CN108299547B - 一种从虎奶菇菌核中制备糖蛋白的方法 - Google Patents
一种从虎奶菇菌核中制备糖蛋白的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种从虎奶菇菌核中制备糖蛋白的方法，属于生物技术领域。本发明首先对虎奶菇菌核粉末进行脱脂，然后用溶剂提取法除去其中游离的蛋白和多糖，再用缓冲液浸提得到糖蛋白粗提液，经过浓缩、沉淀、透析等步骤后，将糖蛋白提取物进行冷冻干燥，得到虎奶菇菌核糖蛋白。本发明制备方法提取率高，易于实现，将对虎奶菇活性价值的开发具有重要的推动作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种从虎奶菇菌核中制备糖蛋白的方法，属于生物技术领域。
背景技术
虎奶菇，拉丁名为：Pleurotus tuber-regium(Fr.)Sing，通常简称为PTR，学名菌核侧耳，又名虎奶菌、核耳菇、茯苓侧耳、南洋茯苓等，属于担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，侧耳科，侧耳属，是一种珍稀食药用真菌。虎奶菇主要生长于热带和亚热带地区，在马来西亚、澳大利亚、尼日利亚和肯尼亚等地均有发现，我国境内主要分布在云南省的腾冲和章凤等地，现在江西抚州也有发现和栽培。与茯苓和猪苓等食药用真菌类似，虎奶菇的生长周期中也包含菌核这一特殊形态。据《本草纲目》记载，虎奶菇子实体及菌核具有治疗胃病、哮喘、高血压等疾病的药效。研究表明，虎奶菇具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、增强人体免疫能力等生物活性，然而其作用机理尚不清楚。
糖蛋白(glycoprotein)是一类由分支的寡糖链与多肽链或蛋白质以共价键连接而成的复合糖，形式多样，在自然界中广泛存在，对生物体的各项生命活动起着十分重要的作用。近年来的研究表明，糖蛋白具有抗癌、抗氧化、抗疲劳、抑制肿瘤等多方面活性及生理功能，研究糖蛋白为主的糖生物学也逐渐兴起。
食药用真菌作为糖蛋白的一个重要来源，其研究也被日益重视，但是糖蛋白的分离纯化是一个相对复杂的过程，现多采用提取纯化蛋白质的方法来对糖蛋白进行提取，针对性不强，步骤繁杂，且纯度较低。目前，虎奶菇中的活性成分研究虽然已经有许多报道，但是糖蛋白这一具有特殊功能活性的成分还鲜有涉及。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从虎奶菇菌核中制备糖蛋白的方法。
本发明所述方法包括以下步骤：
(1)将干燥的虎奶菇菌核粉碎、过筛，将过筛后的菌核粉末用乙酸乙酯脱脂，过滤，向滤渣中继续加入丙酮，继续脱脂，过滤，滤渣干燥后，即得脱脂后的虎奶菇菌核粉末；
(2)将脱脂后的菌核粉末分散到1％-5％质量浓度的NaCl溶液中，搅拌提取，提取结束后过滤除去滤液，水洗滤渣，以除去游离蛋白质和多糖等成分；
(3)将水洗后的滤渣以pH6.0-8.0的Tris-HCl缓冲液反复浸提，浸提结束后合并所得浸提液并过滤以除去不溶性残渣，得到糖蛋白粗提液，将所得粗提液进行浓缩；
(4)将上述浓缩后的提取液进行醇沉，并过滤除去沉淀物，再对上清液继续进行醇沉处理，弃去上清液，将沉淀物溶解、透析，将透析袋中截留的液体进行冷冻干燥，即得虎奶菇菌核糖蛋白。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，将干燥的虎奶菇菌核粉碎后，过40目筛。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，将过筛后的菌核粉末用5-10倍量的乙酸乙酯搅拌脱脂1-3h，过滤，向滤渣中继续加入3-5倍量的丙酮，搅拌脱脂1-3h，过滤，滤渣干燥后即得脱脂后的虎奶菇菌核粉末。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，搅拌脱脂过程在常温下进行。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，搅拌脱脂、过滤后的滤渣经过自然干燥得到脱脂后的虎奶菇菌核粉末。