CN102382181B - 从香菇中提取具有抗氧化降血糖作用的活性蛋白的方法 - Google Patents

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章钰
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Abstract

本发明公开了一种从香菇中提取具有抗氧化降血糖作用的活性蛋白的方法，包括如下步骤：(1)粉碎香菇；(2)水提取香菇蛋白；(3)盐溶液提取香菇蛋白；(4)碱溶液提取香菇蛋白；(5)醇溶液提取香菇蛋白；(6)真空浓缩；(7)盐析；(8)透析；(9)冷冻干燥：将透析后的溶液分别冷冻干燥，分别得到香菇水溶性蛋白、香菇盐溶性蛋白、香菇碱溶性蛋白和香菇醇溶性蛋白。本发明与已有的直接使用碱法进行提取相比，样品的蛋白含量有了明显增加，而且由于不同溶剂的分级作用，使活性较高的蛋白得到富集，表现出的抗氧化和降血糖活性明显增强。本发明的制备过程简便，无毒，安全，收率高。

Description

从香菇中提取具有抗氧化降血糖作用的活性蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种从香菇中提取活性蛋白的方法，属于天然活性成分提取技术领域。
背景技术
香菇是一种生长在木材上的真菌，由于其营养丰富，素有“植物皇后”美誉。香菇性味甘、平、凉；入肝、胃经。有补肝肾、健脾胃、益气血、益智安神、美容颜之功效。还可化痰理气，益胃和中，解毒，抗肿瘤，托痘疹。主治食欲不振、身体虚弱、小便失禁、大便秘结、形体肥胖、肿瘤疮疡等病症。
据报道，鲜香菇除含水外，固形物中含粗蛋白，粗脂肪，粗纤维、灰分等。香菇中的化学成分主要有香菇多糖、香菇嘌呤、核酸、氨基酸、多种微量矿质元素和酶类物质、维生素等。可见，香菇蛋白在香菇中占有十分重要的地位。
相对于研究相对深入的香菇多糖，香菇蛋白的研究尚处初级阶段，已有的实验结果表明香菇蛋白对体外培养的癌细胞u14有直接的细胞毒作用，明显抑制肿瘤细胞的生长，而且在体外能直接杀伤肿瘤细胞，并可诱导肿瘤细胞凋亡。另外，香菇蛋白能明显延长荷瘤小鼠的生存期并对实体肿瘤有明显抑制作用，还能激活机体的免疫系统，提高巨噬细胞、细胞因子的作用效果，来实现其抗肿瘤作用。更多的实验表明，香菇蛋白能有效抑制苹果输纹褐腐病菌、灰霉病菌和落花生褐斑病菌的菌丝的生长，同时能够抑制HIV-1逆转录酶的活性和白血病细胞的增殖。
目前通常采用碱法直接提取的方法进行香菇蛋白的分离提取，但蛋白的得率活性均不十分理想，而且大量工业酒精的应用成为了香菇蛋白在食品领域应用的障碍。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种从香菇中提取具有抗氧化降血糖作用的活性蛋白的方法。
从香菇中提取具有抗氧化降血糖作用的活性蛋白的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)粉碎香菇；
(2)水提取香菇蛋白：将经粉碎的1质量份的香菇粉末加入到10质量份～20质量份的去离子水中，在1℃～10℃提取1小时～3小时，减压过滤，得到香菇水溶性蛋白提取液；并干燥滤渣；
(3)盐溶液提取香菇蛋白：将步骤(2)获得的滤渣加入到0.1M～0.2M的NaCl水溶液中，所述香菇与所述NaCl水溶液的比例为1g∶10ml～20ml，在1℃～10℃提取1小时～3小时，减压过滤，得到香菇盐溶性蛋白提取液；并干燥滤渣；
(4)碱溶液提取香菇蛋白：将步骤(3)获得的滤渣加入到0.05M～0.15M Na0H水溶液中，所述香菇与所述NaOH水溶液的比例为1g∶10ml～20ml，在1℃～10℃提取1小时～3小时，减压过滤，得到香菇碱溶性蛋白提取液；并干燥滤渣；
(5)醇溶液提取香菇蛋白：将步骤(4)获得的滤渣加入到体积浓度为70％～80％的乙醇水溶液中，所述香菇与所述乙醇水溶液的比例为1g∶10ml～20ml，在1℃～10℃提取1小时～3小时，减压过滤，得到香菇醇溶性蛋白提取液；
(6)真空浓缩：在40℃～60℃和0.06MPa～0.1MPa的压力下将步骤(2)～(5)分别得到的蛋白提取液分别置于旋转蒸发仪中减压浓缩至原体积的1/10～1/5；
(7)盐析：向步骤(6)所获得的各个蛋白提取液的浓缩液中，加入硫酸铵，使硫酸铵在所述各个浓缩液中的质量分数为45％～55％，1℃～10℃静置18小时～24小时，在3000转/分～4000转/分的转速下离心分离15分钟～30分钟，分别收集各沉淀物；
(8)透析：将步骤(7)获得的各沉淀物分别加水使其完全溶解，分别加入到透析袋中，在蒸馏水中透析24小时～48小时，在透析期间换蒸馏水3次～5次；
