CN101712726B - 一种高纯度桑叶多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高纯度桑叶多糖的制备方法,所述的方法以桑树的叶为原料,采用微波法辅助提取桑叶多糖,并通过响应面优化得到最佳桑叶多糖提取工艺条件,桑叶多糖粗体液经萃取和凝聚沉淀后去除了杂质色素和蛋白质,再通过超滤、醇沉、干燥后得到了高纯度桑叶多糖,产品中桑叶多糖的含量在60%以上。本发明的有益效果为:该方法过程简单、重现性好、操作时间短、溶剂消耗少、绿色环保,桑叶多糖提取率高,产品纯度高,具有较好的应用前景。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种高纯度桑叶多糖的制备方法。
(二)背景技术
桑叶为桑科植物桑树(Morus alba L.)的叶,是我国卫生部批准的药食两用原料,具有降血糖、降血压、降血脂等作用。现代药理学实验表明,桑叶多糖可以通过多靶点途径抑制α-葡萄糖苷酶活性和促进胰腺α-细胞分泌胰岛素,具有预防和治疗糖尿病的作用。我国每年桑叶产量达1000万吨,除了用于养蚕之外,约有250万吨因过剩而浪费。为了开发桑叶资源和生产天然降血糖保健品、药品,利用现代分离技术提取桑叶多糖具有重要的意义。
目前国内外关于桑叶多糖的提取分离研究主要是通过提取手段和工艺的改进来提高其得率,而对桑叶多糖的纯化方面研究相对甚少。张琳华等通过正交实验得到桑叶多糖的最佳提取工艺为蒸馏水∶原料(质量比)=10∶1,提取温度70℃,提取时间1.5h,提取次数2次;醇沉最佳工艺为乙醇体积分数80%,料液浓度1mL/g生药,pH值为4;刘学军等利用超声波方法提取桑叶多糖,通过正交实验得到提取的最佳工艺条件为原料80目,超声波功率50W,提取温度85℃,提取时间2.5h,得率达2.5%。这些方法虽然应用较广,但提取温度高、时间长,对桑叶多糖分子结构造成一定破坏作用。凌庆枝等采用超高压技术提取桑叶多糖,考察了压力、保压时间、pH和料液比(W∶V)对桑叶多糖提取率的影响,实验结果表明在超高压300MPa、保压4.5min、pH9.0、料液比1∶16条件下,桑叶多糖的提取率达到最高,但该法不适于连续生产,产量低,具有一定弊端。在专利方面,广东农业科学院蚕业研究所《一种桑叶多糖产品及其用途》、天津大学《从桑叶中连续提取生物碱、黄酮和多糖活性成分的方法》、浙江工商大学《一种从桑叶中提取黄酮、多糖的方法》和江苏科技大学《一种联产桑叶黄酮、多糖和生物碱的复合提取工艺》四个发明专利中,主要采用了热水法和超声波法提取桑叶多糖,但在提取桑叶多糖之前进行了预处理,即有机溶剂提取桑叶黄酮类物质,再利用大孔树脂和离子交换树脂进行桑叶多糖纯化,溶剂消耗大,成本高,提取时间长、提取温度高,桑叶多糖得率低、纯度低,工艺条件为:提取时间1h-2h、提取温度60℃-100℃、料液比1∶10-1∶50,桑叶多糖得率1.5%-2.5%,产品纯度仅为30%-50%。
微波法作为一种现代分离提取技术已广泛应用于中药和食品领域,具有设备简单易得、能耗低、适用范围广、提取效率高、重现性好、污染小等特点,而其在桑叶多糖提取方面还没有报道,所以本项目采用微波法辅助提取桑叶多糖,并通过响应面优化得到最佳提取工艺条件。桑叶多糖粗体液经萃取技术和聚集沉淀技术分别去除色素、蛋白质后,利用超滤技术进行浓缩,再通过醇沉、干燥得到高纯度桑叶多糖。
(三)发明内容
为了克服桑叶多糖提取工艺温度高、时间长、纯度低、产量低、溶剂消耗大等缺点,本发明提供了一种高纯度的桑叶多糖的制备工艺。
本发明采用以下技术方案制备高纯度桑叶多糖:
一种桑叶多糖的制备方法,所述的方法以桑树的叶为原料,按以下步骤进行:
(1)取桑树经风干的桑叶,粉碎得40目-80目桑叶粗粉;
(2)取桑叶粗粉用去离子水浸泡,桑叶粗粉与去离子水的质量比为1∶10-30,加碱调节pH值至7-10,再于微波条件下提取3min-10min,微波功率300W-800W,优选为650W-750W过滤收集滤液,滤饼重复提取,共提取2-5次,合并每次的滤液收集为提取液;
(3)将步骤(2)所得的提取液,加酸调节pH值至2-5,再加入乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯与提取液的体积比为1∶2-4,搅拌后静置、分层,保留收集下层,重复用乙酸乙酯萃取2-5次,合并所有的下层收集为保留液;
(4)将步骤(3)的保留液用三氯乙酸溶液调节pH值至2-3,降低温度至4℃-10℃,搅拌、静置8h-12h后,离心,除去沉淀物,收集上清液;
(5)将步骤(4)所得的上清液超滤浓缩至浓缩液中多糖质量浓度为5%-1.5%,所述超滤截留分子量为5000D-10000D,浓缩液中加入体积浓度为95%-100%乙醇水溶液至乙醇体积分数为70%-80%,降温至4℃-10℃,搅拌、静置12h-18h后,离心,收集沉淀物;
(6)取步骤(5)所得的沉淀物,经减压低温干燥、粉碎,即得桑叶多糖产品。
进一步,所述的桑叶多糖的制备方法优选步骤(2)所述的碱为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或氨水,浓度通常为1M。
本发明推荐步骤(3)所述的酸为盐酸溶液或硫酸溶液。所用的盐酸溶液或硫酸溶液的浓度通常为1M。
步骤(4)三氯乙酸溶液质量浓度为10%-20%。步骤(4)所述的离心转速5000rpm-10000rpm。
再进一步,本发明所述的桑叶多糖的制备方法,步骤(6)所述的沉淀物在减压低温干燥以前先推荐以无水乙醇洗涤后再进行减压低温干燥。
做为优选,步骤(6)所述的减压低温干燥条件为在40℃-60℃,真空度低于-0.085MPa,通常在-0.1MPa~-0.085MPa真空条件下,干燥12-18h。
更进一步,步骤(2)于微波功率为650W-750W条件下提取3min-5min,过滤收集滤液,滤饼重复提取,共提取2-5次,合并每次的滤液收集为提取液。
具体的,所述的桑叶多糖的制备方法,以桑树的叶为原料,按以下步骤进行:
(1)取桑树经风干的桑叶,粉碎得40目-80目桑叶粗粉;
(2)取桑叶粗粉用去离子水浸泡,桑叶粗粉与去离子水的质量比为1∶10-30,加1M氢氧化钠溶液调节pH值至8.5,再于微波条件下提取3min-5min,微波功率650W-750W,过滤收集滤液,滤饼重复提取,共提取2-5次,合并每次的滤液收集为提取液;
(3)将步骤(2)所得的提取液,加1M盐酸调节pH值至2-5,再加入乙酸乙酯萃取,所述的乙酸乙酯与提取液的体积比为1∶2-4,搅拌后静置、分层,保留收集下层,重复用乙酸乙酯萃取2-5次,合并所有的下层收集为保留液;
(4)将步骤(3)的保留液用质量浓度为10%-20%的三氯乙酸溶液调节pH值至2-3,降低温度至4℃-10℃,搅拌、静置8h-12h后,离心,除去沉淀物,收集上清液;
(5)将步骤(4)所得的上清液超滤浓缩至浓缩液中多糖质量浓度为5%-15%,超滤膜截留分子量为5000D-10000D,浓缩液中加入体积浓度为95%的乙醇水溶液至乙醇体积分数为70%-80%,降温至4℃-10℃,搅拌、静置12h-18h后,5000rpm-10000rpm离心,收集沉淀物;
(6)取步骤(5)所得的沉淀物,用无水乙醇洗涤后低温减压干燥,通常在40℃-60℃、0.085MPa条件下减压干燥12h-18h,干燥至含水量低于10%,粉碎至60目-100目,即得桑叶多糖产品。