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，将脱脂后的菌核粉末分散到1％-5％质量浓度的NaCl溶液中，料液比1g：8-10mL，搅拌提取。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，搅拌提取结束后过滤除去滤液，并用去离子水将滤渣洗涤3-5次，以除去游离蛋白质和多糖等成分。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，将水洗后的滤渣以pH6.0-8.0的Tris-HCl缓冲液浸提，浸提所用温度为75-95℃，上述滤渣与缓冲液的料液比为1g：10-15mL，提取时间1-2h，浸提过程重复3次，结束后合并所得浸提液并过滤以除去不溶性残渣，得到糖蛋白粗提液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，将所得粗提液进行加热减压浓缩，采用温度不高于65℃，真空度不低于0.085MPa。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，将所得粗提液的体积浓缩至原体积的1/4-1/10。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，向经步骤(3)浓缩后的提取液中加入浓缩液1倍体积的95％乙醇，静置，过滤除去沉淀物；再向上清液中继续加入浓缩提取液2-4倍体积的95％乙醇，静置，弃去上清液，将沉淀物以水溶解后放入透析袋透析，透析后将透析袋中截留的液体进行冷冻干燥，即得虎奶菇菌核糖蛋白。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，透析袋的截流量为3500Da。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，将经过二次醇沉后得到的沉淀物以水溶解后加入截流量3500Da的透析袋中，去离子水透析间歇更换去离子水，透析后将透析袋中截留的液体进行冷冻干燥，即得虎奶菇菌核糖蛋白。
本发明针对食药用真菌虎奶菇中营养活性成分的研究现状，提供一类新的潜在活性成分——糖蛋白的制备方法，所得糖蛋白占菌核干重的5.8％，糖蛋白中总糖含量约为54％，总蛋白含量约为45％，不含游离多糖和大分子蛋白质。本发明所采用的方法工艺简单，易于实现，所用设备简便易得，不仅避免了直接采用分离纯化蛋白质所涉及的盐析、脱盐、柱层析等复杂步骤及设备，也大大缩短了制备时间。
附图说明
图1虎奶菇糖蛋白的SDS-PAGE图，注：1和2为同一样品在同一条件下跑胶后的图，1为跑完胶后用高碘酸-schiff碱法染色以检验其中的糖，2为跑完胶后用考马斯亮蓝法染色以检验其中的蛋白；条带I和条带II为样品中所含的糖蛋白组分，其分子量均在10-20kDa之间。
具体实施方式
实施例1
步骤一、将干燥的虎奶菇菌核通过磨粉机粉碎后，过40目筛。将过筛后的菌核粉末用5倍量的乙酸乙酯在常温下以150r/min转速搅拌脱脂3h，过滤，向滤渣中继续加入5倍量的丙酮，在常温下以150r/min转速搅拌脱脂3h，过滤，滤渣自然干燥，即得脱脂后的虎奶菇菌核粉末。
步骤二、将脱脂后的菌核粉末以缓冲液a(即5％质量浓度的NaCl溶液)以料液比1g：8mL的配比分散混合，在常温下搅拌提取，提取结束后过滤除去滤液，并用去离子水将滤渣洗涤5次，以除去游离蛋白质和多糖等成分。
步骤三、将上述残渣以pH7.0的缓冲液b(即Tris-HCl缓冲液)浸提，浸提所用温度为75℃，上述残渣与缓冲液的料液比为1g：15mL，提取时间1.5h，浸提过程重复3次，结束后合并所得浸提液并过滤以除去不溶性残渣，得到糖蛋白粗提液。将所得粗提液进行加热减压浓缩，采用温度55℃，真空度0.1MPa，将提取液体积浓缩至原体积的1/10。