(9)冷冻干燥：将透析后的溶液分别冷冻干燥，分别得到香菇水溶性蛋白、香菇盐溶性蛋白、香菇碱溶性蛋白和香菇醇溶性蛋白。
本发明的与现有提取方法的最大区别在于本发明先用粉碎机对香菇进行粉碎，以使提取过程更加充分；然后通过使用不同极性的溶剂对香菇中的蛋白进行提取，并利用盐析的方法对其中的蛋白进行分离。与已有的直接使用碱法进行提取，样品的蛋白含量有了明显增加，而且由于不同溶剂的分级作用，使活性较高的蛋白得到富集，表现出的抗氧化和降血糖活性明显增强。另外，本法所采取的第一步水提后得到的溶液可以继续利用分离得到香菇多糖，而得到的其他样品中蛋白含量也相对较高，可以留作他用。
本发明的制备过程简便，无毒，安全，收率高。
附图说明
图1为本发明的方法获得的香菇水溶性蛋白、香菇碱溶性蛋白和已有技术(碱法直接提取)的蛋白产品的DPPH自由基清除能力。
图2为本发明的方法获得的香菇水溶性蛋白、香菇碱溶性蛋白和已有技术(碱法直接提取)的蛋白产品的总还原力测定。
图3为本发明的方法获得的香菇水溶性蛋白、香菇碱溶性蛋白和已有技术(碱法直接提取)的蛋白产品的α-淀粉酶抑制活性。
图4为从香菇中提取具有抗氧化降血糖作用的活性蛋白的方法的制备流程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
从香菇中提取具有抗氧化降血糖作用的活性蛋白的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)粉碎香菇；
(2)水提取香菇蛋白：将经粉碎的1质量份的香菇粉末加入到15质量份的去离子水中，在4℃下提取2小时，减压过滤，得到香菇水溶性蛋白提取液；并干燥滤渣；
(3)盐溶液提取香菇蛋白：将步骤(2)获得的滤渣加入到0.2M的NaCl水溶液中，所述香菇与所述NaCl水溶液的比例为1g∶15ml，在4℃提取2小时，减压过滤，得到香菇盐溶性蛋白提取液；并干燥滤渣；
(4)碱溶液提取香菇蛋白：将步骤(3)获得的滤渣加入到0.10M NaOH水溶液中，所述香菇与所述NaOH水溶液的比例为1g∶15ml，在4℃提取2小时，减压过滤，得到香菇碱溶性蛋白提取液；并干燥滤渣；
(5)乙醇提取香菇蛋白：将步骤(4)获得的滤渣加入到体积浓度为75％的乙醇水溶液中，所述香菇与所述乙醇水溶液的比例为1g∶15ml，在4℃提取2小时，减压过滤，得到香菇醇溶性蛋白提取液；
(6)真空浓缩：在50℃和0.09MPa的压力下将步骤(2)～(5)分别得到的蛋白提取液分别置于旋转蒸发仪中减压浓缩至原体积的1/8；
(7)盐析：向步骤(6)所获得的各个蛋白提取液的浓缩液中，加入硫酸铵，使硫酸铵在所述各个浓缩液中的质量分数为50％，4℃静置20小时，在3500转/分的转速下离心分离20分钟，分别收集各沉淀物；
(8)透析：将步骤(7)获得的各沉淀物分别加水使其完全溶解，分别加入到透析袋中，在蒸馏水中透析36小时，在透析期间换蒸馏水4次；
(9)冷冻干燥：将透析后的溶液分别冷冻干燥分别得到香菇水溶性蛋白、香菇盐溶性蛋白、香菇碱溶性蛋白和香菇醇溶性蛋白。
实施例2
从香菇中提取具有抗氧化降血糖作用的活性蛋白的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)粉碎香菇；
(2)水提取香菇蛋白：将经粉碎的1质量份的香菇粉末加入到15质量份的去离子水中，在5℃提取2小时，减压过滤，得到香菇水溶性蛋白提取液；并干燥滤渣；
(3)盐溶液提取香菇蛋白：将步骤(2)获得的滤渣加入到0.1M的NaCl水溶液中，所述香菇与所述NaCl水溶液的比例为1g∶15ml，在5℃提取2小时，减压过滤，得到香菇盐溶性蛋白提取液；并干燥滤渣；
(4)碱溶液提取香菇蛋白：将步骤(3)获得的滤渣加入到0.10M NaOH水溶液中，所述香菇与所述NaOH水溶液的比例为1g∶15ml，在5℃提取2小时，减压过滤，得到香菇碱溶性蛋白提取液；并干燥滤渣；
(5)乙醇提取香菇蛋白：将步骤(4)获得的滤渣加入到体积浓度为75％的乙醇水溶液中，所述香菇与乙醇水溶液的比例为1g∶15ml，在5℃提取2小时，减压过滤，得到香菇醇溶性蛋白提取液；
(6)真空浓缩：在50℃和0.08MPa的压力下将步骤(2)～(5)分别得到的蛋白提取液分别置于旋转蒸发仪中减压浓缩至原体积的1/10；
(7)盐析：向步骤(6)所获得的各个蛋白提取液的浓缩液中，加入硫酸铵，使硫酸铵在所述各个浓缩液中的质量分数为50％，5℃静置20小时，在3500转/分的转速下离心分离20分钟，分别收集各沉淀物；
(8)透析：将步骤(7)获得的各沉淀物分别加水使其完全溶解，分别加入到透析袋中，在蒸馏水中透析36小时，在透析期间换蒸馏水4次；