本发明采用微波法辅助提取桑叶多糖,并通过响应面优化得到最佳桑叶多糖提取工艺条件,桑叶多糖粗体液经萃取和凝聚沉淀后去除了杂质色素和蛋白质,再通过超滤、醇沉、干燥后得到了高纯度桑叶多糖,产品中桑叶多糖的含量在60%以上。本发明的有益效果为:该方法过程简单、重现性好、操作时间短、溶剂消耗少、绿色环保,桑叶多糖提取率高,产品纯度高,具有较好的应用前景。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
1、高纯度桑叶多糖制备实例
实施例1
称取干燥粉碎后的桑叶原料100g,倒入微波提取罐中,加入1000mL去离子水,利用1M氢氧化钠溶液调节pH值至8.5,调节微波功率650W,提取时间200s,过滤收集滤液,滤饼重复提取,共提取3次,合并得到滤液2600mL。将滤液倒入萃取罐中,利用1M盐酸调节滤液pH至2,加入7000mL乙酸乙酯,充分搅拌5min,静置30min后,除去上层相溶剂,收集下层,重复用乙酸乙酯萃取2次,合并下层液,得到保留液2500mL桑叶多糖溶液I。向桑叶多糖溶液I加入10%三氯乙酸溶液200mL,调节pH值至3,充分搅拌5min,降低溶液温度至4℃,静置12h后,离心除去沉淀物,离心转速5000rpm,收集上清液得到2600mL桑叶多糖溶液II。将桑叶多糖溶液II进行超滤浓缩,滤膜截留分子量5000D,得到浓缩液多糖含量为5%的桑叶多糖溶液III 65mL。向多糖溶液III溶液中加入95%乙醇300mL,充分搅拌5min,降低溶液温度至4℃,静置18h后,离心,取沉淀物。利用100mL无水乙醇洗涤沉淀物,沉淀物减压低温干燥(-0.085MPa,60℃)后,粉碎至60目,得到浅黄色粉末4.2g,经苯酚-硫酸法测定该产品桑叶多糖含量达62.5%。
实施例2
称取干燥粉碎后的桑叶原料100g,倒入微波提取罐中,加入1200mL去离子水,利用1M氢氧化钠溶液调节pH值至8,调节微波功率700W,提取时间240s,过滤收集滤液,滤饼重复提取,共提取3次,合并得到滤液3350mL。将滤液倒入萃取罐中,利用1M盐酸调节滤液pH至2,先加入5000mL乙酸乙酯沸程,充分搅拌5min,静置30min后,除去上层相溶剂,重复萃取2次,合并下层液,得到3200mL桑叶多糖溶液I。向桑叶多糖溶液I加入12%三氯乙酸溶液270mL,调节pH值至3,充分搅拌5min,降低溶液温度至4℃,静置12h后,离心除去沉淀物,离心转速6000rpm,收集上清液得到3400mL桑叶多糖溶液II。将桑叶多糖溶液II进行超滤,滤膜截留分子量5000D,浓缩后得到浓缩液多糖含量为7%的桑叶多糖溶液III 48mL。向桑叶多糖溶液III中加入95%乙醇280mL,充分搅拌5min,降低溶液温度至4℃,静置18h后,离心,取沉淀物。利用100mL无水乙醇洗涤沉淀物,沉淀物减压低温干燥(-0.09MPa,40℃),粉碎至60目,得到浅黄色粉末4.5g,经苯酚-硫酸法测定该产品桑叶多糖含量达60.8%。
实施例3
称取干燥粉碎后的桑叶原料200g,倒入微波提取罐中,加入2000mL去离子水,利用1M氢氧化钠溶液调节pH值至9,调节微波功率700W,提取时间300s,过滤得到滤液,滤饼重复提取,共提取4次,合并得到滤液7700mL。将滤液倒入萃取罐中,利用1M盐酸调节滤液pH至2,在加入25000mL乙酸乙酯,充分搅拌5min,静置30min后,除去上层相溶剂,重复萃取3次,收集合并下层得到7600mL桑叶多糖溶液I。向桑叶多糖溶液I加入10%三氯乙酸溶液650mL,调节pH值至3,充分搅拌5min,降低溶液温度至4℃,静置10h后,离心除去沉淀物,离心转速10000rpm,收集上清液得到8100mL桑叶多糖溶液II。将桑叶多糖溶液II进行超滤浓缩,超滤膜截留分子量为10000D,得到多糖含量为11%的桑叶多糖溶液III 65mL。向多糖溶液III溶液中加入无水乙醇280mL,充分搅拌5min,降低溶液温度至4℃,静置18h后,离心,取沉淀物。利用100mL无水乙醇洗涤沉淀物,减压低温干燥(-0.085MPa,50℃),粉碎至80目,得到浅黄色粉末8.7g,经苯酚-硫酸法测定该产品桑叶多糖含量达61.4%。
