CN101366729A - 一种骨肽提取物的制备方法及其产品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种骨肽提取物的制备方法，包括以下步骤：(1)将猪四肢骨破碎后加水热压提取；提取液浓缩，得浓缩液，备用；(2)酸沉：向浓缩液中加入稀盐酸进行酸沉；(3)碱沉：将酸沉液过滤，向滤液中加入碱液进行碱沉；(4)醇沉：将碱沉液过滤，向滤液中加入稀盐酸，减压浓缩后，冷却，加入乙醇，0－5℃静置12h以上，得药液，备用；(5)超滤：将步骤(4)所得药液超滤，收集超滤液，将超滤液混合均匀，即得。本发明方法将猪四肢骨提取后进行浓缩，方便生产，降低成本；分别采用酸沉、碱沉、醇沉去除酸性蛋白、碱性蛋白和中性蛋白，提高了超滤速度；采用超滤，保证杂蛋白的彻底去除，有效控制高分子量物质。保证临床安全性。
Description
技术领域
本发明涉及一种骨肽提取物的制备方法以及由该方法制备得到的产品，属于生物制药领域。
背景技术
骨肽注射液来源为骨宁注射液，在骨宁注射液的质量标准中详细阐述了其制备方法，在中国医药出版社出版的《生化药物学》中也阐述了骨宁注射液的制备方法，骨宁注射液是以猪四肢骨为原料，制备方法中加入了苯酚、滑石粉和活性炭。
目前，已公开了一些有关骨肽的提取工艺，多数工艺仅采取酸、碱分别沉淀酸性蛋白和碱性蛋白的工艺，也有用树脂柱吸附除杂的方法。
公开号为CN 1831001A(发明名称：一种骨肽提取物、其制备方法及其用途)的中国专利申请公开了一种骨肽提取物的制备方法，该方法将哺乳动物四肢骨经热压提取，冷藏去脂肪、调节pH值、沉淀，加热，离心过滤、超滤等步骤制得四肢骨提取物。该制备过程中加入了苯酚抑菌剂，而骨肽注射液的用法用量为静脉滴注，一次10-20ml，中华人民共和国药典2005年版二部注射剂项下要求：一次注射量超过15ml的注射液，不得加抑菌剂。
公开号为CN 1939342A(发明名称：注射用骨肽冻干剂及其制备方法)的中国专利申请公开了一种骨肽冻干剂的制备方法，其包括：(1)取健康新鲜冷冻的哺乳动物的四肢骨称重，用纯化水清洗三遍后，置液压机上压碎。将压碎的四肢骨，置夹层锅中，按原料重量1：1-5加入5％NaOH溶液，加热30-55℃水解12-48小时后取上清液；(2)上清液置夹层锅中用HCl调pH值3.0-6.0，加热至70-100℃，加热15-40min，冷却降温至30-55℃，静置12-48小时后用滤布过滤。该制备方法中采用碳吸附，能够有效去除热原性物质，但是不能有效去除高分子量物质，易产生过敏反应，不能保证临床用药安全性。
公开号为CN 101062403A(发明名称：一种骨肽注射剂的制备方法)的中国专利申请公开了一种骨肽注射剂的制备方法，其包括：将猪或牛的四肢骨，洗净，打碎，提取，冷藏，去上层油脂，酸沉，煮沸，冷藏，过滤，浓缩，酸沉，静置，过滤，稀配，调中性，过滤，超滤，灭菌，冷冻缓化，放置，过滤，超滤，调pH值，加活性炭，煮沸，过滤，调pH值，灭菌，缓化，粗滤，精滤。
该制备工艺的酸沉pH值范围不能有效去除酸性蛋白及中性蛋白导致过敏反应，影响产品质量，或工艺路线复杂，不适合大生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的制备骨肽提取物的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种骨肽提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将猪四肢骨破碎后加水热压提取；提取液浓缩，得浓缩液，备用；
(2)酸沉：向浓缩液中加入稀盐酸进行酸沉，得酸沉液；
(3)碱沉：将酸沉液过滤，向滤液中加入碱液进行碱沉，得碱沉液；
(4)醇沉：将碱沉液过滤，向滤液中加入稀盐酸，减压浓缩后，冷却，不断搅拌下加入乙醇，0-5℃静置12h以上，得药液，备用；
(5)超滤：将步骤(4)所得到药液超滤，收集超滤液，将超滤液混合均匀，即得。