(9)冷冻干燥：将透析后的溶液分别冷冻干燥分别得到香菇水溶性蛋白、香菇盐溶性蛋白、香菇碱溶性蛋白和香菇醇溶性蛋白。
实施例3
从香菇中提取具有抗氧化降血糖作用的活性蛋白的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)粉碎香菇；
(2)水提取香菇蛋白：将经粉碎的1质量份的香菇粉末加入到20质量份的去离子水中，在1℃提取3小时，减压过滤，得到香菇水溶性蛋白提取液；并干燥滤渣；
(3)盐溶液提取香菇蛋白：将步骤(2)获得的滤渣加入到0.2M的NaCl水溶液中，所述香菇与所述NaCl水溶液的比例为1g∶20ml，在1℃提取3小时，减压过滤，得到香菇盐溶性蛋白提取液；并干燥滤渣；
(4)碱溶液提取香菇蛋白：将步骤(3)获得的滤渣加入到0.15M NaOH水溶液中，所述香菇与所述NaOH水溶液的比例为1g∶20ml，在1℃提取3小时，减压过滤，得到香菇碱溶性蛋白提取液；并干燥滤渣；
(5)乙醇提取香菇蛋白：将步骤(4)获得的滤渣加入到体积浓度为80％的乙醇水溶液中，所述香菇与所述乙醇水溶液的比例为1g∶20ml，在1℃提取3小时，减压过滤，得到香菇醇溶性蛋白提取液；
(6)真空浓缩：在55℃和0.09MPa的压力下将步骤(2)～(5)分别得到的蛋白提取液分别置于旋转蒸发仪中减压浓缩至原体积的1/5；
(7)盐析：向步骤(6)所获得的各个蛋白提取液的浓缩液中，加入硫酸铵，使硫酸铵在所述各个浓缩液中的质量分数为55％，1℃静置24小时，在4000转/分的转速下离心分离15分钟，分别收集各沉淀物；
(8)透析：将步骤(7)获得的各沉淀物分别加水使其完全溶解，分别加入到透析袋中，在蒸馏水中透析48小时，在透析期间换蒸馏水3次；
(9)冷冻干燥：将透析后的溶液分别冷冻干燥分别得到香菇水溶性蛋白、香菇盐溶性蛋白、香菇碱溶性蛋白和香菇醇溶性蛋白。
实施例4
从香菇中提取具有抗氧化降血糖作用的活性蛋白的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)粉碎香菇；
(2)水提取香菇蛋白：将经粉碎的1质量份的香菇粉末加入到10质量份的去离子水中，在10℃提取1小时，减压过滤，得到香菇水溶性蛋白提取液；并干燥滤渣；
(3)盐溶液提取香菇蛋白：将步骤(2)获得的滤渣加入到0.15M的NaCl水溶液中，所述香菇与所述NaCl水溶液的比例为1g∶10ml，在10℃提取1小时，减压过滤，得到香菇盐溶性蛋白提取液；并干燥滤渣；
(4)碱溶液提取香菇蛋白：将步骤(3)获得的滤渣加入到0.05M NaOH水溶液中，所述香菇与所述NaOH水溶液的比例为1g∶10ml，在10℃提取1小时，减压过滤，得到香菇碱溶性蛋白提取液；并干燥滤渣；
(5)乙醇提取香菇蛋白：将步骤(4)获得的滤渣加入到体积浓度为70％的乙醇水溶液中，所述香菇与所述乙醇水溶液的比例为1g∶10ml，在10℃提取1小时，减压过滤，得到香菇醇溶性蛋白提取液；
(6)真空浓缩：在60℃和0.1MPa的压力下将步骤(2)～(5)分别得到的蛋白提取液分别置于旋转蒸发仪中减压浓缩至原体积的1/10；
(7)盐析：向步骤(6)所获得的各个蛋白提取液的浓缩液中，加入硫酸铵，使硫酸铵在所述各个浓缩液中的质量分数为45％，10℃静置18小时，在3000转/分的转速下离心分离30分钟，分别收集各沉淀物；
(8)透析：将步骤(7)获得的各沉淀物分别加水使其完全溶解，分别加入到透析袋中，在蒸馏水中透析24小时，在透析期间换蒸馏水5次；
(9)冷冻干燥：将透析后的溶液分别冷冻干燥分别得到香菇水溶性蛋白、香菇盐溶性蛋白、香菇碱溶性蛋白和香菇醇溶性蛋白。
表1与表2显示的是各实施例的提取结果及与现有方法(碱法直接提取)的比较。
表1本方法各实施例与现有方法得到的香菇蛋白的得率(％)比较
Figure BDA0000099512210000051
表2本方法各实施例与现有方法得到的香菇蛋白的蛋白含量(％)比较
Figure BDA0000099512210000061
实施例5
清除DPPH自由基实验所使用的香菇蛋白分别为实施例1制备的水溶性蛋白和碱溶性蛋白，并与现有方法所获得的香菇蛋白(碱法直接提取)进行了对比，实验结果见图1：
由上述实验结果可以看出，与现有方法相比，利用本发明方法所获得的香菇碱溶性蛋白对DPPH自由基的清除能力得到增强。
同时，本发明人也对蛋白样品的总还原力进行了测定实验结果见图2：
由图2可以看出，本发明方法所得到的香菇水溶性蛋白和碱溶性蛋白的还原能力均优于现有方法所提取的，其中碱溶性蛋白的还原能力有了大幅提高。
最后本发明人还对香菇蛋白的降血糖能力进行了研究，结果见图3：
通过分步提取，香菇蛋白中具降血糖活性的部分得到充分富集，碱溶性蛋白的α-淀粉酶抑制活性远远高于现有方法所提取的香菇蛋白。