对比实施例4
称取干燥粉碎后的桑叶原料200g,倒入微波提取罐中,加入2500mL去离子水,利用1M氢氧化钠溶液调节pH值至8,调节微波功率800W,提取时间300s,过滤得到滤液,滤饼重复提取,共提取2次,过滤、合并得到滤液4800mL。将滤液倒入萃取罐中,利用1M盐酸调节滤液pH至2,先加入10000mL乙酸乙酯,充分搅拌5min,静置30min后,除去上层相溶剂,在加入10000mL乙酸乙酯,充分搅拌5min,静置30min后,除去上层相溶剂,重复萃取2次,收集合并下层得到4700mL桑叶多糖溶液I。将桑叶多糖溶液I进行超滤浓缩,超滤膜截留分子量为8000D,得到多糖含量为6%的桑叶多糖溶液III 130mL。向多糖溶液III溶液中加入95%乙醇560mL,充分搅拌5min,降低溶液温度至4℃,静置18h后,离心,取沉淀物。利用200mL无水乙醇洗涤沉淀物,低温减压干燥(-0.095MPa,60℃),粉碎至60目,得到棕黄色粉末38g,经苯酚-硫酸法测定该产品桑叶多糖含量达18.2%。
2、动物药效试验
本发明制备的桑叶多糖产品已经过动物实验证明,具有显著的降血糖效果,药效实验报告如下:
样品:实施例1和实施例4制得的桑叶多糖产品配置浓度为0.1g/mL溶液。
实验动物:选用雄性小鼠(26±2g),由浙江省医学科学院提供。
试剂:四氧嘧啶、葡萄糖、磷酸盐缓冲液(0.2mol/L,pH7.0)、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林、叠氮钠、苯甲酸、苯酚、磷酸氢二钠、钨酸钠、氯化钠、盐酸、蒸馏水,所有试剂均为分析纯。
仪器:722型分光光度计、离心机。
实验方法:
5.1模型小鼠:小鼠禁食24h后,静脉注射四氧嘧啶(剂量为50mg/Kg),7天后禁食5h,血糖值为大于10mmol/L为模型小鼠。
5.2操作步骤:选用成功造模小鼠按禁食5h的血糖水平分组,随机选1个模型对照组和3个剂量组(组间差异不大于1mmol/L),每组12只,每天灌胃15mL桑叶多糖溶液,对照组灌胃15mL蒸馏水,连续42天后,测空腹血糖值,比较各组动物血糖值及血糖下降百分率。
血糖下降百分率=(实验前血糖值-实验后血糖值)/(实验前血糖值-6.5)×100%
式中6.5:无禁食正常小鼠血糖水平(mmol/L)。
5.3血糖值测试:葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法
6测试结果:
不同纯度桑叶多糖溶液的降血糖效果见表。
表1不同纯度桑叶多糖降血糖效果 n=12
对照组 | 18.2%桑叶多糖 | 62.5%桑叶多糖 | |
血糖值(mmol/L) | 15.66 | 11.82 | 5.25 |
血糖下降百分率(%) | - | 41.9 | 100* |
注:*达到正常水平
实验结果表明,由高纯度桑叶多糖配置的溶液具有显著的降血糖活性,而低纯度桑叶多糖溶液降血糖效果不显著。
Claims (9)
1.一种桑叶多糖的制备方法,其特征在于所述的方法以桑树的叶为原料,按以下步骤进行:
(1)取桑树经风干的桑叶,粉碎得40目-80目桑叶粗粉;