上述制备方法中，为了达到更好的技术效果，步骤(1)中所述的加水热压提取优选是：加入原料2-3倍重量的水(更优选为2倍重量)，压力控制在0.11-0.12mPa，热压提取两次，每次提取0.5-1.5小时(更优选为1小时)；相应的在进行浓缩时，首先将两次提取液分别浓缩至原料重量的50±2％，再合并浓缩液，去掉上层油脂，继续浓缩至原料重量的60％-70％，冷却至室温；
步骤(2)中所述的酸沉优选为：向浓缩液中加入稀盐酸至pH值1.5-3.0，100℃保温30-60分钟(更优选为45分钟)，冷却至室温，0-5℃静置12h以上；其中，所述的稀盐酸优选为纯化水与36～38％盐酸按1:1体积比配制而成；
步骤(3)中所述的碱沉优选为：酸沉液过滤，向滤液中加入碱液至pH值为8.5-9.5，100℃保温30-60分钟(更优选为45分钟)，冷却至室温，0-5℃静置12h以上；其中，所述的碱液优选为20％氢氧化钠；
步骤(4)中所述的醇沉优选为：碱沉液过滤，向滤液中加入稀盐酸(纯化水与36-38％盐酸按体积比配制)至pH值6.5-7.0，减压浓缩至原料重量的25％-30％，冷却至50-70℃，不断搅拌下加入乙醇，使含醇量达到70％，0-5℃静置12h以上；
步骤(5)中所述的超滤优选在以下条件进行超滤：截流分子量为10KDa的中空纤维柱进行超滤，工作压力不高于0.1Mpa；
与现有的骨肽提取物的制备方法相比，本发明制备方法的主要优点如下：
1.本发明方法将猪四肢骨提取后进行浓缩，减少提取液的体积，为后续的酸沉、碱沉、醇沉等工艺减少了操作难度，方便生产，降低成本。2.本发明方法分别采用酸沉、碱沉、醇沉去除酸性蛋白、碱性蛋白和中性蛋白，并提高了超滤速度。3.本发明方法采用超滤技术，保证杂蛋白的彻底去除，有效控制高分子量物质。保证临床安全性。
本发明方法所制备得到的骨肽提取物可用于制备骨肽注射液或注射用骨肽。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1、提取：将破碎后猪四肢骨的物料投入提取罐，加入投料重量2倍的纯化水，热压提取，压力控制在0.11-0.12mPa，热压提取两次，每次1小时；
2、浓缩：将热压提取后所得的药液浓缩，滤液先分别浓缩至原料重量的50％±2％；
3、酸沉：再合并浓缩液，去上层油脂，继续浓缩至原料重量的60％，冷却至室温；用1:1盐酸(纯化水与36-38％盐酸按体积比配制)调pH值至1.5，100℃保温45分钟，冷却至室温，0-5℃静置12h以上；
4、碱沉：酸沉液过滤，滤液用20％氢氧化钠调pH值至8.5，100℃保温45分钟，冷却至室温，0-5℃静置12h以上；
5、醇沉：碱沉液过滤，滤液用1:1盐酸(纯化水与36-38％盐酸按体积比配制)调pH至6.5，减压浓缩至原料量的25％，冷却至50℃，不断搅拌下加入乙醇，使含醇量达到70％，0-5℃静置12h以上；
6、超滤：将药液用截流分子量为10KDa的中空纤维柱进行超滤，工作压力不高于0.1Mpa；收集超滤液。将超滤液混合均匀，冷冻存放，备用。
实施例2
1、提取：将破碎后猪四肢骨的物料投入提取罐，加入投料重量2倍的纯化水，热压提取，压力控制在0.11-0.12mPa，热压提取两次，每次1小时；
2、浓缩：将热压提取后所得的药液浓缩，滤液先分别浓缩至原料重量的50％±2％；
3、酸沉：再合并浓缩液，去上层油脂，继续浓缩至原料重量的70％，冷却至室温；用1:1盐酸(纯化水与36-38％盐酸按体积比配制)调pH值至3.0，100℃保温45分钟，冷却至室温，0-5℃静置12h以上；
4、碱沉：酸沉液过滤，滤液用20％氢氧化钠调pH值至9.5，100℃保温45分钟，冷却至室温，0-5℃静置12h以上；
5、醇沉：碱沉液过滤，滤液用1:1盐酸(纯化水与36-38％盐酸按体积比配制)调pH至7.0，减压浓缩至原料量的30％，冷却至70℃，不断搅拌下加入乙醇，使含醇量达到70％，0-5℃静置12h以上；
