两者按照摩尔1：3混合，于100℃搅拌至澄清；ChCl-丙三醇：将两者按照摩尔比1：2混合，于80℃搅拌至澄清；ChCl-草酸：将两者按照摩尔比1：3混合，于70℃搅拌至澄清；甜菜碱-尿素：将两者和水按照摩尔比1：2：1混合，于80℃搅拌至澄清；甜菜碱-乙二醇：将两者和水按照摩尔比1：1：2混合，于100℃搅拌至澄清；甜菜碱-甘油：将两者和水按照摩尔比1：2：1混合，于100℃搅拌至澄清；ChCl-乙二醇：将两者和水按照摩尔比1：1：10混合，于80℃搅拌至澄清；ChCl-醋酸：将两者和水按照摩尔比1：1：10混合，于80℃搅拌至澄清；
各低共熔溶剂对枸杞蛋白和多糖的提取率如图6～9所示，在相同条件下，NaAc-尿素低共熔溶剂体系对枸杞蛋白和枸杞多糖同时具有较高的提取率，可以用于枸杞蛋白和多糖的同步提取。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (15)

1.一种同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用低共熔溶剂对枸杞原料进行提取，得到枸杞浸提液，其中，所述低共熔溶剂由氢键供体和氢键受体组成，所述氢键供体为尿素和水，所述氢键受体为醋酸钠，所述醋酸钠、尿素和水的摩尔比为1：（1~3）：（1~3），所述提取的步骤包括：将枸杞原料、蒸馏水以及低共熔溶剂混合，经搅拌、离心，得到枸杞浸提液，所述枸杞原料、蒸馏水以及低共熔溶剂的质量体积比为（0.1~1.0）g：（1~15）mL：（5~50）mL，所述枸杞原料为脱脂枸杞粉；
（2）利用乙醇将步骤（1）得到的枸杞浸提液中的枸杞蛋白和多糖析出，得到枸杞蛋白和多糖的混合物；
（3）将步骤（2）得到的枸杞蛋白和多糖的混合物分离后分别得到枸杞蛋白和枸杞多糖，所述分离的步骤包括：向所述枸杞蛋白和多糖的混合物中加蒸馏水溶解，得混合液；向所述混合液中加入过饱和中性盐溶液，经搅拌、静置、离心，得到沉淀物和上清液；取沉淀物经静置、洗涤、离心、冻干后得到枸杞蛋白，取上清液于透析袋中透析，经洗涤、冻干后得到枸杞多糖。
2.根据权利要求1所述的同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法，其特征在于，所述醋酸钠、尿素和水的摩尔比为1：1：2；
所述低共熔溶剂的制备方法包括以下步骤：将所述醋酸钠、尿素和水混合，于75~95℃搅拌至澄清，得到所述低共熔溶剂。
3.根据权利要求1所述的同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法，其特征在于，所述枸杞原料、蒸馏水以及低共熔溶剂的质量体积比为0.5g：6mL：9mL；
所述搅拌为在20~85℃下搅拌100~260min；
所述离心为在5000~8000rpm 转速下离心5~15min。
4.根据权利要求3所述的同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法，其特征在于，所述搅拌为在40~55℃下搅拌120~240min。
5.根据权利要求4所述的同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法，其特征在于，所述搅拌为在45℃下搅拌180min。
6.根据权利要求1所述的同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述析出的步骤包括：将所述枸杞浸提液与乙醇混合，经搅拌、静置、离心，取离心所得沉淀物经静置、洗涤、离心，得到枸杞蛋白和多糖的混合物，
所述乙醇的质量分数不低于95%；
所述枸杞浸提液与乙醇的体积比为1：（2~4）；
所述搅拌为在20~30℃下搅拌1~5h；
第一次静置的时间为20~60min；
第一次离心为在8000rpm转速下离心10min；
第二次静置的时间为20~60min；
第二次离心为在8000rpm转速下离心10min。
7.根据权利要求6所述的同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法，其特征在于，所述乙醇为无水乙醇；所述枸杞浸提液与乙醇的体积比为1：（3~4）。
8.根据权利要求1所述的同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述过饱和中性盐溶液选择过饱和硫酸铵溶液或过饱和氯化钠溶液；
所述枸杞蛋白和多糖的混合物与蒸馏水的体积比为1：（1~3）；
所述混合液与过饱和中性盐溶液的体积比为1：（1~3）；
搅拌后在4℃下静置8~16h；
透析时间为8~12h。
9.根据权利要求8所述的同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法，其特征在于，步骤（3）中，
所述枸杞蛋白和多糖的混合物与蒸馏水的体积比为1：（1~2）；
所述混合液与过饱和中性盐溶液的体积比为1：（1~2）；
搅拌后在4℃下静置12~14h；
透析时间为8~10h。
10.根据权利要求1所述的同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法，其特征在于，所述枸杞原料选用红果枸杞来制备。
11.根据权利要求1所述的同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法，其特征在于，
所述脱脂枸杞的制备方法包括：将枸杞果经干燥、粉碎、过筛，得到枸杞粉；将所述枸杞粉与脱脂剂混合，间歇性搅拌，经冷却、离心，取离心所得沉淀物经干燥、粉碎过筛，得到脱脂枸杞粉。
12.根据权利要求11所述的同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法，其特征在于，
所述干燥为将所述枸杞果干燥至水分含量为5~10%；
枸杞果经干燥、粉碎后，过60~100目筛；
所述脱脂剂选择正己烷或石油醚；
所述枸杞粉与脱脂剂的质量体积比为1g：（1.5~3）mL；
所述间歇性搅拌的温度为40~65℃，时间为2~5h；
所述离心的条件为：转速4000~7000rpm，时间10~30min；
取离心所得沉淀物经干燥、粉碎后过60~100 目筛。
13.根据权利要求12所述的同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法，其特征在于，
所述枸杞粉与脱脂剂的质量体积比为1g：2mL；
所述间歇性搅拌的温度为40~65℃，时间为3~4h；
所述离心的条件为：转速4000~6000rpm，时间10~20min；
取离心所得沉淀物经干燥、粉碎后过80~100目筛。
14.根据权利要求1所述的同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法，其特征在于，还包括：将步骤（1）中离心得到的枸杞渣重复所述步骤（1）~（3）进行二次提取分离。
15.根据权利要求1所述的同步提取分离枸杞蛋白和多糖的方法，其特征在于，还包括：将步骤（2）中离心得到的上清液进行旋蒸，分别回收低共熔溶剂和乙醇，并将回收得到的低共熔溶剂和乙醇循环使用；旋蒸的条件为：温度38~55℃，转速20~40rpm，时间30~60min。
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