(2)取桑叶粗粉用去离子水浸泡,桑叶粗粉与去离子水的质量比为1∶10-30,加碱调节pH值至7-10,再于微波条件下提取3min-10min,微波功率300W-800W,过滤收集滤液,滤饼重复提取,共提取2-5次,合并每次的滤液收集为提取液;
(3)将步骤(2)所得的提取液,加酸调节pH值至2-5,再加入乙酸乙酯萃取,所述的乙酸乙酯与提取液的体积比为1∶2-4,搅拌后静置、分层,保留收集下层,重复用乙酸乙酯萃取2-5次,合并所有的下层,收集为保留液;
(4)将步骤(3)的保留液用三氯乙酸溶液调节pH值至2-3,降低温度至4℃-10℃,搅拌、静置8h-12h后,离心,除去沉淀物,收集上清液;
(5)将步骤(4)所得的上清液超滤,至浓缩液中多糖质量浓度为5%-15%,超滤膜截留分子量为5000D-10000D,浓缩液中加入体积浓度为95%-100%乙醇水溶液至乙醇体积分数为70%-80%,降温至4℃-10℃,搅拌、静置12h-18h后,离心,收集沉淀物;
(6)取步骤(5)所得的沉淀物,经减压低温干燥、粉碎,即得桑叶多糖产品。
2.如权利要求1所述的桑叶多糖的制备方法,其特征在于步骤(2)所述的碱为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或氨水。
3.如权利要求1所述的桑叶多糖的制备方法,其特征在于步骤(3)所述的酸为盐酸溶液或硫酸溶液。
4.如权利要求1所述的桑叶多糖的制备方法,其特征在于步骤(4)三氯乙酸溶液质量浓度为10%-20%。
5.如权利要求1所述的桑叶多糖的制备方法,其特征在于步骤(4)所述的离心转速为5000rpm-10000rpm。
6.如权利要求1所述的桑叶多糖的制备方法,其特征在于步骤(6)所述的沉淀物先以无水乙醇洗涤后再进行减压低温干燥。
7.如权利要求1所述的桑叶多糖的制备方法,其特征在于步骤(6)所述的减压低温干燥条件为在40℃-60℃,真空度-0.1MPa- -0.085MPa,干燥12h-18h。
8.如权利要求1所述的桑叶多糖的制备方法,其特征在于步骤(2)于微波功率为650W-750W条件下提取3min-5min,过滤收集滤液,滤饼重复提取,共提取2-5次,合并每次的滤液收集为提取液。
9.如权利要求1所述的桑叶多糖的制备方法,其特征在于所述的方法为以桑树的叶为原料,按以下步骤进行:
(1)取桑树经风干的桑叶,粉碎得40目-80目桑叶粗粉;
(2)取桑叶粗粉用去离子水浸泡,桑叶粗粉与去离子水的质量比为1∶10-30,加1M氢氧化钠溶液调节pH值至8.5,再于微波条件下提取3min-5min,微波功率650W-750W,过滤收集滤液,滤饼重复提取,共提取2-5次,合并每次的滤液收集为提取液;
(3)将步骤(2)所得的提取液,加1M盐酸调节pH值至2-5,再加入乙酸乙酯萃取,所述的乙酸乙酯与提取液的体积比为1∶2-4,搅拌后静置、分层,保留收集下层,重复用乙酸乙酯萃取2-5次,合并所有的下层,收集为保留液;
(4)将步骤(3)的保留液用质量浓度为10%-20%的三氯乙酸溶液调节pH值至2-3,降低温度至4℃-10℃,搅拌、静置8h-12h后,离心,除去沉淀物,收集上清液;
(5)将步骤(4)所得的上清液超滤浓缩至浓缩液中多糖质量浓度为5%-15%,超滤膜截留分子量为5000D-10000D,浓缩液中加入体积浓度为95%的乙醇水溶液至乙醇体积分数为70%-80%,降温至4℃-10℃,搅拌、静置12h-18h后,5000rpm-10000rpm离心,收集沉淀物;
(6)取步骤(5)所得的沉淀物,用无水乙醇洗涤后,40℃-60℃、-0.085MPa条件下减压干燥12h-18h,粉碎,即得桑叶多糖产品。
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