6、超滤：将药液用截流分子量为10KDa的中空纤维柱进行超滤，工作压力不高于0.1Mpa；收集超滤液。将超滤液混合均匀，冷冻存放，备用。
实施例3
1、提取：将破碎后猪四肢骨的物料投入提取罐，加入投料重量3倍的纯化水，热压提取，压力控制在0.11-0.12mPa，热压提取两次，每次1小时；
2、浓缩：将热压提取后所得的药液浓缩，滤液先分别浓缩至原料重量的50％±2％；
3、酸沉：再合并浓缩液，去上层油脂，继续浓缩至原料重量的65％，冷却至室温；用1:1盐酸(纯化水与36-38％盐酸按体积比配制)调pH值至2.0，100℃保温60分钟，冷却至室温，0-5℃静置12h以上；
4、碱沉：酸沉液过滤，滤液用20％氢氧化钠调pH值至9.0，100℃保温60分钟，冷却至室温，0-5℃静置12h以上；
5、醇沉：碱沉液过滤，滤液用1:1盐酸(纯化水与36-38％盐酸按体积比配制)调pH至7.0，减压浓缩至原料重量的28％，冷却至60℃，不断搅拌下加入乙醇，使含醇量达到70％，0-5℃静置12h以上；
6、超滤：将药液用截流分子量为10KDa的中空纤维柱进行超滤，工作压力不高于0.1Mpa；收集超滤液。将超滤液混合均匀，冷冻存放，备用。
Claims (10)
1.一种骨肽提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将猪四肢骨破碎后加水热压提取；提取液浓缩，得浓缩液，备用；
(2)酸沉：向步骤(1)所得到的浓缩液中加入稀盐酸进行酸沉，得酸沉液；
(3)碱沉：将酸沉液过滤，向滤液中加入碱液进行碱沉，得碱沉液；
(4)醇沉：将碱沉液过滤，向滤液中加入稀盐酸，减压浓缩后，冷却，加入乙醇，0-5℃静置12h以上，得药液，备用；
(5)超滤：将步骤(4)所得到药液超滤，收集超滤液，将超滤液混合均匀，即得。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的加水热压提取是：加入原料2-3倍重量的水，将压力控制在0.11-0.12mPa，热压提取两次，每次提取0.5-1.5小时；将提取液分别浓缩后合并，再继续浓缩后冷却至室温。
3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：将两次提取液分别浓缩至原料重量的50±2％，再合并浓缩液，去掉上层油脂，继续浓缩至原料重量的60％-70％后冷却至室温。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的酸沉为：向浓缩液中加入稀盐酸至pH值1.5-3.0，100℃保温30-60分钟，冷却至室温，0-5℃静置12h以上。
5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的碱沉为：将酸沉液过滤，向滤液中加入碱液至pH值为8.5-9.5，100℃保温30-60分钟，冷却至室温，0-5℃静置12h以上。
6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的碱液为20％氢氧化钠溶液。
7.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的醇沉为：碱沉液过滤，向滤液中加入稀盐酸至pH值6.5-7.0，减压浓缩至原料重量的25％-30％，冷却至50-70℃，不断搅拌下加入乙醇，使含醇量达到70％，0-5℃静置12h以上。
8.按照权利要求4或7所述的制备方法，其特征在于：所述的稀盐酸为纯化水与36-38％盐酸按1:1体积比配制而成。
9.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述的超滤在以下条件进行：采用截流分子量为10KDa的中空纤维柱进行超滤，工作压力不高于0.1Mpa。
10.由权利要求1-7任何一项所述制备方法得到的产品。
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