步骤四、在上述浓缩后的提取液中加入浓缩液1倍体积的95％乙醇，静置5h后，过滤除去沉淀物1；再向上清液中继续加入浓缩提取液3倍体积的95％乙醇，静置8h，弃去上清液，将沉淀物2以水去离子水溶解后加入截流量3500Da的透析袋中，去离子水透析，每5h换一次去离子水，共换3-5次水，透析后将透析袋中截留的液体进行冷冻干燥，即得虎奶菇菌核糖蛋白。取40μg所得糖蛋白用上样液溶解后，平均分成两份，进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，所用胶浓度为4％浓缩胶和20％分离胶；电极缓冲液配制方法为：25mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％(w/v)SDS；110V电压进行电泳，电泳结束后，将同一块胶上的两条泳道分别切下，分别用高碘酸-schiff碱法染色和考马斯亮蓝法染色以检验其中的糖和蛋白，结果如图1。
经检测，所得糖蛋白占菌核干重的5.8％，糖蛋白中总糖含量约为54％，总蛋白含量约为45％。不含游离多糖和大分子蛋白质。其中，总糖和总蛋白的测定方法分别为苯酚-硫酸法和BCA法。游离多糖的测定：将所得糖蛋白用水溶解后，采用sevage法除蛋白，以苯酚-硫酸法测定除蛋白后的上清液中的糖含量。由图1中泳道2可见，所得样品中不含大分子蛋白质，除糖蛋白外，在10-15kDa间有一较深的蛋白条带。
实施例2
步骤一、将干燥的虎奶菇菌核通过磨粉机粉碎后，过40目筛。将过筛后的菌核粉末用8倍量的乙酸乙酯在常温下以150r/min转速搅拌脱脂2h，过滤，向滤渣中继续加入4倍量的丙酮，在常温下以150r/min转速搅拌脱脂2h，过滤，滤渣自然干燥，即得脱脂后的虎奶菇菌核粉末。
步骤二、将脱脂后的菌核粉末以缓冲液a(即3％质量浓度的NaCl溶液)以料液比1g：9mL的配比分散混合，在常温下搅拌提取，提取结束后过滤除去滤液，并用去离子水将滤渣洗涤4次，以除去游离蛋白质和多糖等成分。
步骤三、将上述残渣以pH6.0的缓冲液b(即Tris-HCl缓冲液)浸提，浸提所用温度为90℃，上述残渣与缓冲液的料液比为1g：12mL，提取时间1h，浸提过程重复3次，结束后合并所得浸提液并过滤以除去不溶性残渣，得到糖蛋白粗提液。将所得粗提液进行加热减压浓缩，采用温度60℃，真空度0.09MPa，将提取液体积浓缩至原体积的1/6。
步骤四、在上述浓缩后的提取液中加入浓缩液1倍体积的95％乙醇，静置5h后，过滤除去沉淀物1；再向上清液中继续加入浓缩提取液4倍体积的95％乙醇，静置6h，弃去上清液，将沉淀物2以水去离子水溶解后加入截流量3500Da的透析袋中，去离子水透析，每5h换一次去离子水，共换3-5次水，透析后将透析袋中截留的液体进行冷冻干燥，即得虎奶菇菌核糖蛋白。
经检测，所得糖蛋白占菌核干重的4.7％，不含游离多糖和大分子蛋白质。
实施例3
步骤一、将干燥的虎奶菇菌核通过磨粉机粉碎后，过40目筛。将过筛后的菌核粉末用10倍量的乙酸乙酯在常温下以150r/min转速搅拌脱脂1h，过滤，向滤渣中继续加入3倍量的丙酮，在常温下以150r/min转速搅拌脱脂1h，过滤，滤渣自然干燥，即得脱脂后的虎奶菇菌核粉末。
步骤二、将脱脂后的菌核粉末以缓冲液a(即1％质量浓度的NaCl溶液)以料液比1g：10mL的配比分散混合，在常温下搅拌提取，提取结束后过滤除去滤液，并用去离子水将滤渣洗涤3次，以除去游离蛋白质和多糖等成分。
步骤三、将上述残渣以pH8.0的缓冲液b(即Tris-HCl缓冲液)浸提，浸提所用温度为60℃，上述残渣与缓冲液的料液比为1g：10mL，提取时间2h，浸提过程重复3次，结束后合并所得浸提液并过滤以除去不溶性残渣，得到糖蛋白粗提液。将所得粗提液进行加热减压浓缩，采用温度65℃，真空度0.085MPa，将提取液体积浓缩至原体积的1/4。
步骤四、在上述浓缩后的提取液中加入浓缩液1倍体积的95％乙醇，静置5h后，过滤除去沉淀物1；再向上清液中继续加入浓缩提取液5倍体积的95％乙醇，静置5h，弃去上清液，将沉淀物2以水去离子水溶解后加入截流量3500Da的透析袋中，去离子水透析，每5h换一次去离子水，共换3-5次水，透析后将透析袋中截留的液体进行冷冻干燥，即得虎奶菇菌核糖蛋白。