Claims (1)

1.一种从香菇中提取蛋白的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）粉碎香菇；
（2）水提取香菇蛋白：将经粉碎的1质量份的香菇粉末加入到10质量份～20质量份的去离子水中，在1℃～10℃提取1小时～3小时，减压过滤，得到香菇水溶性蛋白提取液；并干燥滤渣；
（3）盐溶液提取香菇蛋白：将步骤（2）获得的滤渣加入到0.1M～0.2M的NaCl水溶液中，所述步骤（2）的滤渣与所述NaCl水溶液的比例为1g：10mL～20mL，在1℃～10℃提取1小时～3小时，减压过滤，得到香菇盐溶性蛋白提取液；并干燥滤渣；
（4）碱溶液提取香菇蛋白：将步骤（3）获得的滤渣加入到0.05M～0.15M NaOH水溶液中，所述步骤（3）的滤渣与所述NaOH水溶液的比例为1g：10mL～20mL，在1℃～10℃提取1小时～3小时，减压过滤，得到香菇碱溶性蛋白提取液；并干燥滤渣；
（5）醇溶液提取香菇蛋白：将步骤（4）获得的滤渣加入到体积浓度为70%～80%的乙醇水溶液中，所述步骤（4）的滤渣与所述乙醇水溶液的比例为1g：10mL～20mL，在1℃～10℃提取1小时～3小时，减压过滤，得到香菇醇溶性蛋白提取液；
（6）真空浓缩：在40℃～60℃和0.06MPa～0.1MPa的压力下将步骤（2）～（5）分别得到的蛋白提取液分别置于旋转蒸发仪中减压浓缩至原体积的1/10～1/5；
（7）盐析：向步骤（6）所获得的各个蛋白提取液的浓缩液中，加入硫酸铵，使硫酸铵在所述各个浓缩液中的质量分数为45%～55%，1℃～10℃静置18小时～24小时，在3000转/分～4000转/分的转速下离心分离15分钟～30分钟，分别收集各沉淀物；
（8）透析：将步骤（7）获得的各沉淀物分别加水使其完全溶解，分别加入到透析袋中，在蒸馏水中透析24小时～48小时，在透析期间换蒸馏水3次～5次；
（9）冷冻干燥：将透析后的溶液分别冷冻干燥，分别得到香菇水溶性蛋白、香菇盐溶性蛋白、香菇碱溶性蛋白和香菇醇溶性蛋白；所述香菇水溶性蛋白和/或香菇碱溶性蛋白具有抗氧化降血糖的作用活性。
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Assignor: Tianjin University

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Denomination of invention: Method for extracting active proteins with antioxidant and hypoglycemic functions from mushrooms

Granted publication date: 20130306

License type: Exclusive License

Record date: 20130626

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