经检测，所得糖蛋白占菌核干重的5.3％，不含游离多糖和大分子蛋白质。
实施例中所述方法均能对虎奶菇菌核中的糖蛋白起到良好的提取效果，所得糖蛋白中不含游离多糖等干扰成分。
为更好验证本发明所用方法对虎奶菇菌核糖蛋白的制备优势，又进行了几个对比实验。对比例中只简化或调整相应的制备步骤：
对比例1
在实施例1的基础上，省略步骤二，其余条件均同本发明实施例1，经检测，所得糖蛋白组分占菌核干重的9.4％，含有游离多糖32％，大分子蛋白质14％。
对比例2
在实施例1的基础上，将步骤三中的缓冲液以去离子水替换，其余条件均同本发明实施例1，经检测，所得糖蛋白组分占菌核干重的2.8％，不含游离多糖和大分子蛋白质。
对比例3
在实施例1的基础上，将步骤四改为：
在上述浓缩后的提取液中加入浓缩提取液3倍体积的95％乙醇，静置8h，弃去上清液，将沉淀物以水去离子水溶解后加入截流量3500Da的透析袋中，去离子水透析，每5h换一次去离子水，共换5次水，透析后将透析袋中截留的液体进行冷冻干燥，即得虎奶菇菌核糖蛋白。
其余条件均同本发明实施例1，经检测，所得糖蛋白组分占菌核干重的1.4％，含有游离多糖93％。
对比例方法所得糖蛋白产率低；和/或含有较多的多糖和/或蛋白质等大分子干扰组分，导致糖蛋白纯度较低。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (7)
1.一种制备虎奶菇菌核糖蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 将干燥的虎奶菇菌核粉碎、过筛，将过筛后的菌核粉末用乙酸乙酯脱脂，过滤，向滤渣中继续加入丙酮，继续脱脂，过滤，滤渣干燥后，即得脱脂后的虎奶菇菌核粉末；
(2) 将脱脂后的菌核粉末分散到3%-5%质量浓度的NaCl溶液中，料液比1 g：8-10 mL，搅拌提取，提取结束后过滤除去滤液，水洗滤渣，以除去游离蛋白质和多糖成分；
(3) 将水洗后的滤渣以pH6.0-8.0的Tris-HCl缓冲液反复浸提，浸提结束后合并所得浸提液并过滤以除去不溶性残渣，得到糖蛋白粗提液，将所得粗提液进行浓缩；
(4)向经步骤（3）浓缩后的提取液中加入浓缩液1倍体积的95%乙醇，静置，过滤除去沉淀物；再向上清液中继续加入浓缩提取液2-4倍体积的95%乙醇，静置，弃去上清液，将沉淀物以水溶解后放入透析袋透析，透析后将透析袋中截留的液体进行冷冻干燥，即得虎奶菇菌核糖蛋白；
步骤（3）中，将水洗后的滤渣以pH6.0-8.0的Tris-HCl缓冲液浸提，浸提所用温度为75-95℃，滤渣与缓冲液的料液比为1 g：10-15 mL，提取时间1-2 h，浸提过程重复3次，结束后合并所得浸提液并过滤以除去不溶性残渣，得到糖蛋白粗提液。
2.根据权利要求1所述的一种制备虎奶菇菌核糖蛋白的方法，其特征在于，步骤（1）中，将过筛后的菌核粉末用5-10倍量的乙酸乙酯搅拌脱脂1-3h，过滤，向滤渣中继续加入3-5倍量的丙酮，搅拌脱脂1-3h，过滤，滤渣干燥后即得脱脂后的虎奶菇菌核粉末。
3.根据权利要求1所述的一种制备虎奶菇菌核糖蛋白的方法，其特征在于，步骤（2）中，搅拌提取结束后过滤除去滤液，并用去离子水将滤渣洗涤3-5次，以除去游离蛋白质和多糖成分。
4.根据权利要求1所述的一种制备虎奶菇菌核糖蛋白的方法，其特征在于，步骤（3）中，将所得粗提液进行加热减压浓缩，采用温度不高于65℃，真空度不低于0.085 MPa。
5.根据权利要求1或4所述的一种制备虎奶菇菌核糖蛋白的方法，其特征在于，步骤（3）中，将所得粗提液的体积浓缩至原体积的1/4-1/10。
6.根据权利要求1所述的一种制备虎奶菇菌核糖蛋白的方法，其特征在于，步骤（4）中，透析袋的截流量为3500 Da。
7.根据权利要求1所述的一种制备虎奶菇菌核糖蛋白的方法，其特征在于，步骤（4）中，将经过二次醇沉后得到的沉淀物以水溶解后加入截流量3500 Da的透析袋中，去离子水透析间歇更换去离子水，透析后将透析袋中截留的液体进行冷冻干燥，即得虎奶菇菌核糖蛋白。
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